Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus agalactiae, ou Streptococcus do grupo B (GBS), é um importante patógeno oportunista que causa pneumonia, sepse e meningite em recém-nascidos e infecções em adultos imunocomprometidos. O pulmão aparentemente é o portal de entrada para o EGB na corrente sanguínea o que pode evoluir para uma septicemia. Os mecanismos de virulência relevantes envolve a habilidade do EGB em penetrar e sobreviver intracelularmente em células hospedeiras. Neste trabalho, foram analisados os mecanismos moleculares da apoptose epitelial induzida pelo EGB, e a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) em células epiteliais respiratórias A549 durante a infecção por EGB. Todas as amostras de EGB exibiram a capacidade de aderir e invadir células A549. A sobrevivência intracelular do EGB em células A549 ocorreu durante 24 h de incubação sem replicação do patógeno. No entanto, a amsotra 88641-V isolada de vagina não sobreviveu após 0,5 h de interação. O EGB promoveu a perda de viabilidade do epitélio durante a infecção. As alterações morfológicas em células A549 infectadas com o EGB incluem arredondamento celular, condensação nuclear, encolhimento celular e perda de contato célula-célula e célula-substrato. A dupla marcação AV/IP revelou que amostras de EGB sorotipo III induziram apoptose enquanto amostras do sorotipo V induziram morte celular semelhante a necrose em células A549. Caspase-3 foi ativada durante a apoptose induzida por EGB em células epiteliais. No entanto, a ativação de caspases-8 e -9 foi detectada apenas para a amostra 88641-V e as amostras EGB do sorotipo III, respectivamente. Experimentos comparativos de Immunoblotting revelaram que o EGB induziu um aumento da expressão Bim, uma proteína pró-apoptótica e diminuiu a expressão de Bcl-2 e Bcl-xL, proteínas anti-apoptóticas. As células A549 apresentaram perda de potencial de membrana mitocondrial Δψm e co-localização com o Bax. Ensaio de espectrometria de massa identificou a proteína PI-2a, uma proteína estrutural de pili, que exibe atividade carboxipepdidase. Descobrimos que os dois sorotipos (III e V) induziram a produção ROS e NO em células A549. Em conclusão, a apoptose induzida pelo EGB em células A549 é um mecanismo importante de virulência, resultando na destruição de tecidos, escape do sistema imune do hospedeiro com espalhamento bacteriano e, em consequência, a doença invasiva ou uma infecção sistémica. / Streptococcus agalactiae, or group B Streptococcus (GBS), is an important opportunistic pathogen that causes pneumonia, sepsis, and meningitis in neonates and severe diseases in immunocompromised adults. The lung is the apparent portal of entry for GBS into the bloodstream, after which septicemia may ensue. A relevant virulence mechanism involves the ability of GBS to penetrate and to survive intracellularly within these host cells. In this work, we analyzed the molecular mechanisms of GBS-induced epithelial apoptosis, and nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production by lung epithelial cell line A549 cells during infection with GBS. All GBS exhibited the ability to adhere and to invade A549 cells. The survival of GBS within A549 cells without replication was shown during 24 h incubation. However, the 88641-V strain isolated from vagina did not survive after 0.5 h of interaction. GBS promoted the loss of viability of the epithelium during infection. The morphological changes in A549 cells infected with GBS included cell rounding, nuclear condensation, cellular shrinkage and loss of cell-cell contact and cell-substrate. The double staining AV / IP revealed that GBS serotype III induced apoptosis while GBS serotype V induced like necrosis cell death in A549 cells. Caspase-3 was activated during GBS-induced endothelial apoptosis. However, activation of caspases-8 and -9 was detected only by GBS 88641-V and GBS-III, respectively. Comparative immunoblotting experiments revealed that GBS induced an increasing pro-apoptotic Bim expression and decreasing anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-XL expression. A549 cells exhibited loss of mitochondrial membrane potential Δψm with Bax colocalization. Mass spectrometry assay identified protein PI-2a, a structural protein pili, which exhibit carboxipepdidase activity. We found that both serotypes (III and V) induced ROS and NO production in A549 cells. In conclusion, apoptosis of A549 cell induced by GBS is an important virulence mechanism resulting in tissue destruction, escape from the host immune system with bacterial spreading and, in consequence, invasive disease or systemic infection.

