La voie de signalisation Notch est une signalisation fortement conservée chez les metazoans. Elle régule nombreux processus biologiques, y compris le développement embryonnaire, l'homéostasie tissulaire en particulier dans la décision du destin cellulaire. Largement décrit dans la tumeurigénèse, la voie Notch est aussi un régulateur clé dans l'angiogenèse. De plus en plus d'études montrent que la voie Notch joue un rôle important dans régulation d'angiogenèse tumorale. Par conséquent, divers d'efforts ont été faits pour inhiber la voie canonique de Notch. Jusqu'à aujourd'hui, appart Notch1, d'autre récepteurs Notch ont été très peu étudiés dans l'angiogenèse tumorale. Notch3 exprimé restreint dans le systèm vasculaire, n'a jamais été étudié dans le contexte de l'angiogenès tumorale. Par consequent, l'objectif de ma thèse est d'étudier le rôle de Notch3 dans l'angiogenès tumorale. Ici, nous avons montré une expression abérrant de Notch3 dans les cellules endotheliales tumorales où il présente un effect inattendu. En inhibant Noth3 dans le microenvironnement de la tumeur, nous avons montré que Notch3 limite l'angiogenèse tumorale par sa fonction pro-apoptotique dans les cellules endothéliales tumorales, ce qui entraîne une inhibition de la croissance tumorale. De plus, nous avons constaté que l'expression de JAG1 ont été argumenté dans une fraction des cancers humains. En outre, JAG1 dérivé de la tumeur favorise la survie des cellules endothéliales tumorales en inhibant l'effet pro-apoptotique de Notch3. Nous présentons ici pour la première fois que Notch3 est un récepteur de dépendance induisant une apoptose dans les cellules endothéliales tumorales qui est bloqué par JAG1. Par conséquent, nous montrons que l'effet antitumoral bien documenté médié par l'inhibition de la ?-sécrétase dépend au moins en partie de l'apoptose induite par Notch3 dans les cellules endothéliales / The Notch signalling is a highly conserved signalling which mediates numerous of biological processes, including embryonic development, tissue homeostasis especially in the cell fate decision. Widely implicating in tumorigenesis, the Notch signalling is also a key regulator of angiogenesis. Increasing number of studies showed that, the Notch signalling plays an important role in mediating tumour angiogenesis. Therefore, various efforts have been made to inhibit the canonical Notch pathway. To date, besides Notch1, other Notch receptors were few studied in tumour angiogenesis. Notch3, expressed restrictedly in vascular system, has never been studied in the tumour angiogenesis context. Therefore, the objective of my thesis is to study the role of Notch3 during tumour angiogenesis. Here, we showed that Notch3 is aberrantly expressed in tumour endothelial cells where it presents an unexpected pro-apoptotic effect. By silencing Noth3 in the tumour microenvironment, we showed that Notch3 limits tumour angiogenesis via its pro-apoptotic function in tumour endothelial cells which results in inhibition of tumour growth. In addition, we found that JAG1 is up-regulated in a fraction of human cancers. Furthermore, tumour derived JAG1 favourite the survival of tumour endothelial cells by inhibiting the pro-apoptotic effect of Notch3. We thus present here for the first time that Notch3 as a dependence receptor inducing apoptosis in tumour endothelial cells which is blocked by JAG1. Consequently, we show that the well-documented anti-tumour effect mediated by g-secretase inhibition is at least in part dependent on the apoptosis triggered by Notch3 in endothelial cells

L’endothélium préserve l'homéostasie vasculaire et tissulaire qui contrôle plusieurs processus physiologiques dans les corps humain. Lors de certaines pathologies, l'intégrité vasculaire peut être perturbée par une diversité de médiateurs de perméabilité qui interrompent la fonction barrière de cet épithélium, et provoquer des lésions tissulaires au cours de la progression de la maladie. Par conséquent, l'intégrité de la barrière endothéliale est essentielle pour l'homéostasie vasculaire. Dans le cas de la fièvre hémorragique due à la dengue, de nombreuses voies de signalisation induisent une perméabilité vasculaire qui résulte d'une rupture de la barrière hémato-encéphalique qui, dans certains cas, peuvent permettre la pénétration virale dans le système nerveux central (SNC). La plupart de ces voies de signalisation (y compris le TNF-alpha) sur-activent les enzymes appelées métalloprotéinases matricielles (MMP), qui induisent la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC) et des protéines intercellulaires régissant la perméabilité vasculaire. Parmi ces enzymes, les MMP gélatinolytiques (MMP-9 et MMP-2) sont considérées comme la classe la plus importante de MMP puisqu'elles sont capables de dégrader le collagène de type IV, constituant principal de la MEC, et les jonctions cellulaires PECAM- 1 et VE-cadhérine. Ainsi, dans cette étude, nous avons développé deux approches pour inhiber l'activité de MMP-9 et protéger la perméabilité vasculaire in vitro. Ces approches incluent (i) des antagonistes de MMP-9 conçus in silico, tels que le composée HA048 (ii) des composés lipophénoliques synthétiques dérivés du resvératrol. Ce dernier existe naturellement dans les tiges de raisin, les arachides et plusieurs autres plantes et qui est capable d'inhiber l'expression et l'activité de la MMP-9. Bien que le resvératrol ait plusieurs activités biologiques testées in vitro, son utilisation dans des modèles animaux est limitée en raison de sa