Die Inzidenz von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED), insbesondere von Morbus Crohn (MC), nimmt weltweit zu, was auch eine Vielzahl an Kindern betrifft. Obwohl die Krankheit in den letzten Jahrzehnten Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten war, ist die Pathogenese nicht abschließend geklärt. Diese Arbeit vergleicht T-Zellen gesunder pädiatrischer Probanden mit T-Zellen pädiatrischer CED Patienten mittels Flowcytometrie unter Berücksichtigung von Differenzierungsstadium, Krankheitsaktivität, Therapie und CMV-Status. Die Verteilung der T-Zell-Subpopulationen zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten und Kontrollen, jedoch zeigen sich für TH1 und TH17 Zellen Unterschiede zwischen MC Patienten und Kontrollen, welche auch mit Krankheitsaktivität und Therapie korrelieren. Der Anteil von CXCR3+ Zellen ist innerhalb der CD4+ Memory-Populationen und innerhalb der CD8+ Memory- und Effektor-Populationen bei MC Patienten – vor allem mit aktiver Erkrankung bzw. ohne Therapie – deutlich geringer als bei Kontrollen. Gleichzeitig zeigt sich der Anteil an CCR6+ Zellen sowie der Anteil an IL 17+CCR6+ Zellen bei MC Patienten in Remission sowie unter Therapie mit TNFα-Blockern höher als bei Kontrollen. Zudem sind die Effektor-Zell-Gleichgewichte bei MC zugunsten von TH17 Zellen verschoben. Somit unterstützt die Arbeit die weitverbreitete Hypothese einer gesteigerten TH17-Antwort bei MC. Auch zeigt sich eine Verminderung der TH1-Zellen im peripheren Blut bei aktiv erkrankten MC Patienten im Vergleich zu Kontrollen, was sich möglicherweise durch eine Abwanderung oder Umwandlung dieser Zellen bei aktivem MC erklären lässt. Desweiteren zeigt sich, dass CED Patienten eine verstärkte Neigung zur vorzeitigen Immunoseneszenz aufzuweisen scheinen, was durch eine latente CMV-Infektion nochmals verstärkt erscheint. Einige CMV-assoziierte Veränderungen der T-Zell-Differenzierung, wie z.B. die CD45RA-Reexpression sowie die TNFα- und IFNγ-Mehrexpression, zeigen sich bei CMV+ CED Patienten zudem ausgeprägter als bei CMV+ Kontrollen. Interessant ist daher, dass CMV+ Probanden und CED Patienten Veränderungen aufweisen, die sich teilweise zu addieren scheinen. / There is a globally increasing incidence of Inflammatory Bowel Disease (IBD), especially of Crohn’s disease, which can also be seen in children. Despite the disease being studied intensively over the recent decades, the pathogenesis is not yet completely understood. This study compares t cells isolated from pediatric IBD patients with those of healthy donors using flow cytometry and taking into account cell differentiation status, disease activity, current therapeutic regime and the donor’s CMV status. T cell subsets show no significant distributional differences between patients and controls. However, TH1 and TH17 cells show differences between patients with Crohn’s disease and controls, which correlate with disease activity and therapy. The proportion of CXCR3+ cells is reduced within CD4+ memory subsets and CD8+ memory and effector subsets, especially in patients with active disease or without therapy. At the same time CCR6+ and IL-17+CCR6+ subsets are increased in patients with Crohn’s disease in remission or under therapy compared to controls. Furthermore, effector cell balances are shifted towards TH17 cells in patients with Crohn’s disease, supporting the widespread hypothesis of an increased TH17 response in Crohn’s disease. Additionally, TH1 cells are diminished in peripheral blood of patients with active Crohn’s disease compared to controls, possibly suggesting a migration of these cells into tissue or a differentiation into other subsets. As an additional finding, IBD patients exhibited an increased tendency for premature immunosenscence, which was even more distinct in patients with latent CMV infection. Some changes in t cell differentiation commonly attributed to CMV infection, like reexpression of CD45RA and increased expression of TNFα and IFNγ, are more pronounced in CMV positive IBD patients, than in CMV positive healthy donors. Interestingly, the combination of IBD with CMV infection partially add up to more pronounces changes in CD4+ t cells and especially in CD8+ t cells.

