La drépanocytose est une hémoglobinopathie génétique ayant pour conséquences une anémie hémolytique chronique et sévère et des crises vaso-occlusives itératives. Cette pathologie s’accompagne également d’une intolérance à l’effort et d’altérations de la fonction et du tissu musculaire. Récemment, nous avons pu montrer, par une étude contrôlée et randomisée, l’innocuité et les bénéfices fonctionnels d’un programme d’entrainement en endurance, d’intensité modérée, chez des patients drépanocytaires. L’objectif de ce travail doctoral a été d’évaluer les effets de ce programme d’entrainement sur les caractéristiques musculaires de quarante patients drépanocytaires homozygotes. L’analyse des biopsies musculaires rapporte des adaptations tissulaires chez les patients entrainés, illustrées par une augmentation de la surface des myocytes, une amélioration de leur capacité oxydative, une augmentation du nombre de microvaisseaux sans modification de leur tortuosité, laissant supposer une meilleure oxygénation musculaire. L’excellente tolérance de ce mode d’entrainement semble reposer sur une plus faible mobilisation des voies anaérobies comme en témoigne la stabilité des activités enzymatiques associées à la glycolyse lactique et l’absence de modification du contenu musculaire des protéines impliquées dans la régulation du pH. Par ailleurs, cet entrainement n’a pas engendré de dégradation tissulaire notable. Ainsi, cet entrainement a non seulement apporté des bénéfices fonctionnels, mais également réduit les dysfonctionnements tissulaires musculaires. Cette thérapie par l’exercice peut donc être considéré comme une stratégie adjuvante prometteuse pour les patients drépanocytaires. / Sickle cell disease is a genetic hemoglobinopathy resulting in chronic and severe hemolytic anemia and iterative vaso-occlusive crisis. This pathology is also accompanied by exercise intolerance and alterations in muscle function and tissue. Recently, we demonstrated, through a randomized controlled study, the safety and functional benefits of a moderate-intensity endurance exercise training program in sickle cell disease patients. The objective of this doctoral work was to evaluate the effects of this training program on the muscle characteristics of forty homozygous sickle cell disease patients. The analysis of muscle biopsies reported tissue adaptations in trained patients, illustrated by an increase in the surface area of myocytes, an improvement in their oxidative capacity, an increase in the number of microvessels without modification of their tortuosity, suggesting a better muscle oxygenation. The excellent tolerance of this training mode seems to be based on a lower mobilization of the anaerobic pathways, as shown by the stability of the enzymatic activities associated with lactic glycolysis and the lack of any modification of the muscle protein content involved in pH regulation. Moreover, this training did not result in any significant tissue degradation. Thus, this training provided functional benefits, but also reduced muscle tissue dysfunctions. This exercise therapy can therefore be considered a promising adjuvant strategy for sickle cell disease patients.

A la suite des nombreux travaux sur l’inhibition de la glycogène phosphorylase (GP) menés au laboratoire et au travers de diverses collaborations, cette thèse décrit en cinq chapitres suivis d’une partie expérimentale détaillée, les dernières avancées en termes de synthèse et d’évaluation biologique des inhibiteurs du site catalytique de la GP. La chapitre I de ce manuscrit est consacrée à la présentation des diabètes et plus particulièrement du diabète de type II dont le traitement, motivation première de ce projet, repose sur la connaissance des mécanismes complexes régulant la glycémie. Les différents inhibiteurs synthétisés sont classés par famille selon leur structure qui associe un aglycone hétérocyclique, susceptible d’affinité pour le canal β proche du site actif de l’enzyme, avec un motif glycopyranosidique, ou glycopyranosylidène dans le cas des motifs spiro. Le chapitre II est consacré aux inhibiteurs spiro-bicycliques tels que les glucopyranosylidène-spiro-1,4,2-oxathiazoles et les glucopyranosylidène-spiro-isoxazolines. Le chapitre III décrit la synthèse de C- et N-glycosyles hétérocycles, principalement des glycopyranosyl-1,2,3-triazoles. Enfin le chapitre IV décrit la fonctionnalisation de 5-halogéno-1,2,3-triazoles 4-substitués par couplages pallado-catalysés qui ont constitué un développement imprévu mais original des travaux. Pour terminer, le chapitre V décrit l’évaluation des molécules préparées en tant qu’inhibiteurs de la glycogène phosphorylase. Les expériences et résultats d’enzymologie, de cristallographie ainsi que les tests cellulaires in vitro et in vivo sur le rat sont présentés / Following many studies lead on the inhibition of glycogen phosphorylase (GP) in our laboratory an trough several collaborations, this thesis describes in five chapters and a detailed experimental section, the most recent advances in the areas of synthesis and biological evaluation of GP’s catalytic site inhibitors. Chapter I is dedicated to the description of diabetes and especially type 2 diabetes of which treatment, the main goal of this project, requires knowledge of the complex mechanisms that regulates glycemia. Synthesized inhibitors are broken down into families according to their structure which associates an heterocyclic aglycon, prone to binding in the β pocket lining the active site, with a glycopyranoside or glycopyranosylidene moiety in the case of spiro compounds. Chapter II focuses on spiro-bicyclic inhibitors such as glucopyranosilidene-spiro-1,4,2-oxathiazoles and glucopranosylidene-spiro-isoxazolines. Chapter III describes the synthesis of C- and N-glycosyl-heterocycles, mainly glycopyranosyl-1,2,3-triazoles. Finally, chapter IV studies the palladium-mediated cross coupling fonctionalization of 4-substituted-5-halogenated-1,2,3-triazoles that represents an unexpected but interesting development of the project. To conclude, chapter V gathers the evaluation of synthesized molecules as GP inhibitors. Enzymology and crystallography as well as in vitro and in vivo experiments are presented

