Enterococcus são cocos gram-positivos que ocorrem isolados, aos pares (diplococos) ou em cadeias e pertencem à microbiota intestinal de uma grande variedade de hospedeiros, de mamíferos a insetos. Enterococcus foram originalmente considerados organismos de pouca importância clínica, mas têm se revelado importantes patógenos nosocomiais. O fato dos Enterococcus possuírem formas de resistência intrínseca e adquirida a vários antibióticos dificulta o tratamento de infecções causadas por eles. Enterococcus faecalis é geralmente a espécie predominante entre os enterococos isolados, sendo de 80% a 90% das amostras clínicas. O surgimento de Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE- do inglês vancomycin resistant enterococci) reduziu significativamente as opções de tratamento. O objetivo deste estudo foi identificar e comparar amostras de E. faecalis resistentes à vancomicina (VREfs) isolados em pacientes nos anos de 2009 e 2011, durante um programa de vigilância no Hospital Risoleta Tolentino Neves, em Belo Horizonte, MG. A identificação das espécies foi feita por multiplex-PCR com primers espécie-específicos e os E. faecalis foram selecionados para estudo. Foram realizadas a pesquisa da presença dos genes elrA, cylLL, esp e gelE, a determinação do genótipo responsável pela resistência e a caracterização do transposon que contém o gene de resistência, todos por meio de PCR. Foi também realizada a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de acordo com o CLSI (2013) para vancomicina, linezolida, tigeciclina e daptomicina e testes para resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Por fim, a tipagem das amostras foi feita através de eletroforese em campo pulsado (PFGE- do inglês Pulsed Field Gel Eletroforesis) e MLST (Multilocus sequence typing). Foi encontrado que 22,2% dos VRE isolados em 2009 e 61,7% dos isolados em 2011 pertencem à espécie E. faecalis e estes foram utilizados no estudo. Houve surgimento de resistência à tigeciclina nos isolados de 2011, sendo 10 isolados resistentes, logo após o início do uso deste antimicrobiano no hospital. Foi encontrado um isolado de 2011 com resistência intermediária à linezolida. Todos os isolados foram sensíveis à daptomicina e altamente resistentes à vancomicina, com CIM maior que 256 μg/mL. Essa alta resistência à vancomicina é condizente com o genótipo Vana, encontrado em todas as amostras. O perfil de virulência prevalente nos VREfs em 2009 era elrA+gelE+, sendo dos pulsotipos A1 e A4 e ST103. Apenas um isolado de 2009, com pulsotipo A1 apresentou o perfil de virulência cyl+elrA+gelE+. Em 2011, o perfil de virulência prevalente foi cyl+esp+elrA+gelE+, sendo que os 12 isolados com esse perfil pertenciam aos pulsotipos B e C e ST6, que ocorreram somente em isolados de 2011. Onze amostras de 2011 apresentaram o perfil elrA+gelE+ e foram classificadas no pulsotipo A e seis amostras tem perfil cyl+elrA+gelE+ e são dos pulsotipos B e D. Resultados de PFGE mostram a inserção no hospital da linhagem ST6, um clone multirresistente amplamente disseminado em hospitais da Itália, Portugal, Espanha e Estados Unidos. Concluiu-se que houve mudanças no perfil de E. faecalis resistentes à vancomicina no hospital, ao longo dos dois anos, com aumento de resistência e linhagens mais virulentas, sendo estes motivos de preocupação. / Enterococci are Gram-positive cocci occurring isolated, in pairs (diplococci) or chains and belong to the intestinal tract of a wide variety of hosts, from mammalian to insect. Enterococcus organisms were originally considered of little clinical importance, but have proved important nosocomial pathogens. The fact that Enterococcus possess intrinsic and acquired resistance to multiple antibiotics complicates the treatment of infections caused by them. Enterococcus faecalis is usually the predominant species among enterococci isolates, with 80% to 90% of the clinical samples. The emergence of vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) significantly reduced the treatment options. The aim of this study was to identify and compare samples of vancomycin- resistant E. faecalis (VREfs) in patients in the years 2009 and 2011, during a surveillance program in Hospital Risoleta Tolentino Neves, Belo Horizonte, MG. Species identification was done by multiplex-PCR with primers species-specific and E. faecalis were selected for this study. Tests were conducted for the presence of genes elrA, cylLL, esp and gelE, the determination of the genotype responsible for the resistance and characterization of transposon containing the resistance gene, all by PCR. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined according to the CLSI (2013) to vancomycin, linezolid, daptomycin and tigecycline and tests for resistance to high concentrations of aminoglycosides. Finally, the samples typing was performed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST). It was found that 22.2 % of VRE isolates in 2009 and 61.7 % of isolates in 2011 belong to the species E. faecalis and these were used in the study. There was emergence of tigecycline resistance in 2011, with 10 resistant isolates, after the introduction of this drug in the hospital. One isolate from 2011 showed intermediate resistance to linezolid. All isolates were sensitive to daptomycin and highly vancomycin resistant, with MICs greater than 256 mg / mL. This high resistance to vancomycin is consistent with the vanA genotype found in all samples. The virulence profile prevalent in VREfs in 2009 was elrA+gelE+, belonging to the pulsotypes A1 and A4 and ST103. Only one isolate from 2009, presented pulsotype A1 and the virulence profile cyl+elrA+gelE+. In 2011, the prevalent virulence profile was cyl+esp+elrA+gelE+, and the 12 isolates with this profile belonged to pulsotypes B and C and ST6, which occurred only in 2011 isolates. Eleven isolates from 2011 have the profile elrA+gelE+ and were classified as pulsotype A, six isolates have profile cyl+elrA+gelE+ and are of pulsotypes B and D. PFGE results show the insertion of ST6 lineage in the hospital, a multiresistant clone widely disseminated in hospitals in Italy, Portugal, Spain and the United States. It was concluded that there were changes in the profile of E. faecalis resistant to vancomycin in the hospital over the two years, with increased resistance and more virulent strains, which are of concern.

