Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Henrique Leonel Lenzi / Banca: Christiane Pienna Soares / Banca: Maria José Soares Mendes Giannini / Resumo: Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico, agente de doença granulomatosa crônica denominada de paracoccidioidomicose (PCM), com grande variedade de manifestações clínicas, desde formas localizadas até disseminadas evoluindo para letalidade. O fungo tem capacidade de aderir, extravasar e invadir barreiras impostas pelos tecidos do hospedeiro. Em ensaios in vitro verificou-se que P. brasiliensis pode aderir e invadir células epiteliais, aparecendo algumas vezes internalizado dentro de um vacúolo. A identificação do mecanismo pelo qual este fungo adere, invade e sobrevive no interior da célula hospedeira é campo fértil para a descoberta de sua patogênese. Para tanto, a análise de proteínas presentes no microrganismo e nas células do hospedeiro e também os marcadores da via endocítica para co-localizar os microrganismos no interior das mesmas é o objetivo deste estudo. Assim, foi realizada a infecção de células epiteliais A549 e macrófagos AMJ2-C11com P. brasiliensis (Pb18) nos períodos de 3, 5, 8, 24 e 3, 5, 10 e 24h, respectivamente e feitas análises por técnicas de imunofluorescência para as proteínas de junções compactas, junções aderentes, junções tipo fenda e proteínas de ancoramento intracelular, bem como as proteínas da via endocítica. Entres estas, foram ensaiadas a expressão de clatrina, Rab7 e LAMP-1 por imunofluorescência e EEA1, Rab7 e LAMP-1 por imunoblot. As proteínas de junções foram expressas nas células, bem como na parede do fungo. A clatrina foi evidente na célula e aparentemente mais expressa na parede do fungo. Nas células A549 não houve alteração na expressão de Rab7 e LAMP-1, tanto na imunofluorescência quanto no imunoblot, sendo que para EEA1 e Rab5 não foi evidenciada alteração na expressão pela técnica de imunoblot. Rab7 foi expressa nos macrófagos, localizada na periferia das células e também no... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis is a thermally dimorphic fungus, the etiologic agent of paracoccidioidomycosis (PCM). PCM is a polymorphic disease manifested by an array of diverse clinical manifestations and varying organ involvement. P. brasiliensis may actively penetrate the mucocutaneous surface and parasitize epithelial cells, thus evading the host defenses and reaching deeper tissues. The ability of this fungus to adhere to and invade non-professional phagocyte cells has been observed. In vitro assays verify that P. brasiliensis can adhere and could appear internalized within vacuole. The identification of the mechanism by which this fungus adheres, invades and survivor inside the host cell is a fertile area for discover their pathogenesis. The aim of this study was analyzed the junctions proteins in the fungus and the host cells, as well as the endocytic markers to colocate the microorganisms inside the cells. Thus, the infection was performed in A549 epithelial cells and macrophages AMJ2-C11 with P. brasiliensis (PB18) for periods of 3, 5, 8, 24 and 3, 5, 10 and 24 h, respectively, and the immunofluorescence analysis was developed for the proteins claudin-1, claudin-4, E-cadherin, conexin 43, talin e vinculin, and the endocytic proteins. The macrophages and the cells A549 have been blemish along anti-clatrin, anti-Rab7 and anti-LAMP-1. The junctions' proteins have been expressed at the cells, as well as on the wall from the fungus. The clathrin was present at the cells and apparently more expressed on the fungus wall. Rab7 and LAMP-1 were not expressed in the cells A549 as demonstrated by the imunofluorescence and the imunoblot. On the contrary Rab7 was expressed in macrophages located at the periphery of the cells and also in the own fungus. The expression of LAMP-1 apparently not presented alteration both at the imunofluorescence and at the imunoblot. The expression of EEA1 was... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T16:23:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Damas-Souza_DaniloMarchete_M.pdf: 1284568 bytes, checksum: 788b3e248502f5efa2f129d8ab2c6bb8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Na próstata, o crescimento e a fisiologia epitelial dependem da expressão dos receptores de hormônios esteróides por alguns tipos celulares e das interações parácrinas que se estabelecem a partir da resposta inicial a estes hormônios, associados a uma complexa interação com hormônios somatotróficos como insulina, prolactina e hormônio de crescimento. Este estudo investigou a ação da insulina sobre a sobrevivência das células epiteliais prostáticas frente à privação androgênica, e sua possível contribuição para a defasagem entre a queda dos níveis de andrógeno (até 12 horas após castração) e o pico de morte das células epiteliais (72 horas após castração), monitorando a cinética de morte celular em animais castrados em comparação com aquelas de animais diabéticos induzidos com aloxana. A indução do diabetes causou uma redução da densidade de volume e do volume do epitélio. Esta redução foi maior com a aplicação de insulina. O mesmo foi observado para as células musculares lisas, mas não para o compartimento luminal e estromal. A