In recent years, mass spectrometry (MS) become the dominant technology in lipidomic analysis and widely influenced research and diagnosis of diseases of lipid metabolism, e.g. lysosomal storage disorders (LSD) characterized by impairment of the lysosomal functions. Defects in lysosomal processing of sphingolipids SFL belong to the category of sphingolipidoses. This condition has severe and even fatal clinical outcome. The primary aim of this work was to establish quantitative and qualitative methods of SFL analysis useful for research and diagnosis of LSD. At first, semisynthesis of mass labeled lipid standards utilizing immobilized sphingolipid ceramide N-deacylase was performed. Established methods of quantitative analysis were then used to prove the increased excretion of urinary SFL in LSD with characteristic storage in the kidney. Determination of excreted urinary SFL was found useful for differential diagnosis of prosaposin and saposin B deficiences for which routine enzymology is failing. MS also enabled monitoring of individual molecular species (isoforms) of SFL, which led to the finding that their urinary pattern is changing in some LSD. This resulted in the development of new screening method in dry urinary samples based on isoform profile evaluation. Another MS application referred to...

La recherche de variations d’activités enzymatiques associées à des phénotypes chez la tomate (Solanum Lycopersicum) a permis d’apporter de nouveaux éléments pour l’étude desrelations existantes entre le métabolisme central et la qualité du fruit. Ce projet qui engageaitune nouvelle thématique au sein de l’unité Biologie et Pathologie de Fruit (UMR 1332, INRABORDEAUX) a permis dans un premier temps de développer une plateforme d’enzymologieà haut débit. Cette structure permet d’une part de réaliser plus de 10 000 déterminationsd’activités enzymatiques par jour avec une très grande reproductibilité et d’autre part dedéterminer les constantes de Michaelis (Km) apparentes pour jusqu’à une dizaine d’enzymespar jour.Dans un deuxième temps ce projet s’est attaché à étudier les relations existantes entre lesenzymes de la voie de la glycolyse chez le cultivar de tomate MicroTom. Nous y avonsrelevé l’existence de corrélations fortes entre les activités de ces enzymes. Nous avonségalement mis à jour l’existence de corrélations pour les enzymes mesurées à partir de deuxétages foliaires distincts ce qui suggère que les réseaux enzymatiques sont conservés ausein d’une plante.Dans un troisième temps, le criblage d’une collection de mutants de tomate MicroTom a étéentrepris. Ce criblage de plus de 150 familles (soit environ 1800 plantes) sur la base desactivités enzymatique de onze enzymes du métabolisme central à deux concentrations desubstrats différentes (saturante et non saturante) a abouti à l’identification de deux familles.Ces deux familles porteraient chacune une mutation affectant les caractéristiques cinétiquesde la Triose-Phosphate Isomérase. Ces mutations étaient toujours en cours d’étude à la finde ce projet. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour la compréhension desrelations entre les enzymes du métabolisme central. Ils permettent aussi d’apporter desméthodes d’identification rapide de mutants enzymatiques au sein d’une large population. / Research on enzymatic variations associate with phenotypes in tomato (SolanumLycopersicun) provided new and original input regarding links between central metabolismand fruit quality. This project took part in a new topic of the Fruit Biology and Pathology Unit(UMR 1332, INRA BORDEAUX). First, during this project, a new high-throughputenzymology platform was created. This unique lab offers possibility to determine both morethan 10 000 enzyme activities per day with a very good reliability and apparent Michealisconstant (Km) for up to ten enzymes per day.Second, this project investigated existent relationship between glycolytic enzymes inMicroTom tomato cultivar. We highlighted strong correlations between enzymes in leaves.We also uncovered correlations between enzymes activities measured in two distinct foliarlevels. These elements suggest inheritability of the enzymes network within the plant.Third, the screen of an Ethylmethyl Sulfonate (EMS) MicroTom mutant’s collection wasinitiated. 150 families (around 1800 plants) were screened for eleven enzymes with twodifferent substrate concentrations. At the end of the process, two families were identified;both could have mutation(s) that affect(s) the kinetic characteristic of Triose-Phosphateisomerase. These mutations were style investigated at the end of this project. These originalresults provide new perspectives for knowledge of relationship between central metabolism’senzymes. Finally, This project proposes new and rapid enzymatic mutant identification withina large population as an EMS mutant’s collection.