A ampliação do conhecimento sobre as formas de comunicação, controle e regulação existentes em bactérias traz luz aos avanços no combate das infecções hospitalares que são responsáveis por inúmeros prejuízos relacionados à saúde pública em todo planeta. DUMOULIN et al (2013), descreveram o regulador transcricional (RT) ElrR, que regula positivamente a transcrição do gene elrA, um fator de virulência de Enterococcus faecalis. ElrA apresenta grande similaridade com as internalinas de Listeria monocytogenes, que facilitam a invasão da bactéria ao hospedeiro. ElrR é considerada como pertencente à família Rgg-like de RT exclusivo de bactérias Gram positivas. Por vários motivos a família Rgg foi inserida à superfamília RNPP, gerando a superfamília RRNPP de RT. Os RRNPP fazem parte de um sistema de regulação por quorum sensing (QS), um sistema de comunicação célula-célula dependente de densidade celular, com função associada na ativação ou inibição da expressão de proteínas relacionadas, dentre outros, à virulência, formação de biofilme e esporulação. Para a melhor compreensão do mecanismo de como ocorre a ativação da transcrição do fator de virulência ElrA, este trabalho apresenta resultados de expressão heteróloga em E. coli e purificação das proteínas ElrR e ElrA, bem como resultados de experimentos biofísicos que caracterizam algumas propriedades estruturais e biológicas destas proteínas. Utilizando técnicas de cromatografia, espectroscopia de dicroísmo circular (CD), anisotropia de fluorescência, espalhamento dinâmico de luz (DLS), cristalografia de raios X e ressonância plasmônica de superfície (SPR), foi possível a obtenção da estrutura tridimensional de ElrR e de indícios da interação com uma região de 25bp do DNA. Realizou-se ainda, em colaboração com Dra. Pascale Serror, a tentativa de obtenção da molécula autoindutora (AI) de ElrR. São apresentados primeiros resultados da obtenção heteróloga de ElrA, sua purificação e cristalização, com importantes características que permitirão a continuação da investigação deste fator de virulência. ElrR é composta somente por alfa-hélices e apresenta-se dimérico em solução. Apesar da similaridade estrutural dos RRNPP, a identidade da sequência entre ElrR e os outros membros é extremamente baixa, o que motivou a resolução das fases cristalográficas experimentalmente. A estrutura de ElrR apresenta-se similar às homólogas, porém, com maior interface de interação entre os protômeros, que formam o dímero. O sítio de ligação do AI, em ElrR, apresenta-se mais amplo, com cavidade maior que as demais estruturas estudadas, conservando vários dos resíduos apresentados nos homólogos que realizam a estabilização do AI. Os altos fatores de temperatura dos cristais de ElrR, adicionado a anisotropia dos átomos, de uma das estruturas obtidas, apresenta a grande flexibilidade desse RT. Os indícios de interação entre ElrR e DNA aqui apresentados, obtidos por SPR e anisotropia de fluorescência, apresentam que ElrR liga especificamente ao fragmento proposto do DNA, ainda na ausência do AI. A não cristalização do complexo (ElrR-DNA), adicionada a alta flexibilidade apresentada na estrutura e a instabilidade observada na ligação ao DNA (por SPR) apontam para a obrigatoriedade da molécula de regulação (AI) para que o complexo ElrR-DNA seja estável. / The enhancing of the knowledge about communication, control and regulation in bacteria bring possibilities on the advance of hospital-acquired infections control responsible for various prejudices related to public health worldwide. DUMOULIN, et al (2013) described ElrR, a transcriptional regulator (TR), that positively regulates transcription of the elrA gene, which codifies a virulence factor of Enterococcus faecalis. ElrA shows high similarity with Listeria monocytogeneses internalins, which facilitates host invasion by these bacteria. ElrR are considered belonging to Rgg-like TR family exclusive of Gram positive bacteria. Several reasons include the Rgg family into the RNPP superfamily, generating the RRNPP superfamily of TR. The RRNPP are controlled by a quorum sensing (QS) regulation system, a cell-cell communication system based on cellular density that activates or inhibits the expression of proteins related with virulence, biofilm formation, sporulation, and others. For a better understanding of the transcription activation mechanism of ElrA, this work shows ElrR and ElrA heterologous expression in E. coli and purification of these proteins, as well as biophysics assays to characterize some structural and biological features of both proteins. Using chromatography, circular dichroism (CD), fluorescence anisotropy, dynamic light scattering (DLS), X-ray crystallography and surface plasmon resonance (SPR) technics, it was possible to obtain the tridimensional structure of ElrR, and evidences of ElrR-DNA complex formation, confirming DNA interaction site of ElrR with a 25 bp fragment. In collaboration with Dr. Pascale Serror, we attempted to achieve the ElrR auto-induction (AI) molecule. Also, results of the heterologous obtainment of ElrA are presented, as well as ElrA purification and crystallization, presenting important characteristics which will allow the further investigation of this virulence factor in near future. ElrR is composed by alpha-helices presenting dimeric fold in solution. Despite the similarity between the RRNPP members, the low identity of ElrR to the other members motivates the experimental crystallographic phases solution. ElrR structure is very similar to the homologous structures, presenting a higher interface between the protomers that compose the dimer. Its AI binding site is wider than the other structures studied, conserving several amino acid residues presented at the homologous proteins, that stabilizes the AI molecule. High temperature factors of the amino acid residues showed in all the obtained ElrR crystallographic structures plus the anisotropy of the atoms in one of those structures show the high flexibility of this TR. The evidence of the ElrR-DNA complex presented in this study, obtained by SPR and fluorescence anisotropy, indicates that ElrR binds at the proposed DNA site even in the absence of the AI molecule. The failure to obtain the ElrR-DNA complex crystals added to the high flexibility presented at some places of the structure and the observed instability at the formed complex (observed at SPR) suggest the mandatory need of the AI molecule to create a stable ElrR-DNA complex.

