Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-07-25T04:10:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346990.pdf: 2039452 bytes, checksum: 2fe568b2e85e5513a8947e7a52ae6d8f (MD5) Previous issue date: 2017 / O transporte de proteínas através do epitélio intestinal dos insetos é ainda pouco conhecido. Há evidências de que vicilina, uma importante proteína de armazenamento de sementes do feijão-de-corda (Vigna unguiculata), é internalizada em larvas do bruquíneo Callosobruchus maculatus. Tem sido relatado que esta globulina de armazenamento interage com proteínas presentes nas membranas microvilares ao longo do trato digestivo das larvas. Na presente Tese, as vias celulares envolvidas na endocitose de vicilina em larvas do caruncho C. maculatus foram estudadas. Vicilina marcada com FITC (purificada a partir de sementes do feijão-de-corda) foi incorporada na dieta das larvas de C. maculatus na concentração fisiológica (0,5% m/m). O destino das globulinas marcadas ou não-marcadas foi monitorado por microscopia confocal, imunohistoquímica e Western blotting. A proteína microvilar de ligação à vicilina foi purificada usando cromatografia de afinidade em uma coluna de vicilina-Sepharose seguida por espectrometria de massa MALDI-TOF. A absorção de vicilinas é um caso de endocitose mediada por receptor. O receptor de vicilina foi purificado e mostrou uma elevada homologia com as proteínas da superfamília SEC14, principalmente a proteína transportadora de ?-tocoferol. Estas proteínas estão presentes no intestino das larvas nas microvilosidades das células epiteliais, associadas a vesículas de endocitose. Vesículas endocíticas e cisternas foram encontradas em toda a extensão das células epiteliais do intestino médio. O tipo de transcitose destas macromoléculas foi confirmado através da utilização de inibidores específicos da via endocítica mediada por clatrina ou via mediada por caveolina. Os inibidores filipina III, nistatina e wortmanina inibiram significativamente a endocitose de vicilina, sugerindo que a via endocítica é principalmente mediada por caveolina. Este trabalho mostrou que a transcitose de vicilina através das células do intestino médio de larvas do inseto C. maculatus é mediada por um membro da família SEC14 homóloga à proteína transportadora de ?-tocoferol. É possível sugerir que vicilina é internalizada por endocitose dependente majoritariamente por caveolina. Em relação à faseolina foi observada dificuldade de internalização pelas larvas de C. maculatus. Estas globulinas favoreceram a geração de espécies reativas de oxigênio, onde o aumento da peroxidação lipídica foi determinado pelo método TBARS e o uso de anticorpos anti malondialdeído e 4- hidroxinonenal.<br> / Abstract : The transport of proteins across the intestinal epithelium of insects is still little known. There is evidence that vicilin, a major storage protein of cowpea seeds (Vigna unguiculata), is internalized in larvae of the bruchid C. maculatus. It has been reported that this storage globulin interacts with proteins present in the microvillar membranes along the digestive tract of the larvae. In the present Thesis, the cellular routes involved in the endocytosis of vicilin in larval C. maculatus was investigated. FITC-labeled vicilin (purified from C. maculatus susceptible seeds of cowpea) were incorporated into the diet of the larvae at physiological concentration (0.5% m/m). The fate of labeled or non-labeled globulins was monitored by confocal microscopy, immunohistochemistry and western blotting. The microvillar vicilin-binding protein was purified by using affinity chromatography on a vicilin-Sepharose column followed by MALDI-TOF mass spectrometry. The absorption of vicilins is a case of receptor-mediated endocytosis. The putative vicilin receptor was purified and showed high homology with proteins from the SEC14 superfamily. These proteins are present in the luminal surface of the midgut cell microvilli and inside these epithelial cells, associated to endocytic vesicles. Endocytic vesicles and cisternae were found throughout the extent of midgut epithelial cells. The type of transcytosis of these macromolecules was confirmed through the use of specific inhibitors of clathrin or caveolin-mediated pathways. The inhibitors filipin III, nystatin and wortmannin significantly inhibited the endocytosis of vicilin, suggesting that the endocytic pathway is mediate mainly by caveolin. In this Thesis it was shown that the transcytosis of vicilin through the midgut cells of larval C. maculatus is mediated by a member of the SEC14 family homologous to the a-tocopherol transfer protein. It is possible to suggest that vicilin is internalized by endocytosis dependent on caveolin. In relation to the phaseolin, it was observed difficulty of internalization by the larvae of C. maculatus. These globulins favor the generation of reactive oxygen species, where the increase of lipid peroxidation was determined by the TBARS method and the use of anti-malondialdehyde and 4-hydroxynenal antibodies.