Le projet de recherche a été réalisé en collaboration avec Professeur Jean-François Masson du Département de Chimie de l'Université de Montréal. The research project was made in collaboration with Professor Jean-François Masson from the Chemistry department of University of Montreal. / L'objectif du projet de recherche est de développer une méthode de criblage d’inhibiteurs basée sur une technologie émergente, soit un dispositif portatif utilisant la résonance des plasmons de surface (SPR). La cible du criblage est la dihydrofolate réductase R67 (DHFR R67), une enzyme qui confère une résistance bactérienne à l'antibiotique triméthoprime. Ici, l'enzyme cible est immobilisée sur une surface d'or mince avec des propriétés plasmoniques (optiques) spécifiques qui varient en fonction de la masse des molécules se liant à cette surface. Cette technique permet de suivre les événements de liaison de molécules à la DHFR R67 immobilisée, et ainsi peut permettre l'identification d'inhibiteurs potentiels. Cependant, la masse molaire des inhibiteurs typiquement utilisés lors de criblages préliminaires (i.e. 500-1000 g/mol) est trop faible pour générer un signal SPR détectable. Afin de contrer cette lacune, ce mémoire a pour objet de développer un essai compétitif indirect qui mettra en jeu des molécules de masse supérieure. D’abord, une nanoparticule d'or portant un analogue de substrat se liera à la DHFR R67 immobilisée à la surface d’or, générant ainsi un signal SPR important en raison de la masse molaire élevée de la nanoparticule. Ensuite, lors du criblage d'inhibiteurs potentiels, les nanoparticules liées seront déplacées de l'enzyme cible si la molécule criblée fournit une affinité suffisante. Ainsi, il sera possible de suivre indirectement la liaison d'un inhibiteur à la cible. Ce projet vise donc à tester et à valider l'approche de criblage SPR appliquée à la DHFR R67. / The objective of the research project is to develop a method for inhibitor screening based on a portable Surface Plasmon Resonance (SPR) device, an emerging technology. The target is R67 dihydrofolate reductase (R67 DHFR), an enzyme that confers bacterial resistance to the antibiotic trimethoprim. Here, the target enzyme is linked to a thin gold surface having specific plasmonic (optical) properties that vary as a function of the mass of bound molecules. This allows monitoring binding to the surface-linked R67 DHFR, and thus permits identification of inhibitors. However, the mass of the low-affinity inhibitors typically identified in early stages of screening (i.e. 500-1000 g/mol) is too low to produce a significant SPR signal. To address this shortcoming, a competitive assay will be developed: a gold nanoparticle carrying a substrate analog will bind the surface-immobilized R67 DHFR, resulting in a strong SPR signal due to its high mass. Then, upon screening for potential inhibitors, the bound nanoparticle will be displaced from the target enzyme if a molecule provides sufficient affinity. By those means, it will be possible to indirectly monitor the binding of an inhibitor to the target. This goal of this project is to test and validate the SPR screening approach applied to R67 DHFR.

