Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-08-16Bitstream added on 2014-06-13T19:12:08Z : No. of bitstreams: 1 cury_jrlm_me_botib.pdf: 264091 bytes, checksum: d3c5fa57917230a1a6aae9c3b8f93830 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O protocolo denominado P36 tem sido amplamente utilizado para induzir ovulação múltipla e permitir a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) facilitando o manejo de doadoras de embriões. Estudos recentes com o P36 indicam que a substituição das duas últimas doses de FSH por eCG pode melhorar a produção de embriões, possivelmente por sua atividade LH. Objetiva-se com o presente trabalho comparar o protocolo P36 com o tratamento superestimulatório convencional (com observação do estro) e testar, em vacas da raça Nelore, a substituição da eCG pela aplicação simultânea de FSH e LH no último dia de tratamento superestimulatório. Vacas Nelore (n=16) foram distribuídas aleatoriamente em 4 grupos: superovulação convencional com observação de estro (Controle), P36, P36/eCG e P36/FSH+LH. Os tratamentos foram feitos em modelo cross-over, ou seja todos os animais passaram pelos 4 tratamentos. No grupo Controle, o tratamento superestimulatório iniciou 10 dias após a observação do estro. As aplicações de FSH foram feitas durante 4 dias consecutivos (133mg, IM), duas vezes ao dia em doses decrescentes. Dois dias após o início do tratamento as doadoras receberam uma dose luteolítica de d-cloprostenol (150μg, IM). As inseminações foram realizadas 12 e 24 horas após a detecção do estro. No grupo P36, em dia aleatório do ciclo estral (D0), as doadoras receberam um dispositivo intravaginal de progesterona (1g) e benzoato de estradiol (3 mg, IM). O FSH (133mg, IM) foi administrado em doses decrescentes, 2 vezes ao dia durante o D4 ao D7. No D6, foi aplicado d-cloprostenol (150μg, IM) e o dispositivo intravaginal foi removido 36h mais tarde. No dia 8, a ovulação foi induzida com 12,5mg de pLH e os animais foram inseminados artificialmente em tempo pré-determinado, sem a observação de... / The P36 protocol has been widely used to induce multiple ovulation and allow for fixed-time artificial insemination (FTAI) facilitating the management of embryo donors. Recent studies with the P36 protocol indicate that the replacement of the last two doses of FSH by eCG can improve embryo yield, possibly due to its LH activity. The objective of this study was to compare the P36 protocol with conventional superestimulatory treatments (with estrus observation) and to test, in Nelore cows, the replacement of eCG by the simultaneous administration of FSH and LH on the last day of the superstimulatory treatment. Nelore cows (n=16) were randomly distributed into four groups: conventional superovulation with estrus observation (control); P36; and P36 / eCG P36 / FSH+LH. The treatments were performed in a crossover model, i.e. all animals passed through the four treatments. In the control group, the superstimulatory treatment started 10 days after estrus observation. Administration of FSH was made in 4 consecutive days (133 mg, IM), twice daily in decreasing doses. Two days after the initiation of treatment donors received a luteolytic dose of d-cloprostenol (150 μg, IM). Insemination was performed 12 and 24 h after estrus observation. In the P36 group, in a random day of estrous (D0), donors received a progesterone intravaginal device (1.0 g) and estradiol benzoate (3.0 mg, IM). The FSH (133 mg, IM) was administered at decreasing doses, twice daily from D4 to D7. In D6, d-cloprostenol was administered (150 μg, IM) and the intravaginal device was removed after 36 h. On day 8, ovulation was induced with 12.5 mg of pLH and the FTAI was performed at 12 and 24 h after pLH administration. Cows from the P36/eCG group were treated similarly to P36 group, except that the last two doses of FSH were replaced by two... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-28Bitstream added on 2014-06-13T20:13:51Z : No. of bitstreams: 1 silva_cf_me_botib.pdf: 208564 bytes, checksum: 9902237dc3cc6c5d01fc8b9f746d5c3e (MD5) / Os efeitos deletérios do estresse térmico calórico (ETC) sobre a fertilidade são menos pronunciados em raças tolerantes ao calor, devido às diferenças na capacidade de termorregulação. Para melhor compreender as diferenças entre zebuínos e taurinos em relação ao ETC, objetivou-se com o presente trabalho comparar a expressão dos genes COX2, CDX-2, IFN-τ, HSF1, HSP70 PLAC8, relacionados com o desenvolvimento embrionário inicial, em embriões bovinos produzidos in vitro (zebuínos vs. taurinos), submetidos ou não ao ETC. Oócitos de vacas