Ziel dieser Studie ist die Bestimmung der Serum-sRAGE-Kon- zentrationen bei Hunden mit Chronische Enteropathie (CIE) und deren Zusammenhang mit histologischen sowie klinisch- pathologischen Befunden. Ein weiteres Ziel der Studie ist der quantitative Vergleich der Expression von Transmembran (full-length)-RAGE entlang des Gastrointestinaltrakts bei Hunden mit CIE sowie die Untersuchung auf deren Zusammenhang mit Serum-sRAGE-Konzentrationen sowie klinischen, klinisch-pathologischen und histologischen Befunden. Die Ergebnisse deuten auf eine Dysregulation der RAGE/sRAGE-Achse bei der CIE des Hundes und legen nahe, dass die RAGE-Signalwege eine Rolle bei der Patho- genese dieser Erkrankung spielen.:Introduction. Review of Literature Functional Anatomy and Physiology of the Intestines. Anatomy of the Intestines. Gastrointestinal Physiology Small Intestinal Physiology. Large Intestinal Physiology. Gastrointestinal Neuronal and Endocrine System Gastrointestinal Immune System Innate Immunity and Acquired Immunity Intestinal Microbiome Enteropathies in Dogs.Definition Acute Enteropathy Chronic Enteropathies Food-Responsive Enteropathy (FRE) Antibiotic-Responsive Enteropathy (ARE) Steroid- or Immunosuppressant-responsive enteropathy (SRE/IRE) Non-Responsive Enteropathy (NRE) Protein-Losing Enteropathy (PLE) Diagnostic evaluation of dogs with suspected CIE Clinical and Clinicopathologic Approach Diagnostic Imaging of the Abdomen Laboratory Tests for Gastrointestinal Disease Serum cobalamin (vitamin B12 Serum folic acid (vitamin B9) Serum C-reactive protein (CRP) Fecal calprotectin and S100A12 Protein Fecal alpha1-proteinase inhibitor (α1PI) Gastrointestinal Histopathology attern Recognition Receptors Receptor for Advanced Glycation End Products Aims and Hypotheses Own Publications Association between serum soluble receptor for advanced glycation end-products (RAGE) deficiency and severity of clinicopathologic evidence of canine chronic in- flammatory enterophy Dysregulation of gastrointestinal RAGE (receptor for advanced glycation end products) expression in dogs with chronic inflammatory enteropathy Discussion Objective of the Study Discussion of the results Limitations of the Study Conclusions Summary Zusammenfassung References Acknowledgments

Background: Increased numbers of intestinal E. coli are observed in inflammatory bowel disease, but the reasons for this proliferation and it exact role in intestinal inflammation are unknown. Aim of this PhD-project was to identify E. coli proteins involved in E. coli’s adaptation to the inflammatory conditions in the gut and to investigate whether these factors affect the host. Furthermore, the molecular basis for strain-specific differences between probiotic and harmful E. coli in their response to intestinal inflammation was investigated. Methods: Using mice monoassociated either with the adherent-invasive E. coli (AIEC) strain UNC or the probiotic E. coli Nissle, two different mouse models of intestinal inflammation were analysed: On the one hand, severe inflammation was induced by treating mice with 3.5% dextran sodium sulphate (DSS). On the other hand, a very mild intestinal inflammation was generated by associating interleukin 10-deficient (IL-10-/-) mice with E. coli. Differentially expressed proteins in the E. coli strains collected from caecal contents of these mice were identified by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis. Results DSS-experiment: All DSS-treated mice revealed signs of a moderate caecal and a severe colonic inflammation. However, mice monoassociated with E. coli Nissle were less affected. In both E. coli strains, acute inflammation led to a downregulation of pathways involved in carbohydrate breakdown and energy generation. Accordingly, DSS-treated mice had lower caecal concentrations of bacterial fermentation products than the control mice. Differentially expressed proteins