Tese (doutorado) - Universidade de São Paulo, Faculdade de Odontologia / Made available in DSpace on 2013-07-15T21:10:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0

Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição patológica que acomete os homens na senescência e está presente em 50% da população masculina, com cerca de 85 anos de idade. Os hormônios androgênicos atuam na próstata provendo sua diferenciação, crescimento e funcionalidade, sendo este efeito mediado pela ligação do hormônio com o receptor de androgênios (AR) e pela a ativação de genesalvo. O equilíbrio entre apoptose e proliferação celular é mantido por uma série de genes modulados pelos androgênios que estão implicados no controle do ciclo celular. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares mediados por androgênio que possam estar envolvidos no descontrole proliferativo do epitélio prostático que ocorre durante a senescência. As células epiteliais prostáticas humanas não- transformadas derivadas de HPB (HNTEP) foram cultivadas e incubadas com diferentes concentrações de diidrotestosterona (DHT) e com o antiandrogênio hidroxiflutamida (OH-FLU). Uma baixa concentração de DHT (10-13M) provocou um aumento significativo na proliferação destas células em relação ao controle e às doses mais altas de androgênio (10-10 e 10-8 M ). Este efeito foi abolido pela adição de OHFLU. A expressão do gene do AR foi avaliada por RT-PCR em tempo real com diferentes tempos e condições de tratamento, sendo que os níveis de RNAm do AR permaneceram inalterados bem como sua proteína. Buscando compreender fatores que possam interferir na ativação transcricional do AR, avaliou-se a expressão dos coreguladores FHL-2 e shp-1. No grupo tratado com DHT.10-13 M houve um aumento significativo na expressão do co-ativador FHL-2 em relação aos outros grupos tratados (C5%, OH-FLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU e DHT.10-13 +OH-FLU) enquanto que a expressão do co-repressor shp-1 foi diminuída com esta dose, mas aumentada com a dose de DHT.10-8. Genes envolvidos na proliferação celular e que podem ser modulados pela ação androgênica, também foram avaliados em células HNTEP por RT-PCR em tempo real. O gene anti-apoptótico bcl-2 teve sua expressão aumentada sob o tratamento com DHT.10-13 M em relação ao tratamento com DHT.10-8 . Entretanto, o gene supressor de tumor p53 apresentou um aumento na sua expressão mediante o tratamento com a alta dose de androgênio (DHT.10-8M) em relação ao grupo controle, OH-FLU, DHT.10-13M e DHT.10-8 + OH-FLU. A análise da expressão do gene p21, alvo direto do gene p53, apresentou resultados semelhantes, com uma maior expressão com DHT.10-8M. Para averiguar alterações pós-transcrionais avaliou-se também os níveis protéicos do AR que não apresentaram alteração siginificativa e do p21, que apresentou uma maior marcação da proteína quando tratado com DHT10-8 M. Os dados obtidos neste trabalho indicam que pode ocorrer uma modulação da expressão destes genes mediante o tratamento com diidrotestosterona. Baixas doses de androgênio desencadeiam uma via estimulatória da proliferação enquanto que altas doses promovem a ativação de uma via inibitória nas células HNTEP. / Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a pathologic condition that affects older men and is present in 50% of the male population at 85 years of age. The androgenic hormones act on the prostate gland promoting its differentiation, growth and function, this effect being mediated by the hormone's binding to the androgen receptor (AR) and the activation of target genes. The balance between apoptosis and cell proliferation is maintained by a series of genes modulated by the androgens that are implicated in the cell cycle control. This research aimed to investigate the androgen-mediated molecular mechanisms that may be involved in the proliferative imbalance of the prostatic epithelium in older men. Human non-transformed epithelial prostate (HNTEP) cells derived from BPH were incubated in different concentrations of dihydrotestosterone (DHT) and of antiandrogen hydroxylutamide (OH-FLU). A low concentration of DHT (10- 13M) led to a significant increase in the proliferation of these cells as compared to the control condition and to higher concentrations (10-10 and 10-8 M). This effect was abolished by the addition of OH-FLU. AR gene expression was evaluated by real-time RT-PCR in different times and conditions of treatment, and no differences in the AR mRNA and its protein were found. In an attempt to understand the factors that can change the AR transcriptional activation, the expression of co-regulators FHL-2 and shp 1 were also evaluated. There was a significantly increased expression of co-activator FHL-2 in the group treated with DHT.10-13 M as compared to all other groups (C5%, OHFLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU and DHT.10-13 +OH-FLU). On the other hand shp-1 expression was low at this concentration but high when cells were treated with DHT.10-8 M. Genes participating in cell proliferation and that can be modulated by androgens were also evaluated in HNTEP cells by real-time RT-PCR. The anti-apoptotic bcl-2 gene had its expression increased by the treatment with DHT.10-13 M as compared to the treatment with DHT.10-8 M. However, the expression of tumor-suppressing p53 gene showed an increase in its expression by the treatment with a high level of androgen (DHT.10-8 M) as compared to control, OH-FLU, DHT.10-13M and DHT.10-8 + OH-FLU. The analysis of gene p21 expression, direct target of p53 gene, presented similar results (higher expression with DHT.10-8M). Post-transcriptional alterations were studied by evaluating the proteins levels of AR and p21; there were no significant differences, but the latter showed greater protein labeling when treated with DHT.10-8 M. The data obtained here indicate that the expression of these genes may be modulated by dihydrotestosterone (DHT). Low concentrations of androgens trigger a stimulatory pathway of proliferation, while high concentrations promote the activation of an inhibitory pathway in HNTEP cells.

Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-24. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:39Z : No. of bitstreams: 1 000860359.pdf: 1099817 bytes, checksum: 063f5eb6adda8329efff7c14173ff413 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Staphylococcus aureus é um dos principais patógenos envolvidos na mastite humana e bovina. Entre seus diversos fatores de virulência está a capacidade de aderir e invadir células do epitélio mamário, estabelecendo a doença, produzir enterotoxinas que podem causar intoxicações de origem alimentar, caso haja consumo do leite contaminado. O objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar o potencial de adesão e de invasão de S. aureus, isolados de leite de vacas com mastite subclínica e de leite humano de um Banco de Leite, em cultura de células epiteliais mamárias bovinas (BMECs), HEp-2 e HeLa, pesquisar os genes envolvidos na formação de algumas enterotoxinas por PCR, verificar a produção das enterotoxinas clássicas in vitro e pesquisar a presença do gene mecA, que confere resistência à vários antibióticos beta lactâmicos. Foram utilizados 20 isolados de S. aureus, de leite de vacas com mastite subclínica e 20 de leite humano de um Banco de Leite, de um hospital público, na cidade de Botucatu, SP. Os isolados de leite humano apresentaram melhor adesão em células HeLa (p=0,043), enquanto os isolados de leite bovino aderiram melhor em células HEp-2 e BMEC (p=0,01). Nos testes de invasão, os isolados de leite humano e bovino invadiram os três tipos celulares indistintamente em porcentagens de invasão de 1 a 62,5% para S. aureus de origem humana e de 0,7 a 100%, para isolados de origem bovina. O gene que codifica a enterotoxina G (seg) foi o mais frequente em ambos os tipos de leite, com prevalência de 90% (n=18) e 80% (n=16), em humanos e bovinos, respectivamente. No leite humano, sea foi o segundo mais prevalente, com 75% (n=15), dos quais 11 (73,3%) produziram SEA in vitro, seguido de sec, que foi observado em 9 (45%) isolados, dos quais 4 (44,5%) produziram a enterotoxina in vitro. Os genes sea e sec foram observados, simultaneamente, em 6 desses isolados e 2 deles produziram ambas as enterotoxinas. Em relação... / Staphylococcus aureus is one of the main pathogens involved in human and bovine mastitis. Among his many virulence factors is the ability to adhere and invade mammary epithelial cells, establishing the disease, produce enterotoxin that can cause foodborne poisoning, if any contaminated milk consumption. The objective of this study was to evaluate and compare the potential of adherence and invasion of S. aureus, isolated from dairy cows with subclinical mastitis and breast milk from a milk bank in culture bovine mammary epithelial cells (BMEC), HEp -2 and HeLa, searching genes involved in the formation of certain enterotoxins by PCR, verify the production of enterotoxins classical in vitro and investigate the presence of the mecA gene, which confers resistance to various beta lactam antibiotics. Were used 20 S. aureus isolates from milk cows with subclinical mastitis and 20 human milk from a milk bank of a public hospital in the city of Botucatu, SP. The isolated human milk showed better adhesion to HeLa cells (p = 0.043), while isolates from bovine milk adhered better to HEp-2 cells and BMEC (p = 0.01). In invasion testing, isolates from human milk and bovine invaded the three cell types indistinctly in percentage from 1 to 62.5% invasion for S. aureus of human origin and 0.7 to 100% for isolates from bovine origin. It was concluded that the adhesion test for human isolates can be used and HeLa cells isolated from bovine origin, can be used Hep-2 and BMEC cells. For testing invasion any cell type may be utilized for S. aureus from both origins. The gene encoding the enterotoxin C (sec) was the most common in both types of milk, with a prevalence of 90% (n = 18) and 80% (n = 16) in human and bovine, respectively. In human milk, sea was the most prevalent second, with 75% (n = 15), of which 11 (73.3%) produced SEA in vitro, followed sec, which was observed in 9 (45%) isolates of which 4 (44.5%) enterotoxin produced in vitro. The sea and ...