castração tem um efeito tardio sobre o epitélio, com reduções tanto da densidade de volume como do volume somente 96 horas após castração. Já nos animais diabéticos o efeito é observado já às 24h após castração. Relação inversa se dá com o lúmen. Embora tenham sido observados aumentos na densidade de volume do estroma, não houve efeito significativo no volume final após 120 horas. No caso das células musuclares lisas, não foi observado efeito da castração, no período analisado. Já no caso dos animais diabéticos, há uma redução significativa dentro do período analisado. A reação de Feulgen permitiu analisar a morfologia nuclear e a observar uma antecipação do pico de apoptose para 48 horas após a castração na ausência de insulina. A aplicação de insulina restaura a posição do pico para as 72h e diminui a taxa de morte celular em todos os pontos experimentais analisados, antes e após castração. Os mecanismos moleculares envolvidos nestas respostas estão relacionados à privação androgênica associada a um elemento de sobrevivência celular promovido pela insulina. Na ausência desta, ocorre uma antecipação da morte das células epiteliais. Esta hipótese é reforçada pela observação de que a insulina exógena não somente restaura o pico às 72 horas, como reduz a taxa de apoptose, inclusive nos animais não castrados. / Abstract: Prostate growth and physiology depend on the expression of steroid receptors in some cell types and on paracrine interactions established after the initial response to these hormones in association with somatotrophic hormones such as insulin, prolactin and growth hormone. This study investigates the action of insulin on the survival of prostate epithelial cells in response to androgen deprivation, and its possible contribution to the lag between the drop in androgen levels (within 12 hours after castration) and the peak of the epithelial cell death (at 72 hours after castration), by monitoring the kinetic of cell death in castrated animals as compared to that in alloxan-induced diabetic animals. Diabetes induction caused a reduction in epithelial volume density and volume. This reduction was higher with the administration of insulin. The same was observed for the smooth muscle cells, but not for the luminal and stromal compartments. Castration has a later effect on the epithelium of non-diabetic animals, with reduction in the volume density and volume only 96 hours after castration. In the diabetic animals, the effect is already observed 24 hours after castration. The opposite behavior was observed for the lumen. There were increases in the volume density of the stoma, but no effect on its volume 120 hours after castration. Feulgen reaction allowed the examination of the nuclear morphology and the observation of an anticipation of the peak of apoptosis to 48 hours after castration in the absence of insulin. Insulin administration restores the peak to 72 hours and reduces the rate of cell death in all experimental points. It is suggested that an element of cell survival promoted by insulin acts in concert with the response to androgen deprivation. This idea is strengthened by the observation that insulin not only restores the apoptosis peak at 72 hours, but also reduces the percentual of apoptosis cells. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Mary Ann Foglio, Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz, João Ernesto de Carvalho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:38:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zago_PatriciaMariaWiziack1982-_D.pdf: 5120519 bytes, checksum: a581f776ecdecf5822427a828d170cc1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A Osteonecrose Maxilar Induzida por Bisfosfonatos (OMIB) está associada à terapia com bisfosfonatos como o ácido zoledrônico (ZA), que são medicamentos importantes para o manejo de patologias ósseas. Estudos in vitro demostraram que os bisfosfonatos podem alterar a viabilidade e proliferação de células epiteliais, o que justificaria situações de deficiente cicatrização em feridas de OMIB. Arrabidaea chica (H&B.) Verlot é uma Bignoniaceae com propriedades cicatrizantes, e que apresenta as antocianidinas como principais compostos identificados. Este estudo avaliou a atividade antimicrobiana, citotóxica e citoprotetora, in vitro, do extrato hidroalcoólico de A. chica (AC) na presença de ZA. Foi realizado estudo de estabilidade nas condições de 40 °C e 75% umidade, do extrato microencapsulado em mistura de goma arábica com maltodextrina (1:1) e do extrato livre correspondente. Queratinócitos (HaCaT), fibroblastos (PT64-04HF) e osteoblastos (MC3T3-E1) foram submetidos a 2 protocolos de tratamento: a exposição a ZA 10 µM por 24h e posteriormente AC por 48h e vice-versa; ou o co-tratamento de ambos. Os parâmetros estudados foram viabilidade, ocorrência de apoptose e ativação de caspases 3/7. A viabilidade de células de câncer de próstata (C4-2B) foi avaliada após tratamento com AC. Streptococcus mutans foram submetidos ao co-tratamento ZA e AC. Microcápsulas contendo AC foram produzidas por processamento em spray dryer, aliquotadas e armazenadas em câmara climática para o estudo de estabilidade acelerada, segundo protocolo da ANVISA (RE 01/2005). Os resultados foram submetidos à análise