faible biodisponibilité, de son métabolisme rapide et de son élimination. Par conséquent, cette étude a trois objectifs principaux. Premièrement, de trouver un nouveau composé capable d'inhiber l'activité de MMP-9 in vitro. Deuxièmement, de vérifier s’il peut protéger l'intégrité de la couche endothéliale dans les HUVEC. Enfin, de passer à des études précliniques sur le modèle de souris dengue afin de vérifier son activité, sa toxicité et sa biodisponibilité. Outre le resvératrol et le SB-3CT (inhibiteur commercial de la MMP-9), nous avons constaté que le resvératrol-acide linoléique oméga 6 (RES-LA), le resvératrol-docosanoïque (RES-C22) et le HA048 ont montré la plus forte activité anti-MMP-9 parmi d'autres composés. Cependant, RES-LA a été préférentiellement choisi par rapport à RES-C22 en raison de sa meilleure solubilité. Par conséquent, nous avons utilisé un nouveau concept de formulation de ces composés en les solubilisant dans un solvant compatible et moins toxique pour des expériences in vivo, un solvant eutectique profond naturel (NADES), composé de 1,2-propanediol:ChCl: eau (1:1:1) (NADES/PCW). Les résultats de la perméabilité vasculaire in vitro ont révélé que les inhibiteurs de la MMP-9 ont diminué la perméabilité endothéliale exacerbée induite par le TNF-α dans les HUVEC, mesurée à la fois en temps réel et en fluorescence. En outre, l'examen microscopique des jonctions cellulaires adhérentes a montré qu’il y avait plus de CD31/PECAM-1 entre les HUVEC traitées à la fois par le TNF-α et les inhibiteurs de la gélatinase par rapport au témoin positif (TNF-alpha).Le mécanisme d'action des lipophénols dérivés du resvératrol a été évalué. Nos résultats ont révélé que les lipophénols dérivés du resvératrol ont inhibé l'expression de la MMP-9 en atténuant la phosphorylation des kinases MAPK ERK1/2 et JNK1/2. / The endothelial barrier preserves the vascular and tissue homeostasis that controls several physiological processes inside the body. In pathologies, vascular integrity could be disrupted by a diverse of permeability mediators that interrupt the barrier function and cause tissue damage during disease progression. Therefore, endothelial barrier integrity is critical for vascular homeostasis. Although the mechanisms leading to vascular leakage have been studied over several past decades, recent approaches have pointed new therapeutic targets in pre-clinical studies. In the pathogenesis of dengue hemorrhagic fever (DHF), many signaling pathways induce vascular permeability that result of disruption of blood brain barrier, that in some cases could allow viral penetration into the central nervous system (CNS). Most of these signaling pathways (including TNF-alpha) activate the overproduction active enzymes called matrix metalloproteinases (MMPs) that induce degradation of the extracellular matrix (ECM) and intercellular proteins governing vascular permeability. Among these enzymes, gelatinolytic MMPs, (MMP-9 and MMP-2), which are considered the most important class of MMPs since they are capable of degrading collagen type-IV, the main constituent of ECM, and cell junctions (PECAM-1 and VE-cadherin). Thus, in this study, we have developed two approaches to inhibit MMP-9 activity and protect the vascular permeability in vitro. Those approaches include, (i) in silico designed MMP-9 antagonists, where we had determined a lead MMP-9 blocker (HA048). The second approach is to synthesize derived lipophenolic compounds from resveratrol, that naturally exists in grape stalks, peanuts, and several other plants, which is capable of inhibiting the expression and activity of active MMP-9 inside the cells. Despite that resveratrol has several biological activities tested in vitro, its use in animal models is limited due to its poor bioavailability, rapid metabolism, and elimination. Therefore, this study has three main goals. First, is to find a novel compound capable of inhibiting MMP-9 activity in vitro. Second, is to verify whether it can preserve the endothelial monolayer integrity. Finally, is to move to the preclinical studies in dengue mouse model to verify its activity in vivo, toxicity, and bioavailability.Besides resveratrol and SB-3CT (commercial MMP-9 inhibitor), we found that resveratrol-linoleic acid, omega-6 (RES-LA), resveratrol-Docosanoic acid (RES-C22) and HA048 (in silico designed inhibitor) have demonstrated the highest MMP-9 inhibitory activity among dozens of synthesized compounds. However, RES-LA was preferably selected over RES-C22 due to for solubility reasons. Moreover, we formulated these compounds in novel solvents that could be compatible and less toxic for in vivo experiments, which is known as natural deep eutectic solvent (NADES) based on 1,2-propanediol:ChCl:water (1:1:1) (NADES/PCW).Results of in vitro vascular permeability revealed that MMP-9 inhibitors have decreased TNF-α induced-exacerbated endothelial permeability in HUVEC, measured in both real-time impedance sensing and fluorescence count. In addition, microscopic examination of cell junction proteins showed that CD31/PECAM-1 were more adherent and attached between HUVEC treated with both TNF-α and gelatinase inhibitors comparing to the positive control (TNF-alpha).The mechanisms of action of resveratrol derived lipophenols were assessed. Our findings revealed that resveratrol derived lipophenols have inhibited MMP-9 expression by attenuating the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) and c-Jun N-terminal kinases (JNK) mitogen-activated protein kinases (MAPK).