A proposta deste estudo foi avaliar a infiltração bacteriana em dentes obturados pela técnica de condensação lateral, cone único modificada e termoplastificada por onda contínua de condensação. Quarenta e nove raízes disto-vestibulares de molares superiores padronizados no limite de trabalho de 9 mm foram instrumentados com sistema ProTaper até lima F2, e assim divididos em 3 grupos (n=15) de acordo com a técnica de obturação: G1 cone único modificada, G2 condensação lateral, e G3 - termoplastificada por onda contínua de condensação e injeção de guta percha. O grupo controle positivo foram 2 espécimes sem obturação, e o grupo controle negativo foram 2 espécimes obturados pela técnica de condensação lateral e abertura coronária selada com cianoacrilato. As raízes foram impermeabilizadas deixando 2 mm apicais livre e montadas no aparato de duplo compartimento. Após esterilização com óxido de etileno, 3 ml de TSB estéril foi inoculado no compartimento inferior, e 400 l de caldo contendo Enterococcus faecalis no compartimento superior. A nutrição bacteriana foi realizada a cada 48 h através da retirada de 200 l de caldo bacteriano e adição de 200 l de TSB. O TSB contido no compartimento inferior foi checado a cada 48 h para verificar presença de turvamento num período experimental de 30 dias. O grupo controle positivo infiltrou em 24 h, e nenhum controle negativo apresentou infiltração em 30 dias. No tempo experimental, o grupo do cone único modificado apresentou 73,3% das amostras infiltradas, a condensação lateral apresentou 66,6%, e a termoplastificada 53,3%, não havendo diferença significante entre os grupos aplicando-se os testes do Quiquadrado e Kruskal-Wallis (p>0.05). Pode-se concluir que a técnica de cone único modificada apresenta capacidade de selamento semelhante à técnica de condensação lateral e termoplastificada por onda contínua. / The aim of this study was to evaluate bacterial leakage in root canals obturated with lateral condensation, modified single-cone and continuous wave of condensation techniques. Forty-nine distobuccal root canals of upper molars were standardized with 9 mm of working length. Then the canals were shaped by ProTaper Rotary system up to F2, and divided in three groups (n=15) according to obturation technique: G1 modified single-cone, G2 lateral condensation and G3 continuous wave of condensation. The positive control was two no obturated root canals, and positive control two root canals obturated with lateral condensation technique and coronal opening sealed with cyanoacrylate. The roots external surfaces were sealed, except for the apical 2 mm around the apical foramen, and the bacterial leakage model of two chambers was used. After sterilization by ethylene oxide gas, 3 ml of TSB was poured into the lower chamber, and 400 l of soy broth containing Enterococcus faecalis was inoculated into the upper chamber. Bacterial nutrition was performed each through changing of 200 l of bacterial soy broth to 200 l of TSB. The TSB placed in the lower chamber was checked each 48 h to verify turbidity on the experimental period of 30 days. The positive control leaked within 24 h, and the negative control no leaked on 30 days. In the experimental period, modified single-cone technique showed leakage of 73,3% samples, lateral condensation showed 66,6%, and wave continuous of condensation 53,3%. There were no significant difference between the groups according to Chi-square and Kruskal-Wallis tests (p>0.05). It can be concluded that modified single-cone technique shows sealing ability semelhante to lateral condensation and continuous wave of condensation techniques.