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase qui fait preuve d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-bisphosphate (FBP), du sorbose-1,6-bisphosphate et du psicose-1,6-bisphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Aldolase de classe I, qui donc catalyse sa réaction en formant un intermédiaire covalent obligatoire, ou base de Schiff, avec son susbtrat, la TBP aldolase de S. pyogenes partage 14 % d’identité avec l’enzyme modèle de cette famille, la FBP aldolase de muscle de mammifère. Bien que le mécanime catalytique de la FBP aldolase des mammifères ait été examiné en détails et qu’il soit approprié d’en tirer des renseignements quant à celui de la TBP aldolase, le manque singulier de stéréospécificité de cette dernière tant dans le sens du clivage que celui de la condensation n’est toujours pas éclairci. Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution des structures de l’enzyme native et mutée, en complexe avec des subtrats et des inhibiteurs compétitifs, à des résolutions comprises entre 1.8 Å et 2.5 Å. Le trempage des cristaux de TBP aldolase native et mutante dans une solution saturante de FBP ou TBP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire covalent lié à la Lys205, la lysine catalytique. La determination des profils pH de la TBP aldolase native et mutée, entreprise afin d'évaluer l’influence du pH sur la réaction de clivage du FBP et TBP et ìdentifier le(s) résidu(s) impliqué(s), en conjonction avec les données structurales apportées par la cristallographie, ont permis d’identifier sans équivoque Glu163 comme résidu responsable du clivage. En effet, le mode de liaison sensiblement différent des ligands utilisés selon la stéréochimie en leur C3 et C4 permet à Glu163, équivalent à Glu187 dans la FBP aldolase de classe I, d’abstraire le proton sur l’hydroxyle du C4 et ainsi d’amorcer le clivage du lien C3-C4. L’étude du mécanimse inverse, celui de la condensation, grâce par exemple à la structure de l’enzyme native en complexe avec ses substrats à trois carbones le DHAP et le G3P, a en outre permis d’identifier un isomérisme du substrat G3P comme possible cause de la synthèse des isomères en C4 par cette enzyme. Ce résultat, ainsi que la decouverte d’un possible isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP, identifié précedemment, permet de cerner presque complètement les particularités du mécanisme de cette enzyme et d’expliquer comment elle est capable de synthétiser les quatres stéréoisomères 3(S/R), 4(S/R). De plus, la résolution de ces structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. Enfin, la résolution de la structure du mutant Lys229→Met de la FBP aldolase de muscle en complexe avec la forme cyclique du FBP, de même que des études cristallographiques sur le mutant équivalent Lys205→Met de la TBP aldolase de S. pyogenes et des expériences de calorimétrie ont permis d’identifier deux résidus particuliers, Ala31 et Asp33 chez la FBP aldolase, comme possible cause de la discrimination de cette enzyme contre les substrats 3(R) et 4(S), et ce par encombrement stérique des substrats cycliques. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières. / Tagatose-1,6-bisphosphate aldolase from Streptococcus pyogenes is a class I aldolase that shows a lack of stereospecificity that is rare in enzymes in general, and in aldolases in particular. This aldolase catalyzes the reversible cleavage of tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), fructose-1,6-bisphosphate (FBP), sorbose-1,6-bisphosphate and psicose-1,6-bisphosphate, four stereoisomers, in dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and glyceraldehyde-3-phosphate (G3P). A class I aldolase, the aldolase TBP S. pyogenes shares 14 % identity with the model enzyme of this family, mammalian FBP aldolase. Although the catalytic mechanism of the class I FBP aldolase has been examined in detail and it is appropriate to infer information as to the class I TBP aldolase, the singular lack of specificity of the latter enzyme both in the direction of cleavage and condensation is still not elucidated. To better comprehend the characteristics of the enzymatic mechanism, a structural study of the TBP aldolase of S. pyogenes, an extremely versatile human pathogen, has been undertaken. It has allowed the resolution of high resolution structures of the native and mutated enzyme in complex with subtrates and competitive inhibitors. These same structures allowed us to gain information as to the active site of the enzyme in general and the catalytic residues in particular. TBP aldolase native and mutated soaked in a saturated solution of FBP or TBP also trapped an iminium intermediate covalenty bound to Lys205, the Schiff base-forming lysine. The determination of the pH profiles of the native and mutated enzyme, carried out to assess the influence of pH on FBP and TBP cleavage and identify the residue(s) involved, in conjunction with the structural data provided by crystallography, identified unequivocally Glu163, corresponding to Glu187 in FBP aldolase, as the residue responsible for substrate cleavage. The substantially different binding mode of the ligands, according to the stereochemistry of their C3 and C4 carbons, indeed allows Glu163 to abstract the proton in C3-OH and thus initiate C3-C4 bond cleavage. The study of the inverse mechanism, the condensation one, using for instance the crystallographic structure of native TBP aldolase in complex with DHAP and G3P, its three carbons substrates, has led us to believe that a possible isomerism of the G3P substrate was the reason for the synthesis of both C4 isomers by this enzyme. This result, as well as the discovery of a possible cis-trans isomerism around the C2-C3 bond of the Schiff base formed with DHAP, identified previously, almost completely elucidated the features of this enzyme`s mechanism. In addition, these structures have highlighted three highly mobile regions of the protein, which may be related to the role of its isozyme in the regulation of gene expression and virulence in S. pyogenes. Lastly, the resolution of the structure of the FBP aldolase mutant Lys229 → Met in complex with the cyclic form of FBP, as well as crystallographic studies of the corresponding mutant in TBP aldolase, Lys205→Met and ITC experiments, allowed the identification of two particular residues, Ala31 and Asp33 in FBP aldolase, as responsible for this enzyme discrimination against 3(R) 4(S) substrates, by steric hindrance of the cyclic substrates. X-ray crystallography, enzyme kinetics and isothermal calorimetry thus enabled advances in the elucidation of the mechanism and structural properties of this enzyme with singular characteristics.