L'endothélium artériel pulmonaire joue un rôle déterminant dans la régulation du tonus vasomoteur en libérant des substances vasodilatatrices et vasoconstrictrices. Toute perturbation des fonctions endothéliales entraîne une perte de l'équilibre physiologique très finement régulé entre réponse vasoconstrictrice et vasodilatatrice, avec perte conjointe du contrôle de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires et de l'effet antiagrégant plaquettaire. Ces modifications conduisent à un remodelage du lit vasculaire pulmonaire avec une augmentation des résistances vasculaires parfois à l'origine d'une hypertension pulmonaire (HTP) irréversible. Le rôle de l'hypoxémie n'y est pas exclusif. Le réseau bronchique est soumis quant à lui à des agressions physiques par les particules inhalées. Celles-ci peuvent entraîner un remodelage bronchique et une perturbation du tonus bronchique et de la broncho-réactivité, dont les médiateurs peuvent être en partie partagés par la dysfonction vasculaire.Le but de ce travail était d'évaluer dans un premier temps l'existence d'une dysfonction endothéliale, en tant que précurseur potentiel d'une HTP, dans deux modèles de bronchopathies chroniques à des stades opposés de la sévérité de l'atteinte respiratoire : la mucoviscidose terminale et le tabagisme avec peu ou pas d'impact sur la fonction respiratoire.Nous avons ainsi montré à partir d'explants pulmonaires qu'une dysfonction endothéliale était fréquente au cours de la mucoviscidose au stade pré-greffe et qu'elle était au-moins en partie liée à une surexpression vasculaire pulmonaire de l'ET-1 et de ses récepteurs ET-A.Nous avons montré par ailleurs que 25% environ des sujets fumeurs à fonction respiratoire normale ou peu altérée présentaient également une telle dysfonction. Nous en avons étudié ici deux voies physiopathologiques potentielles, celle de l'ET-1 et celle qui gouverne la synthèse du NO : la balance NO Synthases (NOS)/arginases. Nous avons mis en évidence une surexpression des récepteurs ET-A de l'ET-1 chez les sujets avec dysfonction ainsi qu'une corrélation inverse entre cette expression et la réponse vasoactive à l'Acétylcholine (Ach). Par ailleurs, si le NO a entre autres un effet anti-prolifératif sur les cellules musculaires lisses, la voie des arginases - système enzymatique compétitif avec les NOS - mène quant à elle à la réparation et au remodelage. Nous avons étudié l'expression vasculaire de ces différentes enzymes ainsi que l'effet pharmacologique d'inhibiteurs des NOS ou des arginases sur la réponse vasoactive à l'Ach. Nous avons montré qu'il n'existait pas de déficit d'expression des NOS et qu'il ne semblait pas y avoir d'effet délétère des arginases dans la dysfonction endothéliale dans ce modèle.Parallèlement aux mécanismes sous-tendant le remodelage vasculaire au cours du tabagisme nous avons recherché l'existence d'une « dysfonction » bronchique chez ces fumeurs, qui pourrait précéder le remodelage bronchique qui les caractérise. La présence d'une hyperréactivité bronchique est un marqueur prédictif de remodelage des voies aériennes et de l'obstruction bronchique qui en découle. Le rôle de la balance NOS/arginases dans le contrôle du tonus bronchique est encore méconnu. Notre premier objectif était d'évaluer l'expression de cette balance enzymatique dans le tissu bronchique de ces patients et le second d'étudier les effets de l'inhibition des NOS et des arginases sur la réponse bronchoconstrictrice à l'Ach. Nous avons montré qu'une augmentation d'expression bronchique de la NOS 2 chez les fumeurs était impliquée dans la régulation du tonus bronchique et dans l'obstruction bronchique, tandis qu'une augmentation de l'activité des arginases était impliquée dans la sensibilité bronchique. / Pulmonary arteriel endothelium has a key role in the regulation of vascular tone by the release of dilating and constrictive mediators. Impairment of endothlium functions leads to a loss of the physiological equilibrium between vasoconstriction and vasodilation, together with the loss of vascular smooth muscle cells (SMC) proliferation. These alterations induce pulmonary vascular remodeling and elevation of vascular resistance which can lead to an irreversible pulmonary hypertension (PH). The role of hypoxemia is not exclusive. Airways are exposed to physical aggressions by inhaled particles, which can lead to bronchial remodeling and impaired bronchial tone and reactivity, the mediators of which can be partly shared by endothelial dysfunction.Our goal was to evaluate the existence of endothelial dysfunction as a precursor of PH in 2 models of chronic bronchopathy of opposite stages of disease severity: end-stage cystic fibrosis (CF) and tobacco smoking with or without impaired lung function. We showed that in end-stage CF pulmonary explants, endothelial dysfunction is frequent and that it was at least partly due to a vascular upregulation of the endothelin (ET)-1 pathway.Furthermore, approximately ¼ of smokers with normal or poorly impaired lung function also displayed a similar endothelial dysfunction. We studied therein 2 potential physiopathological pathways, that of ET-1 and that which governs nitric oxide (NO) synthesis: the NO synthases (NOS)/arginases balance. We showed an upregulation of ET-A receptor expression and an inverse correlation between this expression and the vasoactive response to acetylcholine (Ach). If NO has an anti mitogenic effect on SMC, the arginases pathway-competitive with the NOS- leads to tissue repair and remodeling.We studied the vascular expression of these enzymes and the pharmacological effect of NOS and arginases inhibitors on response to Ach. We showed that the expression of NOS was not deficient and that arginases did not seem to have a deleterious effect on endothelial function in this model.Concomitantly to these mechanisms leading to vascular remodeling, wr searched for a bronchial dysfunction in smokers which could antecede bronchial remodeling, a well known feature of tobacco smoking. Bronchial hyperresponsiveness is a predictive marker of airway remodeling and subsequent bronchial obstruction. The role of the NOS/arginases pathway in the control of bronchial tone is still unknown. We evaluated the bronchial expression of the NOS/arginases balance in smokers and the effects of NOS and arginases inhibitors on bronchoconstrictive response to Ach. We found that an upregulation of NOS2 expression in COPD patients is involved in airway tone regulation and functional airflow limitation, whereas increased arginase activity is involved in airway sensitivity.