estatística (ANOVA e Teste T de Student, a=0,05). Após 48 h, ZA reduziu a viabilidade de queratinócitos, fibroblastos e osteoblastos em, respectivamente, 34%, 47% e 51%. O co-tratamento ZA e AC 5 µg mL-1 aumentou a viabilidade celular (82%, 83% e 55%), o mesmo ocorrendo para ZA e AC 10 µg mL-1 (69%, 70% e 64%). Após 48 h de tratamento com ZA, não houve apoptose celular ou ativação de caspases em fibroblastos, mas verificou-se a ativação de caspase 3/7 em osteoblastos. As concentrações de 5 e 10 µg mL-1 de AC não alteraram a viabilidade de células C4-2B, porém observou-se uma redução de mais de 40% em concentrações maiores que 10 µg mL-1. O crescimento de S. mutans foi aparentemente aumentado após o tratamento com ZA em concentrações maiores que 50 µM, sem que AC ocasionasse qualquer efeito. Finalmente, o material formador de parede (mistura de goma arábica com maltodextrina 1:1) empregado para microencapsular AC, foi incapaz de inibir a degradação das antocinidinas, cujas concentrações relativas foram reduzidas após 15 dias de incubação. Assim, baixas concentrações de AC (5 e 10 µg mL-1) demostraram promissora atividade citoprotetora contra os efeitos prejudiciais de ZA, em células epiteliais e osteoblastos, sem estimularem o crescimento das células cancerígenas (C4-2B) e de S. mutans. Outros materiais formadores de parede serão avaliados, buscando-se aumentar a estabilidade química de AC. Mais estudos são necessários para a comprovação dos efeitos benéficos de AC como um auxiliar no tratamento de OMIB / Abstract: The bisphosphonate related osteonecrosis of the jaw (BRONJ) is a condition associated to bisphosphonates, medicines used to treat bone disorders, as zoledronic acid. In vitro studies showed epithelial cells viability and growth can be altered by bisphosphonates, and may cause a deficient wound healing in BRONJ. Arrabidaea chica (H&B.) Verlot is a Bignoniaceae with wound healing properties, however, anthocyanidins, the main compounds of the plant extract, can be easily degraded under environmental conditions. This in vitro study aimed to evaluate the antimicrobial, citotoxic and citoprotective actions of A. chica hydroalcoholic extract (AC) in the presence of ZA therapy. Stability studies at 40 °C and 75% humidity conditions, from microencapsulated into arabic gum plus maltodextrin (1:1) and free crude extract samples were conducted. Keratinocytes (HaCaT), fibroblasts (PT64-04HF) and osteoblasts (MC3T3-E1) were submitted to 2 treatment protocols: zoledronic acid 10 µM (ZA) therapy during 24 h and then AC during 48 h and vice-versa; or co-treatment with both. Parameters as viability, apoptosis and caspase 3/7 activation were evaluated. Cancer cells (C4-2B) viability was determined after AC treatment. Streptococcus mutans were submitted to co-treatment with ZA and AC. Microcapsules containing AC were obtained after spray dryer processing, aliquoted and stored into climatic chamber for stability study according to ANVISA protocol (RE 01/2005). ANOVA and T Student test, ?a=0,05, were applied for statistical analysis. After 48 h, ZA treatment decreased viability of keratinocytes, fibroblasts and osteoblasts repectively by 34%, 47% and 51%. Co-treatments ZA and AC 5 µg mL-1 (82%, 83% and 55%), and ZA and AC 10 µg mL-1 (69%, 70% and 64%) increased cell viability. No apoptosis or caspase activation were detected on fibroblasts, however, caspase 3/7 was active on osteoblasts after ZA 48 h treatment. Concentrations higher than 10 µg mL-1 of AC were toxic to cancer cells and showed a decrease by 40% in cell viability, while no effect was seen with AC 5 or 10 µg mL-1. Higher ZA concentrations (50 µM) seemed to induce S. mutans growth, while AC showed no effect on bacteria. Finally, the studied core matherial (arabic gum plus matodextrin 1:1) was ineffective on protecting AC extract against degradation, since anthocyanidins concentration was reduced after 15 days incubation. Therefore, lower AC concentrations (5 and 10 µg mL-1) were promising on treating BRONJ wounds, as they were effective in protect epithelial cells against harmfull effects of ZA, without affecting cancer cells or S. mutans growth. Different types of core matherials must be evaluated for improving AC chemical stability. More studies are required to prove AC beneficial effects on treating BRONJ / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutora em Odontologia

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T21:24:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Damas-Souza_DaniloMarchete_D.pdf: 2083384 bytes, checksum: f2c3f40fb23b6b092127e3ba4a576d24 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O crescimento e a fisiologia da próstata é dependente da expressão de receptores esteróides em alguns tipos celulares e de interações parácrinas estabelecidas após a resposta inicial a esses hormônios, em associação com hormônios somatotróficos como a insulina. O presente trabalho tem o objetivo de caracterizar componentes moleculares relacionados aos mecanismos de adaptação das células epiteliais prostáticas de rato na ausência andrógeno e/ou insulina e possíveis conexões com as vias gerais de regulação do metabolismo celular, monitorando diferentes pontos da via de sinalização integradas pelos