Introdução: Pacientes com Polipose Adenomatosa Familiar (PAF) tem maior risco de desenvolvimento de carcinoma duodenal em comparação com a população em geral, sendo a classificação de Spigelman adotada como método de estadiamento da adenomatose duodenal em doentes com PAF. No entanto, a relação entre a gravidade da polipose duodenal e variáveis clínicas não é bem compreendida. Objetivos: 1) Avaliar, através do método endoscópico, a prevalência e a intensidade da adenomatose duodenojejunal em pacientes com PAF em nosso meio. 2) Verificar a associação de variáveis clínicas, com a gravidade fenotípica da adenomatose duodenal e ampular. Metodologia: Foram estudados prospectivamente, 62 pacientes com diagnóstico de PAF, atendidos no Ambulatório de Poliposes Intestinais do Departamento de Gastroenterologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo. Os pacientes foram submetidos à duodenoscopia, classificados segundo Spigelman e a presença ou não de adenomas ampulares. Os pacientes foram distribuídos em dois grupos: Estadio de Spigelman de 0 a II, e Estadio III e IV. Estes grupos foram relacionados com variáveis clínicas, tais quais: sexo, idade, antecedentes familiares positivos de PAF, tipo de cirurgia do cólon, e tipo de polipose colônica. Naqueles pacientes classificados como Spigelman III e IV foi realizada enteroscopia assistida por balão via anterógrada para avaliação do jejuno. Resultados: Quarenta e nove pacientes foram classificados como estadios de Spigelman 0, I ou II, e 13 pacientes como estadios III ou IV. A análise da correlação destes grupos foi estatisticamente significativa com a variável história familiar (p = 0,03). Naquelas famílias que apresentaram vários parentes inclusos neste estudo, observou-se estadio de Spigelman similar entre os diferentes parentes de cada família. Sete pacientes apresentaram adenomas menores da papila duodenal. A associação da presença de adenoma de papila com a variável manifestações extraintestinais (p= 0,009) foi estatisticamente significante na análise multivariável. Enteroscopia assistida por balão foi realizada em 12 pacientes, dos quais 10 apresentaram adenomas tubulares com displasia de baixo grau no jejuno proximal. Conclusões: 1. A prevalência da adenomatose duodenal avançada e de adenomas ampulares é clinicamente significativa na PAF em nosso meio. 2. A prevalência de adenomas jejunais em pacientes com adenomatose duodenal avançada é alta, apesar de não serem lesões clinicamente significativas. No entanto, enteroscopia deve ser indicada de forma individualizada em casos de polipose duodenal avançada na avaliação da extensão do acometimento jejunal. 3. A intensidade da adenomatose duodenal pode ser previsível a partir da gravidade da adenomatose duodenal de algum parente de primeiro grau. 4. A presença de manifestações extracolônicas reforça a necessidade de avaliação da região da papila de Vater, desde que houve associação independente entre a presença de adenomas ampulares e as mesmas / Background: Patients with Familial Adenomatous Polyposis (FAP) have higher risk of duodenal cancer development compared with the general population. Spigelman classification has been adopted as the staging method of duodenal adenomatosis in patients with FAP. However, the relationship between the severity of duodenal polyposis and clinical variables is not well understood. Objectives: 1) To assess endoscopically, the prevalence and intensity of duodenojejunal adenomas in patients with FAP in our population. 2) To correlate clinical variables with the phenotypic severity of duodenal and ampullary adenomatosis. Methods: We prospectively studied 62 patients with FAP, attended at Intestinal polyposis Clinic of the Department of Gastroenterology, Clinics Hospital, University of São Paulo. Patients underwent duodenoscopy and were classified according to Spigelman and the presence or absence of ampullary adenomas. Patients were divided into two groups: Spigelman 0 to II and Stage III and IV. These groups were related to the clinical variables: gender, age, family history for FAP, type of colorectal surgery, and type of polyposis of the colon. Patients classified as Spigelman III and IV were submitted to balloon assisted enteroscopy for evaluation of the jejunum. Results: Forty-nine patients were staged as Spigelman 0, I or II, and 13 as stage III or IV. There was statistic significant correlation between these groups and family history (p = 0,03). Families that had several relatives included in this study showed that there was a similar Spigelman stage in different relatives of each family. Seven patients had minor ampullar adenomas. Association between ampullary adenomas and extraintestinal manifestations (p = 0.009) was statistically significant in multivariavel analysis. Balloon assisted enteroscopy was performed in 12 patients. Ten of those presented tubular adenomas with low grade dysplasia in the proximal jejunum. Conclusions: 1. The prevalence of advanced duodenal adenomatosis and ampullary adenomas is clinically significant in FAP patients of our population. 2. The prevalence of jejunal adenomas in patients with advanced duodenal adenomatosis is high, although lesions were not clinically significant. Indication for enteroscoDpy should be individualized in patients with advanced duodenal disease to evaluate jejunal disease. 3. The intensity of duodenal adenomatosis can be predicted upon the severity of duodenal polyposis of a first-degree relative. 4. The presence of extracolonic manifestations reinforces the importance for avaliation of the Vater Papilla since there was an independent association between ampullary adenomas and extracolonic manifestations

Escherichia coli enteroinvasora (EIEC) é um dos agentes etiológicos da disenteria bacilar, caracteriza-se pela destruição do epitélio do cólon provocado pela resposta inflamatória induzida após invasão da mucosa por bactérias. Cepas de EIEC são bioquímica, genética e patogênica semelhante a Shigella spp. A patogenicidade de EIEC e Shigella dependem da presença da pInv plasmídeo, que contém os genes necessários para a colonização bacteriana na mucosa intestinal. Recentemente, demonstrou-se que genes plasmidias ospC1, ospG e ospF de S. flexneri estão envolvidos na inibição da resposta inflamatória em células epiteliais intestinais, um fator importante na iniciação da colonização bacteriana e produção de doença. Como a EIEC mostrou doença menos grave, foi analisada as sequências de aminoácido, avaliada a transcrição destes genes plasmídiais e resposta inflamatória modulada por este micro-organismo na célula epitelial intestinal Caco-2. As células Caco-2 foram infectadas em momentos diferentes com 11 sorotipos de EIEC e S. flexneri (M90T). Os dados sobre a capacidade de invasão e sobrevivência de bactérias, expressão de genes de bactérias e da quimiocina IL-8 foram obtidos por CFU, RT-PCR, e ELISA, respectivamente. A significância estatística foi avaliada por ANOVA de dois fatores. Os 11 sorotipos de EIEC estudados apresentaram similaridade de 100% com S.flexneri para OspC1 e OspF,contudo, foram diferentes na homologia do OspG. Quando comparamos as sequências de aminoácido dos 11 sorotipos observamos 100% de similaridade entre eles para OspG, sugerindo o envolvimento destas proteínas na modulação da resposta imune induzida por estes micro-organismos. Os sorotipos de EIEC apresentam diferenças na capacidade de invasão dos enterócitos. Algumas diferenças significativas foram observadas na transcrição dos genes e na produção de IL-8. Os sorotipos de EIEC O29: H-e O167: H-apresentou um baixo transcrição de genes ospC1 e ospF, e um aumento significativo na produção de IL-8 quando comparado com outros sorotipos. Além disso, demonstrou que a maior transcrição destes genes por alguns sorotipos de EIEC parecem estar relacionados com a menor indução de IL-8. Estes dados sugerem que as proteínas OspC1 e OspF desempenham um papel na resposta inflamatória. No entanto, não se observou relação na transcrição ospG para a produção de IL-8. Estes resultados sugerem que as proteinas efetoras OspC1 e OspF estão envolvidas na inibição da resposta inflamatória em células epiteliais do intestino favorecendo a invasão da EIEC. / Enteroinvasive E. coli (EIEC) is one of the etiological agents of bacillary dysentery, it is characterized by the destruction of the colonic epithelium caused by the inflammatory response induced upon invasion of the mucosa by bacteria. Strains of EIEC are biochemical, genetic and pathogenic similar to Shigella