Nos travaux montrent qu’au cours de la fibrillation atriale (FA), les microparticules (MP) reflètent et contribuent à un état d’hypercoagulabilité et pro-inflammatoire. Leurs concentrations similaires dans les deux oreillettes de patients en FA témoignent d’une absence de différence de statut pro-thrombotique entre ces deux cavités cardiaques. Au cours des procédures d’ablation de FA, les concentrations de MP évoluent parallèlement à l’augmentation de l’activation cellulaire et plaquettaire. Nous avons également montré dans l'altération tissulaire des oreillettes en FA, l'importance de la sénescence qui évolue avec la progression du trouble du rythme. Nous avons caractérisé un modèle cellulaire de sénescence réplicative de cellules endothéliales auriculaires de porc permettant d'identifier l'apparition d'un phénotype pro-thrombotique, pro-inflammatoire, pro-adhésif et de mieux comprendre la physiologie de la cellule endothéliale atriale sénescente et le rôle majeur du système rénine-angiotensine dans ces mécanismes. / Our data evidence that during atrial fibrillation (AF), microparticles (MP) contribute to an enhanced hypercoagulable and pro-inflammatory state. Similar concentrations of MP measured in left and right atria of AF patients highlight the absence of chamber-specific enhanced thrombogenic status. During AF ablation procedures, MP concentrations progress in parallel with cell and platelet activation. We also showed that AF progression is strongly related to human atrial senescence burden pointing toward a possible network that links in human atrium, senescence burden, endothelial dysfunction, thrombogenicity and atrial remodeling. We also developed a model of left atrium endothelial cell replicative senescence providing compelling evidences indicating that atrial endothelial senescence promotes thrombogenicity, inflammation and proteolysis. These data underline the major role of renin-angiotensin system in endothelial atrial cell senescence.

L’hypothalamus médiobasal contient de nombreux noyaux régulant l’homéostasie énergétique en réponse aux variations des signaux métaboliques périphériques, telles que les nutriments et les hormones, l’informant de l’état énergétique de l’individu. Parmi ces noyaux, le noyau arqué hypothalamique (NA) est considéré comme le noyau clé de la régulation de la prise alimentaire. En effet, il est capable de recevoir et d’intégrer les informations métaboliques périphériques, pour ensuite les relayer vers les autres noyaux hypothalamiques régulant la prise alimentaire. Dans ce contexte, l’accès des molécules périphériques au NA est une étape importante dans la régulation de la prise alimentaire. L’organisation des interfaces sang/cerveau à ce niveau est d’ailleurs très particulière, suggérant une régulation spécifique de l’accès des molécules périphériques vers le NA. En effet, deux types de vaisseaux sont retrouvés dans cette région cérébrale : 1- les vaisseaux de la barrière hématoencéphalique (BHE) dans le NA et 2- les vaisseaux fenêtrés dans l’éminence médiane (EM), un organe circumventriculaire (OCV) adjacent au NA. Alors que les vaisseaux de la BHE présentent des propriétés de barrière et régulent les échanges sang/NA, les vaisseaux de l’EM possèdent de nombreuses fenestrations facilitant les échanges sang/EM. Ces deux types de vaisseaux ont la particularité d’être contactés par des cellules épendymaires hautement spécialisées formant le bas du 3ème ventricule. Ces cellules, appelées « tanycytes », expriment des protéines de jonctions serrées suggérant leur participation à la régulation des échanges sang/cerveau dans cette région cérébrale. En effet, des études menées au sein du laboratoire ont montré que les tanycytes de l’EM, contactant les vaisseaux fenêtrés, expriment des protéines de jonctions serrées (JS) organisées en ceinture continue autour de leur pôle apical. Ces JS créent ainsi un épendyme étanche qui limite les échanges EM/LCR. A l’inverse, les tanycytes du NA, contactant les vaisseaux de la BHE, expriment des protéines de JS non organisées en leur pôle apical. L’épendyme du NA est ainsi perméable et favorise les échanges LCR/NA. Le but de mon travail de thèse a donc été de comprendre, en prenant en compte tous ces éléments -c’est-à-dire la présence de vaisseaux fenêtrés, de vaisseaux de la BHE et des tanycytes -, comment est organisé l’accès des signaux métaboliques périphériques vers le NA et si cet accès pouvait être modulé afin de contrôler l’homéostasie énergétique. Nos expériences ont montré que, chez la souris mâle adulte, une glucopénie induite par le jeûne ou par le 2-desoxyglucose induisait une réorganisation structurale des vaisseaux et de l’épendyme au niveau de l’EM et du NA, modifiant ainsi les échanges sang/cerveau. En effet, chez ces souris, nous avons observé une augmentation du nombre de vaisseaux fenêtrés au niveau de l’EM et du NA, ainsi qu’une réorganisation fonctionnelle des protéines de JS au niveau du ventricule : les tanycytes du NA, contactant des vaisseaux fenêtrés à présent, réorganisent leurs protéines de jonctions serrées (JS) afin d’assurer l’homéostasie cérébrale. Ces réorganisations induisent alors un meilleur accès des molécules périphériques vers le NA. De plus, nos résultats ont montré que cette plasticité est induite par le VEGF-A, produit localement par les tanycytes. En effet, la neutralisation du VEGF-A bloque la plasticité de l’EM/NA induite par l’hypoglycémie et perturbent la réponse physiologique hyperphagique lors de la réalimentation. Enfin, nos données supplémentaires indiquent que cette plasticité de l’EM/NA est conservée dans différents modèles alimentaires et se produit également au cours de la journée, suggérant son implication dans le contrôle circadien du comportement alimentaire. / The mediobasal hypothalamus contains numerous nuclei regulating energy homeostasis in response to peripheral metabolic signals. Among these nuclei, the arcuate nucleus of the hypothalamus (ARH) is considered to be a critical component of the neural circuits