also included the Fe-S cluster repair protein NfuA, the tryptophanase TnaA, and the uncharacterised protein YggE. NfuA was upregulated nearly 3-fold in both E. coli strains after DSS administration. Reactive oxygen species produced during intestinal inflammation damage Fe-S clusters and thereby lead to an inactivation of Fe-S proteins. In vitro data indicated that the repair of Fe-S proteins by NfuA is a central mechanism in E. coli to survive oxidative stress. Expression of YggE, which has been reported to reduce the intracellular level of reactive oxygen species, was 4- to 8-fold higher in E. coli Nissle than in E. coli UNC under control and inflammatory conditions. In vitro growth experiments confirmed these results, indicating that E. coli Nissle is better equipped to cope with oxidative stress than E. coli UNC. Additionally, E. coli Nissle isolated from DSS-treated and control mice had TnaA levels 4- to 7-fold higher than E. coli UNC. In turn, caecal indole concentrations resulting from cleavage of tryptophan by TnaA were higher in E. coli Nissle- associated control mice than in the respective mice associated with E. coli UNC. Because of its anti-inflammatory effect, indole is hypothesised to be involved in the extension of the remission phase in ulcerative colitis described for E. coli Nissle. Results IL-10-/--experiment: Only IL-10-/- mice monoassociated with E. coli UNC for 8 weeks exhibited signs of a very mild caecal inflammation. In agreement with this weak inflammation, the variations in the bacterial proteome were small. Similar to the DSS-experiment, proteins downregulated by inflammation belong mainly to the central energy metabolism. In contrast to the DSS-experiment, no upregulation of chaperone proteins and NfuA were observed, indicating that these are strategies to overcome adverse effects of strong intestinal inflammation. The inhibitor of vertebrate C-type lysozyme, Ivy, was 2- to 3-fold upregulated on mRNA and protein level in E. coli Nissle in comparison to E. coli UNC isolated from IL-10-/- mice. By overexpressing ivy, it was demonstrated in vitro that Ivy contributes to a higher lysozyme resistance observed for E. coli Nissle, supporting the role of Ivy as a potential fitness factor in this E. coli strain. Conclusions: The results of this PhD-study demonstrate that intestinal bacteria sense even minimal changes in the health status of the host. While some bacterial adaptations to the inflammatory conditions are equal in response to strong and mild intestinal inflammation, other reactions are unique to a specific disease state. In addition, probiotic and colitogenic E. coli differ in their response to the intestinal inflammation and thereby may influence the host in different ways. / Hintergrund: Chronisch entzündliche Darmerkrankungen zeichnen sich unter anderem durch eine starke Proliferation intestinaler E. coli aus. Unbekannt ist jedoch, ob diese Vermehrung eine Ursache oder eine Folge der Erkrankung darstellt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es daher, E. coli-Proteine zu identifizieren, welche der Anpassung an die entzündlichen Bedingungen im Darmtrakt dienen und unter Umständen einen Effekt auf den Gesundheitszustand des Wirtes haben. Weiterhin sollten die molekularen Ursachen für stammesspezifische Unterschiede zwischen probiotischen und gesundheitsschädlichen E. coli näher untersucht werden. Methoden: In den tierexperimentellen Analysen wurden keimfreie Mäuse entweder mit dem probiotischen E. coli Nissle oder dem adhärent-invasiven E. coli UNC monoassoziiert und in zwei verschiedenen Entzündungsmodellen näher untersucht. Einerseits wurde eine starke Darmentzündung durch die Gabe von 3,5% Natrium-Dextransulfat (DSS) ausgelöst. Andererseits wurde in Interleukin 10-defizienten (IL-10-/-) Mäusen eine sehr milde Form der Entzündung durch Besiedlung mit E. coli induziert. Die E. coli Bakterien wurden am