TSC1-TSC2 e mTORC1 e mTORC2. Foram empregados 54 ratos Wistar adultos jovens com idade entre 75 e 105 dias. Os animais foram induzidos diabetes por injeções intraperitoneal de aloxana, em seguida, os ratos foram divididos em não diabético (ND), diabético (DIA) e diabético tratado com insulina (INS), somados a castração cirúrgica e sacrificados 48 e 72 horas após a castração. Utilizando a técnica de Western Blotting foram analisados os conteúdos e fosforização de mTOR, p70S6K, eIF4B, 4E-BP, eIF4E e p53. Os resultados obtidos no presente trabalho identificam uma nítida função do estímulo androgênico na regulação negativa de eIF4E (via 4E-BP1) e positiva de eIF4B. Ficou claro também que a insulina regula positivamente a fosforilação de 4E-BP1 e que a privação androgênica promove aumento de p53. Assim dois mecanismos parecem essenciais para a manutenção e seleção das células epiteliais prostáticas de ratos: (I), p53/4E-BP/eIF4E na ausência de andrógeno; (II), p70S6K/eIF4B na ausência de insulina. Apoio financeiro: CNPq, Capes / DS e FAPESP / Abstract: The growth and physiology of the prostate is dependent on steroid receptors in certain types of cells and the paracrine interactions established after the initial response to these hormones in combination with somatotropic hormones such as insulin. The current work aims to characterize the molecular components related to the adaptation mechanisms of the epithelial cells in the prostate of rats. In addition to the absence of androgen and/or insulin and possible connections with the general pathways regulating cell metabolism, monitoring different points of the signaling pathways that integrate TSC1- TSC2 and mTORC1 and mTORC2. 54 male Wistar rats aged between 75 and 105 days were used for the current work. Diabetes was induced by intraperitoneal injection of alloxan and the rats were divided into non-diabetic (ND), diabetic (DIA) and diabetic treated with insulin (INS) groups. Every group was divided into three sub groups and the rats were sacrificed non castrated, surgically castrated 48 and 72 hours. Using Western blotting the contents and phosphorylation of mTOR, p70S6K, eIF4B, 4E- BP, eIF4E and p53 were analyzed. The results obtained in this study identify a clear function of androgenic stimulation in the negative regulation of eIF4E (by 4E-BP1) and positive regulation eIF4B and p53. It also became clear that insulin positively regulates the phosphorylation of 4E-BP1. In conclusion two mechanisms seem to be essential for the maintenance and selection of prostatic epithelial cells in rats: (I) p53/4E-BP/eIF4E in the absence of androgen, (II ) p70S6K/eIF4B in the absence of insulin. Financial support: CNPq , CAPES / DS and FAPESP / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:28:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3453_1.pdf: 6248742 bytes, checksum: 6d46a06a72e19950f5e91e03734d6053 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Organização Panamericana de Saúde / A infecção genital pelo Papilomavírus Humano (HPV) é uma das doenças sexualmente transmissíveis (DST) mais freqüentes e o principal fator etiológico do câncer cervical. Capaz de desenvolver Lesões Intra-epiteliais Cervicais (LIE), precursoras do câncer cervical, o HPV é mais diagnosticado em mulheres portadoras do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). O objetivo deste estudo foi avaliar, por meio de técnicas de biologia molecular, a freqüência da infecção pelo HPV, em mulheres imunodeprimidas, gestantes e não-gestantes HIV-positivas. O método consistiu em estudo, de caráter analítico, de um total de 147 mulheres, sendo 51 gestantes HIV-soropositivas, 51 mulheres HIV-positivas não-gestantes e 45 mulheres gestantes HIV-negativas, todas atendidas em maternidade pública de referência para acompanhamento de pacientes infectadas pelo HIV/AIDS e recrutadas entre abril de 2006 e maio de 2007. Elas responderam a questionário estruturado e submeteram-se a coleta endocervical para pesquisa de HPV por métodos moleculares (PCR e CH II) e métodos morfológicos (citologia e colposcopia com biópsia dirigida, quando necessária). As pacientes soropositivas tiveram registradas carga viral e contagem de células TCD4, mediante consultas aos respectivos prontuários. Dentre os resultados obtidos, vale ressaltar os seguintes: o DNA-HPV foi detectado em 122 mulheres (85,3%) de um total de 143, com elevada proporção de tipos de alto risco para câncer; no grupo das gestantes HIV-positivas, a prevalência alcançou 96,0 % (48/50), sendo 68,8% de alto risco (33/48 casos); os HPV-16, 58, 18, 66 e 31 foram os mais freqüentes; a concordância dos métodos moleculares (PCR e CH II) foi fraca (Kappa=0,119, p=0,031); as alterações colpocitológicas foram identificadas em 18 não-gestantes HIV-positivas (35,3%), em 11 gestantes soropositivas (21,6%), com predomínio de lesões de baixo grau; as chances de LIE estão associadas a tabagismo (OR=2,78 IC95% 1,14-6,77), outras drogas fumadas (OR=2,96 IC95% 1,09-8,05) e níveis de CD4 ≤ 200 células/mm³, no grupo de mulheres HIV-positivas; no grupo de gestantes, tabagismo (OR=3,70 IC95% 1,25-10,9), outras drogas fumadas (OR=4,24 IC95% 1,26-14,2), baixa renda familiar (OR=3,36 IC95% 1,11-10,2) e número de parceiros sexuais (OR=3,10 IC95% 0,87-10,9). Entre as gestantes HIV positivas a infecção por Chlmydia trachomatis foi 4 vezes mais freqüente (17,6%). O estudo permitiu concluir que a alta prevalência de infecção pelo HPV, especialmente pelos tipos de alto risco 16, 58, 18 e 66, identificados, por vezes, em infecções múltiplas, destaca essa população como de risco elevado para câncer cervical. Os resultados demonstram características particulares da infecção pelo HPV, em mulheres HIV- positivas da região Nordeste do Brasil e apontam para a necessidade de avaliação ginecológica e de colpocitologia oncótica periódica, visando à detecção precoce das neoplasias cervicais