regulating energy balance. Indeed, the ARH is able to integrate the metabolic information carried by nutrients and peripheral hormones, and to transmit their message to secondary nuclei regulating food intake. Therefore, the delivery of peripheral molecules conveying metabolic information to the ARH is a critical step in the regulation of food intake. At the level of the ARH, the organization of blood-brain interface is indeed peculiar. Both the vessels of the blood brain barrier (BBB) and the fenestrated vessels of the median eminence (ME), a circumventricular organ adjacent to the ARH, represent two pathways by which peripheral molecules may reach the ARH. While BBB vessels possess barrier properties restricting the access of peripheral molecules to the ARH, the vessels in the ME possess numerous fenestrations facilitating blood-brain exchanges. These two types of vessels are contacted by specialized ependymal cells lining the floor of the 3rd ventricle called tanycytes. Tanycytes express tight junction (TJ) proteins providing a putative role in the regulation of blood/brain exchanges. While ME tanycytes contact the fenestrated vessels which lie in the ME, they express TJ proteins organized as a continuous belt around their apical pole, creating a tight ependyma limiting ME/cerebrospinal fluid exchanges. In contrast, ARH tanycytes contact BBB vessels and express TJ proteins in a disorganized pattern thus creating a permeable ependyma allowing CSF/ARH exchanges. In the following studies we wished to examine how peripheral signals may reach the ARH through this peculiar blood-brain interface. Moreover, we wished to determine whether the blood-brain interface undergoes dynamic remodeling according to the energetic status of individual. To these aims the plasticity of the BBB vessels, fenestrated vessels of the ME, and tanycytes were analyzed under various metabolic challenges. Our studies show that both fasting- or 2-deoxyglucose-induced glucopenia induce vascular and ependymal reorganization in the ME and the ARH. This reorganization is characterized by an increase in the number of fenestrated vessels in the ME and in the ARH, and a reorganization of TJ proteins in ARH tanycytes, and led to improved access of peripheral molecules to the ARH. Furthermore, our results reveal that VEGF-A expression in tanycytes modulates the plasticity at the blood/brain interface. Indeed, the neutralization of VEGF signaling blocks fasting-induced barrier remodeling and significantly impairs the physiological response to refeeding. Finally, our supplementary results show that the ME-ARH reorganization is also observed in mice under different diet, as well as implicated in the circadian regulation of food intake. Strikingly, the ME-ARH organization is disturbed in diet-induced obese mice, which could be the origin of hormonal resistances observed in these mice. Altogether, our results suggest a new concept in the regulation of the food intake: peripheral glucose modulates blood/brain interface in the ME through a VEGF-dependent mechanism to improve the access of the metabolic signals towards the ARH. As other circumventricular organs possess a similar organization, characterized by fenestrated vessels and a tanycyte barrier, these exciting results pave the way to for future studies examining the remodeling of the blood-brain interface and its role in other neuroendocrine processes.

Les cellules endothéliales (CE) qui tapissent la surface luminale des vaisseaux sanguins sont sensibles aux variations des contraintes hémodynamiques engendrées par le flux sanguin comme les forces de cisaillements (FC). Altérer les mécanismes qui détectent les FC pourrait compromettre l’intégrité des CE entrainant une dysfonction endothéliale et le développement de l'athérosclérose, qui reste la cause majeure des pathologies cardiovasculaires. L'athérosclérose se développe initialement au niveau des embranchements et des courbures des vaisseaux, au niveau de territoires vasculaires où les FC sont faibles et où les CE présentent un phénotype «pro-athérogène». Dans ce contexte physiopathologique, mon projet de thèse cherche à identifier un nouveau mécanisme qui pourrait retarder le développement des plaques d’athéromes au niveau des régions vasculaires qualifiées de «pro-athérogènes» où les FC sont faibles. De façon intéressante le cil primaire (CP), protrusion membranaire présente à la surface de la CE, serait capable d’intégrer ces faibles FC. En réponse à ces forces, cet organelle cellulaire pourrait activer des voies de signalisation protectrices nécessaires pour contrebalancer les mécanismes de dysfonction endothéliale. Ainsi, bloquer l'assemblage et/ou la fonction du CP à la surface des CE pourrait participer à l'accélération du processus athéromateux. Récemment, des études ont établi une communication à double sens entre le CP et l'autophagie en réponse aux faibles FC. Parmi les acteurs de signalisation impliqués dans l'autophagie, les phosphoinositide 3-kinases (PI3K), enzymes clés impliquées dans la production de 3-phosphoinositides (3-PI), pourraient être d'un intérêt majeur. En effet, le PI(3)P, 3-PI produit par les PI3K de classe II et de classe III, est impliqué dans la nucléation de la vésicule d’autophagie. Bien que VPS34 (unique PI3K de classe III) soit décrite comme la principale isoforme de PI3K capable de réguler l'autophagie, l'implication de l’isoforme alpha des PI3K de classe II vient juste d’être caractérisée. De façon originale, la PI3KCIIalpha a également été identifiée comme un régulateur majeur de la biogenèse du CP via la synthèse de PI(3)P dans les fibroblastes embryonnaires et dans les cellules épithéliales rénales. Ainsi, l’ensemble de ces données nous ont amené à étudier la PI3KCIIα au niveau de l'interaction entre le CP et l’autophagie dans les CE. Mon travail a particulièrement mis à jour le rôle central de cette enzyme dans le maintien d’une signalisation protectrice essentielle pour garantir la fonction endothéliale. Mon projet de thèse propose d’identifier les