O neuroblastoma é o tumor sólido mais comum e com maior índice de letalidade em crianças. Diversas famílias de retrovírus endógenos humanos (HERV) estão presentes no genoma humano, em diferentes níveis de integridade, e são reativadas sob diferentes circunstâncias. A atividade de HERV tem sido cada vez mais sido associada a doenças como câncer, doenças autoimunes e ainda com a infecção por vírus exógenos. O principal objetivo deste projeto foi avaliar a expressão de retrovírus endógenos das famílias H (HH), W (HW) e K (HK) em pacientes diagnosticados com neuroblastoma. Amostras tumorais e amostras controle foram submetidas a extração de RNA total, síntese de cDNA e PCR em fase única. Os produtos de HERV foram submetidos ao sequenciamento em larga escala. No total, 43 loci de HH e 14 loci de HW foram diferencialmente expressos entre os grupos e 202 loci de HK foram detectados. As análises de expressão somadas ao contexto genético e epigenético de neuroblastoma, permitiram com que várias hipóteses fossem levantadas acerca da regulação da expressão de HERV neste tumor. A hipometilação geral do tecido tumoral pode ter um papel importante na expressão gênica e na reativação de retrotransposons, podendo ser a principal razão para a expressão de HERV neste contexto. / Neuroblastoma represents the most common solid tumor as well as the most lethal form of tumor in children. Several families of human endogenous retroviruses (HERV) are present in human genome in different integrity levels, and they are reactivated under different circumstances. HERV activity has been linked to diseases such as cancer, autoimmune diseases and even with the infection by exogenous viruses. The main goal of this project was to evaluate the expression of endogenous retroviruses families H (HH), W (HW) and K (HK) in patients diagnosed with neuroblastoma. Tumor samples and control samples were subjected to RNA extraction and a single round in-house RT-PCR. HERVs amplicons were next generation sequenced to access the specific origin of transcripts. Overall, 43 HH loci and 14 HW loci were differentially expressed between groups and, 202 HK loci was detected. Taken together, HERV expression analysis and genetic and epigenetic context of neuroblastoma provided several hypotheses about regulation of HERV expression in this type of tumor. The global hypomethylation of tumoral tissue may have a role in genes expression and retrotransposons reactivation, which may be the main reason for HERV expression in this context.

La presente tesis doctoral se estructura en un total de seis capítulos. En el primer capítulo se presenta la motivación de este trabajo y se expone la estructura de la investigación, las hipótesis y los objetivos más relevantes. Además, se comentan de forma breve las conclusiones que se derivan de cada uno de los capítulos y los antecedentes de investigación que el doctorando ha llevado a cabo hasta la fecha, incluyendo artículos, participación en congresos y seminarios, y el trabajo en proyectos de investigación, entre otros. En el Capítulo II se realiza una aproximación a la teoría de la economía de la innovación, estudiando la aportación de los autores más relevantes, como Joseph A. Schumpeter, Paul Romer, Robert Solow o Robert Lucas, entre otros muchos. En él se establece la que será la base teórica para el conjunto de la tesis, dado que son los fundamentos teóricos de estos autores los que permiten entender la relevancia de la tecnología en el desarrollo económico. Sin comprender por qué la disrupción tecnológica es capaz de provocar un verdadero salto cualitativo y cuantitativo en nuestro tejido productivo, pero también en la propia teoría económica, no podríamos explicar las transformaciones que están teniendo lugar en nuestra sociedad, ni el impacto macroeconómico esperado de la inteligencia artificial (IA) en una mayor fase de desarrollo. En el Capítulo III, tras exponer las medidas y estrategias de las principales potencias económicas en el campo de la IA, realizamos nuestra primera aproximación aplicada. En concreto, llevamos a cabo un análisis sobre el grado de preparación para la adopción de la IA por parte de un conjunto de países, lo que nos conduce a generar un índice multivariable en el que se tiene en cuenta diferentes dimensiones como el capital físico y el entorno, el capital humano y el capital organizativo y social. Ello nos permite conocer qué países están mejor posicionados para liderar la era de la IA. Además, en este primer ejercicio, se ha trabajado sobre un conjunto de factores amplio, muchos de los cuales son usados por primera vez en esta tesis. La metodología Borda Condorcet es empleada para dar robustez a los resultados obtenidos, en los que se comparan las economías europeas más destacadas con países asiáticos y otras potencias occidentales como Estados Unidos (EE.UU.), Canadá o Australia. Los resultados obtenidos con nuestro estudio nos permiten identificar el liderazgo relativo de Asia en lo que respecta a su capacidad de transformación socioeconómica presente y futura en base a la IA. Además, al realizar varias técnicas de análisis comparado, podemos identificar cómo las variables utilizadas condicionan la posición de cada uno de los países analizados, permitiéndonos identificar las principales fortalezas y debilidades de cada uno de ellos. En el Capítulo IV se realiza un análisis sobre si el grado de despliegue de la IA en los países europeos es suficiente como para reflejar el impacto de esta tecnología en su desarrollo económico. Empleando variables similares a las del Capítulo III e incorporando