Nelore (Bos indicus) e Jersey (Bos taurus) foram obtidos por aspiração folicular guiada por ultrasson (OPU) e maturados in vitro por 24 horas. Em seguida, foram fertilizados in vitro (D=0) com sêmen Nelore e Jersey, respectivamente. Doze horas após a fertilização, os prováveis zigotos (zebuínos e taurinos) foram cultivados in vitro em temperatura de 38,5oC. Noventa e seis horas após a fertilização, os embriões ≥ 16 células, de ambas as raças, foram divididos aleatoriamente em dois grupos experimentais: controle, cultivado continuamente a 38,5 oC, e ETC, exposto a 41 oC por 6 horas, retornando a seguir para 38,5 oC. No D7, “pools” contento 5 blastocistos para cada grupo experimental foram submetidos à extração de RNA total (RNAesay-Qiagen). A expressão gênica dos genes-alvo foi analisada por RT-PCR em tempo real com oligo-dT na transcrição reserva (RT) e primers bovinos específicos na PCR. A expressão de ciclofilina A (CYC-A) foi utilizada como controle interno. As taxas de produçaão de embriões foram analisadas por ANOVA, utilizando o Proc GLM do SAS. As médias dos níveis de mRNA dos genes alvo entre os grupos foram comparadas por ANOVA paramétrica, seguido de contraste ortogonal. O ETC reduziu significativamente... / Not available

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-17Bitstream added on 2014-06-13T20:23:03Z : No. of bitstreams: 1 satrapa_ra_dr_botib.pdf: 444664 bytes, checksum: ea4f185d0abddba64ab9a9ce073f5407 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A fim de melhor compreender as diferenças entre zebuínos e taurinos em relação à resistência ao estresse térmico (ET), objetivou-se com o presente trabalho: (1) verificar se a adição de IGF-I ao meio de cultivo, na ausência de Soro Fetal Bovino (SFB), seria capaz de manter as taxas de produção embrionária semelhantes àquelas obtidas em meio de cultivo com SFB; (2) verificar se a adição de IGF-I ao meio de cultivo é mais eficiente em diminuir os efeitos deletérios do ET em embriões da raça Holandesa preto e branco (HPB) quando comparados aos da raça Nelore; (3) verificar se o efeito deletério do ET no desenvolvimento embrionário e na taxa de apoptose é mais acentuado em embriões da raça HPB, quando comparado aos da raça Nelore. No experimento 1, oócitos de vacas aneloradas oriundas de matadouro foram maturados, fertilizados com sêmen de touros da raça Nelore e, 10 horas pós inseminação (hpi), os embriões foram distribuídos ao acaso em quatro grupos, de acordo com a composição do meio de cultivo: SFB (5% de SFB + 0 ng/mL de IGF-I; n=165); IGF (0% de SFB + 51 100 ng/mL de IGF-I; n=163); SFB+IGF (5% de SFB + 100 ng/mL de IGF; n=169) e controle (0% de SFB + 0 ng/mL de IGF-I; n=168). Foram avaliadas as taxas de clivagem, mórula, blastocisto e blastocisto eclodido. Nos experimentos 2 e 3, oócitos de vacas Nelore e HPB oriundas de matadouro foram maturados em meio TCM 199, fertilizados com sêmen de touros das raças Nelore (n=6) e HPB (n=6), respectivamente, e cultivados em meio SOF (synthetic oviduct fluid, na ausência de SFB) até o estágio de blastocisto. Dadas 10 hpi, os embriões foram distribuídos ao acaso em quatro grupos: controle (cultivados na ausência de IGF a 39 oC); ET (cultivados na ausência de IGF e expostos a 41 oC, 96 hpi, por 9 horas, retornando a seguir para 39 oC); IGF (cultivados na presença de IGF a 39 oC) e ET/IGF (IGF e ET). No... / Not available

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001-12-11Bitstream added on 2014-06-13T18:45:26Z : No. of bitstreams: 1 jacomini_jo_dr_jabo.pdf: 3623737 bytes, checksum: 3b6e9aca9b253bde7a9aa506de4fa862 (MD5) / Este estudo teve como objetivo acompanhar o processo de desenvolvimento testicular desde a fase indiferenciada até sua completa formação. Embriões e fetos de vacas da raça Nelore (Bos taurus indicus) foram obtidos em frigoríficos. Imediatamente após o abate das fêmeas, o útero era aberto e os embriões e fetos coletados. As gônadas e os embriões menores foram fixados em Bouin e processados para microscópica óptica convencional. Foi realizada a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) dos embriões cujo sexo não pode ser identificado macroscopicamente. A crista gonádica foi observada, primeiramente, em um embrião de 1,0 cm de comprimento. Em embriões com 2,5 cm de comprimento, a presença da albugínea permitiu a identificação do sexo. A espessura média da albugínea variou de 29,1 a 558,5 mm. O mediastino encontra-se localizado centralmente. Houve uma diminuição no espaço ocupado pelos cordões testiculares de 63,7 para 42,0% do volume total dos testículos. O seu diâmetro variou de 31,7 a 48,8 mm. O diâmetro das