mécanismes moléculaires contrôlant l'interaction entre le CP et l’autophagie in vitro dans les HUVEC et le rôle de la PI3KCIIα dans un contexte de FC in vivo dans des souris ApoE-/- capables de développer spontanément des plaques d’athérome. Mes résultats indiquent que la délétion de la PI3KCIIα abolit la biogénèse du CP et réduit le flux autophagique dans les HUVEC. En utilisant un modèle de souris athéromateuses invalidé pour la PI3KCIIα (ApoE-/- PI3KCIIα+/-), mon travail montre que l'absence de l’interaction entre le CP et l’autophagie in vivo pourrait participer à la progression des plaques d'athérome dans les régions vasculaires où les FC sont faibles. Enfin, nos résultats démontrent qu’en absence de la PI3KCIIα et de l'interaction entre le CP et l’autophagie, les CE de ces zones pro-athérogènes ne sont plus capables de réguler leur morphologie, suggérant que ces cellules perdent leur capacité d’adaptation aux faibles FC. En étudiant l’interaction entre l’autophagie et le CP dans les CE, mon projet de thèse permettra une meilleure compréhension des fonctions biologiques contrôlées par les FC dans ces cellules et offrira de nouvelles perspectives dans l’identification de mécanismes moléculaires originaux impliqués dans les premières étapes du développement de la plaque d'athérome. / Endothelial cells (EC) are highly responsive to changes in hemodynamic shear stress (SS) that drags the vessel luminal surface. Altering the mechanisms that detect SS on EC could compromise its integrity leading to the initiation of endothelial dysfunction and the development of atherosclerosis, the underlying cause of coronary artery disease (CAD). In arterial tree, atherosclerosis develops in a pattern that correlates with low shear stress (SS) localized with branches and curvatures where EC present an “atheroprone” phenotype. In this context, my PhD project proposes to identify novel mechanism in atheroprone territories that could delay atherogenic response induced by low SS. Very interestingly, primary cilium (PC) that protrudes from EC surface was shown to integrate these low SS forces and relay protective signaling pathways in order to counteract EC dysfunction. Thus, we hypothesized that blocking PC assembly and/or functions could participate to the acceleration of atheroma plaque progression. Recent findings links PC with autophagy as an important crosstalk in response to low SS. Among the signaling module involved in autophagy, phosphoinositide 3-kinases (PI3K) which are key enzymes involved in 3-phosphoinositides (3-PI) production, could be of major interest. Indeed, a critical 3-PI signaling involved in the nucleation of autophagic vesicle is PI(3)P, a product of class II and class III PI3K. Although the class III PI3K VPS34 is largely described as a master regulator of autophagy, the implication of class II PI3K is less characterized. Meanwhile, PI3KCII was also clearly identified in embryonic fibroblast and renal epithelial cell as a regulator of PC biogenesis via PI(3)P synthesis. Altogether, these data led us to investigate the role of PI3KCIIα as an essential protective signaling hub of EC through PC/autophagy interplay. My PhD project defines more specifically the molecular mechanisms controlling PC/autophagy interplay in vitro in HUVEC and the role of PI3KCIIα in fluid flow context in vivo in ApoE-/- atherosclerotic animal model. My results indicate that deletion of PI3KCIIα abrogated PC biogenesis and decreased autophagic flux in HUVEC. Using a mice model deleted for PI3KCIIα prone to atherosclerosis (ApoE-/-PI3KCII+/-), my work reveals that absence of PC/autophagy interplay in vivo could participate to atheroma plaques progression in low SS parts of the arterial tree. Finally, our data support the idea that EC of atheroprone areas were not able to regulate their morphology in absence of PI3KCIIα contributing to a defect in adaptation to low SS in absence of PC/autophagy interplay. By connecting autophagy and PC, my PhD project improve our understanding of the biological functions of EC controlled by SS and open new advances in the comprehension of molecular mechanisms involved in the first steps of atheroma plaque development.

La résistance à l’insuline joue un rôle dans le développement de l’obésité, du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires. Cette étude avait pour but de caractériser les dérèglements vasculaires et métaboliques chez le rat insulino-résistant nourri avec un régime HFHS (high fat high sucrose). La sensibilité à l’insuline, la fonction endothéliale et l’expression de la protéine eNOS (endothelial nitric oxide synthase) ont été étudiées. Les résultats démontrent que le régime HFHS entraînerait une altération de la vasodilatation associée à une réduction de l’expression de eNOS dans les muscles squelettiques et l’aorte thoracique. De plus, une diminution de la biodisponibilité du NO (monoxyde d’azote) a été observée chez les rats HFHS lié à une augmentation des nitrotyrosines et de l’endothéline. Cette étude démontre que la protéine eNOS est importante dans le développement des maladies vasculaires et métaboliques et qu’il existe une interaction gène-environnement dans la régulation du NO. / Insulin resistance (IR) plays a role in the development of obesity, type 2 diabetes and cardiovascular diseases. This study was initiated to characterize vascular and metabolic dysregulations in a rat model with IR fed a high fat high sucrose diet (HFHS). Insulin sensitivity, endothelial function and eNOS (endothelial nitric oxide synthase) gene expression were studied. The results indiquate that the HFHS diet induce an alteration of the vasodilation associated with a reduction of eNOS protein expression in skeletal muscles and thoracic aorta. Also, a reduction of NO (nitric oxide) bioavailability was observed, linked with an augmentation of nitrotyrosine and endothelin. This study show that eNOS is crucial in the development of metabolic and vascular diseases and that there is a geneenvironnement interaction in NO regulation.