más variables relacionadas con el ecosistema IA, se contrasta si el grado de implantación de la IA tiene un reflejo en factores como el empleo, la productividad, el reparto de la riqueza o el índice de desarrollo humano. Para ello se emplea un modelo de ecuaciones estructurales basado en Partial Least Squares Equation Modeling (PLS-SEM), complementado con un análisis de tétradas –que nos confirma que estamos ante un modelo de constructos formativos– y un test de cúpula gaussiana para controlar los problemas de endogeneidad. La incorporación de este test a nuestro estudio representa una importante novedad en este tipo de trabajos y proporciona información clave para el correcto análisis de la relación entre los constructos. Los resultados de este capítulo ofrecen indicios sólidos sobre el impacto positivo del ecosistema IA europeo en el desarrollo económico del continente. Además, permiten identificar el efecto de cada una de las variables utilizadas sobre los constructos relacionados con el entorno tecnológico y de inteligencia artificial. Por su parte, el test de cúpula gaussiana refleja problemas de endogeneidad entre el entorno tecnológico vinculado a tecnologías más maduras como pueden ser las TIC y el desarrollo económico, no siendo así en el caso del ecosistema IA. Estos resultados enriquecen la argumentación expuesta en el apartado de implicaciones políticas y conclusiones con el que se culmina este capítulo. Una vez descubiertos indicios sólidos sobre el impacto positivo de los ecosistemas IA sobre el desarrollo económico. En el Capítulo V nos planteamos el objetivo de aproximar el estado actual del ecosistema IA de la Comunitat Valenciana. Para ello, en primer lugar analizamos el contexto español puesto que consideramos que constituye un factor determinante para entender la situación de la Comunitat Valenciana. A continuación, llevamos a cabo un ejercicio de inferencia. En concreto, ante la escasez de datos oficiales sobre el estado de la IA a nivel autonómico, procedemos a identificar las organizaciones públicas y privadas que están relacionadas con la IA en esta comunidad. Una vez identificadas, pasamos a extraer información de las mismas mediante la elaboración de una encuesta y la realización de entrevistas telefónicas. Además, esta información se combina con los datos disponibles en CamerData e información disponible en las webs de las propias organizaciones. El propósito de este capítulo es doble: en primer lugar, nos sirve para reconocernos como país y región dentro del entramado geopolítico descrito en los capítulos anteriores, y en segundo lugar para tener información de fuentes directas con la que advertir de los retrasos en el desarrollo y la aplicación de los algoritmos inteligentes en nuestro territorio. Dado el avance que las grandes potencias económicas están llevando a cabo, podemos exponer con datos los riesgos que corremos en materia competitiva y productiva si nos quedamos atrás en el proceso de transformación económica basado en la IA y las tecnologías digitales. En el Capítulos VI se presentan las conclusiones de los apartados anteriores, se exponen las limitaciones encontradas durante la realización de esta tesis doctoral, así como las líneas futuras de investigación que se abren gracias a este trabajo. Finalmente, este capítulo es posteriormente traducido al inglés en el Capítulo VII, a modo de resumen y con una extensión superior a las 5000 palabras, en cumplimiento de los requisitos establecidos por la Escuela Internacional de Doctorado de la Universidad de Alicante para las tesis doctorales con mención internacional.

Ao longo dos processos de imortalização e transformação maligna, as células adquirem inúmeras alterações genéticas, que são causadas por fatores endógenos e exógenos como agentes biológicos e a geração de espécies reativas de oxigênio. Neste trabalho, uma linhagem celular espontaneamente transformada foi clonada a partir de explantes de embriões de camundongos C57bl/6. Esta linhagem mostrou-se produtora de pigmento escuro; a análise citoquímica e ultraestrutural permitiu caracterizar a linhagem como tendo origem melanocítica. A linhagem, denominada Mgal3, mostrou-se tumorigênica quando implantada no tecido subcutâneo de animais singenéicos, apresentando capacidade de disseminação linfática, dando origem a metástases em linfonodos, o que permitiu caracteriza-la como uma linhagem de melanoma murino. O processo de transformação deste melanoma caracterizou-se pela expressão de genes retrovirais endógenos, com expressão do antígeno associado a melanoma (MAA), reconhecido pelo anticorpo monoclonal MM2-9B6; ausência de mutações nos exons 5 a 8 do gene supressor de tumor TP53; e, silenciamento do gene CDKN2a, que codifica duas proteínas que atuam em redes de supressão de tumores, p16INK4a e p19ARF. A perda de expressão de pelo menos um destes produtos gênicos parece associada a mecanismos epigenéticos, uma vez que o tratamento de Mgal3 com o inibidor de DNA metiltransferase 5-Aza-2-deoxicitidina, restaurou a transcrição de pelo menos um dos transcritos do gene CDKN2a. Da mesma forma, observamos que o gene LGALS3, que codifica a lectina animal galectina-3 também é silenciado nesta linhagem, mostrando que esta molécula não está associada à manutenção desta célula transformada em condições de cultivo. / A novel murine melanoma cell line named Mgal3 was generated from embryo explants. This cell line gave rise to metastatic tumors when injected subcutaneously in C57bl/6 mice. Tumor histogenesis was determined at the cytochemical (Fontana Masson staining), immunohistochemical (staining with anti-HMB45 and anti-S100) and ultrastructural levels. Mgal3 produces high amounts of retroviral C particles and was recognized by the mAb MM2-9B6, which reacts with a melanoma associated antigen derived from the envelope of the ecotropic retrovirus MelArv. No mutations were found in TP53 exons 5-8, however loss of CDKN2a expression was observed. Treatment of Mgal3 with the demethylating agent azadeoxycytidine indicated that at least one of the genes encoded at the CDKN2a locus was silenced by promoter hypermethylation. Furthermore, this cell line did not express the animal lectin, galectin-3. The galectin-3 gene promoter seemed to be hypermethylated, since treatment of Mgal3 with azadeoxycytidine led to the de novo expression of the lectin.