A presença de microrganismos no interior do sistema de canais radiculares é a principal causa do fracasso na terapia endodôntica. A importância da sanificação durante o preparo do canal fica clara, portanto. Dentre os microrganismos isolados nos casos de insucesso o Enterococcus faecalis é comumente encontrado. O E. faecalis é um microrganismo resistente à terapia endodôntica, à medicação intracanal de hidróxido de cálcio e sua presença contribui para o insucesso em Endodontia. A radiação laser apresenta características antimicrobianas que podem auxiliar no tratamento endodôntico. Esse estudo tem por objetivo avaliar o grau de descontaminação provocado pelo uso do laser de diodo de alta potência na dentina radicular em profundidade, após preparo químico-cirúrgico in vitro. Foram utilizadas 30 raízes de dentes unirradiculares ? esterilizadas em autoclave - que depois de inoculadas por E. faecalis cepa ATCC 29212 durante 4 semanas, foram divididas em 3 grupos: grupo 1 instrumentação rotatória - K3 (Sybron Endo, Orange, CA, EUA) com hipoclorito de sódio 0,5 % e creme Endo PTC, irrigação final com EDTA-T 17 % e posterior irradiação com laser de diodo de alta potência com comprimento de onda 830 nm na potência de 3 W por 5 s com 4 repetições segundo Gutknecht; grupo 2 instrumentação, como grupo 1, sem irradiação e grupo 3 apenas irrigação com 20 mL de solução fisiológica estéril. Os espécimes foram divididos em três terços (cervical, médio e apical), tiveram suas paredes dentinárias desgastadas por brocas Batt e as raspas, bem como o cilindro externo restante de dentina foram imersos em 1 mL de água peptonada. Assim alíquotas foram semeadas em meio seletivo mEnterococcus, em triplicata para contagem de unidades formadoras de colônias. Os resultados foram tratados estatisticamente pelo teste Kruskal-Wallis com método de comparação Dunn e apresentaram as seguintes médias: Grupo 1 ? 0, Grupo 2 ? 2,77 X 102, Grupo 3 ? 171 X 102 u.f.c./mL; com diferenças estatísticas significantes entre os 3 grupos (p<0,05). Em porcentagens, a redução da microbiota provocada pelo Grupo 1 foi de 100% e do Grupo 2 de 98,39% ambas em relação ao Grupo 3 (controle). A irradiação do laser de diodo nos parâmetros e amostras testadas foi eficaz na redução da contaminação em profundidade da dentina radicular frente ao Enterococcus faecalis. / The main cause for failure in Endodontics is the presence of microorganisms in root canal system. Enterococcus faecalis is a resistant microorganism presents in failure endodontic treatment. Therefore the disinfection plays fundamental rule in endodontic therapy. The laser irradiation presents properties that may improve the treatment success rates, reducing the microbial contamination. The aim of this study is evaluate the disinfection degree in depth caused by diode laser irradiation after chemomechanical procedures in vitro. Thirty extracted dental roots were sterilized by autoclave, inoculated by strain of Enterococcus faecalis ATCC 29212 during 4 weeks, and then randomly divided in 3 groups. Group 1: 10 specimens were instrumented by rotary files K3 (Sybron Endo, Orange, CA, USA) with 0.5 % sodium hypochlorite and urea peroxide (Endo PTC cream, Oficinalis Farmácia de Manipulação, São Paulo, SP, Brazil). At the end irrigation by 17 % EDTA-T was performed. The specimens were irradiated intracanal by diode laser 830 nm wavelength 3 W during 5 seconds, four times. Group 2: same procedures of group 1 without laser irradiation. Group 3: irrigation by saline solution. The specimens were divided in three thirds (apical, middle and cervical). Samples of dentin were obtained with carbide burs from inner canal walls of each third. The samples were immersed in 1 mL of peptonic water, and then aliquots were sowed to count viable cells in mEnterococcus agar (Difco?, Becton Drive, NJ, USA). The groups showed the following means: Group 1 ? 0, Group 2 ? 2,77 X 102 and Group 3 ? 171 X 102 CFU/mL. The disinfection degree achieved was 100 % in group 1, 98,39 % in group 2 both compared with group 3. The Kruskal-Wallis statistical analysis with Dunn method of comparison shows better results in group with diode laser irradiation (p<0.05), followed by group 2 and 3. Irradiation by diode laser in that samples and parameters achieved disinfection improvement in root dentin depth.

O objetivo foi avaliar a influência da agitação ultrassônica (U) na atividade antimicrobiana e penetrabilidade de pastas de hidróxido de cálcio (HC) em propilenoglicol, com ou sem extrato etanólico de própolis (EEP) em propilenoglicol a 10%, através da Microscopia Confocal de Varredura a Laser (MCVL) e cultura microbiológica (CM). Para isso setenta e dois tubos de dentina bovina padronizados foram infectados com Enterococcus faecalis em caldo BHI (Brain Heart Infusion) utilizando um novo protocolo de contaminação com dois ciclos de centrifugação por 5 dias. Durante o período experimental os espécimes foram divididos em 4 grupos e preenchidos com as medicações a seguir: Grupo1- HC, Grupo 2 HC + EEP, Grupo 3 HC + U e Grupo 4 HC + EEP + U. A agitação ultrassônica foi realizada durante 1 minuto nas direções vestíbulo-lingual e mésio-distal, com o auxílio de um inserto liso. As medicações permaneceram no interior dos espécimes por 15 dias. A MCVL analisou as bactérias viáveis (verde) e mortas (vermelho), com o auxílio do corante Live and Dead® nos tubos de dentina após o período de medicação. A contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFCs) foi realizada a partir da cultura microbiológica (CM). As raspas de dentina foram coletadas e diluídas para semeadura em placas de Petri com ágar BHI. Para a penetração foi utilizado o corante Rodamina B durante a manipulação das pastas de HC e as análises feitas por MCVL. O grupo 1 (HC) mostrou a maior viabilidade bacteriana nos tubos de dentina contaminados e o grupo 4 (HC + EEP +U) a menor. A agitação ultrassônica (U) reduziu significativamente a viabilidade bacteriana para todos os grupos. A pasta de HC + EEP mostrou-se mais eficaz que aquela somente com HC (p<0,05%). Concluiu-se que a agitação ultrassônica das pastas de HC aumentou sua atividade antimicrobiana e possibilitou maior penetração intratubular, com preenchimento de túbulos dentinários. / The purpose was to evaluate the influence of ultrasonic agitation (U) on the antimicrobial potential and penetrability of calcium hydroxide (CH) pastes with or without the ethanolic extract of propolis (EEP) in propylene glycol (10%) using Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and microbiological cultures (MC) of infected dentin. Seventy two cylindrical dentin specimens were infected with Enterococcus faecalis in BHI broth using a new contamination protocol for 5 days with centrifugations. During the experimental period, the specimens were divided into 4 groups and dressed with the following: Group1- CH paste, Group 2 - CH + EEP, Group 3 CH + U and Group 4 CH + EEP + U. The ultrasonic activation was made during 1 minute in both directions (buccal-lingual / mesio-distal), with the aid of plain point insertion. The medications remained in the root canals for 15 days. The CLSM analyzed the viable (green) and dead (red) bacteria in the infected dentinal tubules, with Live and Dead dye. The colony forming units (CFUs) count was made possible with the MC method. The dentinal wall debris were collected and diluted to be seeded on Petri BHI-agar plates. For the penetration test, the dye Rodamine B was added to CH pastes during the manipulation and analysed by CLSM. Group 1 (CH) showed the greatest bacteria viability in the infected dentinal tubes and Group 4 (CH + EEP+ U) the lowest. Ultrasonic activation created a significant reduction of bacteria viability for all groups. The CH + EEP paste was more bactericidal than the CH (p< 0.05%). It was possible to conclude that ultrasonic activation of CH pastes increased the antimicrobial action and was responsible for better intradentinal penetration with fulfilling of the dentinal tubules.