Le contrôle de la transparence de la cornée dépend de l'intégrité de l'endothélium cornéen mono-stratifié qui est classiquement considéré dès la naissance, dépourvu de capacité de régénération chez l'homme. Dans des conditions pathologiques conduisant à la cécité par œdème cornéen, les pertes significatives en cellules endothéliales (CE) ne sont pas remplacée efficacement, ce qui signifie que ni de nouvelles CE provenant de cellules souches (CS), ni la division des cellules voisines des lésions ne peuvent contribuer à la régénération endothéliale. Toutefois, plusieurs travaux ont prouvé depuis 25 ans que les CE possédaient une capacité proliférative résiduelle ex vivo et deux équipes ont suggéré l'existence de CS ou de progéniteurs à la périphérie de l'endothélium cornéen. Dans notre travail de thèse, nous avons tout d'abord optimisé, en la systématisant, une technique d'immunomarquage spécialement adaptée à l'endothélium cornéen intact de cornées montées à plat. A l'issue de ces développements, nous disposons de protocoles simples de fixation à température optimale et de démasquages antigéniques susceptibles de permettre la révélation de nombreuses protéines. A partir d'une importante série de cornées humaines non conservées et d'autres conservées en organoculture, et grâce à cet outil désormais efficace, nous avons étudié le cycle cellulaire des CE et la localisation de potentielles CS sur l'endothélium cornéen humaine. Nos résultats démontrent que dans ces conditions, les CE expriment de façon homogène des régulateurs positifs (PCNA, MCM2, cycline D1, cycline E et cycline A) et des régulateurs négatifs du cycle cellulaire (P16, P27); certaines particularités ont par ailleurs pu être décrites de façon innovante, comme la localisation cytoplasmique diffuse de MCM2, paranucléaire de la cycline D1, l'absence de P21. L'ensemble des marquages pourrait suggérer que les CE sont arrêtées en fin de G1, après le point de restriction et que de nombreux mécanismes de réparation de l'ADN sont mis en jeux dans les CE exposées à un stress oxydant important tout au long de l'existence. Nous avons identifié une nouvelle organisation de la micro-anatomie de la périphérie et de l'extrême périphérie de l'endothélium où des cellules regroupées en multiples clusters pluristratifiés semblent alimenter des colonnes de CE radiaires longues d'un millimètre. Ces éléments, associés à l'observation d'une moindre différenciation et d'une compétence proliférative plus élevés en périphérie suggèrent un nouveau modèle d'homéostasie endothéliale humaine in vivo: toute la vie, des CS périphériques alimentent de façon très lente la périphérie cornéenne en CE qui migrent de façon centripète pour assurer la stabilité du centre cornéen dont les propriétés optiques primordiales sont sous-tendues par un endothélium qui ne perd que 0,6% de CE par an. A la différence de l'épithélium cornéen, ce système ne peut être accéléré lors de circonstances pathologiques. Les perspectives de nos travaux sont désormais d'essayer d'isoler de l'extrême périphérie les CS endothéliales ou les progéniteurs et de les cultiver en recréant un microenvironnement favorable. La possibilité de produire un grand nombre de CE in vitre non pas à partir de CE sénescentes prélevées sur la totalité de l'endothélium comme cela a été tenté par la passé, mais cette fois à partir de CS ou des progéniteurs ouvriraient la voie d'une véritable thérapie cellulaire endothéliale. L'enrichissement des greffons pendant la durée de leur conservation à la banque de cornée pourrait constituer une première étape majeure avant d'envisager créer de novo un endothélium sur un support greffable pour une greffe endothéliale du 3e type qui deviendrait ainsi enfin indépendante des aléas de la découpe du greffon. Enfin, l'ïdentification de la CS endothéliale et de son microenvironnement permettra aussi d'envisager une thérapie cellulaire in vivo pour traiter les stades précoces des pathologies endothéliales cornéennes

Effet de l’atorvastatine sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à l’hypertrophie ventriculaire gauche dans un modèle porcin Forcillo J, Aubin MC, Horn A, Shi YF, Carrier M, Tardif JC, Perrault LP Introduction: L’atorvastatine par ses effets pléiotropiques pourrait limiter la dysfonction endothéliale associée au développement de l’HVG. Méthodologie : Un cerclage de l’aorte ascendante pendant 2 mois entraîne le développement d’HVG et les groupes ont été traités avec atorvastatine 40 ou 80 mg de 60 à 90 jours. L’HVG est confirmée par échographie. La réactivité vasculaire est évaluée en chambres d’organe, la fonction endothéliale par la quantification de la GMPc et des nitrites/nitrates plasmatiques. Le stress oxydant est mesuré par les niveaux d’ANG II et de la carbonylation des protéines. Résultats : Après 60 et 90 j de cerclage, l’HVG est observée chez tous ces groupes. Les courbes concentrations-réponse des anneaux des artères coronaires épicardiques des groupes traités avec l’atorvastatine 40 et 80 mg pour 30 et 60 jours n’ont démontré aucune amélioration des relaxations dépendantes de l’endothélium. Une exacerbation significative de la dysfonction endothéliale a été observée. Les niveaux vasculaires de GMPc sont significativement diminués dans le groupe sans cerclage traité 60 d et ceux d’ANG II sont fortement augmentés chez ce dernier groupe ainsi que le groupe traité avec 80 mg pour 30 jours par rapport aux contrôles. L’expression de la carbonylation des protéines est augmentée dans le groupe témoin traité avec atorvastatine 80 mg, reflétant une augmentation du stress oxydant. Conclusion : L’administration d’atorvastatine ne prévient pas le développement de l’HVG ni