células germinativas (e dos seus núcleos) foi de 12,3 (6,6) a 16,9 (14,2) mm. A quantidade de células germinativas, por corte transversal de cordão, diminuiu de um máximo de 2,8 para 0,8. O número total de células germinativas aumentou de 16, no princípio da colonização da gônada, para 18,3 x 106 no final do estudo. O número de células de Sertoli, por corte transversal de cordão, variou de 10,0 a 16,2. Os resultados obtidos mostram que a origem e a formação dos testículos nos embriões e fetos de vacas da raça Nelore (Bos taurus indicus), ocorrem de forma muito semelhante à descrita para Bos taurus taurus. / The aim of this study was to accompany the process of testicular development from the indifferentiable phase to its complete formation. Embryos and fetuses of Nelore breed cows (Bos taurus indicus) were obtained in slaughterhouses near the Uberlandia city, Minas Gerais. As soon as the females were slaughtered, the uterus was opened and the embryos and fetuses gathered. The gonads and the smaller embryos were fixed in Bouin's fixative and afterwards processed for conventional optical microscopy. It was carried out the PCR (Polymerase Chain Reaction) from parts of embryos whose sex could not be identified macroscopically. The gonadal ridge was observed firstly in a 1.0 cm long embryo. In 2.5 cm long embryos the presence of the albuginea allowed the sex identification. The mean thickness of the albuginea ranged from 29.1 to 558.5 mm. Gradually increase of vascularization of the albuginea and parenchyma was observed. The mediastinum was located centrally. There was a decrease in the space occupied by the testicular cords, from 63.7 to 42.0 % of the total testes volume. Its diameter ranged from 31.7 to 48.8 mm. The diameter of germinal cells (and their nuclei) ranged from 12.3 (6.6) to 16.9 914.2) mm. The quantity of germinal cells by cross section of cord decreased from a maximum of 2.8 to 0.86. The total number of germinal cells was from 16 at the beginning of colonization of the gonad to 18.3 x 106 at the end of the study. The number of Sertoli's cells by cross section of cord ranged from 10.0 to 16.2. The results showed that the origin and formation of testes in embryos and fetuses from Nelore breed cows (Bos taurus indicus) does occur in a very similar way to what is described for Bos taurus taurus.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001-11-28Bitstream added on 2014-06-13T19:23:41Z : No. of bitstreams: 1 diniz_eg_dr_jabo.pdf: 1766438 bytes, checksum: b28fd4b1e87d5ab565efa2f5084bd69a (MD5) / Pouco se sabe sobre os eventos morfológicos que ocorrem durante o desenvolvimento pré-natal das gônadas nas raças zebuinas. O objetivo deste estudo foi descrever os eventos morfológicos relacionados ao desenvolvimento pré-natal da gônada, incluindo a sua formação, identificação de células germinativas primordiais, surgimento de oogônios, oócitos e folículos em embriões e fetos da raça Nelore. Oitenta e um embriões e fetos bovinos, com idade variando de 26 a 240 dias após fecundação, foram coletados em frigoríficos. A idade dos fetos foi estimada a partir de medidas tomadas no sentido crânio-caudal e aplicadas à fórmula proposta por Rexroad et. al. (1974). O sexo foi identificado a partir de observações macroscópicas e usando a técnica do PCR (Polymerase Chain Reaction) somente quando as diferenças sexuais morfológicas não foram evidentes. Para histologia, as gônadas foram fixadas em líquido de Bouin por 24 horas. Após processamento histológico, cortes de tecido de 5mm, foram corados com hematoxilina-eosina. Os resultados mostraram que a crista gonádica se formou a partir de 29 dias após fecundação. No 34º dia, células germinativas primordiais foram identificadas. As oogônias surgiram em grande quantidade entre 50 e 100 dias e seu número reduziu drasticamente, atingindo números finais aos 140 dias. Os folículos primordiais, folículos em crescimento e antrais apareceram em média aos 95, 140 e 180 dias, respectivamente. Oogônias e folículos primordiais, de forma diferente dos folículos em crescimento, apresentaram diferenças significativas no seu diâmetro nos vários períodos estudados. Folículos antrais mostraram diâmetro médio de 96,92 l 31,07mm aos 180 dias , chegando atingir médias de1331,43 l 567,43mm aos 240 dias... / Little is known about morphological events occurring during the prenatal development of gonads in the Zebu breeds. The objective of this study was to describe the morphologic events related to the prenatal development of the gonad, including its formation, identification of primordial germinative cells, appearance of oogonia, oocytes and