The photobiomodulation therapy (PBMT) has many demonstrated applications in the health area including anti-inflammatory and wound healing effects. The main objective of this work is to verify if the PBMT causes measurable changes in the mechanical properties of cells, specifically in red blood cells, epithelial cells and fibroblasts. In addition, to contribute to the knowledge of the action mechanisms of the PBMT, this study intends to support applications of the PBMT during invasive procedures, such as the direct photo-treatment of the blood in surgical procedures with cardiopulmonary bypass, regarding security of the cellular integrity. For this analysis, three experimental techniques were used: optical magnetic twisting cytometry (OMTC), defocusing microscopy and confocal laser-scanning microscopy. Human bronchial epithelial cells were evaluated with OMTC. The epithelial cell culture was either photo-treated or not, with red laser (lambda=660 nm), and fixed power and time (power density of 153 mW/cm2, time 300 s). It was not possible to observe significant differences between photo-treated and control epithelial cells, for the hysteresivity (ratio between the cell loss and elastic shear moduli). The defocusing microscopy, similar to a phase contrast microscopy, was used to study human red blood cells from fresh blood. The red blood cells were either photo-treated or not, with red laser (lambda=660 nm), and different powers and times (power densities from 0 to 510 mW/cm2, times from 0 to 180 s). Some morphological and mechanical characteristics of individual red blood cells were evaluated, such as volume, radial profile of cell thickness, lateral and vertical membrane fluctuations, for the photo-treated and control red blood cells. It was not possible to detect differences between the two groups, for any of the parameters analyzed. For both techniques, the absence of detectable differences might be due to several factors, such as the non-action of the PBMT, with the parameters used, in the epithelial cells and red blood cells or to the small sensitivity of each technique. Confocal laser-scanning microscopy was used to evaluate the actin filaments of mouse fibroblasts. The fibroblast cell culture was either photo-treated or not, with red (lambda=625 nm) or infrared (lambda=808 nm) light and fixed power and time (power density from 113 to 158 mW/cm2, time 300 s). The nucleus and cell areas increased slightly when comparing photo-treated and control cells. On the other hand, the total actin, total actin density and the number of filaments decreased. These changes were detected for a short time after treatment, however, after 24 h they are not anymore detectable. The total branch length does not seem to suffer any modifications. In summary, with the data acquired with the three techniques, it was found that the PBMT, in the red range, with the parameters used, could not cause noticeable changes in red blood cells and epithelial cells, in vitro. On the other hand, the PBMT in the red and near-infrared range, with the power and times used, cause changes in actin filaments of fibroblasts, in vitro, in particular the decrease of the total actin density. / A terapia por fotobiomodulação tem muitas aplicações na área de Saúde devido a sua ação anti-inflamatória e de reparação tecidual. O objetivo geral desse trabalho é verificar se a terapia por fotobiomodulação provoca mudanças nas propriedades mecânicas de células, em particular em hemácias, células epiteliais e fibroblastos. Além de contribuir com o conhecimento dos mecanismos de ação da terapia por fotobiomodulação, este estudo pretende subsidiar aplicações da terapia por fotobiomodulação durante procedimentos mais invasivos, como a iluminação direta do sangue em procedimentos cirúrgicos com circulação extracorpórea, sob o ponto de vista da segurança quanto à integridade celular. Para essa análise foram utilizadas três técnicas experimentais: citometria óptica magnética de oscilação (OMTC), microscopia de desfocalização e microscopia confocal. Com a técnica de OMTC foram avaliadas células epiteliais brônquicas humanas em cultura, foto-tratadas com laser vermelho (lambda=660 nm), com potência e tempo fixos (densidade de potência de 153 mW/cm2, tempo 300 s). Não foi possível constatar diferenças significativas entre as células epiteliais foto-tratadas e as células controle, para a histerisividade (razão entre os módulos viscoso e elástico das células). Com a técnica de microscopia de desfocalização, semelhante a uma microscopia de contraste de fase, foram estudadas hemácias humanas de sangue recém coletado. As