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2016-04-12T13:00:18Z No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1701778 bytes, checksum: 4e6e0ca5635cf810784f97567b64095f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T13:00:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1701778 bytes, checksum: 4e6e0ca5635cf810784f97567b64095f (MD5) Previous issue date: 2014-03-10 / This paper conducts tests for structural breaks in the reaction function of the Central Bank of Brazil to evaluate possible changes in the conduct of monetary policy in Brazil, taking into account the reaction function of the regressors are potentially endogenous variables. For this, we uses the methodology developed by Hall et al. (2012) who, using an extension of the framework developed by Bai and Perron (1998), develops a method capable of identifying multiple structural breaks at unknown periods. The main results indicate presence of structural breaks in the three reaction functions studied. Furthermore, the actions of monetary policy through interest rate Selic seem to suffer greater influence of deviations of inflation around its target, compared to changes in the output gap and the exchange rate. / Este estudo realiza testes de quebra estrutural na função de reação do Banco Central do Brasil para avaliar possíveis mudanças na condução da política monetária doméstica, levando-se em conta que os regressores da função de reação são potencialmente variáveis endógenas. Para isto, é utilizada a metodologia desenvolvida por Hall et al. (2012) que, utilizando uma extensão da estrutura desenvolvida por Bai e Perron (1998), elaboram um método capaz de identificar múltiplas quebras estruturais em períodos desconhecidos. Os principais resultados apontam para a presença de quebras estruturais nas três funções de reação estudadas. Além disso, as ações da política monetária, por meio da taxa de juros Selic, parecem sofrer maior influência dos desvios da inflação em torno de sua meta, comparativamente a variações no hiato do produto e na taxa de câmbio.

Ao longo dos processos de imortalização e transformação maligna, as células adquirem inúmeras alterações genéticas, que são causadas por fatores endógenos e exógenos como agentes biológicos e a geração de espécies reativas de oxigênio. Neste trabalho, uma linhagem celular espontaneamente transformada foi clonada a partir de explantes de embriões de camundongos C57bl/6. Esta linhagem mostrou-se produtora de pigmento escuro; a análise citoquímica e ultraestrutural permitiu caracterizar a linhagem como tendo origem melanocítica. A linhagem, denominada Mgal3, mostrou-se tumorigênica quando implantada no tecido subcutâneo de animais singenéicos, apresentando capacidade de disseminação linfática, dando origem a metástases em linfonodos, o que permitiu caracteriza-la como uma linhagem de melanoma murino. O processo de transformação deste melanoma caracterizou-se pela expressão de genes retrovirais endógenos, com expressão do antígeno associado a melanoma (MAA), reconhecido pelo anticorpo monoclonal MM2-9B6; ausência de mutações nos exons 5 a 8 do gene supressor de tumor TP53; e, silenciamento do gene CDKN2a, que codifica duas proteínas que atuam em redes de supressão de tumores, p16INK4a e p19ARF. A perda de expressão de pelo menos um destes produtos gênicos parece associada a mecanismos epigenéticos, uma vez que o tratamento de Mgal3 com o inibidor de DNA metiltransferase 5-Aza-2-deoxicitidina, restaurou a transcrição de pelo menos um dos transcritos do gene CDKN2a. Da mesma forma, observamos que o gene LGALS3, que codifica a lectina animal galectina-3 também é silenciado nesta linhagem, mostrando que esta molécula não está associada à manutenção desta célula transformada em condições de cultivo. / A novel murine melanoma cell line named Mgal3 was generated from embryo explants. This cell line gave rise to metastatic tumors when injected subcutaneously in C57bl/6 mice. Tumor histogenesis was determined at the cytochemical (Fontana Masson staining), immunohistochemical (staining with anti-HMB45 and anti-S100) and ultrastructural levels. Mgal3 produces high amounts of retroviral C particles and was recognized by the mAb MM2-9B6, which reacts with a melanoma associated antigen derived from the envelope of the ecotropic retrovirus MelArv. No mutations were found in TP53 exons 5-8, however loss of CDKN2a expression was observed. Treatment of Mgal3 with the demethylating agent azadeoxycytidine indicated that at least one of the genes encoded at the CDKN2a locus was silenced by promoter hypermethylation. Furthermore, this cell line did not express the animal lectin, galectin-3. The galectin-3 gene promoter seemed to be hypermethylated, since treatment of Mgal3 with azadeoxycytidine led to the de novo expression of the lectin.