Orientador: Vera Lúcia Mores Rall / Coorientador: João Pessoa Araújo Júnior / Banca: Ary Fernandes Júnior / Banca: Antonio Carlos Paes / Resumo: Staphylococcus aureus é um dos principais patógenos envolvidos na mastite humana e bovina. Entre seus diversos fatores de virulência está a capacidade de aderir e invadir células do epitélio mamário, estabelecendo a doença, produzir enterotoxinas que podem causar intoxicações de origem alimentar, caso haja consumo do leite contaminado. O objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar o potencial de adesão e de invasão de S. aureus, isolados de leite de vacas com mastite subclínica e de leite humano de um Banco de Leite, em cultura de células epiteliais mamárias bovinas (BMECs), HEp-2 e HeLa, pesquisar os genes envolvidos na formação de algumas enterotoxinas por PCR, verificar a produção das enterotoxinas clássicas in vitro e pesquisar a presença do gene mecA, que confere resistência à vários antibióticos beta lactâmicos. Foram utilizados 20 isolados de S. aureus, de leite de vacas com mastite subclínica e 20 de leite humano de um Banco de Leite, de um hospital público, na cidade de Botucatu, SP. Os isolados de leite humano apresentaram melhor adesão em células HeLa (p=0,043), enquanto os isolados de leite bovino aderiram melhor em células HEp-2 e BMEC (p=0,01). Nos testes de invasão, os isolados de leite humano e bovino invadiram os três tipos celulares indistintamente em porcentagens de invasão de 1 a 62,5% para S. aureus de origem humana e de 0,7 a 100%, para isolados de origem bovina. O gene que codifica a enterotoxina G (seg) foi o mais frequente em ambos os tipos de leite, com prevalência de 90% (n=18) e 80% (n=16), em humanos e bovinos, respectivamente. No leite humano, sea foi o segundo mais prevalente, com 75% (n=15), dos quais 11 (73,3%) produziram SEA in vitro, seguido de sec, que foi observado em 9 (45%) isolados, dos quais 4 (44,5%) produziram a enterotoxina in vitro. Os genes sea e sec foram observados, simultaneamente, em 6 desses isolados e 2 deles produziram ambas as enterotoxinas. Em relação... / Abstract: Staphylococcus aureus is one of the main pathogens involved in human and bovine mastitis. Among his many virulence factors is the ability to adhere and invade mammary epithelial cells, establishing the disease, produce enterotoxin that can cause foodborne poisoning, if any contaminated milk consumption. The objective of this study was to evaluate and compare the potential of adherence and invasion of S. aureus, isolated from dairy cows with subclinical mastitis and breast milk from a milk bank in culture bovine mammary epithelial cells (BMEC), HEp -2 and HeLa, searching genes involved in the formation of certain enterotoxins by PCR, verify the production of enterotoxins classical in vitro and investigate the presence of the mecA gene, which confers resistance to various beta lactam antibiotics. Were used 20 S. aureus isolates from milk cows with subclinical mastitis and 20 human milk from a milk bank of a public hospital in the city of Botucatu, SP. The isolated human milk showed better adhesion to HeLa cells (p = 0.043), while isolates from bovine milk adhered better to HEp-2 cells and BMEC (p = 0.01). In invasion testing, isolates from human milk and bovine invaded the three cell types indistinctly in percentage from 1 to 62.5% invasion for S. aureus of human origin and 0.7 to 100% for isolates from bovine origin. It was concluded that the adhesion test for human isolates can be used and HeLa cells isolated from bovine origin, can be used Hep-2 and BMEC cells. For testing invasion any cell type may be utilized for S. aureus from both origins. The gene encoding the enterotoxin C (sec) was the most common in both types of milk, with a prevalence of 90% (n = 18) and 80% (n = 16) in human and bovine, respectively. In human milk, sea was the most prevalent second, with 75% (n = 15), of which 11 (73.3%) produced SEA in vitro, followed sec, which was observed in 9 (45%) isolates of which 4 (44.5%) enterotoxin produced in vitro. The sea and ... / Mestre

Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é micose sistêmica causada pelos fungos dimórficos Paracoccidioides brasiliensis (espécies cripticas S1, PS2, PS3) e Paracoccidioides lutzii (Pb01-like espécies), endêmica na América Latina, principalmente no Brasil. A capacidade de causar micose com grande variedade de manifestações clínicas, desde formas localizadas até doença disseminada evoluindo para letalidade, depende da virulência do fungo e de sua habilidade em interagir com as estruturas superficiais do hospedeiro e invadi-las, e a resposta imunológica deste último. P. brasiliensis tem a capacidade de aderir e invadir células epiteliais de linhagens humanas e animais e o processo de invasão do fungo afeta a estrutura do citoesqueleto, interferindo em aspectos morfológicos da actina, tubulina e citoqueratina, indicando a participação funcional dos microfilamentos e microtúbulos neste mecanismo. Em estudos prévios foi identificada adesina de P. brasiliensis de 30 kDa, ligante de laminina, caracterizada como uma proteína pertencente à família 14-3-3. O objetivo deste trabalho foi produzir a proteína recombinante, verificar o papel desta na interação do fungo com células epiteliais pulmonares