follicles in Nelore breed embryos and fetuses. Eighty-one bovine embryos and fetuses, with age range from 26 to 240 days following fecundation, were gathered in a local slaughter-house. The age of fetuses was estimated from measures taken in the cranium-caudal direction and applied to the formula proposed by Rexroad et. al. (1974). The sex was identified from macroscopic observations and using PCR (Polymerase Chain Reaction) technique only when the morphologic sexual differences were not evident. For histology, gonads were fixed into Bouin fluid for 24 hours. Then, 5mm-tissue cuts were stained with hematoxylin-eosin. The results showed that the gonadal ridge was developed from 29 days following fecundation. At the 34th day, primordial germ cells were identified. Oogonia arose in great quantity between 50 and 100 days and its number reduced dramatically, attaining final numbers at 140 days. The primordial follicles, growing follicles and antral follicles appeared on the average at 95, 140 and 180 days, respectively. Oogonia and primordial follicles, in a different way from growing follicles, presented significant differences in its diameter in the several periods studied. Antral follicles showed 96.92 l 31.07mm in diameter at 180 days, achieving means of 1331.43 l 567.43 mm at 240 days. The statistical analysis showed a positive and highly significant correlation (P< 0.01), between the oogonia diameter and its nucleus, as well as between the primordial and growing follicles with its oocytes and respective nuclei... (Complete abstract, access undermentioned eletronic address)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-06Bitstream added on 2014-06-13T18:46:30Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_cs_dr_jabo.pdf: 1211579 bytes, checksum: 2f19bde4e0f7fbfd3f2aae7f084ceea1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Modificações pós-translacionais de histonas são importantes componentes do código epigenético, e contribuem para o controle da transcrição gênica de cada célula. O presente trabalho descreve a participação de duas modificações de histonas no desenvolvimento embrionário pré-implantacional: a acetilação de lisinas e a citrulinização de argininas. No capítulo 1, avaliamos a presença de duas modificações de histona H3, K9ac (permissiva) e K27me3 (repressiva) em embriões bovinos no ciclo de ativação do genoma embrionário (AGE), por imunofluorescência. Ambas as marcas estão presentes e apresentam alto coeficiente de correlação, e dois perfis de embriões (com alta e baixa variação dos níveis das modificações entre blastômeros) foram descritos. A acetilação de histonas está relacionada à ativação da expressão gênica, portanto no capítulo 2 hipotetizamos que a manipulação de seus níveis em embriões bovinos poderia influenciar a ativação do genoma embrionário, o desenvolvimento de blastocistos e a inativação do cromossomo X em fêmeas. Foram testadas concentrações do inibidor das histona desacetilases tricostatina A variando de 5 a 50nM, aplicadas por 12 a 144h, iniciando 70h após a FIV. Três protocolos foram selecionados: 5nM 48h, 5nM 144h e 15nM 48h. Após, foi utilizado sêmen sexado para estudar os efeitos da TSA sobre embriões fêmeas e machos separadamente. Por imunofluorescência para H3K9ac, foi observado aumento na acetilação de histonas em ambas as concentrações (5 e 15nM), sendo 5nM mais eficaz em fêmeas do que machos. O tratamento com 15nM 48h reduziu a produção de blastocistos em machos e fêmeas, e 5nM 144h em machos. A taxa de apoptose, avaliada pelo ensaio TUNEL, foi elevada em embriões fêmeas (grupos 5nM144h e 15nM48h), e em machos (grupo 15nM48h), mas tal aumento... / Histone post translational modifications are important components of the epigenetic code, and contribute to the control of gene transcription in each cell. This work describes the participation of two histone modifications in embryonic preimplantation development: acetylation of lysines and citrullination of arginines. In chapter 1, we evaluated the presence of two modifications of histone H3, K9ac (permissive) and K27me3 (repressive) in bovine embryos in the cycle of embryonic genome activation (EGA), by immunofluorescence. Both marks are present and show a high correlation coefficient, and two profiles of embryos were described, displaying high and low variation of modifications level between blastomeres. The acetylation of histones is related to gene expression activation, so in Chapter 2 we hypothesized that the manipulation of acetylation levels in bovine embryos could influence embryonic genome activation, blastocyst development and X chromosome inactivation in females. Five concentrations of the histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA), ranging from 5 to 50nM beginning 70 hours after FIV were applied per 12 to 144h. Three protocols were selected: 5nM 48h, 5nM 144h and 15nm 48h. After, sexed semen was used to study the effects of TSA on male and female embryos separately. Immunofluorescence of H3K9ac showed increased histone acetylation at both concentrations (5 and 15nM). 