Bases: A antinocicepção induzida por substâncias doces tem sido largamente estudada. Contudo, a investigação dos neurotransmissores envolvidos nesse processo antinociceptivo ainda carece de mais estudos, pois é de extrema importância entender o envolvimento desses neurotransmissores no sistema neural que controla este tipo de antinocicepção. Objetivo: O objetivo deste estudo é clarificar o envolvimento dos sistemas opióide e serotoninérgico na antinocicepção induzida por substância doce. Método: O presente trabalho foi realizado em modelo animal (Rattus norvegicus, Rodentia, Muridae), objetivando investigar se a ingestão crônica de solução de sacarose é seguida de antinocicepção. A latência de retirada de cauda após a aplicação de estímulo nocivo térmico foi medida antes e após esse tratamento no teste de retirada de cauda (provavelmente um reflexo espinal). Não houve diferenças estatisticamente significantes entre os valores de linha basal dos diferentes grupos e foi calculado um índice de analgesia da latência de retirada de cauda antes e depois do tratamento. O envolvimento de opióides endógenos e de serotonina neste processo antinociceptivo foi pesquisado com fármacos antagonistas específicos e não-específicos dos receptores opióides e serotoninérgicos. Resultados: O efeito analgésico da ingestão de sacarose depende da concentração da solução de sacarose e do tempo de duração do consumo da mesma. Naltrexona e metisergida diminuíram a antinocicepção induzida por substâncias doce (após 14 dias de ingestão da sacarose). Estes efeitos foram corroborados pela administração periférica de naloxonazina e cetanserina. Conclusões: Os resultados sugerem o envolvimento de opióides endógenos e serotonina no processo antinociceptivo atualmente estudado. Tudo apontando para a participação de receptores opióides µ1 e serotoninérgicos 5-HT2 na regulação central da antinocicepção induzida por substâncias doces. / Rationale: Sweet substance-induced antinociception has been widely studied, and the investigation of the neurotransmitters involved in the antinociceptive process is an important way for understanding the involvement of neural system controlling this kind of antinociception. Objective: The aim of this study is to investigate the involvement of opioid and serotonergic system in the sweet substance-induces antinociception. Methods: the present work was made in animal model (Rattus norvegicus, Rodentia, Muridae); with the aim of investigating if the chronic intake of sweet substance, such as sucrose, is followed by antinociception. Their tail withdrawal latencies in the tail-flick test (probably a spinal reflex) were measured before and immediately after this treatment. As there was not statistic significant differences between baseline values of different groups, an analgesia index was calculated from the withdrawal latencies before and after treatment. The involvement of endogenous opioid and serotonin in the antinociceptive process was investigated with specific and non-specific pharmacological antagonism on opioid and serotonergic receptors. Results: The analgesic effect of sucrose intake depends on the concentration of sucrose solution and on the time during which the solution is consumed. Naltrexone and methysergide decreased the sweet substance-induced antinociception (post 14 days of sucrose intake). These effects were corroborated by peripheral administration of naloxonazina and ketanserin. Conclusions: The present results suggest the involvement of endogenous opioids and serotonin in the antinociceptive process presently studied. µ1-opioid and 5-HT2 serotonergic receptors may be involved in the central regulation of the sweet substance-produced antinociception.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da sinvastatina, isolada e associada ao α-tocoferol e à L-arginina, sobre os inibidores endógenos da óxido nítrico sintase, os metabólitos do óxido nítrico e tióis, em pacientes hipercolesterolêmicos. Analisou-se um grupo de 16 pacientes hipercolesterolêmicos que seguiram o seguinte protocolo: período de washout (sem medicação), 1 mês; sinvastatina (20mg/dia), 2 meses; sinvastatina (20mg/dia) + α-tocoferol (400U/dia), 2 meses; sinvastatina (20mg/dia, washout), 1 mês; sinvastatina (20mg/dia) + L-arginina (7g/dia), 2 meses. A sinvastatina reduziu significativamente as concentrações do colesterol total e LDL-colesterol e a razão LDL-colesterol/HDL-colesterol. O tratamento com sinvastatina, isolada e associada ao α-tocoferol, promoveu diminuição nas concentrações de S-nitrosotióis. A L-arginina associada à sinvastatina, aumentou os níveis de colesterol total quando comparada com a sinvastatina isoladamente. As concentrações plasmáticas de α-tocoferol e L-arginina não aumentaram em decorrência da suplementação, devido à grande dispersão dos dados obtidos, embora as medianas das concentrações plasmáticas de Larginina e α-tocoferol tenham sido mais elevadas após as suplementações. O tratamento com sinvastatina, isolada ou associada à L-arginina e ao α-tocoferol, não alterou as concentrações dos inibidores endógenos da óxido nítrico sintase (ADMA e SDMA), dos metabólitos do óxido nítrico, da nitrotirosina total e dos tióis analisados. / The aim of this study was to evaluate the effect of sinvastatin, isolated and associated to α-tocopherol and to L-arginine, on the endogenous inhibitors of nitric oxide synthase, on nitric oxide metabolytes and thiols, in hypercholesterolemic patients. A group of 16 hypercholesterolemic patients were analysed, acconting to the protocol: a washout period (without medication) of 1 month, sinvastatin (20 mg/day) for 2 months; sinvastatin (20 mg/day) + α-tocopherol (400U/day) for 2 months; sinvastatin (20 mg/day) for 1 months (washout period), sinvastatin (20 mg/day) + L-arginine (7g/day) for 2 months. Sinvastatin significantly reduced the concentrations of total cholesterol and LDL-cholesterol, as well as the LDL-cholesterol/HDLcholesterol ratio. The treatment with sinvastatina, alone and associate to α-tocoferol, resulted in a reduction of RSNO concentration. The L-arginine associated with sinvastatin, increase the level of total cholesterol as compared with simvastatin alone. The plasma concentrations of a-tocopherol and Larginine did not increase following supplementation due to the large dispersion of the data obtained, even though the median plasma concentrations of L-arginine and a-tocopherol were elevated after supplementation. Treatment with simvastatin, alone or associated to L-arginine and a-tocopherol did not alter the concentrations of the endogenous inhibitors of nitric oxide synthase (ADMA and SDMA), or that of nitric oxide metabolytes, total nitrotyrosine or the thiols analysed.