La fructose-1,6-bisphosphate aldolase de classe I est une enzyme glycolytique (EC 4.1.2.13) qui catalyse le clivage réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Des années de recherche sur FBP aldolase ont permis d’identifier les résidus impliqués dans son mécanisme réactionnel, ont tracé en grande partie les coordonnées de la réaction, ont révélé de nouvelles fonctions dites « moonlighting », et ont validé l’aldolase comme une cible attrayante pour des applications anti-glycolytiques tel que le cancer. Il existe néanmoins des questions en suspens relatives à ces activités que nous avons étudiées. Tout d'abord, la trajectoire détaillée de l'aldéhyde relatif à sa liaison au site actif allant jusqu’à la formation du lien carbone-carbone par condensation aldolique est indéfini. Pour élucider les détails moléculaires liés à ces événements, nous avons déterminé des structures cristallographiques à hautes résolution de l’aldolase de classe I chez Toxoplasma gondii, qui porte une identité de séquence élevée avec l’aldolase humaine (57%), en complexe avec l’intermédiaire ternaire de pré-condensation. Le complexe ternaire révèle un mode de liaison non-productive inhabituel pour G3P dans une configuration cis qui permet l’alignement de l'aldéhyde à proximité du nucléophile naissant. La configuration compétente pour la condensation aldolique provient d'une transposition cis-trans de l'aldéhyde qui produit une liaison hydrogène courte permettant la polarisation de l'aldéhyde et le transfert de proton au niveau de Glu-189. Nos résultats informent les chimistes synthétiques qui cherchent à développer l’aldolase comme biocatalyseur pour des réactions stéréo-contrôlées. Le rôle présumé de l’aldolase dans la production du méthyglyoxal (MGO), un métabolite dicarbonyle hautement réactif qui génère des « advanced glycation end products » (AGES) a également été étudié structurellement et enzymatiquement. Une enquête structurelle cristallographique de MGO générée par décomposition enzymatique chez l’aldolase de classe I a révélé que, contrairement aux indications préliminaires, l'apparition hypothétique de MGO et de phosphate inorganique (Pi) résultant de la décomposition enzymatique de DHAP dans le site actif de l’aldolase est mieux interprétée par une population mixte de DHAP et de molécules d'eau. Une étude enzymatique a révélé que la décomposition spontannée des trioses-phosphate est une source majeure de la production de MGO, alors qu’une production catalysée par l’aldolase est peu concluante. L’identification des sources de production de MGO continue d'être une priorité afin de développer des stratégies pour atténuer les manifestations cliniques de pathologies associées au MGO. La FBP aldolase est également reconnu pour ses activités « moonlighting » - du fait qu’elle effectue plus d'une activité sans rapport avec sa fonction glycolytique. Divers partenaires de l’aldolase sont rapportés dans la littérature, y compris les adhésines de surface cellulaire chez les parasites apicomplexes, dans lequel l’aldolase exécute une fonction d'échafaudage entre le complexe actomyosine et les adhésines - une interaction qui est décisive pour la motilité et l'invasion des cellules hôte. Le mode de liaison de cette interaction a été étudié et nos résultats sont compatibles avec une liaison au site actif. Les détails précis de cette interaction ont des implications thérapeutiques, étant donné que le ciblage de celui-ci réduit l'invasion des cellules hôte par les parasites. Enfin, l’aldolase de classe I est de plus en plus reconnu pour son potentiel comme cible anti-glycolytique dans les cellules qui sont fortement tributaires du flux glycolytique, comme les cellules cancéreuses et les parasites protozoaires. Le développement de nouveaux inhibiteurs de haute affinité est donc non seulement avantageux pour des études mécanistiques, mais représente un potentiel pharmacologique sans fin. Nous avons développé une nouvelle classe d’inhibiteurs de haute affinité de type inhibition lente et avons déterminé la base moléculaire de leur inhibition grâce à des structures cristallographiques à haute résolution et