spp. The pathogenecity of EIEC and Shigella depend on the presence of the plasmid pInv, which contains the genes necessary for bacterial colonization in the intestinal mucosa. Recently, it was demonstrated that the plasmid genes ospC1, ospG and ospF of S. flexneri are involved in inhibition of the inflammatory response in intestinal epithelial cells, an important factor in the initiation of bacterial colonization and production of disease. As EIEC has showed less severe disease, we evaluated the transcription of these plasmid genes and inflammatory response modulated by this microorganism in the intestinal epithelial cell Caco-2. The Caco-2 cells were infected in different times with 11 serotypes of EIEC and S. flexneri M90T strain. The data about sequences of amino acids, invasiveness and survival of bacteria, bacterial genes expression, and chemokine IL-8 were obtained by CFU, RT-PCR, and ELISA, respectively. The statistical significance was evaluated by two-way ANOVA. All EIEC serotypes studied showed 100% similarity with S.flexneri to OspC1 and OSPF, however, were different in the homology of OspG. Compared the amino acid sequences of the 11 serotypes observed 100% similarity between them to OspG, suggesting the involvement of them in modulating of the immune response induced by these microorganisms. There were no differences in the invasion the enterocytes among EIEC serotypes. However, some significant differences were observed in the transcription of those genes and production of IL-8. The EIEC serotypes O29:H- and O167:H- showed a low transcription of genes ospC1 and ospF, and a significant increase in production of IL-8 when compared with other serotypes. Furthermore, it was shown that the high transcription of ospF and ospC1 by some EIEC serotypes are related to low induction of IL-8. These data suggested that the proteins OspC1 and OspF play a role in the inflammatory response. However, we did not observed association between ospG transcription to the production of IL-8. These results lead us to believe that the effector proteins OspF and OspC1 are involved in inhibition of the inflammatory response in intestinal epithelial cells favoring the EIEC invasion.

O envenenamento por aranhas Loxosceles é caracterizado pelo desenvolvimento de dermonecrose. A expressão de metaloproteases induzidas pelas esfingomielinases do veneno pode estar envolvida no loxoscelismo cutâneo. Os resultados mostraram que o veneno de Loxosceles laeta e a proteína recombinante SMase I foram capazes de: induzir a expressão de metaloproteases (MMP-2, MMP-7 e MMP-9); diminuir a expressão de alguns marcadores de superfície e causar morte celular. A indução de MMP-7, como produto da ação do veneno e da SMase I de L. laeta, não foi reportada em outras espécies do gênero. O uso de inibidores de metaloproteases, como a tetraciclina, impediu a morte celular e reduziu a expressão de MMPs. A galardina, um composto que inibe metaloproteases da família das adamlisinas e das MMPs, evitou a clivagem dos marcadores MCP, 2-microglobulina, MHCI, EPCR em queratinócitos humanos tratados. Os resultados revelam que a inibição das metaloproteases de matriz extracelular e da família das adamlisinas pode ser uma alternativa eficaz no tratamento do loxoscelismo cutâneo. / The envenomation by Loxosceles spider characterized by the development of dermonecrosis. Metalloproteinases expression, induced by venom sphingomyelinases, may be involved in cutaneous loxoscelism. The results showed that Loxosceles laeta venom and the recombinant protein SMase I were able to: induce the expression of matrix metalloproteinases (MMP-2, MMP-7 e MMP-9); reduce the expression of some surface markers and cause cell death. The induction of MMP-7, as a product of venom and SMase I action, has not been reported for other genus species. The use of metalloproteinase inhibitors, such as tetracycline, prevented cell death and reduced MMPs expression. Galardin, a compound that inhibits metalloproteinases from the adamlisins family and MMPs, avoided the cleavage of MCP, 2-microglobulin, MHCI and EPCR on the surface of the treated human keratinocytes. These data indicate that inhibition of metalloproteinases can be an effective alternative on the cutaneous loxoscelism treatment.