O tráfego de leucócitos é um processo complexo, dependente da ação de inúmeras substâncias químicas, além da perfeita interação celular. Desta forma, este estudo teve como objetivo avaliar a ação dos GCe e da ANXA1 sobre o eixo SDF-1α/CXCR4 e IL-17/IL-23/G-CSF e sobre a expressão de moléculas de adesão CD18, CD49d e CD62L. Foram utilizados camundongos machos Balb/C selvagens (WT) ou ANXA1-/-. As avaliações foram realizadas em condições basais, na presença de altas concentrações de GCe e na vigência de processo inflamatório, induzidos pela administração de ACTH (5 µg/animal, i.p.) ou pela injeção de LPS (100 µg/kg, i.p.), respectivamente, ou na ausência da ação dos GCe, pela ação do RU 38486 (RU, 10 mg/kg, i.p.). A participação da ANXA1 e do receptor FPR2 foi avaliada pelo pré-tratamento com Ac2-26 (1 mg/Kg, i.p.) ou com BOC2 (10 µg/animal, i.p.) durante 4 dias, 1 vez ao dia. A quantificação total e diferencial das células foi realizada em câmara de Neubauer e em esfregaços corados por May-Grunwald ou citometria de fluxo. As quantificações de CXCR2, CXCR4, FPR2, CD18, CD49d, CD62L e maturação granulocítica (CD11b/Ly6G) em células da medula e da circulação foram realizadas por citometria de fluxo. A expressão de ANXA1 nos tecidos do estomago e do baço foi realizada por western blotting e nas células da medula óssea e sangue circulante foi realizada por imunofluorescência. As quantificações de IL-17, IL-23, G-CSF, SDF-1α e corticosterona foram realizadas por ELISA. A quimiotaxia de neutrófilos da medula óssea e sangue periférico foi ensaiada na placa de quimiotaxia com filtro de poro de 8 µm. A fagocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos da medula óssea foi avaliada por ensaio in vitro. Para verificar os efeitos do ACTH na migração de neutrófilos no processo inflamatório, foi empregado o modelo de bolsa de ar (100 µg/mL; LPS); e o comportamento dos leucócitos circulantes de animais tratados com ACTH foi avaliado pela técnica de microscopia intravital. Os resultados obtidos, que estão apresentados em quatro temáticas, mostraram que: 1) neutrófilos da medula óssea e sangue periférico expressam ANXA1 no citoplasma e membrana, bem como o receptor FPR2, constitutivamente, e a expressão de ambos é regulada pelos GCe. A ANXA1, via receptor FPR2 expresso em células da medula óssea, controlam a maturação neutrofílica e o tráfego destas células da medula óssea para o sangue. A ANXA1, via interação ao FPR2, controla o clearance de neutrófilos do sangue para a medula óssea, modulando o eixo SDF-1α/CXCR4; 2) A administração do ACTH causa neutrofilia e os neutrófilos circulantes são ANXA1+, CD18+, CD49d+, CD62L+, mostrando que injeção do ACTH in vivo altera o fenótipo destas células na circulação. Estas modificações alteram o comportamento dos neutrófilos na circulação, bem como a migração para a bolsa de ar na vigência de inflamação e para os tecidos de clearance. Estes efeitos podem ser dependentes, pelo menos em parte, da inibição de migração orientada, já que quimiotaxia frente ao fMLP ou ao SDF-1α estavam reduzidas. Ainda, o clearance de neutrófilos é reduzido em animais tratados com o ACTH pela menor atividade fagocítica e secretora dos macrófagos medulares; 3) Animais tratados com RU 38486 e ANXA1-/- mobilizam granulócitos da medula óssea para o sangue circulante e, deste compartimento para o foco de inflamação com maior intensidade que o observado em animais controles. O eixo IL-17/IL-23/G-CSF parece estar envolvido na granulopoiese e na mobilização de neutrófilos para o sangue durante a inflamação, mas não é alvo de ação da ANXA1 e o GCe nesta etapa do processo inflamatório. Adicionalmente, foi observado que na vigência de peritonite, as moléculas de adesão, CD49d e CD62L estão envolvidas no processo de migração de neutrófilos da medula óssea para o sangue. Os resultados aqui obtidos permitem concluir que os GCe e a ANXA1 são relevantes para granulopoiese e tráfego dos neutrófilos da medula óssea em condições fisiológicas e na vigência de processo inflamatório. Ainda, em conjunto com os dados da literatura, os nossos resultados podem sugerir a participação da ANXA1 dos GCe na plasticidade fenotípica dos neutrófilos de acordo com os estímulos a que são submetidos, e podem auxiliar na compreensão dos novos conceitos sobre a produção, tempo de