Ende der Versuche aus den Caecuminhalten der Mäuse isoliert und die bakterielle Proteinexpression wurde mittels zwei-dimensionaler Gelelektrophorese analysiert. Ergebnisse des DSS-Versuchs: Alle Tiere des DSS-Versuchs entwickelten unabhängig vom E. coli Stamm, mit dem sie besiedelt waren, eine moderate Entzündung im Caecum und eine starke im Colon, wobei die Entzündungsreaktion durch die Monoassoziation mit E. coli Nissle leicht abgeschwächt wurde. In beiden E. coli Stämmen führte die Darmentzündung zu einer verringerten Expression von Enzymen des Kohlenhydratabbaus und der Energiegewinnung. In Folge dessen waren die intestinalen Konzentrationen bakterieller Fermentationsprodukte in den entzündeten Tieren geringer als in den gesunden Kontrolltieren. Weitere differentiell exprimierte Proteine umfassen das Fe-S- Cluster Reparaturprotein NfuA, die Tryptophanase TnaA und das uncharakterisierte Protein YggE. In beiden E. coli Stämmen, welche aus den DSS-Tieren isoliert wurden, war das NfuA Protein dreifach höher exprimiert. Eine Darmentzündung führt zu einer vermehrten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, welche die Fe-S-Cluster in Eisen-Schwefel-Proteinen zerstören und damit zu einer Inaktivierung dieser Proteine führen. In vitro Untersuchungen bestätigten, dass die Reparatur der Eisen-Schwefel-Proteine durch NfuA ein wichtiger Mechanismus ist um oxidativem Stress entgegenzuwirken. Das YggE Protein, welches laut Literaturangaben einen hemmenden Einfluss auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies hat, war in E. coli Nissle 4- bis 8-fach erhöht (verglichen mit E. coli UNC unter Kontroll- und Entzündungsbedingungen). In vitro Versuche bestätigten diese Daten und zeigten, dass E. coli Nissle im Vergleich zu E. coli UNC eine erhöhte Resistenz gegenüber oxidativem Stress aufweist. Außerdem wurde im Vergleich E. coli Nissle vs. E. coli UNC (unter Entzündungs- und Kontrollbedingungen) ein 4- bis 7-fach erhöhter TnaA-Gehalt nachgewiesen. Indol, das Produkt der TnaA-katalysierten Tryptophanspaltung wurde in erhöhten Mengen im Intestinaltrakt E. coli Nissle-assoziierter Kontrolltiere detektiert. Seit längerem werden entzündungshemmende Eigenschaften für Indol postuliert, die aufgrund der Ergebnisse dieser Doktorarbeit nun auch mit den gesundheitsfördenden Eigenschaften von E. coli Nissle in Zusammenhang gebracht werden können. Ergebnisse des IL-10-/-- Versuchs: Nach einer 8-wöchigen Assoziationsdauer wurde nur in den mit E. coli UNC besiedelten IL-10-/- Tieren eine schwache Entzündungsreaktion nachgewiesen. Bedingt durch diese sehr schwach ausgeprägte Entzündungsantwort waren auch die Veränderungen im bakteriellen Proteom von E. coli UNC nur gering. Wie im DSS-Versuch waren Proteine des bakteriellen Energiestoffwechsels reprimiert, allerdings wurde keine Induktion von NfuA beobachtet. Daher scheint die Induktion von NfuA nur der Anpassung an eine starke Entzündung zu dienen. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass E. coli Nissle aus IL-10-/- Tieren den Hemmer für das vertebrate C-Typ Lysozym (Ivy) sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene stärker exprimiert als E. coli UNC. Überexpression von Ivy unter in vitro Bedingungen zeigte, dass es an der erhöhten Lysozymresistenz von E. coli Nissle beteiligt ist und somit eine Rolle als möglicher Fitnessfaktor von E. coli Nissle spielt. Schlussfolgerungen: In dieser Doktorarbeit wurde gezeigt, dass Darmentzündungen die Proteinexpression eines im Darm lebenden Bakteriums beeinflussen. Einige der aufgedeckten bakteriellen Anpassungsreaktionen werden sowohl bei einer starken als auch bei einer schwachen Entzündung ausgelöst; andere wiederum sind spezifisch für nur einen dieser Entzündungszustände. Weiterhin wurde deutlich, dass sich E. coli-Stämme hinsichtlich ihrer Reaktion auf eine Darmentzündung unterscheiden und damit möglicherweise den Wirt beeinflussen. 