A expressão de E-caderina (Ecad) pode ser regulada pré ou pós transcricionalmente por Snail e Hakai, respectivamente. Nosso objetivo foi determinar a expressão de Ecad, Snail e Hakai, em células epiteliais (CE) de tecido tumoral e peritumoral de pacientes com carcinoma ductal invasivo da mama e correlacionar sua expressão ao comprometimento linfonodal axilar (LN+). As CE de amostras de tecidos de 45 pacientes (52% LN+) foram extraídas por método imunomagnético, o RNA foi extraído por RT-PCR em tempo real e utilizou-se primers específicos para a moléculas. A expressão de Ecad, Snail e Hakai não variou entre o tecido tumoral e peritumoral e não houve correlação com comprometimento linfonodal / E-cadherin (Ecad) expression may be transcriptionally or post-transcriptionally regulated by Snail and Hakai. Our aim was to determine the expression of Ecad, Snail and Hakai, in epithelial cells (EC) obtained from tumor and its adjacent tissue from women with invasive ductal breast carcinoma (IDC) and evaluate their correlation to the axillary's lymph node (LN+) involvement. Tissue from 45 patients (52% LN+) had their EC recovered by immunomagnetic antibody process, RNA was extracted and real-time RT-PCR was performed using specific primers. Ecad, Snail and Hakai mRNA expression did not vary between tumoral and peritumoral samples and their expression was not correlated to LN involvement

O câncer de pâncreas é considerado um dos adenocarcinomas mais agressivos, ocupando o quarto lugar de mortes devidas a câncer, isto é dado principalmente a seu desenvolvimento silencioso e a sua complexidade genética, tornando-o de difícil detecção. Consequentemente, o diagnóstico desta doença ocorre apenas em fase tardia, quando o tratamento é apenas para fins paliativos. As anomalias genéticas mais frequentes no câncer de pâncreas invasivo estão relacionadas à ativação por mutações do gene KRAS e à inativação dos genes supressores de tumor CDKN2A, TP53, SMAD4 e BRCA2. Além destas conhecidas vias de sinalização, fatores de crescimento como o TGF-? e EGF também apresentam papel fundamental na progressão e metástase do câncer de pâncreas. Interessantemente, TGF-? e EGF são também indutores do processo denominado transição epitelial-mesenquimal (EMT), onde células epiteliais normais, durante a embriogênese, ou células cancerosas durante a progressão tumoral e metástase, perdem seus contatos intracelulares e adquirem caráter migratório. Desta forma a EMT, induzida por altos níveis de TGF-? e/ou EGF, é considerada como um dos mecanismos de progressão tumoral em adenocarcinomas. No presente estudo, foram estudados os proteomas e o fosfoproteoma da EMT do PanCa. Assim, células de câncer de pâncreas PANC- 1 foram induzidas à EMT em cultura com os fatores de crescimento TGF-?1 ou TGF-?2 e EGF, e após a indução, marcadores moleculares e propriedades funcionais de migração e invasão foram confirmados. Duas condições de indução da EMT foram estabelecidas, para as quais foram desenvolvidas as análises proteômicas quantitativas. A abordagem foi baseada em marcação isotópica de células em cultura (SILAC), em conjunto com fracionamento celular e de proteínas intactas, e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas para identificação de proteínas em larga escala. No total, aproximadamente 5.000 proteínas foram identificadas, e a maioria delas quantificadas com precisão nas duplicatas experimentais. Foram selecionadas 37 proteínas com expressão diferencial estatisticamente significativa nos experimentos proteômicos, as quais participam principalmente em processos de biogênese, adesão e apoptóticos. A análise de redes de interação revelou que as proteínas alteradas estavam principalmente localizadas em vias de sinalização que controlam processos de organização da matriz extracelular, splicing alternativo e regulação da apoptose. A análise do fosfoproteoma foi feita usando TGF-?1 como agente indutor da EMT nas células PANC-1, usando a estratégia ERLIC para o enriquecimento de fosfopeptídeos. No total, foram identificados 5.965 fosfopeptídeos não redundantes, correspondendo a um total de 2.250 fosfoproteínas analisadas, sendo quantificadas 2.053 ao menos em duas replicatas, e destas foram identificados 61 fosfopeptídeos regulados pertencentes a 55 fosfoproteínas, relacionados com processos de regulação do mRNA e vias de sinalização ligadas à adesão celular. Em conclusão, nosso estudo elucida potenciais novos alvos para inibição da EMT, controle da metástase, ou para auxiliar no diagnóstico da doença, quando devidamente validada. / Pancreatic cancer kills more than 200 thousand people worldwide every year. Also, pancreatic cancer is considered one of the most aggressive adenocarcinomas and