de linhagem contínua. Para tanto, com o anticorpo anti-14-3-3 foi verificada a sua localização, tanto nas formas leveduriformes do fungo como no processo de interação. A clonagem foi realizada em vetor de clonagem pCR2.1-TOPO - pET32a, para permitir a expressão da proteína Pb14-3-3r com cauda de histidina no espaço periplasmático de E. coli. A fração periplasmática foi purificada por cromatografia de afinidade seguida de eletroeluição. Foi possível verificar alteração do padrão de distribuição de actina quando as células foram tratadas com a proteína recombinante e nativa. A proteína 14-3-3 apresenta distribuição ubíqua na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis (cryptic species S1, PS2, PS3) and Paracoccidioides lutzii (Pb01-like species), endemic in Latin America, mainly Brazil. The ability to cause mycosis with a variety of clinical manifestations, from localized forms to disseminated disease progressing to lethality, possibly depends on the relationship between the virulence of these, the ability to interact with the surface structures of the host and invade them, and this immune response. P. brasiliensis has the ability to adhere and o invade human and animal epithelial cells lineage and the process of invasion of the fungus affects the structure of the cytoskeleton, morphological interfering with actin, tubulin and cytokeratin morphology, indicating the functional participation of microfilaments and microtubules in this mechanism. Previous study identified a 14-3-3 protein (30 kDa) that acts as a P. brasiliensis adhesin (laminin ligand) and this protein contributes to the virulence of this important fungal pathogen. The objective of this study was to produce recombinant protein, to verify the role of the interaction of the fungus with lung epithelial cells of continuous lineage. To do so, with the anti-14-3-3 was verified its location, both in the forms of the fungus and yeast in the process of interaction. The cloning was done in cloning vector pCR2.1-TOPO - pET32a to allow expression of protein Pb14-3-3r-tailed histidine periplasmic space of E. coli. The periplasmic fraction was purified by affinity chromatography followed by electroelution. It was possible to see change in the pattern of distribution of actin when cells were treated with recombinant and native protein. The 14-3-3 protein has ubiquitous distribution in yeast cells of P. brasiliensis (strain 18/S1) have a certain... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Clayton Luiz Borges / Banca: Oscar Zaragoza Hernandez / Doutor

Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição patológica que acomete os homens na senescência e está presente em 50% da população masculina, com cerca de 85 anos de idade. Os hormônios androgênicos atuam na próstata provendo sua diferenciação, crescimento e funcionalidade, sendo este efeito mediado pela ligação do hormônio com o receptor de androgênios (AR) e pela a ativação de genesalvo. O equilíbrio entre apoptose e proliferação celular é mantido por uma série de genes modulados pelos androgênios que estão implicados no controle do ciclo celular. Este trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos moleculares mediados por androgênio que possam estar envolvidos no descontrole proliferativo do epitélio prostático que ocorre durante a senescência. As células epiteliais prostáticas humanas não- transformadas derivadas de HPB (HNTEP) foram cultivadas e incubadas com diferentes concentrações de diidrotestosterona (DHT) e com o antiandrogênio hidroxiflutamida (OH-FLU). Uma baixa concentração de DHT (10-13M) provocou um aumento significativo na proliferação destas células em relação ao controle e às doses mais altas de androgênio (10-10 e 10-8 M ). Este efeito foi abolido pela adição de OHFLU. A expressão do gene do AR foi avaliada por RT-PCR em tempo real com diferentes tempos e condições de tratamento, sendo que os níveis de RNAm do AR permaneceram inalterados bem como sua proteína. Buscando compreender fatores que possam interferir na ativação transcricional do AR, avaliou-se a expressão dos coreguladores FHL-2 e shp-1. No grupo tratado com DHT.10-13 M houve um aumento significativo na expressão do co-ativador FHL-2 em relação aos outros grupos tratados (C5%, OH-FLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU e DHT.10-13 +OH-FLU) enquanto que a expressão do co-repressor shp-1 foi diminuída com esta dose, mas aumentada com a dose de DHT.10-8. Genes envolvidos na proliferação celular e que podem ser modulados pela ação androgênica, também foram avaliados em células HNTEP por RT-PCR em tempo real. O gene anti-apoptótico bcl-2 teve sua expressão aumentada sob o tratamento com DHT.10-13 M em relação ao tratamento com DHT.10-8 . Entretanto, o gene supressor de tumor p53 apresentou um aumento na sua expressão mediante o tratamento com a alta dose de androgênio (DHT.10-8M) em relação ao grupo controle, OH-FLU, DHT.10-13M e DHT.10-8 + OH-FLU. A análise da expressão do gene p21, alvo direto do gene p53, apresentou resultados semelhantes, com uma maior expressão com DHT.10-8M. Para averiguar alterações pós-transcrionais avaliou-se também os níveis protéicos do AR que não apresentaram alteração siginificativa e do p21, que apresentou uma maior marcação da proteína quando tratado