O preparo biomecânico acompanhado pela irrigação no tratamento endodôntico de canais infectados tem se mostrado efetivo, porém alguns micro-organismos ainda sobrevivem. A espécie bacteriana mais frequentemente encontrada em casos de fracasso endodôntico é Enterococcus faecalis. Para combatê-lo diferentes medicações intra-canal são utilizadas, principalmente as pastas a base de hidróxido de cálcio e outras substâncias vem sendo associadas a estas para potencializar seu efeito antimicrobiano. Desta forma, é pertinente comparar in vitro a capacidade antimicrobiana do hidróxido de cálcio com diferentes veículos e aditivos, sobre Enterococcus faecalis, através de cultura microbiológica e microscopia confocal de varredura a laser (MCVL). Para isso, tubos de dentina bovina padronizados foram previamente esterilizados e em seguida contaminados durante 5 dias com a bactéria. Os espécimes receberam a medicação por 15 dias e foram divididos em cinco grupos-teste: pasta de hidróxido de cálcio veiculado em água destilada (G1), pasta veiculada em propilenoglicol(G2), pasta de hidróxido de cálcio veiculado em propilenoglicol com os aditivos extrato etanólico de própolis (G3), clorexidina (G4) e paramonoclorofenol canforado - PMCC (G5). Após o período da medicação, a coleta bacteriana dos fragmentos de dentina foi realizada com brocas de Largo em dispositivo esterilizado, para contagem dos micro-organismos ainda viáveis em unidades formadoras de colônias. A MCVL analisou as bactérias viáveis (verde) e mortas (vermelho) no interior dos túbulos dentinários, com o auxílio do corante Live and Dead®. Houve ação antimicrobiana intra-tubular dentinária sobre Enterococcus faecalis por todas as pastas de hidróxido de cálcio testadas. A partir deste trabalho foi possível observar a melhor ação antimicrobiana contra E. faecalis pela pasta de hidróxido de cálcio com propilenoglicol e PMCC nas regiões superficial e profunda da massa dentinária. / Biomechanical preparation followed by irrigation in endodontic treatment of infected root canals has been shown, however, some micro-organisms still survive. The most frequently founded bacterial specie in endodontic treatment fail is Enterococcus faecalis. To combat it, different intra-canal medications are used, mainly the calcium hydroxide pastes and other substances have been associated to calcium hydroxide to leverage it antimicrobial effect. Thus, its relevant to compare in vitro the antimicrobial ability of calcium hydroxide with different vehicles and additives, against Enterococcus faecalis, through microbiological culture and confocal laser scanning microscopy (CLSM). For this, standard dentine tubes were sterilized and then infected with the bacteria for 5 days and were divided in five test-groups, submitted to medication for 15 days with calcium hydroxide paste in distilled water (G1), in propylene glycol (G2), besides clacium hydroxide in propylene glycol with ethanol extract of propolis (G3), chlorexidine (G4) and CPMC (G5). After the medication period, the bacterial collection of the dentine´s fragments was done with Largos drill in a sterilized device, to count micro-organisms still viable in colony forming units. The CLSM evaluated the viable (green) and dead (red) bacteria inside the dentinal tubules with the aid of the Live and Dead® dye. There was dentinal intra-tubular antimicrobial action against Enterococcus faecalis for all the tested calcium hydroxide pastes. From this work was possible to observe a better antimicrobial activity against Enterococcus faecalis by the calcium hydroxide paste in propylene glycol and CPMC in superficial and deep areas of the dentine.