hemácias foram tratadas com laser vermelho (lambda=660 nm), com potências e tempos variados (densidade de potência de 0 a 510 mW/cm2, tempo de 0 a 180 s). Foram avaliadas algumas características morfológicas e mecânicas das hemácias individualmente, como o volume, perfil radial de espessura, flutuações lateral e vertical da membrana, tanto para hemácias foto-tratadas quanto para hemácias controle. Não foi possível detectar diferenças entre as hemácias foto-tratadas e controle para nenhum dos parâmetros avaliados. Para ambas as técnicas, a falta de mudanças observáveis poderia ser devida a diversos fatores, como a não ação da terapia por fotobiomodulação nas células epiteliais e nas hemácias, com os parâmetros aqui empregados, ou à falta de sensibilidade de cada uma das técnicas usadas. A microscopia confocal foi utilizada para avaliar os filamentos de actina de fibroblastos de camundongo em cultura, os quais foram foto-tratados com luz vermelha (lambda=625 nm) ou infravermelha (lambda=808 nm) e potência e tempo fixos (densidade de potência de 113 a 158 mW/cm2, tempo 300 s). Foi possível constatar ligeiro aumento nas áreas nuclear e celular das células foto-tratadas em relação aos fibroblastos controle. Também foi possível verificar a diminuição da quantidade total de actina, densidade de actina e do número de filamentos de actina nos fibroblastos foto-tratados. Essas mudanças são detectadas para tempos curtos após o tratamento, sendo que depois de 24 h elas desaparecem. O tamanho total dos filamentos parece não sofrer alterações. A partir dos dados coletados com as três técnicas, foi possível constatar que a terapia por fotobiomodulação, com os parâmetros utilizados, não consegue provocar mudanças perceptíveis em hemácias e em células epiteliais, in vitro. Porém, causa mudanças nos filamentos de actina de fibroblastos, in vitro, em particular a diminuição da densidade de actina total.

Avanços na identificação e caracterização de diferentes populações de célulastronco tem melhorado as perspectivas do seu uso clínico. A maioria dos estudos obtêm as células-tronco com base na expressão de marcadores de superfície celular e testa as suas propriedades por meio de ensaios funcionais in vitro e in vivo. Na presente pesquisa foram isoladas diferentes populações de células epiteliais com base na expressão de dois marcadores de células-tronco epiteliais descritos pela literatura, o receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) e o receptor de transferrina 1 (CD71). Uma vez isso feito, foi avaliado a co-expressão de outros marcadores de células-tronco epiteliais, como as integrinas 6 e 1, e realizado ensaios de eficiência de formação de colônias, potencial de crescimento celular, capacidade de reconstrução epitelial in vitro, análise da resposta ao trauma e avaliação da capacidade de auto renovação. Os resultados mostram que as células p75NTR+ tem um desempenho funcional melhor do que as p75NTR- na maioria dos ensaios funcionais realizados, exceto pela capacidade de responder ao trauma e de se autorenovar. Ademais, comprovou-se que células p75NTR+ expressam em maior proporção as integrinas 6 e 1 e que o isolamento de células por dupla marcação (p75NTR+CD71-) possibilita a obtenção de uma população de células epiteliais ainda mais enriquecida com estes marcadores. No entanto, foi observado também que independentemente da população celular estudada e do tempo em cultivo, as populações de células epiteliais alteraram drasticamente o seu fenótipo quando de tal forma que as populações celulares inicialmente positivas se tornaram majoritariamente negativas e que as populações celulares inicialmente negativas passaram a ter células positivas em seu meio. / Recent advances in cell sorting and characterization technics of stem cells have provided new insights and perspectives for clinical applications of this particular cell population. Most of the studies isolat stem cells based on the expression of cell surface markers and evaluate their stem cells-like proprieties by performing in vitro and in vivo assays. Here we isolated different populations of keratinocytes based on the expression of the epithelial stem cell markers neurotrophin receptor p75 (p75NTR) and transferrin receptor 1 (CD71). The co-expression of other epithelial stem markers such as integrins 6 and 1 was also assessed and in vitro functional assays such as colony-forming efficiency; long-term growth potential, in vitro epithelial reconstruction-capacity and response to damage and self-renew capacity. Our results showed that p75NTR+ve cells have better functional proprieties in most of the assays however they did not respond to damage nether presented self-renew capacity. Additionally, p75NTR-ve cells express higher percentage of other epithelial stem cell markers such as integrins 6 and 1 when compared to p75NTR-ve cells and the double staining (p75NTR+veCD71-ve) contributes to isolate a more enriched cell population based on the expression of the integrins. Nevertheless, independently of the cell population or of the amount of time in culture, cells have changed dramatically their phenotype in a way that the cell population initially p75NTR+ve lost the expression of the p75NTR and the negative population have gained it.