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Interleukin-10 (IL-10) is a potent anti-inflammatory cytokine, with therapeutic applications in inflammatory bowel disease. For the in situ delivery of IL-10 by Escherichia coli as carrier chassis, a modified transporter was designed with the ability to secrete biologically active IL-10. De novo DNA synthesis comprised a 561-bp fragment encoding the signal sequence of the E. coli outer membrane protein F fused in frame to an E. coli codon-optimized mature human IL-10 gene under control of a T7 promoter. The construct was overexpressed in E. coli laboratory strains, E. coli BL21 (DE3) and E. coli MDS42:T7. The mean concentrations of human IL-10 in the periplasm and culture supernatant of E. coli BL21 (DE3) were 355.8 ± 86.3 and 5.7 ± 1.7 ng/ml, respectively. The molecular mass of the recombinant E. coli-derived human IL-10 was 19 kDa, while under non-reducing conditions the native IL-10 dimer could be demonstrated. Reduction of tumor necrosis factor-α secretion in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophages and detection of the activated form of the transcription factor signal transducer and activator of transcription protein 3 proved the biological activity of the bacteria-produced human IL-10. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Hintergrund: Angaben zu Inzidenz und Prävalenz von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) bei Kindern und Jugendlichen in Deutschland fehlen bisher, die Daten des im Jahr 2000 gegründeten Sächsischen CED-Registers für Kinder und Jugendliche wurden bisher nicht veröffentlicht. Bei internen Diskussionen der Registerdaten zeigte sich stets eine nicht erklärbare abfallende altersspezifische Inzidenz der CED ab dem 15. Lebensjahr. Es wurde vermutet, dass einige ältere Jugendliche ausschließlich von Erwachsenengastroenterologen betreut wurden und bei einigen Adoleszenten eine längere diagnostische Latenz zur Diagnosestellung nach dem 18. Lebensjahr führte. Patienten und Methoden: Zur Prüfung der Thesen wurden alle gastroenterologisch tätigen Internisten in Leipzig aufgesucht und Patienten eingeschlossen, bei denen bis zum 26. Lebensjahr in den Jahren 2005-2009 eine CED endoskopisch neu diagnostiziert wurde. Die Auswertung des Sächsischen CED-Registers erfolgte hinsichtlich Inzidenz, Prävalenz, Geschlechterverteilung und diagnostischer Latenz im Zehnjahreszeitraum 2000-2009. Ergebnisse: Es wurden tatsächlich einige Jugendliche vor dem 18. Lebensjahr ausschließlich von Internisten betreut und nicht an das Register gemeldet. Die korrigierte Inzidenz von CED bei Patienten bis zum 18. Lebensjahr in Leipzig lag um 37 % höher als im Register angegeben. Nach dem 15. Lebensjahr wurde – ebenfalls in Abweichung zu den Registerdaten – ein kontinuierlicher Anstieg der altersspezifischen Inzidenz bis zum 18. Lebensjahr registriert. Es zeigte sich eine Tendenz zur längeren diagnostischen Latenz bei Adoleszenten, die sich jedoch nicht statistisch sichern ließ. Bis zum 15. Lebensjahr wurden nahezu alle Patienten im CED-Register erfasst.