O objetivo foi avaliar através da Microscopia Confocal de Varredura a Laser (MCVL) e cultura microbiológica (CM) a influência do veículo propilenoglicol e água destilada e agitação ultrassônica (U) na atividade antimicrobiana e penetrabilidade de pastas de hidróxido de cálcio (HC), em diferentes tempos de manutenção da medicação intra-canal. Para isso cento e noventa e três tubos de dentina bovina padronizados foram infectados com Enterococcus faecalis em caldo BHI (Brain Heart Infusion) utilizando um novo protocolo de contaminação com dois ciclos de centrifugação por 5 dias. Durante o período experimental os espécimes foram divididos em 8 grupos de acordo com o veículo da pasta de HC, água destilada (Ad) e propilenoglicol (prop), com o uso do ultrassom, e tempo experimental e de 7 e 15 dias: Grupo1- HC+pro+15d, Grupo 2 HC+prop+U+15d, Grupo3 HC+prop+7d, Grupo 4 HC+prop+U+7d Grupo5- HC+Ad+15d, Grupo 6 HC+Ad+U+15d, Grupo7 HC+Ad+7d, Grupo8 HC+Ad+U+7d . A agitação ultrassônica foi realizada durante 1 minuto nas direções vestíbulo-lingual e mésio-distal, com o auxílio de um inserto liso. As medicações permaneceram no interior dos espécimes durante cada período experimental. A MCVL analisou as bactérias viáveis (verde) e mortas (vermelho), com o auxílio do corante Live and Dead® nos tubos de dentina após o período de medicação. A contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFCs) foi realizada a partir da cultura microbiológica (CM). As raspas de dentina foram coletadas e diluídas para semeadura em placas de Petri com ágar BHI. Para a penetração foi utilizado o corante Rodamina B durante a manipulação das pastas de HC e as análises feitas por MCVL. O grupo 3 e 7 mostraram a maior viabilidade bacteriana nos tubos de dentina contaminados e os demais grupos as menores. A agitação ultrassônica (U) reduziu significativamente a viabilidade bacteriana, nos diferentes períodos. A pasta de HC + Prop+U 7 e 15 dias, mostraram-se mais eficazes, seguidas pela pasta HC+Ad+U+15. Concluiu-se que todas as pastas demonstraram ação antimicrobiana contra E. faecalis e com melhor desempenho quando potencializadas com ultrassom, mesmo em períodos de 7 dias, podendo ser de escolha clínica um curativo que permaneça menor tempo no interior do canal com a mesma efetividade, otimizando o tratamento endodôntico. / The purpose was to evaluate using Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and microbiological cultures (MC) of infected dentin the influence of veicol propylene glycol (prop) or distilled water (Ad) and ultrasonic agitation (U) on the antimicrobial potential and penetrability of calcium hydroxide (CH) pastes). one hundred ninetythree cylindrical dentin specimens were infected with Enterococcus faecalis in BHI broth using a new contamination protocol for 5 days with centrifugations. During the experimental period, the specimens were divided into 8 groups and dressed with the following during 7 or 15 days: Group1- HC+pro+15d, Group 2 HC+prop+U+15d, Group 3 HC+prop+7d, Group 4 HC+prop+U+7d Group 5- HC+Ad+15d, Group 6 HC+Ad+U+15d, Group 7 HC+Ad+7d, Group 8 HC+Ad+U+7d. The ultrasonic activation was made during 1 minute in both directions (buccal-lingual / mesio-distal), with the aid of a plain point insertion. The medications remained in the root canals for each experimental period. The CLSM analyzed the viable (green) and dead (red)bacteria in the infected dentinal tubules, with Live and Dead dye. The colony forming units (CFUs) count was made possible with the MC method. The dentinal wall debris were collected and diluted to be seeded on Petri BHI-agar plates. For the penetration test, the dye Rodamine B was added to CH pastes during the manipulation and analysed by CLSM. The groups 3 and 7 showed the greatest bacteria viability in the infected dentinal tubes and the other groups the lowest,. The pastes HC + Prop+U 7 and 15 days performed more efficacy, followed by HC+Ad+U+15d paste . We conclude that all the paste tested demostrated antimicrobial activity against E. faecalis from calcium hydroxide paste with propylene glycol and distilled water when leveraged with ultrasound, even in periods of seven days. Therefore, a dressing that remains less time inside the root canal with the same effectiveness can be the choice in clinical practice, optimizing the endodontic treatment.

O meio ambiente aquático vem recebendo grande carga de poluição fecal, sendo este um dos fatores que contribuem para sua degradação. O objetivo deste trabalho foi identificar bactérias do gênero Enterococcus em oito pontos ao longo da Lagoa dos Patos – RS, com diferentes níveis de degradação ambiental e verificar a resistência a antimicrobianos nestes isolados. Foi observado que nos pontos situados no Parque Itapuã e na praia do Cassino as contagens de Enterococcus sp. foram baixas. Os pontos situados em Tapes e São Lourenço do Sul apresentaram níveis elevados de contagens de Enterococcus sp no verão e na primavera e os pontos na região estuariana de Rio Grande apresentaram valores elevados no outono e inverno. Dentre os antimicrobianos testados a resistência a tetraciclina e a doxaciclina foram verificadas em todos os pontos de coleta, sendo que as maiores percentagens de isolados resistentes foram na região estuarina de Rio Grande. Os Enterococcus spp também apresentaram suscetibilidade diminuída para ampicilina, gentamicina (120μg/ml) e estreptomicina (300 μg/ml) e nenhuma para vancomicina. Entre os isolados resistentes a tetraciclina, as duas espécies mas frequentemente identificadas foram E. faecalis e E. faecium. O nível de resistência à tetraciclina, verificada através da Concentração Inibitória Mínima (CIM), variou de 16μg/ml a 256μg/ml nas duas espécies. Isolados de E. faecalis foram encontrados mais em Tapes e São Lourenço do Sul e E. faecium na região estuarina de Rio Grande, os últimos apresentaram os maiores níveis de resistência a tetraciclina e gentamicina. Os resultados do presente estudo indicam que a contaminação fecal pode estar relacionada ao descarte de dejetos humanos e de animais nestes locais. / The aquatic environment has been receiving a great amount of fecal pollution and this is one of the factors that contribute to its degradation. The aim of the present study was to identify Enterococcus sp in eight collection points with different levels of environmental degradation at Lagoa dos Patos/RS and to verify the antimicrobial resistance among these isolates. We verified low numbers of Enterococcus sp in Parque Itapuã e Praia do Cassino collection points. In Tapes and São Lourenço do Sul, higher counting of Enterococcus were observed during summer and spring seasons and at the estuarine area of Rio Grande, higher numbers were observed during autumn and winter. Among the antimicrobial drugs tested, the resistance to tetracycline and doxycycline was detected in all collection sites and the highest percentages of resistant isolates were in the estuarine area of Rio Grande. The Enterococcus spp have also presented diminished susceptibility to ampicillin, gentamicin (120μg/ml) and streptomycin (300 μg/ml) and none to vancomycin. Among the isolates resistant to tetracycline, E. faecalis e E. faecium were the most identified species. The resistance level to tetracycline, verified by MIC analysis, varied from 16μg/ml to 256μg/ml in both species. E. faecalis isolates were found mostly in Tapes and São Lourenço and E. faecium, in the estuarine area of Rio Grande and among these, the higher level of resistance to tetracycline and gentamycin was verified. The results from the present study indicate that the fecal contamination from this sampling points can be related to the discharge of human and animal waste.