vida, localização e funções de neutrófilos. / The traffic leukocytes is a complex process dependent on the action of severals chemical mediators, in addition to perfect cell interaction. Therefore, this study aimed to evaluate the effect of GCe and ANXA1 on SDF-1α/CXCR4 and IL-17/IL-23/G-CSF and on the expression of adhesion molecules CD18, CD49d and CD62L. Balb/C wild type and ANXA1-/- male mice were employed. The analysis were performed at physiological conditions, in the presence of high concentrations of GCe and during of inflammatory process induced by ACTH administration (5 µg/animal, i.p.) or LPS injection (100 µg/kg, i.p.), respectively or in the absence of GCe action, by the action of RU 38486 (RU, 10 mg/kg , i.p.). The involvement of the receptor FPR2 and ANXA1 was assessed by pre-treatment with Ac2-26 (1 mg/kg, i.p.) or BOC2 (10 µg/animal, i.p.) for 4 days, once a day. The quantification of total and differential cell was performed in a Neubauer chamber and stained smears by May-Grunwald and flow cytometry. Quantification of expression of CXCR2, CXCR4, FPR2, CD18, CD49d, CD62L and granulocytic maturation (CD11b/Ly6G) in the bone marrow and circulation were performed by flow cytometry. The expression of ANXA1 on tissues was performed by western blotting and on cells from bone marrow and blood by immunocytochemistry. Quantification of IL-17, IL-23, G-CSF, SDF-1α and corticosterone were performed by ELISA. The chemotaxis of neutrophils from the bone marrow and blood was tested in the chemotaxis chamber with filter pore of 8 microns. The phagocytosis of apoptotic neutrophils by bone marrow macrophages was assessed by in vitro assay. To investigate the effects of ACTH in the migration of neutrophils in the inflammatory process, the model employed was air pouch (100 µg/ ml, LPS), and the behavior of circulating leukocytes from animals treated with ACTH were evaluated by intravital microscopy. The results obtained, which are presented in three sections, showed that: 1) neutrophils from the bone marrow and blood expressed ANXA1 in the cytoplasm and membrane, as well as FPR2, constitutively and the expression of both is regulated by GCe. The ANXA1 via FPR2 receptor expressed in bone marrow cells, controls the neutrophilic maturation and traffic of these cells from the bone marrow into the blood. The ANXA1 via interaction to FPR2 controls the clearance of neutrophils from the blood to the bone marrow by modulating the SDF-1α/CXCR4 axis; 2) the administration of ACTH induces neutrophilia and the circulating neutrophils are ANXA1+, CD18+, CD49d+ and CD62L+, showing that the injection of ACTH in vivo alters the phenotype of these cells in the blood. These modifications alter the behavior of neutrophils in the blood, as well as the migration to the air pouch in the presence of inflammation and to the tissue clearance, and these effects may be dependent, at least in part, on inhibition of migration oriented events, as chemotaxis in response to fMLP or SDF-1α were reduced. Further, the clearance of neutrophils is reduced in animals treated with ACTH due to the lower phagocytic and secretory activity of medullary macrophages; 3) Animals treated with RU 38486 and ANXA1-/- mobilize granulocytes from bone marrow into the blood, and from this compartment to the focus of inflammation with higher intensity than that observed in the control group. The axis IL-17/IL-23/G-CSF seems to be involved in granulopoiesis and mobilization of neutrophils into the blood during inflammation, but it is not the target of action of ANXA1 and GCe at this step of inflammatory process. Additionally, it was observed that in the presence of peritonitis, the adhesion molecules, CD49d and CD62L are involved in the migration of neutrophils from the bone marrow into the blood. The results obtained allow concluding that the GCe and ANXA1 are relevant to the granulopoiesis and the traffic of neutrophils from bone marrow under physiological conditions and in the presence of inflammation. Furthermore, together with literature data, the data presented here may suggest the involvement of ANXA1 the GCe in phenotypic plasticity of neutrophils according to the stimuli that are submitted, and may support to understand the new concepts of production, half-life, location and function of neutrophils.