Many human diseases, including cancer, share an inflammatory component but the molecular underpinnings remain incompletely understood. We report that physiological and pathological Dickkopf1 (DKK1) activity fuels inflammatory cytokine responses in cell models, mice and humans. DKK1 maintains the elevated inflammatory tone of cancer cells and is required for mounting cytokine responses following ligation of toll-like and cytokine receptors. DKK1- controlled inflammation derives from cell-autonomous mechanisms, which involve SOCS3- restricted, nuclear RelA (p65) activity. We translate these findings to humans by showing that genetic DKK1 variants are linked to elevated cytokine production across healthy populations. Finally, we find that genetic deletion of DKK1 but not pharmacological neutralization of soluble DKK1 ameliorates inflammation and disease trajectories in a mouse model of endotoxemia. Collectively, our study identifies a cell-autonomous function of DKK1 in the control of the inflammatory response, which is conserved between malignant and nonmalignant cells. Additional studies are required to mechanistically dissect cellular DKK1 trafficking and signaling pathways.

Die vorliegende wissenschaftliche Arbeit widmet sich epidemiologischen Frage-stellungen zu CED bei Kindern und Jugendlichen am Anfang des 21. Jahrhunderts in Deutschland. Konkrete Aufgabenstellungen bestanden in der Vervollständigung, Validierung, Aufbereitung, Auswertung und Publikation der über 15 Jahre (2000-2014) erhobenen Daten des Sächsischen Kinder-CED-Registers mit dem Ziel, die hypothetische Zunahme der CED in Sachsen zu untersuchen, zu dokumentieren und quantifizieren. Im Fokus der Auswertung stehen vor allem die Inzidenz, Prävalenz und die bisherigen und zukünftigen Trends von CED bei Kindern und Jugendlichen bis zum 15. Lebensjahr in einem der neuen Bundesländer Deutschlands.:Abkürzungsverzeichnis V Abbildungsverzeichnis VII Tabellenverzeichnis VIII Zusammenfassung 1 Abstract 4 1 Einführung in die Thematik 7 1.1 Wissenschaftliche Ausgangssituation 7 1.2 Hintergrund für die Registergründung in Sachsen 8 1.3 Aufgabenstellung 9 2 Theoretisch wissenschaftlicher Ansatz der eigenen Arbeiten 10 2.1 Material und Methoden 10 2.1.1 Sächsisches Kinder-CED-Register 10 2.1.2 Finanzielle Förderung 11 2.1.3 Zweite Datenquelle und Registervollständigkeit 12 2.1.4 Population unter Risiko 12 2.1.5 Merkmale der Patientenkohorte 13 2.2 Statistische Auswertungen 13 3 Wesentliche wissenschaftliche Ergebnisse 15 3.1 Inzidenzraten und Prävalenz 15 3.2 Analyse von Inzidenztrends 18 3.3 Analyse des Alterstrends bei Manifestation 20 3.4 Diagnostische Latenz 21 3.5 Prognostizierte Inzidenztrends 23 4 Diskussion 26 4.1 Langzeitentwicklung der Anzahl von CED-Patienten 26 4.2 Internationale und nationale Einordnung der Ergebnisse 27 4.3 Stärken und Limitationen 32 4.3.1 Stärken der Arbeit 32 4.3.2 Limitationen der Arbeit 32 5 Schlussfolgerungen und Ausblick 33 Literatur IX Danksagung XVIII Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens XIX Anlage 2: Erklärung über die Einhaltung gesetzlicher Bestimmungen XXI Anlage 3: Kern et al. (2021) XXII Anlage 4: Kern et al. (2022) XLI Anlage 5: Einwilligungserklärung der Eltern LXI Anlage 6: Erstmeldebogen LXII Anlage 7: Dokumentationsbogen LXIII Anlage 8: Eigenanteil LXIV