Cofatores ferro-enxofre são grupos prostéticos inorgânicos ubíquos e evolutivamente ancestrais, cuja formação é dependente de complexas maquinarias protéicas. Três sistemas de formação distintos já foram determinados, denominados sistemas NIF, ISC e SUF. Apesar de bem descritos em diversos organismos, estas maquinarias são pouco caracterizadas no filo Firmicutes, o qual agrupa diversas bactérias patogênicas, e onde Enterococcus faecalis aparece como um representante clinicamente relevante. O objetivo deste estudo foi identificar a maquinaria biossintética de formação dos cofatores [Fe-S] de E. faecalis mediante análises de bioinformática, determinação das regiões promotoras do operon e de elementos cis-atuantes, padrão de expressão gênica, caracterização bioquímica dos elementos encontrados e comparação entre as maquinarias de associação do cofator [Fe-S] presente em Proteobacteria e Firmicutes através da capacidade de complementação deste sistema nos sistemas ISC e SUF de Azotobacter vinelandii e Escherichia coli, respectivamente. Metodologias de bioinformática permitiram identificar representantes da maquinaria SUF de formação dos cofatores [Fe-S], previamente identificado em Proteobacteria, apresentando os genes sufB, sufC, sufD e sufS e a presença de sufU, o único representante homólogo do sistema ISC, codificando possível proteína arcabouço, no lugar de sufA; da mesma forma, sufE e sufR não foram identificadas. A alta conservação deste sistema foi verificada em Firmicutes através de análises filogenéticas. Análise de sequências primária e estrutural de SufU verificaram um padrão estrutural similar à IscU. Modelagem molecular de SufU de E. faecalis apresentou dados de alta flexibilidade na região do sítio ativo, bem como a presença de região específica em Firmicutes, denominada região Gram-positiva (GPR), possivelmente envolvida em interações com outros fatores e/ou reguladores. SufU e o complexo SufSU são capazes de reconstituir cofactor [4Fe-4S], apresentando-se portanto como a proteína arcabouço do sistema. A enzima SufS purificada apresenta PLP ligado como cofator e atividade de cisteína desulfurase. Esta enzima apresenta um residuo catalítico essencial de cisteína na posição 365 , e necessita SufU como ativador, onde outro residuo de cisteína (128) atua como aceptor do enxofre durante a reação de transpersulfuração. SufC apresenta atividade ATPase, porém em nível reduzido em comparação ao homólogo de E. coli; SufD apresenta alta similaridade com homólogo de proteobactérias. Por outro lado, SufB não apresenta os resíduos de cisteína previamente descritos como importantes na formação dos cofatores [Fe-S] em outros organismos, assim sua função no sistema ainda deve ser determinada. Experimentos in vivo demonstraram a conservação específica de sistemas biossintéticos dos cofatores [Fe-S], onde o operon SUF de E. faecalis não foi capaz de complementar os sistemas ISC de Proteobacteria, porém complementou sistema SUF de E. coli, tornando viáveis mutantes de ambos os operons sufABCDSE e iscRSU-hscBA-fdx. / Iron-sulfur clusters are ubiquitous and evolutionary ancient inorganic prosthetic groups, which biosynthesis depends on complex protein machineries. Three distinct assembly systems involved in the maturation of cellular Fe-S proteins have been determined, designated the NIF, ISC and SUF systems. Although well described in several organisms, these machineries are poorly understood in the Firmicutes phylum, which groups several pathological bacteria, where Enterococcus faecalis rises as a clinical relevant representative. The aim of this study was to identify the E. faecalis [Fe-S] cluster biosynthetic machinery through bioinformatics analysis, determination of operon promoter regions and cis-acting elements, relative genetic expression pattern, biochemical characterization of putative elements, and comparison of Proteobacteria and Firmicutes machineries through the ability of complementing Azotobacter vinelandii and Escherichia coli ISC and SUF systems, respectively. Bioinformatics methods enabled us to identify representatives of the SUF machinery for [Fe-S] cluster biosynthesis, previously verified in Proteobacteria showing conserved sufB, sufC, sufD and sufS genes and the presence of sufU, the only ISC homolog representative, coding for putative scaffold protein, instead of sufA; neither sufE nor sufR are present. High conservancy of this system for Firmicutes bacteria was verified through phylogenetic analysis. Primary sequences and structural analysis of the SufU protein demonstrated its structural-like pattern to the scaffold protein IscU. E. faecalis SufU molecular modeling showed high flexibility over the active site regions, and demonstrated the existence of a specific region in Firmicutes, the Gram positive region (GPR), a possible candidate for interaction with other factors and/or regulators. SufU is able to reconstitute a [4Fe-4S] cluster, such as the complex SufSU, arising as the scaffold protein in the system. Purified SufS corresponds to a PLP containing enzyme with cysteine desulfurase activity. It encloses a catalytically essential cysteine residue at position 365, and requires SufU as activator, where another cysteine residue (128) works as a proximal sulfur acceptor site for transpersulfurization reaction. SufC presents ATPase activity, though in a reduced level, when compared to the Escherichia coli homolog; SufD also shares high similarity with proteobacterial SufD. On the other hand, SufB does not present cysteine residues previously described as important involved in the [Fe-S] cluster formation process of other organisms, therefor its function in the system still have to be determined. In vivo experiments enabled us to dfemonstrate the conservancy of specific [Fe-S] cluster biosynthetic systems, where E. faecalis SUF operon was not able to complement Proteobacteria ISC systems, but complemented E. coli SUF system, turning viable mutants of both sufABCDSE and iscRSU-hscBA-fdx operons.