O tráfego de leucócitos é um processo complexo, dependente da ação de inúmeras substâncias químicas, além da perfeita interação celular. Desta forma, este estudo teve como objetivo avaliar a ação dos GCe e da ANXA1 sobre o eixo SDF-1α/CXCR4 e IL-17/IL-23/G-CSF e sobre a expressão de moléculas de adesão CD18, CD49d e CD62L. Foram utilizados camundongos machos Balb/C selvagens (WT) ou ANXA1-/-. As avaliações foram realizadas em condições basais, na presença de altas concentrações de GCe e na vigência de processo inflamatório, induzidos pela administração de ACTH (5 µg/animal, i.p.) ou pela injeção de LPS (100 µg/kg, i.p.), respectivamente, ou na ausência da ação dos GCe, pela ação do RU 38486 (RU, 10 mg/kg, i.p.). A participação da ANXA1 e do receptor FPR2 foi avaliada pelo pré-tratamento com Ac2-26 (1 mg/Kg, i.p.) ou com BOC2 (10 µg/animal, i.p.) durante 4 dias, 1 vez ao dia. A quantificação total e diferencial das células foi realizada em câmara de Neubauer e em esfregaços corados por May-Grunwald ou citometria de fluxo. As quantificações de CXCR2, CXCR4, FPR2, CD18, CD49d, CD62L e maturação granulocítica (CD11b/Ly6G) em células da medula e da circulação foram realizadas por citometria de fluxo. A expressão de ANXA1 nos tecidos do estomago e do baço foi realizada por western blotting e nas células da medula óssea e sangue circulante foi realizada por imunofluorescência. As quantificações de IL-17, IL-23, G-CSF, SDF-1α e corticosterona foram realizadas por ELISA. A quimiotaxia de neutrófilos da medula óssea e sangue periférico foi ensaiada na placa de quimiotaxia com filtro de poro de 8 µm. A fagocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos da medula óssea foi avaliada por ensaio in vitro. Para verificar os efeitos do ACTH na migração de neutrófilos no processo inflamatório, foi empregado o modelo de bolsa de ar (100 µg/mL; LPS); e o comportamento dos leucócitos circulantes de animais tratados com ACTH foi avaliado pela técnica de microscopia intravital. Os resultados obtidos, que estão apresentados em quatro temáticas, mostraram que: 1) neutrófilos da medula óssea e sangue periférico expressam ANXA1 no citoplasma e membrana, bem como o receptor FPR2, constitutivamente, e a expressão de ambos é regulada pelos GCe. A ANXA1, via receptor FPR2 expresso em células da medula óssea, controlam a maturação neutrofílica e o tráfego destas células da medula óssea para o sangue. A ANXA1, via interação ao FPR2, controla o clearance de neutrófilos do sangue para a medula óssea, modulando o eixo SDF-1α/CXCR4; 2) A administração do ACTH causa neutrofilia e os neutrófilos circulantes são ANXA1+, CD18+, CD49d+, CD62L+, mostrando que injeção do ACTH in vivo altera o fenótipo destas células na circulação. Estas modificações alteram o comportamento dos neutrófilos na circulação, bem como a migração para a bolsa de ar na vigência de inflamação e para os tecidos de clearance. Estes efeitos podem ser dependentes, pelo menos em parte, da inibição de migração orientada, já que quimiotaxia frente ao fMLP ou ao SDF-1α estavam reduzidas. Ainda, o clearance de neutrófilos é reduzido em animais tratados com o ACTH pela menor atividade fagocítica e secretora dos macrófagos medulares; 3) Animais tratados com RU 38486 e ANXA1-/- mobilizam granulócitos da medula óssea para o sangue circulante e, deste compartimento para o foco de inflamação com maior intensidade que o observado em animais controles. O eixo IL-17/IL-23/G-CSF parece estar envolvido na granulopoiese e na mobilização de neutrófilos para o sangue durante a inflamação, mas não é alvo de ação da ANXA1 e o GCe nesta etapa do processo inflamatório. Adicionalmente, foi observado que na vigência de peritonite, as moléculas de adesão, CD49d e CD62L estão envolvidas no processo de migração de neutrófilos da medula óssea para o sangue. Os resultados aqui obtidos permitem concluir que os GCe e a ANXA1 são relevantes para granulopoiese e tráfego dos neutrófilos da medula óssea em condições fisiológicas e na vigência de processo inflamatório. Ainda, em conjunto com os dados da literatura, os nossos resultados podem sugerir a participação da ANXA1 dos GCe na plasticidade fenotípica dos neutrófilos de acordo com os estímulos a que são submetidos, e podem auxiliar na compreensão dos novos conceitos sobre a produção, tempo de vida, localização e funções de neutrófilos. / The traffic leukocytes is a complex process dependent on the action of severals chemical mediators, in addition to perfect cell interaction. Therefore, this study aimed to evaluate the effect of GCe and ANXA1 on SDF-1α/CXCR4 and IL-17/IL-23/G-CSF and on the expression of adhesion molecules CD18, CD49d and CD62L. Balb/C wild type and ANXA1-/- male mice were employed. The analysis were performed at physiological conditions, in the presence of high concentrations of GCe and during of inflammatory process induced by ACTH administration (5 µg/animal, i.p.) or LPS injection (100 µg/kg, i.p.), respectively or in the absence of GCe action, by the action of RU 38486 (RU, 10 mg/kg , i.p.). The involvement of the receptor FPR2 and ANXA1 was assessed by pre-treatment with Ac2-26 (1 mg/kg, i.p.) or BOC2 (10 µg/animal, i.p.) for 4 days, once a day. The quantification of total and differential cell was performed in a Neubauer chamber and stained smears by May-Grunwald and flow cytometry. Quantification of expression of CXCR2, CXCR4, FPR2, CD18, CD49d, CD62L and granulocytic maturation (CD11b/Ly6G) in the bone marrow and circulation were performed by flow cytometry. The expression of ANXA1 on tissues was performed by western blotting and on cells from bone marrow and blood by immunocytochemistry. Quantification of IL-17, IL-23, G-CSF, SDF-1α and corticosterone were performed by ELISA. The chemotaxis of neutrophils from the bone marrow and blood was tested in the chemotaxis chamber with filter pore of 8 microns. The phagocytosis of apoptotic neutrophils by bone marrow macrophages was assessed by in vitro assay. To investigate the effects of ACTH in the migration of neutrophils in the inflammatory process, the model employed was air pouch (100 µg/ ml, LPS), and the behavior of circulating leukocytes from