par un profilage enzymatique. Cette étude, qui combine plusieurs disciplines, y compris la cristallographie, enzymologie et chimie organique, souligne l'intérêt et l'importance d'une approche multidisciplinaire. / Class I Fructose-1,6-bisphosphate aldolases are glycolytic enzymes (EC 4.1.2.13) that catalyze the reversible cleavage of fructose-1,6-bisphosphate (FBP) to dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and glyceraldehyde-3-phosphate (G3P). Years of research on FBP aldolases has identified residues implicated in the reaction mechanism, mapped the greater part of the reaction coordinates, and revealed novel moonlighting functions. Further, FBP aldolase is recognized as an attractive target for anti-glycolytic applications such as cancer. There are nevertheless outstanding questions related to these activities that were investigated in this thesis. First, the detailed trajectory of the reaction mechanism from aldehyde binding in the active site to carbon-carbon bond formation by aldol condensation is undefined. To elucidate the molecular details related to these events, we solved high-resolution crystallographic structures of native class I aldolase from Toxoplasma gondii, which has a high sequence identity with human aldolase (57 %), in complex with the pre-condensation ternary intermediate. The ternary complex reveals a condensation-incompetent binding mode for G3P in a cis-configuration that aligns the aldehyde alongside the nascent nucleophile. The productive aldol-competent configuration arises from a cis-trans rearrangement of the aldehyde that produces a short hydrogen bond required for polarization of the aldehyde and coincident proton transfer at Glu-189. Our results inform synthetic chemists seeking to develop aldolases for stereo-controlled reactions in biosynthetic applications. The suspected role of aldolase in methylglyoxal (MGO) production, a highly reactive dicarbonyl metabolite that produces advanced glycation end-products (AGES) was also probed structurally and enzymatically. A crystallographic structural investigation of MGO generated by enzymatic decomposition in class I aldolase revealed that, contrary to preliminary indications, the appearance of MGO and inorganic phosphate (Pi) resulting from enzymatic decomposition of DHAP in the active site of aldolase is more appropriately modeled by a mixed population of DHAP and water molecules. Enzymatic investigation revealed triose-phosphate decomposition to be a major source of MGO production, whereas production by aldolase did not exceed assay background levels. Identifying the main sources of MGO production continues to be a priority for mitigating the clinical manifestations of MGO-derived pathologies. FBP aldolase is also recognized for its moonlighting properties – performing more than one activity unrelated to the glycolytic function. Diverse aldolase partners are reported, including cell surface adhesins in apicomplexan parasites, in which aldolase performs a bridging function between the actomyosin complex and the cytoplasmic domain of the adhesins – an interaction that is crucial for motility and host-cell invasion. The binding mode of this interaction was investigated and our results are consistent with active site binding. The precise details of aldolase-adhesin binding has therapeutic implications, since targeting of the latter reduces host-cell invasion by parasites. Finally, class I aldolase is gaining prominence as an anti-glycolytic target in cells that are highly dependent on glycolytic flux, such as cancer cells and protozoan parasites. Developing new high-affinity inhibitors for these enzymes is therefore not only advantageous for mechanistic studies, but has endless pharmacological potential. We developed a novel class of high-affinity aldolase inhibitors, bisphosphonates, and determined the molecular basis of their inhibition with high-resolution crystallographic structures and enzymatic profiling. This study, which combined several disciplines, including crystallography, enzymology, and organic chemistry, underscores the interest and significance of a multidisciplinary approach.