O patótipo de Escherichia coli diarreiogênica denominado E. coli enteroagregativa (EAEC) é caracterizado pela expressão do padrão de adesão agregativo (AA) em células epiteliais cultivadas. Amostras de EAEC são classificadas como típicas ou atípicas, dependendo da presença ou não do gene aggR, respectivamente. O padrão AA no teste de adesão em células epiteliais é o diagnóstico padrão para a classificação de EAEC. Técnicas moleculares, como a PCR multiplex, são alternativas a esse teste. No presente estudo foi desenvolvida uma PCR multiplex para o diagnóstico molecular de EAEC típica e atípica, baseada na detecção dos genes aatA, aggR, aaiA e aaiG. A partir de colônias isoladas de E. coli de origem fecal o teste apresentou sensibilidade de 94,8%, especificidade de 94,7%, valor preditivo de teste positivo de 74,3% e valor preditivo de teste negativo de 99,1%. O teste desenvolvido mostrou-se uma alternativa diagnóstica sensível e específica para EAEC e permite um acréscimo significativo na detecção de EAEC atípica. / The diarrheagenic Escherichia coli pathotype known as enteroaggregative E. coli (EAEC) is characterized by the expression of the aggregative adherence pattern (AA) on cultured epithelial cells. EAEC strains are classified as typical or atypical, depending on the presence or absence of the aggR gene, respectively. The AA pattern in the adherence assay with epithelial cells is the gold standard diagnostic for EAEC. Molecular techniques, such as multiplex PCR, are alternatives to this test. In the present study we developed a multiplex PCR for the molecular diagnostic of typical and atypical EAEC, based on the detection of aatA, aggR, aaiA and aaiG genes. The test presented 96.5% of sensitivity, 94.8% of specificity, 74.3% of positive predictive value and 99.1% of negative predictive value, when tested in isolated colonies of E. coli from feces. The test developed is a sensitive and specific diagnostic alternative for EAEC and allows a significant increase in atypical EAEC detection.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Estreptococos do grupo B (EGB) comumente colonizam adultos saudáveis, sem sintomas, mas sob certas circunstâncias possui a capacidade de invadir tecidos do hospedeiro, evadir da detecção imunológica e causar doenças invasivas graves. Por conseguinte, os EGB continuam sendo uma das principais causas de mortalidade neonatal, pneumonia, sepse e meningite. Contudo, a patogênese desta infecção ainda está pouco elucidada. O sorotipo V é freqüentemente associado à doença invasiva em mulheres adultas não gestantes e o segundo mais prevalente em mulheres grávidas. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a aderência, invasão e persistência intracelular de amostras pertencentes ao sorotipo V (88641-vagina/portador e 90186-sangue/paciente) usando as células epiteliais respiratórias A549. As amostras de EGB demonstraram capacidade de aderir e invadir as células epiteliais A549, mas somente a amostra 90186-sangue apresentou maior invasão quando comparada com a de vagina (P <0.001). Ambas as amostras demonstraram persistência intracelular sem replicação no interior das células A549. Apenas o isolado 90186-sangue sobreviveu dentro das células epiteliais até 24h de incubação (P <0,05). A fusão dos lisossomas das células epiteliais com vacúolos contendo bactérias foi observada em células A549 tratadas com Lyso Tracker Grenn DND-26 para todas as amostras testadas. Nossos dados indicam pela primeira vez que as amostras viáveis do sorotipo V permanecem dentro de vacúolos ácidos epiteliais. Curiosamente, a amostra 90186- sangue induziu vacuolização celular e a amostra 88641-vagina promoveu a morte celular após 7h de incubação. Finalmente, nossos resultados aumentam o nosso conhecimento sobre eventos celulares da fagocitose e da patogênese das doenças invasivas promovidas pelos EGB. / Group B Streptococcus (GBS) commonly colonizes healthy asymptomatic adults, yetunder certain circumstances displays the ability to invade host tissues, evade the immune system and cause serious invasive disease. Consequently, GBS remains the major cause of neonatal pneumonia, sepsis and meningitis. However, the pathogenesis of this infection is poorly understood. The serotype V is frequently associated with invasive diseases in non-pregnant adults and the second most prevalent in pregnant