animals treated with ACTH were evaluated by intravital microscopy. The results obtained, which are presented in three sections, showed that: 1) neutrophils from the bone marrow and blood expressed ANXA1 in the cytoplasm and membrane, as well as FPR2, constitutively and the expression of both is regulated by GCe. The ANXA1 via FPR2 receptor expressed in bone marrow cells, controls the neutrophilic maturation and traffic of these cells from the bone marrow into the blood. The ANXA1 via interaction to FPR2 controls the clearance of neutrophils from the blood to the bone marrow by modulating the SDF-1α/CXCR4 axis; 2) the administration of ACTH induces neutrophilia and the circulating neutrophils are ANXA1+, CD18+, CD49d+ and CD62L+, showing that the injection of ACTH in vivo alters the phenotype of these cells in the blood. These modifications alter the behavior of neutrophils in the blood, as well as the migration to the air pouch in the presence of inflammation and to the tissue clearance, and these effects may be dependent, at least in part, on inhibition of migration oriented events, as chemotaxis in response to fMLP or SDF-1α were reduced. Further, the clearance of neutrophils is reduced in animals treated with ACTH due to the lower phagocytic and secretory activity of medullary macrophages; 3) Animals treated with RU 38486 and ANXA1-/- mobilize granulocytes from bone marrow into the blood, and from this compartment to the focus of inflammation with higher intensity than that observed in the control group. The axis IL-17/IL-23/G-CSF seems to be involved in granulopoiesis and mobilization of neutrophils into the blood during inflammation, but it is not the target of action of ANXA1 and GCe at this step of inflammatory process. Additionally, it was observed that in the presence of peritonitis, the adhesion molecules, CD49d and CD62L are involved in the migration of neutrophils from the bone marrow into the blood. The results obtained allow concluding that the GCe and ANXA1 are relevant to the granulopoiesis and the traffic of neutrophils from bone marrow under physiological conditions and in the presence of inflammation. Furthermore, together with literature data, the data presented here may suggest the involvement of ANXA1 the GCe in phenotypic plasticity of neutrophils according to the stimuli that are submitted, and may support to understand the new concepts of production, half-life, location and function of neutrophils.

Bases: A antinocicepção induzida por substâncias doces tem sido largamente estudada. Contudo, a investigação dos neurotransmissores envolvidos nesse processo antinociceptivo ainda carece de mais estudos, pois é de extrema importância entender o envolvimento desses neurotransmissores no sistema neural que controla este tipo de antinocicepção. Objetivo: O objetivo deste estudo é clarificar o envolvimento dos sistemas opióide e serotoninérgico na antinocicepção induzida por substância doce. Método: O presente trabalho foi realizado em modelo animal (Rattus norvegicus, Rodentia, Muridae), objetivando investigar se a ingestão crônica de solução de sacarose é seguida de antinocicepção. A latência de retirada de cauda após a aplicação de estímulo nocivo térmico foi medida antes e após esse tratamento no teste de retirada de cauda (provavelmente um reflexo espinal). Não houve diferenças estatisticamente significantes entre os valores de linha basal dos diferentes grupos e foi calculado um índice de analgesia da latência de retirada de cauda antes e depois do tratamento. O envolvimento de opióides endógenos e de serotonina neste processo antinociceptivo foi pesquisado com fármacos antagonistas específicos e não-específicos dos receptores opióides e serotoninérgicos. Resultados: O efeito analgésico da ingestão de sacarose depende da concentração da solução de sacarose e do tempo de duração do consumo da mesma. Naltrexona e metisergida diminuíram a antinocicepção induzida por substâncias doce (após 14 dias de ingestão da sacarose). Estes efeitos foram corroborados pela administração periférica de naloxonazina e cetanserina. Conclusões: Os resultados sugerem o envolvimento de opióides endógenos e serotonina no processo antinociceptivo atualmente estudado. Tudo apontando para a participação de receptores opióides µ1 e serotoninérgicos 5-HT2 na regulação central da antinocicepção induzida por substâncias doces. / Rationale: Sweet substance-induced antinociception has been widely studied, and the investigation of the neurotransmitters involved in the antinociceptive process is an important way for understanding the involvement of neural system controlling this kind of antinociception. Objective: The aim of this study is to investigate the involvement of opioid and serotonergic system in the sweet substance-induces antinociception. Methods: the present work was made in animal model (Rattus norvegicus, Rodentia, Muridae); with the aim of investigating if the chronic intake of sweet substance, such as sucrose, is followed by antinociception. Their tail withdrawal latencies in the tail-flick test (probably a spinal reflex) were measured before and immediately after this treatment. As there was not statistic significant differences between baseline values of different groups, an analgesia index was calculated from the withdrawal latencies before and after treatment. The involvement of endogenous opioid and serotonin in the antinociceptive process was investigated with specific and non-specific pharmacological antagonism on opioid and serotonergic receptors. Results: The analgesic effect of sucrose intake depends on the concentration of sucrose solution and on the time during which the solution is consumed. Naltrexone and methysergide decreased the sweet substance-induced antinociception (post 14 days of sucrose intake). These effects were corroborated by peripheral administration of naloxonazina and ketanserin. Conclusions: The present results suggest the involvement of endogenous opioids and serotonin in the antinociceptive process presently studied. µ1-opioid and 5-HT2 serotonergic receptors may be involved in the central regulation of the sweet substance-produced antinociception.