5nM TSA was more effective in females than in males. Treatment with 15nM 48h reduced male and female blastocyst yield, and 5nM 144h reduced male blastocyst yield. Apoptosis rate was measured by the TUNEL assay. Female 5nM144h and 15nM48h groups, and male 15nM48h group displayed higher apoptosis levels, but this increase was not observed in low quality embryos. In female embryos, TSA did not affect... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-19Bitstream added on 2014-06-13T20:26:10Z : No. of bitstreams: 1 rascado_ts_dr_botfmvz.pdf: 519776 bytes, checksum: 01ba22778e4b1e2e1003285f9b0b7014 (MD5) / Este experimento objetivou analisar o padrão de expressão do mRNA de SOX2, STAT3 e GBX2 em embriões bovinos produzidos in vitro nos estádios de blastocisto (E7) e blastocisto eclodido (E10). O RNA foi extraído de embriões em cada fase do desenvolvimento embrionário (n=7) e da massa celular interna (MCI) e epiblasto isolados por imunocirurgia de 20 embriões (n=20). A expressão do mRNA foi obtida por transcriptase reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR), quantificada pelo método da curva padrão e normalizada pela média geométrica de GAPDH, YWHAZ e SDHA. Os dados de cinco replicatas foram analisados por ANOVA seguido de comparações, aos pares, pelo teste de Tukey. A expressão relativa do mRNA de SOX2 foi significativamente maior em blastocistos (E7) do que em blastocistos eclodidos (E10) (P<0,05), sendo que a expressão na MCI foi 40X maior do que a obtida no blastocisto inteiro (P<0,05). A expressão relativa do mRNA de STAT3 3 não diferiu entre blastocistos (E7) e blastocistos eclodidos (E 10) (P>0,05). Não houve diferença entre blastocisto eclodido (E10) e epiblasto para SOX2 e STAT3 (P>0,05). Comparando-se o nível relativo de mRNA de GBX2 entre blastocistos (E7) e MCI e blastocisto eclodido (E10) e epiblasto não foi detectada diferença (P>0,05), sendo que MCI e epiblasto corresponderam a aproximadamente 90% da expressão observada nos embriões em suas respectivas fases de desenvolvimento. Portanto, com o desenvolvimento do blastocisto, há a tendência do aumento dos níveis de mRNA de STAT3 e SOX2 nas células pluripotentes do epiblasto; o nível de mRNA de GBX2 se mantém constante em blastocistos, com alta expressão em células pluripotentes / This experiment aimed to analyze the pattern of expression of the mRNA of SOX2, STAT3 and GBX2 in in vitro produced bovine embryos at stages of blastocyst (E7) and hatched blastocyst (E10). The RNA was extracted from embryos at each stage of embryonic development (n= 7) and from the inner cell mass (ICM) and epiblasts isolated from 20 embryos by immunosurgery. The expression of mRNA was obtained by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (real-time qPCR), quantified by the standard curve method and normalized by geometric mean of genes YWHAZ, SDHA and GAPDH. The data from five replicates were analyzed by ANOVA followed by comparisons, in pairs by Tukey test. The relative expression levels of SOX2 mRNA was significantly higher in blastocysts (E7) than in hatched blastocysts (E10) (P<0.05), whereas that the expression in MCI was 40X greater than the expression obtained in blastocyst (P< 0.05). The relative expression of STAT3 mRNA did not differ between blastocysts (E7) and hatched blastocysts (E 10) (p>0.05). There was no difference between blastocyst hatched (E10) and epiblasts for SOX2 and STAT3. By Comparing the relative level of GBX2 mRNA between blastocysts (E7) and ICM and blastocyst hatched (E10) and epiblasts no difference was detected (P>0.05), ICM and epiblasts corresponded to approximately 90% of expression observed in embryos in their respective stages of development. Therefore, with the development of the blastocyst, there is a tendency for increased levels of STAT3 and SOX2 mRNA in the pluripotent cells of epiblasts; the level of GBX2 mRNA is constant in blastocysts with high expression in pluripotent cells