Les enzymes lipolytiques sont solubles en phase aqueuse mais hydrolysent des substrats insolubles. Leurs activités lipolytiques dépendent donc fortement de l’organisation des substrats lipidiques présents sous forme de structures interfaciales telles que des émulsions, des micelles, des liposomes, ou des bicouches lipidiques. Les propriétés cinétiques et la spécificité de substrat de ces enzymes résultent de l’étape initiale d’adsorption à l’interface lipide-eau et des interactions entre le substrat et le site actif. Dans le cadre de ce travail de thèse, la technique des films monomoléculaires a été utilisée pour étudier en détail les étapes séquentielles d’adsorption, de catalyse et d’inhibition de l’enzyme à l’interface lipide-eau. Dans une première partie, nous avons réalisé la caractérisation physico-chimique de la lipase gastrique de chien (DGL), avec l’étude :  de son adsorption sur un film non substrat de dilauroylphosphatidylcholine ; ‚ de l’hydrolyse interfaciale de la 1,2-dicaprine dans des films mixtes en présence d’Orlistat. Concernant l’étape de catalyse, nous avons étudié l’effet du propeptide sur la spécificité de substrat et l’activité interfaciale de la phospholipase A2 sécrétée de groupe X de souris. Enfin, dans une troisième partie, nous avons comparé les propriétés interfaciales de la lipase YLLIP2 de la levure Yarrowia lipolytica qui serait un bon candidat pour l’enzymothérapie de substitution chez les patients atteints d’insuffisance pancréatique exocrine (IPE), la lipase pancréatique humaine et la DGL. Nos résultats ont confirmé le rôle d’YLLIP2 en tant qu’excellent « substitut » non seulement de la HPL en cas d’IPE, mais aussi de la DGL. / Lipolytic enzymes are water-soluble whereas their substrates are insoluble in water. Their lipolytic activities depend strongly on the organization of the lipid substrates present in interfacial structures such as oil-in-water emulsions, micelles, liposomes, and membrane bilayers. The kinetic properties and substrate specificity of these enzymes result from both their adsorption at the lipid-water interface, and the interactions occurring between the substrate and the active site. In this thesis work, the monomolecular film technique was used to study in details the sequential steps of adsorption, catalysis and inhibition of model enzymes at the lipid-water interface. In a first part, we performed the physico-chemical characterization of the dog gastric lipase (DGL), by studying:  its adsorption onto a dilauroylphosphatidylcholine non-substrate film; ‚ its interfacial hydrolysis of 1,2-dicaprin in mixed films with various amounts of Orlistat. Regarding the catalysis step, we studied the effect of the propeptide on the substrate specificity and interfacial activity of the murine group X secreted phospholipase A2. A model of this enzyme with its propeptide was built from the available 3D structure of the corresponding mature human enzyme. Finally, in the third part, we compared the interfacial kinetic properties of YLLIP2 lipase of the yeast Yarrowia lipolytica which has been identified as a good candidate for enzyme replacement therapy for patients with exocrine pancreatic insufficiency (EPI), human pancreatic lipase and DGL. Our results confirmed the role of YLLIP2 as an excellent "substitute" not only for HPL in case of PEI, but also for the DGL at acidic pH values.

Ces travaux de thèse s'articulent autour de deux projets : les études structure-fonction de l'aminopeptidase A, d'une part, et celles du récepteur de l'apéline, d'autre part. I/ L'aminopeptidase A (APA, EC 3.4.11.7) est une aminopeptidase monozinc membranaire qui, dans le cerveau, produit l'angiotensine (Ang) III à partir de l'Ang II. L'Ang III est l'un des principaux peptides effecteurs du système rénine-angiotensine cérébral qui exerce un effet stimulateur tonique sur le contrôle central de la pression artérielle chez le rat hypertendu. Ainsi le blocage de l'APA par un inhibiteur spécifique et sélectif, l'EC33 ou sa prodrogue, le RB150, normalise la pression artérielle dans deux modèles expérimentaux d'hypertension artérielle (HTA). L'APA constitue une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de l'HTA qui justifie le développement de nouveaux inhibiteurs de cette enzyme plus puissants et plus sélectifs que l'EC33 et avec un profil pharmacodynamique et pharmacocinétique amélioré par rapport au RB150. Pour cela, nous avons construit un modèle tridimensionnel (3D) de l'APA sur la base de la structure cristallographique de l'APA humaine récemment publiée. Nous avons ensuite validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée en démontrant l'implication, d'un résidu du sous-site S1 dans la spécificité de substrat acide de l'APA et de deux résidus formant le sous-site S2' interagissant avec le résidu P2' acide d'inhibiteurs tripeptidiques précédemment développés dans le laboratoire.II/ L'apéline est le ligand naturel du récepteur orphelin humain APJ (ApélineR), un récepteur à sept domaines transmembranaires couplé aux protéines G. L'apéline et son récepteur sont impliqués dans le maintien de l'équilibre hydrique et des fonctions cardiovasculaires. L'ApélineR constitue une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de l'insuffisance cardiaque et des rétentions hydriques. Etant donné que