O objetivo deste estudo foi caracterizar o potencial probiótico, antimicrobiano e antioxidante, bem como analisar os genes envolvidos em relação aos fatores de virulência e de resistência. Do mesmo modo, objetivouse avaliar a capacidade de bioacumulação e a especiaçao de selênio (Se(IV)) na biomassa microbiana. O micro-organismo utilizado neste estudo foi isolado de queijo “Minas Frescal” e caracterizado por métodos fenotípicos (Vitek® 2 system) e moleculares (sequenciamento do gene 16s rRNA e análise pelo gene ddl (D-Ala–D-Ala ligase)). O isolado LAB18s foi identificado fenotipicamente e genotipicamente como Enterococcus durans. Além disso, apresentou características probióticas; atividade antimicrobiana e capacidade antioxidante. Quando analisados os genes relacionados aos fatores de virulência (ace, agg, asa, bopA, bopB, bopC e bopD), e de resistência à vancomicina (vanA, vanB, vanC1 e vanC2/3) não foi verificada a presença destes genes pela E. durans LAB18s. Da mesma forma, o isolado mostrou-se sensível aos antibióticos testados (eritromicina, tetraciclina, vancomicina, gentamicina e penicilina) e apresentou ainda capacidade de adesão e hidrofobicidade, assim como forte capacidade para a formação de biofilme. Para a bioacumulação de Se(IV) pelo isolado E. durans LAB18s foram encontrados como parâmetros ótimos de crescimento a temperatura de 30°C e pH 7. Através da especiação foi demonstrado que em todas as análises o isolado E. durans LAB18s pode bioacumular concentrações consideráveis de Se(IV), sendo que a maior percentagem de selênio orgânico foi encontrada na fração de proteínas totais e, quando analisada as extrações por diferentes solventes, observou-se maior conteúdo de selênio em meio alcalino. As análises de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e Espectrometria de Energia Dispersiva (MEV-EDS) corroboraram com os resultados obtidos em termos de bioacumulação de selênio pelo E. durans LAB18s. De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que o isolado E. durans LAB18s pode ser considerado um micro-organismo com potencial probiótico, biologicamente seguro e com ampla capacidade em bioacumular selênio na biomassa microbiana. / The aim of this study was to characterize the potential probiotic, antimicrobial and antioxidant activity as well as analyze the genes involved in virulence factors and resistance. Similarly, it was aimed to evaluate the ability of selenium (Se (IV)) bioaccumulation and speciation through the microbial biomass. The micro-organism used in this study was isolated from "Minas Frescal" cheese and characterized by phenotypic (Vitek® 2 system) and molecular methods (16S rRNA gene sequencing and analysis by gene ddl (DAla- D-Ala ligase)). The isolate LAB18s was identified phenotypically and genotypically as Enterococcus durans. Moreover, it exhibited probiotic characteristics, antimicrobial and antioxidant activity. The genes related to virulence factors (ace, agg, asa, bopA, bopB, bopC e bopD), and vancomycin resistance (vanA, vanB, vanC1 e vanC2/3) were not verified the presence of these genes by LAB18s. Likewise, the isolate showed susceptibility to the antibiotics tested (erythromycin, tetracycline, vancomycin, gentamicin and penicillin) and also it showed adhesion and hydrophobicity ability, as well as a strong ability to form biofilms. For the Se(IV) bioaccumulation by isolated Enterococcus durans LAB18s have been found as optimal parameters growth by isolate at temperature of 30°C and pH 7. Analysis for Se(IV) speciation had shown in all analyzes that the isolate E. durans LAB18s can bioaccumulate considerable concentrations of Se(IV), and the highest percentage of organic selenium was found in the fraction of total protein; and when analyzed different solvent extractions, it was observed a higher content of selenium in alkaline medium. Analyses from Electron Microscopy (SEM), Transmission Electron Microscopy (TEM) and Energy Dispersive Spectroscopy (SEM-EDS) corroborate with the results obtained with Se(IV) bioaccumulation by E. durans LAB18s. In according to the obtained results it can be infer that the isolated E. durans LAB18s can be considered a micro-organism with potential probiotic, biologically safe and with wide capacity to bioaccumulate selenium in microbial biomass.