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-29Bitstream added on 2014-06-13T19:24:35Z : No. of bitstreams: 1 prado_fra_dr_jabo.pdf: 264327 bytes, checksum: dd7379d7711c643e9ed9087d9e75a42d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / objetivo deste estudo foi contribuir para o conhecimento da técnica de criopreservação de embriões in vitro. Oócitos (n=965) foram maturados durante 24h em TCM-199 suplementado com 0,2mM de piruvato, 25 mM de bicarbonato de sódio e 75 mg/ml de gentamicina. Os zigotos foram cultivados em meio SOFm suplementado com 0,5% BSA e FCS 2,5%. Culturas foram realizadas a 38,5°C em 5% de CO2 no ar umidificado, em 100 μl de meio de gotículas recuperado com óleo mineral. No sétimo dia da cultura, os embriões (n = 387) foram marcados e apenas blastocistos excelente a boa qualidade foram criopreservados (10 embriões / palheta 0,25 ml). Os seguintes grupos experimentais foram concebidos, nomeado de acordo com a solução de crioprotetor utilizado: glicerol 1,0 M de etileno glicol em PBS (G); glicerol 1,0 M + 0,3 M de sacarose em PBS (GS); etilenoglicol 1.5 M em PBS (E) e 1,5 M + 0,3 M de sacarose em PBS (ES). Após o descongelamento, os embriões foram re-cultivadas em 100 ml de meio de gotas SOFm a 38,5 º C e 5% de CO2 no ar por 72 h. Os dados demonstraram que a qualidade do embrião, avaliada pelo escore de embriões e número de células embrionárias, parece ser melhor no grupo E e ES. No processo de vitrificação, 300 embriões de excelente qualidade morfológica, Bi e Bl foram vitrificados, e foram sincronizadas 500 receptoras de embriões, divididas em 3 grupos de 150 animais cada grupo. O diagnóstico de gestação nas receptoras após a inovulação dos embriões foram realizados após 42 dias. A taxa de concepção variou entre os grupos, sendo que no grupo I obteve 6 gestações (18,75%) de receptoras que receberam embriões da raça Nelore, 9 gestações (26,47%) de receptoras que receberam embriões da raça Brangus e 12 gestações (35,3%) de receptoras que receberam embriões da raça Brahman... / The aim of this study was to contribute to the knowledge of the technique of cryopreservation of embryos in vitro. Oocytes (n = 965) were matured for 24h in TCM- 199 supplemented with 0.2 mM pyruvate, 25 mM sodium bicarbonate and 75 mg / ml of gentamicin. Zygotes were cultured in medium supplemented with 0.5% SOFm BSA and 2.5% FCS. Cultures were performed at 38.5 ° C in 5% CO2 in humidified air in 100 l of medium droplets recovered with mineral oil. On the seventh day of culture, the embryos (n = 387) were scored and only good quality excellent blastocysts were cryopreserved (10 embryos / straw 0.25 ml). The following experimental groups were designed, named according to the cryoprotectant solution used: glycerol 1.0 M ethylene glycol in PBS (G) 1.0 M glycerol + 0.3 M sucrose in PBS (GS), ethylene glycol 1.5 M PBS (E) and 1.5 M + 0.3 M sucrose in PBS (ES). After thawing, the embryos were re-grown in 100 ml of medium SOFm drops to 38.5 º C and 5% CO2 in air for 72 h. The data demonstrated that embryo quality was evaluated by scoring the number of embryos and embryonic cells, seems to be better in group E and ES. In the process of vitrification, 300 embryos of excellent morphology, Bi and Bl, were vitrified, and 500 were synchronized embryo recipients were divided into 3 groups of 150 animals each group. Pregnancies after embryo transfer in recipient embryos were performed after 42 days. The conception rate varied between the groups, whereas in group I had six pregnancies (18.75%) of recipients that received embryos Nellore, 9 pregnancies (26.47%) of recipients that received embryos of Brangus and 12 pregnancies (35.3%) of recipients that received embryos from Brahman ... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2016. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2016-04-27T12:15:35Z No. of bitstreams: 1 2016_SeverinoBernardinoDeSenaNetto.pdf: 838386 bytes, checksum: 5afb6bda32d890becbc877491dbd2376 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-04-27T14:25:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_SeverinoBernardinoDeSenaNetto.pdf: 838386 bytes, checksum: 5afb6bda32d890becbc877491dbd2376 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T14:25:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_SeverinoBernardinoDeSenaNetto.pdf: 838386 bytes, checksum: 5afb6bda32d890becbc877491dbd2376 (MD5) / Um dos fatores mais limitantes da produção in vitro de embriões (PIVE) é a criopreservação, pois além dos embriões serem mais sensíveis ao frio eles suportam melhor a vitrificação do que o congelamento lento. Mas a vitrificação requer a presença de um técnico especializado para a manipulação embrionária enquanto que o congelamento lento permite a transferência direta. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da substituição do SFB por BSA durante a maturação e cultivo embrionário na resposta à criopreservação utilizando o congelamento lento. Os CCOs obtidos de ovários de abatedouro foram distribuídos em 2 grupos: 1) controle: CCOs maturados e cultivados em meios suplementados com SFB, 2) CCOs maturados e cultivados em meios suplementados com BSA. Em D7 os embriões de cada grupo foram distribuídos em dois tratamentos, fresco e congelado. O experimento 1 avaliou o efeito da fonte proteica na PIVE e a resposta à criopreservação. Após o descongelamento os embriões foram avaliados às 24h e 48h quanto à expansão e eclosão. No experimento 2 foi quantificada a expressão dos genes KRT8, PLAC8, FOSL1, HSP1A1 e HSPA5 por qPCR e quanto ao número total de células e células apoptóticas. Os dados referentes ao desenvolvimento embrionário e taxa de células apoptóticas foram realizados pelo teste χ2 e número de células pela ANOVA e teste de Tukey. A taxa de clivagem foi semelhante (P>0,05) entre os grupos, entretanto a taxa de blastocisto foi maior (P< 0,05) no grupo 1 (42,8±10,1%) do que no grupo 2 (27,9±8,5%). Às 24 horas pós-descongelamento o grupo SFB Fresco apresentou maior taxa de eclosão (P< 0,05) do que os demais. Entretanto, as 48 horas, a taxa de eclosão foi semelhante (P>0,05) entre os grupos SFB Controle (68,1±23.3%) e BSA Controle (70.0±31.0%) e SFB Congelado (39.2±27.1) e BSA Congelado (38,2±23,9). Não houve diferença (P>0.05) entre os grupos Frescos, e entre os grupos congelados quanto ao número total de células. A percentagem de células apoptóticas foi maior no grupo BSA Congelado do que grupo SFB Fresco, não diferindo (P< 0,05) dos demais grupos. A expressão do gene KRT8 foi maior (P< 0,05) no grupo SFB Congelado do que no BSA Congelado, mas foi semelhante (P>0.05) entre Congelados e Frescos dentro de cada grupo. O gene PLAC8 foi mais expresso no grupo BSA Fresco do que no grupo SFB Congelado (P< 0,05). Pode-se concluir que o uso de BSA em substituição ao SFB causou uma redução na produção de embriões, mas teve resposta semelhante na criopreservação. A expressão diferencial dos genes KRT8 e PLAC8 sugere que os embriões cultivados em BSA são de qualidade superior. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / One of the most limiting factors in vitro embryos (IVP) is cryopreservation, because besides the embryos are more sensitive to cold they support better vitrification than slow freezing. But vitrification requires the presence of a technical expert for embryo manipulation while slow freezing allows direct transfer. The objective of this study was to evaluate the effect of replacing SFB by BSA during maturation and embryo culture in response to cryopreservation using slow freezing. The COCs obtained from slaughterhouse ovaries were divided into 2 groups: 1) control: COCs matured and grown in media supplemented with SFB, 2) COCs matured and grown in media supplemented with BSA. D7 in the embryos of each group were divided into two treatments, fresh and frozen. Experiment 1 evaluated the effect of protein source in IVP and response to cryopreservation. After thawing the embryos were evaluated at 24 and 48 hours as the expansion and hatching. In experiment 2 was quantified the expression of genes KRT8, PLAC8, FOSL1, HSP1A1 and HSPA5 by qPCR and for the total number of cells and apoptotic cells. The χ2 test and the number of cells performed the data relating to embryonic development and cell apoptotic rate by ANOVA and Tukey test. Cleavage rate was similar (P> 0.05) between groups, however blastocyst rate was higher (P <0.05) in group 1 (42.8 ± 10.1%) than in group 2 (27.9 ± 8.5%). At 24 hours post-thaw SFB group Fresh showed the highest hatching rate (P <0.05) than the others. However, the 48 hours, the hatching rate was similar (P> 0.05) between SFB Control groups (68.1 ± 23.3%) and BSA control (70.0 ± 31.0%) and Frozen SFB (39.2 ± 27.1) and BSA Frozen (38.2 ± 23.9). There was no difference (P> 0.05) between groups Fresh, frozen and between groups regarding the total number of cells. The percentage of apoptotic cells was higher in the Frozen BSA group than group SFB Fresh, did not differ (P <0.05) from the other groups. The KRT8 gene expression was higher (P <0.05) in Frozen FBS group than in BSA Frozen, but was similar (P> 0.05) between frozen and fresh within each group. The PLAC8 gene was more expressed in the BSA Fresh group than in the Frozen SFB group (P <0.05). It can be concluded that the use of BSA replacing FBS caused a reduction in embryo production, but had similar response in cryopreservation. The differential expression of KRT8 and PLAC8 genes suggests that embryos cultured in BSA are top quality.