la dysfonction endothéliale dans notre modèle. Au contraire l’atorvastatine à haute dose a un effet toxique sur les artères coronaires épicardiques en augmentant la dysfonction endothéliale. / Effect of atorvastatin on endothelial dysfunction of epicardial coronary arteries associated with left ventricular hypertrophy in a porcine model. Forcillo J, Aubin MC, Horn A, Shi YF, Carrier M, Tardif JC, Perrault LP Background: Atorvastatin, through pleiotropic effects, may prevent or reverse the endothelial dysfunction associated with LVH. Methods: After performing a banding of the ascending aorta for 2 months leading to the development of LVH, groups have been treated with atorvastatin 40 or 80 mg for 60 and 90 day periods. LVH was evaluated by echocardiographic studies. Vascular reactivity studies were performed in organ chambers. In vitro endothelial function was evaluated by plasmatic nitrites/nitrates, the degradations products of nitric oxide, and cGMP quantification. To quantify and qualify oxidative stress, protein carbonyl and angiotensin II levels were assessed. Results: Following 60 and 90 days of aortic banding, the development of LVH was observed in these groups. Concentration-response curves from rings of epicardial coronary arteries of groups treated with atorvastatin 40 and 80 mg for 30 and 60 days showed a significant decrease of endothelium-dependent relaxations with worsening of the endothelial dysfunction. Levels of cGMP were significantly decreased in the 60 days treated sham group and levels of ANG II were increased in the latter and also in the 90 days banded groups treated with 80 mg for 30 days compared to controls. The expression of protein carbonyl increased in the sham group treated with atorvastatin 80 mg compatible with an increase in oxidative stress. Conclusion: The administration of atorvastatin does not limit the development of LVH nor the endothelial dysfunction in our model. On the opposite, atorvastatin at a high dose has a toxic effect on epicardial coronary arteries by exacerbating the endothelial dysfunction.

Bien que l’environnement intra-utérin défavorable soit associé à des conditions pathologiques à l’âge adulte, les mécanismes mis en place in utero ne sont pas encore élucidés. Nous avons établi un modèle de restriction de croissance intra-utérine (RCIU) en donnant une diète faible en sodium à la rate pendant la dernière semaine de gestation. Ce modèle se caractérise par une diminution de perfusion placentaire et une redistribution du flot sanguin, favorisant l’irrigation des organes nobles (cœur et cerveau) au détriment du rein fœtal. De plus, l’expression rénale du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) est diminuée chez le fœtus. L’hypothèse de travail est que la néoglucogenèse hépatique et rénale augmente chez les fœtus RCIU afin de compenser la diminution de perfusion placentaire, et que l’expression rénale des récepteurs de VEGF (Flt-1 et Flk-1) est altérée à la suite de la redistribution du flot sanguin. Nos objectifs étaient de comparer l’expression protéique des enzymes de la néoglucogenèse et des récepteurs de VEGF entre les fœtus témoins et RCIU. L’aldolase B, la fructose-1,6-biphosphatase et la glucose-6-phosphatase augmentent dans les reins de fœtus RCIU par rapport aux témoins alors qu’aucun changement n’est observé dans le foie. De plus, l’expression de ces enzymes est différente selon le sexe du fœtus. Une diminution de Flt-1 est notée dans les reins de fœtus RCIU. Nos résultats démontrent que des adaptations surviennent chez le fœtus à la suite d’une insulte intra-utérine favorisant sa survie mais ayant des conséquences telles que la dysfonction rénale observée chez les adultes de ce modèle animal. À long terme, ces travaux pourront permettre d’entrevoir des avenues pour mieux identifier les approches de prévention lors de naissance à la suite d’une RCIU. / An adverse intrauterine environment is associated with several pathological conditions at adult age, however, the mechanisms underlying such a link remain to be elucidated. Feeding a low-sodium diet to dams during the last week of gestation consistently resulted in giving birth to intrauterine growth restriction (IUGR) offsprings. The present model is characterized by a reduced placental perfusion and a redistribution of a preferential blood flow to the brain and heart at the expense of the kidney. Moreover, renal expression of the vascular endothelial growth factor (VEGF) is decreased in the IUGR fetuses. In this view, we hypothesize that the hepatic and renal gluconeogenesis is increased in the IUGR fetus in order to compensate the diminished placental perfusion, and the renal expression of VEGF receptors (Flt-1 and Flk-1) is altered in response to the redistribution of the blood flow. The specific aim of this study was to compare the protein expression of gluconeogenic enzymes and VEGF receptors between IUGR and control fetuses. Aldolase B, fructose-1,6- biphosphatase and glucose-6-phosphatase were significantly increased in the IUGR fetal kidneys compared to controls. However, gluconeogenic enzymes did not show any significant change in the IUGR liver. The fetal sex had an impact on the enzymes expression. A decreased expression of Flt-1 was also noted in the kidneys of the IUGR fetuses. Our results pointed out alterations in the fetal life that may be, in a way, essentiel for the survival of the fetus, but somehow, responsible for many pathological consequences at adult age, as the renal dysfunction observed in the present model. For the long term, this work may lead to many future perspectives helping to prevent several diseases, such as hypertension or diabetes for an IUGR case.