com DHT10-8 M. Os dados obtidos neste trabalho indicam que pode ocorrer uma modulação da expressão destes genes mediante o tratamento com diidrotestosterona. Baixas doses de androgênio desencadeiam uma via estimulatória da proliferação enquanto que altas doses promovem a ativação de uma via inibitória nas células HNTEP. / Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a pathologic condition that affects older men and is present in 50% of the male population at 85 years of age. The androgenic hormones act on the prostate gland promoting its differentiation, growth and function, this effect being mediated by the hormone's binding to the androgen receptor (AR) and the activation of target genes. The balance between apoptosis and cell proliferation is maintained by a series of genes modulated by the androgens that are implicated in the cell cycle control. This research aimed to investigate the androgen-mediated molecular mechanisms that may be involved in the proliferative imbalance of the prostatic epithelium in older men. Human non-transformed epithelial prostate (HNTEP) cells derived from BPH were incubated in different concentrations of dihydrotestosterone (DHT) and of antiandrogen hydroxylutamide (OH-FLU). A low concentration of DHT (10- 13M) led to a significant increase in the proliferation of these cells as compared to the control condition and to higher concentrations (10-10 and 10-8 M). This effect was abolished by the addition of OH-FLU. AR gene expression was evaluated by real-time RT-PCR in different times and conditions of treatment, and no differences in the AR mRNA and its protein were found. In an attempt to understand the factors that can change the AR transcriptional activation, the expression of co-regulators FHL-2 and shp 1 were also evaluated. There was a significantly increased expression of co-activator FHL-2 in the group treated with DHT.10-13 M as compared to all other groups (C5%, OHFLU, DHT.10-8, DHT.10-8 + OH-FLU and DHT.10-13 +OH-FLU). On the other hand shp-1 expression was low at this concentration but high when cells were treated with DHT.10-8 M. Genes participating in cell proliferation and that can be modulated by androgens were also evaluated in HNTEP cells by real-time RT-PCR. The anti-apoptotic bcl-2 gene had its expression increased by the treatment with DHT.10-13 M as compared to the treatment with DHT.10-8 M. However, the expression of tumor-suppressing p53 gene showed an increase in its expression by the treatment with a high level of androgen (DHT.10-8 M) as compared to control, OH-FLU, DHT.10-13M and DHT.10-8 + OH-FLU. The analysis of gene p21 expression, direct target of p53 gene, presented similar results (higher expression with DHT.10-8M). Post-transcriptional alterations were studied by evaluating the proteins levels of AR and p21; there were no significant differences, but the latter showed greater protein labeling when treated with DHT.10-8 M. The data obtained here indicate that the expression of these genes may be modulated by dihydrotestosterone (DHT). Low concentrations of androgens trigger a stimulatory pathway of proliferation, while high concentrations promote the activation of an inhibitory pathway in HNTEP cells.

Submitted by Heitor Rapela Medeiros (heitor.rapela@ufpe.br) on 2015-03-05T12:26:26Z No. of bitstreams: 2 TESE-biblioteca MAURILIO.pdf: 3471460 bytes, checksum: b197cfdac22918657ecccdcca1b0adae (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T12:26:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE-biblioteca MAURILIO.pdf: 3471460 bytes, checksum: b197cfdac22918657ecccdcca1b0adae (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-03-27 / A pele é frequentemente exposta a traumatismos que podem provocar soluções de continuidade. Quando a perda cutânea é extensa, ocorre um retardo na cicatrização decorrente do processo de organização da ferida e da lenta atividade de reparação das células epiteliais. A utilização de um curativo com função de impermeabilizar a ferida e servir de guia na migração das células epiteliais poderia resultar em proteção, maior velocidade de epitelização e conforto para o paciente. O biopolímero da cana-de-açúcar é um polissacarídeo atóxico e biocompatível, obtido pela síntese de bactérias Gram negativas do gênero Zoogloea pertencentes à família Pseudomonadaceae, a partir do melaço da cana-de-açúcar, que pode exercer função transitória de protetor da ferida e guia para migração de células. Objetivo: Avaliar a eficácia da membrana do biopolímero da cana-de-açúcar no tratamento de feridas cutâneas excisionais induzidas, em ratos. Material e Métodos: Foram utilizados 40 ratos da raça Wistar, de ambos os gêneros, nos quais foram confeccionadas feridas cutâneas pela excisão de dois retalhos de espessura total da pele, na região dorsal. Por sorteio, em uma das feridas, foi aplicada membrana do biopolímero da cana-de-açúcar (grupo experimental) e, na outra, foi realizado curativo convencional, com lavagem com soro fisiológico (grupo controle). Os animais foram submetidos a eutanásia no 7º, 14º, 21º e 40º dias de pós-operatório, para a coleta de material das feridas e cicatrizes para estudo histopatológico e imunoistoquímica. Avaliaram-se a intensidade dos infiltrados inflamatórios polimorfonuclear e linfomononuclear, da