la demi-vie de l'apéline dans la circulation sanguine est de l'ordre de la minute, l'objectif est de développer des analogues de l'apéline métaboliquement stables. Pour développer de tels composés, nous avons entrepris de comprendre comment l'apéline se lie à son récepteur et comment elle l'active. Dans ce but, nous avons construit un modèle 3D de l'ApélineR basé sur la structure cristallographique du récepteur aux chimiokines, CXCR4. Nous avons validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée. Nous avons identifié à la surface du récepteur, les résidus acides des boucles extracellulaires qui interagissent avec les résidus basiques de l'apéline. Nous avons ensuite développé des analogues de l'apéline-17 (K17F) métaboliquement stables par deux stratégies différentes. Premièrement, nous avons substitué chacun des résidus de l'apéline par son énantiomère de la série D ou par un acide aminé synthétique. Deuxièmement, nous avons ajouté une chaîne fluoroalkyle à l'extrémité N-terminale de l'apéline. Ces deux stratégies ont permis d'obtenir plusieurs composés dont les plus actifs sont le P92 et le LIT01-196 qui conservent des propriétés pharmacologiques identiques à celles de K17F et qui présentent une demi-vie plasmatique largement supérieure à celle du peptide endogène. Ces deux analogues se sont révélés particulièrement actifs in vivo avec une capacité à diminuer la pression artérielle et à réduire la sécrétion de vasopressine dans le sang conduisant à une augmentation de la diurèse aqueuse. Les modèles 3D validés de l'APA et de l'ApélineR seront utilisés pour des campagnes de criblage in silico de chimiothèques virtuelles afin de découvrir de nouveaux inhibiteurs de l'APA et des agonistes de l'ApélineR qui pourraient conduire à terme à de nouveaux candidats-médicaments. Ces composés pourraient être utiles pour le traitement de l'HTA et de l'insuffisance cardiaque. / The doctoral work was divided in two parts, one on the structure-function studies of aminopeptidase A, and the second one, on those of the apelin receptor. I/ Aminopeptidase A (APA) is a membrane bound monozinc aminopeptidase which generates, in the brain, angiotensin (Ang) III from Ang II. Ang III is one of the main effector peptides of the brain renin-angiotensin system, which exerts a tonic stimulatory action on the control of blood pressure in hypertensive rats. Thus, the blockade of brain APA by a specific and selective inhibitor, EC33 or its prodrug, RB150, normalizes blood pressure in two animal models of arterial hypertension (HTA). APA constitutes a potential therapeutic target for the treatment of HTA that justifies the development of more potent and selective APA inhibitors than EC33, with enhanced pharmacodynamic and pharmacokinetic profiles when compared to RB150. With this aim, we built a three dimensional (3D) model of APA based on the recently published crystal structure of human APA. We validated this model by structure-function studies combining molecular modeling and site-directed mutagenesis demonstrating the crucial role of one residue in the S1 subsite responsible for substrate specificity of APA for N-terminal acidic amino-acid residues and two other residues constituting the S2' subsite of APA involved in the binding of the P2' acidic residue of tripeptidic inhibitors, previously developed in the laboratory. II/ Apelin is the endogenous ligand of the human orphan receptor named APJ (ApelinR), a G protein-coupled receptor. Apelin and ApelinR are involved in the control of body fluid homeostasis and cardiovascular functions. ApelinR constitutes a potential therapeutic target for the treatment of heart failure and water retentions. Given that apelin half-life in the blood circulation is in the minute range, we aimed to develop potent metabolically stable apelin analogs.. In this context, it is necessary to understand how apelin binds to ApelinR and how it is activated. To do so, we build a 3D model of ApelinR based on the crystal structure of the chemokine receptor, CXCR4. We validated this model by structure-function studies by molecular modeling and site-directed mutagenesis. We showed that apelin interacts with the receptor through interactions between the basic residues of the peptide and the acidic residues of the ApelinR, located in the extracellular loops. ,We then developed metabolically stable apelin-17 (K17F) analogs following two different strategies. First, we substituted each residue of K17F by its D-isomer or a synthetic amino-acid. Secondly, we added a fluoroalkyl chain at the N-terminal part of K17F. These two strategies allowed to significantly improve plasma half-life of the modified peptides for several hours without modifying their pharmacological properties as compared to K17F. Two apelin metabolically stable analogs, P92 and LIT01-196, were found to have significantly higher in vivo activity than K17F with a strong capacity to decrease blood pressure and to inhibit vasopressin release in the blood stream inducing an increased aqueous diuresis. These new validated 3D models will be now used to perform in silico screening of virtual chemical libraries to discover new APA inhibitors and ApelinR agonists that could ultimately lead to new drug candidates. These compounds could be useful for the treatment of HTA and heart failure.