women. The aim of this work was to study the adherence; invasion and persistence intracellular of the GBS serotype V (88641-vagina/carriers and 90186-blood/patient) in epithelial cells A549. All GBS strains showed ability to adhere and invade the epithelial A549 cells, but GBS 90186-blood was more invasive than the vagina isolate (P<0,001). Both strains persisted intracellular, but without replicating into the A549 cells. Only 90186-blood strain survived within epithelial cells even after a 24h incubation (P<0,05). Fusion of epithelial lysosomes with bacteria containing phagocytic vacuoles was observed in A549 cells treated with Lysotracker Grenn DND-26 for all strains tested. Our data indicate for the first time that viable strains of serotype V remain within acidic epithelial vacuoles. Interestingly, the 90186-blood strain induced cellular vacuolization and 88641-vagina strain caused cell death after 7h incubation. Lastly, our results increase our knowledge about cellular events of phagocytosis and pathogeneses of GBS diseases.

Avanços na identificação e caracterização de diferentes populações de célulastronco tem melhorado as perspectivas do seu uso clínico. A maioria dos estudos obtêm as células-tronco com base na expressão de marcadores de superfície celular e testa as suas propriedades por meio de ensaios funcionais in vitro e in vivo. Na presente pesquisa foram isoladas diferentes populações de células epiteliais com base na expressão de dois marcadores de células-tronco epiteliais descritos pela literatura, o receptor de neurotrofina p75 (p75NTR) e o receptor de transferrina 1 (CD71). Uma vez isso feito, foi avaliado a co-expressão de outros marcadores de células-tronco epiteliais, como as integrinas 6 e 1, e realizado ensaios de eficiência de formação de colônias, potencial de crescimento celular, capacidade de reconstrução epitelial in vitro, análise da resposta ao trauma e avaliação da capacidade de auto renovação. Os resultados mostram que as células p75NTR+ tem um desempenho funcional melhor do que as p75NTR- na maioria dos ensaios funcionais realizados, exceto pela capacidade de responder ao trauma e de se autorenovar. Ademais, comprovou-se que células p75NTR+ expressam em maior proporção as integrinas 6 e 1 e que o isolamento de células por dupla marcação (p75NTR+CD71-) possibilita a obtenção de uma população de células epiteliais ainda mais enriquecida com estes marcadores. No entanto, foi observado também que independentemente da população celular estudada e do tempo em cultivo, as populações de células epiteliais alteraram drasticamente o seu fenótipo quando de tal forma que as populações celulares inicialmente positivas se tornaram majoritariamente negativas e que as populações celulares inicialmente negativas passaram a ter células positivas em seu meio. / Recent advances in cell sorting and characterization technics of stem cells have provided new insights and perspectives for clinical applications of this particular cell population. Most of the studies isolat stem cells based on the expression of cell surface markers and evaluate their stem cells-like proprieties by performing in vitro and in vivo assays. Here we isolated different populations of keratinocytes based on the expression of the epithelial stem cell markers neurotrophin receptor p75 (p75NTR) and transferrin receptor 1 (CD71). The co-expression of other epithelial stem markers such as integrins 6 and 1 was also assessed and in vitro functional assays such as colony-forming efficiency; long-term growth potential, in vitro epithelial reconstruction-capacity and response to damage and self-renew capacity. Our results showed that p75NTR+ve cells have better functional proprieties in most of the assays however they did not respond to damage nether presented self-renew capacity. Additionally, p75NTR-ve cells express higher percentage of other epithelial stem cell markers such as integrins 6 and 1 when compared to p75NTR-ve cells and the double staining (p75NTR+veCD71-ve) contributes to isolate a more enriched cell population based on the expression of the integrins. Nevertheless, independently of the cell population or of the amount of time in culture, cells have changed dramatically their phenotype in a way that the cell population initially p75NTR+ve lost the expression of the p75NTR and the negative population have gained it.