fibrose, da fibroplasia e da crosta. Obtiveram-se fotografias digitais das preparações histológicas para determinação da espessura epitelial e contagem do número de vasos neoformados. Resultados: O tempo de cicatrização completa, observado clinicamente, não diferiu entre as feridas que receberam a membrana (21dias) e aquelas que não receberam (20 dias), permanecendo a membrana aderida ao leito cruento por um período médio de seis dias. Na comparação das imagens digitalizadas não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significantes no que se refere à área e ao diâmetro médio das áreas cicatriciais, nos momentos avaliados (2o, 7o e 14o dias de pós-operatório), assim como não houve diferença do ponto de vista estatístico, em relação aos parâmetros histopatológicos avaliados nos grupos experimental e controle, apesar de ter sido observado uma menor intensidade do infiltrado inflamatório polimorfonuclear e da fibroplasia, além de uma menor contagem do número de vasos nas áreas cicatriciais das feridas que receberam a membrana. Conclusão: Conclui-se que as feridas onde foi aplicada a membrana do biopolímero da cana-de-açúcar apresentaram, ao estudo histopatológico e morfométrico, características de um processo cicatricial completo e estável, em comparação com aquelas que não receberam a membrana

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-21T17:34:19Z No. of bitstreams: 1 Ana Claudia Mallet de Souza Ramos.pdf: 923885 bytes, checksum: 8abdfd61e6d345ec8e6d3633951b0d80 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-21T17:34:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Claudia Mallet de Souza Ramos.pdf: 923885 bytes, checksum: 8abdfd61e6d345ec8e6d3633951b0d80 (MD5) Previous issue date: 2014-03-29 / Introduction: Chronic kidney disease is a worldwide growing problem. The kidney has the ability for nearly complete regenerate after ischemia/reperfusion or toxic injury. However, in some injuries the kidney undergoes epithelial-mesenchymal transition and fibrosis with loss of function. The best treatment is transplantation; nevertheless less than one third of patients are able to receive a kidney transplant due to lack of organs. Cell therapy may retard the progression of chronic kidney disease boht in allograft or in native kidney. This study aims to evaluate the feseabilty of a cell therapy. The main objective of this study is to evaluate the cell response to uremic toxins, specially indoxil sulfate. Methods: Human kidney cells were obtained by digestion method from human kidneys discard from Hospital do Rim e Hipertensão, UNIFESP-EPM. Immunofluorescence technique and flow cytometry (FACS) were performed to characterize cells. Indoxil sulfate was used to stimulate injury FACS and immunofluorescence were performed to determine the expression of apha smooth muscle actin. Results: Eight donors were included, only six cultrues were kept. Donors were 46,25 years old on avarage, 100% received vasoactive drugs and 50% received nefrotoxic drugs.Cells were kept for 7 days until confluency were obtain in the passage zero, for the other passages duplication time was 72h.In the primary culture, 3.3% were proximal tubule cells, 1.7% distal tubule cells, 4.6% were EPO producing fibroblasts, 3.6% were mesenchymal cells and 8.9% pluripotente stem cells. There were no changing on cells phenotype while indoxil sulfate were added to the cultures. Conclusions: Primary culture from deceased donors do not change phenotype when exposed to indoxil sulfato. / Introdução: A doença renal crônica é um problema mundial em crescimento nas últimas décadas.O rim tem a capacidade de se regenerar após isquemia-reperfusão e lesões tóxicas. Entretanto, em alguns insultos inicia o processo de transição epitelial-mesenquimal com consequente acúmulo de tecido fibrótico e perda da função. O melhor tratamento doença renal crônica é o transplante, porém existeescassez de órgãos.Potencialmente a terapia celular poderá retardar a progressão da doença renal em humanos tanto em rins nativos como em rins transplantados. Este estudo tem como objetivo avaliar células renais para terapia celular no tratamento da doença renal crônica.O objetivo central é avaliar a resposta celulara toxinas urêmicas especialmente o indoxil sulfato. Métodos: Células renais foram obtida por método de digestão à partir de rins descartados do Hospital do Rim e Hipertensão, UNIFESP_EPM.Imunofluorescencia e citometria de fluxo(FACS) foram utilizados para caracterização de células. O indoxil sulfato foi utilizado para estimular lesão renal sendo avaliadas quanto a expressão de alpha-smooth muscle actin. Resultados: Oito doadores foram incluídos neste estudo. Seis culturas foram continuadas. Os doadores apresentaram idade média de 46,25 anos, 100% fez uso de drogas vasoativas e 50% fez uso de drogas nefrotóxicas. O tempo de confluência na passagem zero foi de 7 dias e duplicação celular foi de 72 h. 3,3% das células da cultura primária são de túbulo proximal, 1,7% de túbulo distal, 4,6% fibroblastos produtores de EPO, 3,6% céulas mesenquimais e 8,9%progenitoras multipotentes. As células da cultura primária não tiveram seu fenótipo aletrado com o tratamento com indoxil sulfato. Conclusões:Não houve alteração do fenótipo celular em resposta ao indoxil sulfato.