Submitted by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-03-02T14:03:04Z No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Larissa Alves Berté Barbosa.pdf: 410769 bytes, checksum: 903677a2ce06bd213b48a06034419b79 (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-03-03T12:03:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Larissa Alves Berté Barbosa.pdf: 410769 bytes, checksum: 903677a2ce06bd213b48a06034419b79 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-03T12:03:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Larissa Alves Berté Barbosa.pdf: 410769 bytes, checksum: 903677a2ce06bd213b48a06034419b79 (MD5) Previous issue date: 2015-03-19 / O hormônio de crescimento (GH) é um hormônio secretado pela hipófise e atua no crescimento de vários tecidos, incluindo a sistema reprodutor. Ele não é um hormônio reprodutivo, porém tem uma ligação importante para o desenvolvimento dos folículos ovarianos e no amadurecimento oocitário. Seus receptores estão presentes nas células do cumulus na membrana citoplasmática e nuclear do oócito, e isso faz com que o GH atue diretamente em seu crescimento. Na produção in vitro de embriões o GH vem sendo estudado visando aumentar a quantidade e a qualidade dos embriões, porém a concentração de GH na maturação in vitro ainda não está definida, havendo uma variação na literatura de 10 a 1000 ng/mL. Com isso, esse estudo comparou diferentes dosagens de GH adicionados ao meio de maturação, a fim de definir uma dosagem ideal para que haja um aumento na quantidade e qualidade dos embriões produzidos, que foi mensurada através das taxas de clivagem, produção de embriões e quantificação do número de células embrionárias, como também se comparou a interação do GH com a geração de estresse oxidativo. Os oócitos foram maturados com meio composto por TCM 199 com sais de Earl, suplementado com 10% de soro fetal bovino, hormônio luteinizante, hormônio folículo estimulante, estradiol e amicacina. Diferentes dosagens de GH foram adicionadas ao meio de maturação sendo elas 0 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 75 ng/mL e 100 ng/mL. Após 24 horas de maturação os oócitos foram fertilizados e estes foram incubados por 22 horas, para posteriormente passarem para o cultivo, onde ficaram incubadas por 7 dias. No terceiro dia de cultivo foram avaliadas as clivagens e no sétimo dia a produção de embriões. Os embriões em estagio de blastocisto expandido foram fixados em lâmina e corados com Panótico para a contagem de células embrionárias. A análise de estresse oxidativo foi feito pela reação dos meios de maturação, fertilização e cultivo com o acido tiobarbitúrico. Houve diferenças significativas sobre a quantificação de células quando usado 100 ng/ml proporcionando uma melhora na qualidade dos embriões, e também se aumentou o estresse oxidativo quando usado 75 e 100 ng/mL na fertilização e no cultivo in vitro. / Growth hormone (GH) is a hormone secreted by the pituitary gland and acts on the growth of various tissues, including the reproductive system. It is not a reproductive hormone, but has an important link to the development of ovarian follicles and the oocyte maturation. Its receptors are present in cumulus cells in cytoplasmic and nuclear membrane of the oocyte, and this causes the GH acts directly in its growth. In vitro production of embryos GH has been studied to increase the amount and quality of embryos, but the concentration of GH in vitro maturation is not yet defined, with a variation in the literature 10 to 1000 ng/mL. This study compared different dosages of GH added to the maturation medium in order to set an optimal dosage so that there is an increase in the quantity and quality of embryos produced, which was measured by the cleavage rates, embryo production and quantifying the number of embryonic stem cells, as well as comparing the interaction of GH with the generation of oxidative stress. Oocytes were matured in medium composed of TCM 199 with Earl's salts, supplemented with 10% fetal bovine serum, luteinizing hormone, follicle stimulating hormone, estradiol, and amikacin. Different dosages of GH were added to maturation medium these being 0 ng/mL 25 ng /mL, 50 ng/mL, 75 ng/mL and 100 ng/mL. After 24 hours of maturation, oocytes were fertilized and these were incubated for 22 hours to later pass to the culture and they were incubated for 7 days. On the third day of cultivation were evaluated cleavages and on the seventh day the production of embryos. Embryos expanded blastocyst stage were fixed on slides and stained with Panotic for embryonic cell count. The oxidative stress analysis was done by the reaction of the means of maturation, fertilization and cultivation with thiobarbituric acid. There were significant differences in quantitation of cells when used 100 ng/mL giving an improvement in the quality of embryos, and also increased the oxidative stress used when 75 and 100 ng/mL in fertilization and in vitro culture.