The photobiomodulation therapy (PBMT) has many demonstrated applications in the health area including anti-inflammatory and wound healing effects. The main objective of this work is to verify if the PBMT causes measurable changes in the mechanical properties of cells, specifically in red blood cells, epithelial cells and fibroblasts. In addition, to contribute to the knowledge of the action mechanisms of the PBMT, this study intends to support applications of the PBMT during invasive procedures, such as the direct photo-treatment of the blood in surgical procedures with cardiopulmonary bypass, regarding security of the cellular integrity. For this analysis, three experimental techniques were used: optical magnetic twisting cytometry (OMTC), defocusing microscopy and confocal laser-scanning microscopy. Human bronchial epithelial cells were evaluated with OMTC. The epithelial cell culture was either photo-treated or not, with red laser (lambda=660 nm), and fixed power and time (power density of 153 mW/cm2, time 300 s). It was not possible to observe significant differences between photo-treated and control epithelial cells, for the hysteresivity (ratio between the cell loss and elastic shear moduli). The defocusing microscopy, similar to a phase contrast microscopy, was used to study human red blood cells from fresh blood. The red blood cells were either photo-treated or not, with red laser (lambda=660 nm), and different powers and times (power densities from 0 to 510 mW/cm2, times from 0 to 180 s). Some morphological and mechanical characteristics of individual red blood cells were evaluated, such as volume, radial profile of cell thickness, lateral and vertical membrane fluctuations, for the photo-treated and control red blood cells. It was not possible to detect differences between the two groups, for any of the parameters analyzed. For both techniques, the absence of detectable differences might be due to several factors, such as the non-action of the PBMT, with the parameters used, in the epithelial cells and red blood cells or to the small sensitivity of each technique. Confocal laser-scanning microscopy was used to evaluate the actin filaments of mouse fibroblasts. The fibroblast cell culture was either photo-treated or not, with red (lambda=625 nm) or infrared (lambda=808 nm) light and fixed power and time (power density from 113 to 158 mW/cm2, time 300 s). The nucleus and cell areas increased slightly when comparing photo-treated and control cells. On the other hand, the total actin, total actin density and the number of filaments decreased. These changes were detected for a short time after treatment, however, after 24 h they are not anymore detectable. The total branch length does not seem to suffer any modifications. In summary, with the data acquired with the three techniques, it was found that the PBMT, in the red range, with the parameters used, could not cause noticeable changes in red blood cells and epithelial cells, in vitro. On the other hand, the PBMT in the red and near-infrared range, with the power and times used, cause changes in actin filaments of fibroblasts, in vitro, in particular the decrease of the total actin density. / A terapia por fotobiomodulação tem muitas aplicações na área de Saúde devido a sua ação anti-inflamatória e de reparação tecidual. O objetivo geral desse trabalho é verificar se a terapia por fotobiomodulação provoca mudanças nas propriedades mecânicas de células, em particular em hemácias, células epiteliais e fibroblastos. Além de contribuir com o conhecimento dos mecanismos de ação da terapia por fotobiomodulação, este estudo pretende subsidiar aplicações da terapia por fotobiomodulação durante procedimentos mais invasivos, como a iluminação direta do sangue em procedimentos cirúrgicos com circulação extracorpórea, sob o ponto de vista da segurança quanto à integridade celular. Para essa análise foram utilizadas três técnicas experimentais: citometria óptica magnética de oscilação (OMTC), microscopia de desfocalização e microscopia confocal. Com a técnica de OMTC foram avaliadas células epiteliais brônquicas humanas em cultura, foto-tratadas com laser vermelho (lambda=660 nm), com potência e tempo fixos (densidade de potência de 153 mW/cm2, tempo 300 s). Não foi possível constatar diferenças significativas entre as células epiteliais foto-tratadas e as células controle, para a histerisividade (razão entre os módulos viscoso e elástico das células). Com a técnica de microscopia de desfocalização, semelhante a uma microscopia de contraste de fase, foram estudadas hemácias humanas de sangue recém coletado. As hemácias foram tratadas com laser vermelho (lambda=660 nm), com potências e tempos variados (densidade de potência de 0 a 510 mW/cm2, tempo de 0 a 180 s). Foram avaliadas algumas características morfológicas e mecânicas das hemácias individualmente, como o volume, perfil radial de espessura, flutuações lateral e vertical da membrana, tanto para hemácias foto-tratadas quanto para hemácias controle. Não foi possível detectar diferenças entre as hemácias foto-tratadas e controle para nenhum dos parâmetros avaliados. Para ambas as técnicas, a falta de mudanças observáveis poderia ser devida a diversos fatores, como a não ação da terapia por fotobiomodulação nas células epiteliais e nas hemácias, com os parâmetros aqui empregados, ou à falta de sensibilidade de cada uma das técnicas usadas. A microscopia confocal foi utilizada para avaliar os filamentos de actina de fibroblastos de camundongo em cultura, os quais foram foto-tratados com luz vermelha (lambda=625 nm) ou infravermelha (lambda=808 nm) e potência e tempo fixos (densidade de potência de 113 a 158 mW/cm2, tempo 300 s). Foi possível constatar ligeiro aumento nas áreas nuclear e celular das células foto-tratadas em relação aos fibroblastos controle. Também foi possível verificar a diminuição da quantidade total de actina, densidade de actina e do número de filamentos de actina nos fibroblastos foto-tratados. Essas mudanças são detectadas para tempos curtos após o tratamento, sendo que depois de 24 h elas desaparecem. O tamanho total dos filamentos parece não sofrer alterações. A partir dos dados coletados com as três técnicas, foi possível constatar que a terapia por fotobiomodulação, com os parâmetros utilizados, não consegue provocar mudanças perceptíveis em hemácias e em células epiteliais, in vitro. Porém, causa mudanças nos filamentos de actina de fibroblastos, in vitro, em particular a diminuição da densidade de actina total.