difficult to diagnose since it develops silently and presents a high genetic complexity. Consequently, the diagnostic is often late, when the pancreatic cancer has already metastasized and the treatment has only palliative purposes. The most frequent genetic alterations observed in pancreatic cancer are related to mutations in KRAS oncogene and CDKN2A, TP53, SMAD4 and BRCA2 tumor suppressor genes. In addition to these known frequent mutations, growth factors such as TGB- ? and EGF play important roles in pancreatic cancer progression and metastasis. Interestingly, TGB- ? and EGF are also inducers of the Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT), in which epithelial cells lose their intracellular contacts and acquire migratory capacities. Therefore, EMT is considered one of the mechanisms responsible for tumor progression and metastasis in adenocarcinomas in addition of being correlated to the process of generating cancer stem cells. In our present study, pancreatic cancer cell line PANC-1 was induced to EMT by using growth factors TGF-?1 or TGF-?2 and EGF. Both molecular and functional properties, such as invasion and migration, were evaluated in PANC-1 cells undergoing EMT and confirm the induction. Two conditions of EMT induction were properly established and in-depth quantitative proteomic analysis based on stable isotope labeling in cell culture (SILAC) followed by cellular and protein fractionation were assessed. In total, 5.000 proteins were identified and most of them were accurately quantified in duplicate experiments. Thirty-seven proteins were selected as differentially expressed with statistical significance, and were related mainly with biogenesis, adhesion and apoptosis processes. Interaction network analysis showed that regulated proteins were predominantly participating in signaling pathways linked to extracellular matrix organization, alternative splicing and apoptosis regulation. Phosphoproteome analysis was done using TGF-?1 as EMT-inductor agent on PANC-1 cells and ERLIC strategy for phosphopeptides enrichment. In total, were identified 5.965 non-redundant phosphopeptides corresponding to approximately 2.250 analyzed phosphoproteins, thereof 2.053 were quantified in at least two replicates. At comparison, were identified 61 regulated phosphopeptides belonging to 55 phosphoproteins, which were related with mRNA regulation processes and signialing pathways linked to cellular adhesion. In conclusion, our study highlighted potential new targets for EMT inhibition, metastasis control or to help in pancreatic cancer diagnosis, when careful validated.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-27T14:08:11Z No. of bitstreams: 1 Vera Lucia Silva Rigoni.pdf: 1348554 bytes, checksum: 28c01d5b4e69fddd38792d76d20fcf02 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-27T14:08:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vera Lucia Silva Rigoni.pdf: 1348554 bytes, checksum: 28c01d5b4e69fddd38792d76d20fcf02 (MD5) Previous issue date: 2013-12-13 / The scorpionism is considered a public health worldwide, with Tityus serrulatus the main cause of accidents in Brazil. Symptoms of envenomation by Tityus serrulatus ranging from local pain to severe systemic reactions such as cardiac dysfunction and pulmonary edema, which is the leading cause of death. The amount of venom injected the age, physical and genetic factors of the victims are related to the severity of the symptoms presented by patients. Endothelial cells under physiological conditions play a protective role in the cardiovascular system. In the case of dysfunction or injury of that tissue occurs repercussion in the vascular structure, surrounding tissue, and finally on the cardiovascular system. In bronchial epithelial cells after injury, occurs repair mechanism mediated by cytokines and growth factors also occur increase in cell proliferation and differentiation after epithelial damage. Thus, this study aims to evaluate the modulating effect of Tityus serrulatus scorpion venom on endothelial cells and bronchial epithelial cells analyzing the viability of these cells and the mechanism by which inflammation occurs. Therefore, the cells in this study are cultured and incubated in culture plates with Tityus serrulatus scorpion venom in different concentrations and periods of time. The inflammatory mechanism was assessed through the measurement of cytokines in the supernatant of these cells. The results showed that Tityus serrulatus venom changed the viability of monolayers of endothelial cells (tEnd), and bronchial epithelial cells (BEAS), and this effect was more marked in bronchial epithelial cells. The results also demonstrate that the venom induces the release of cytokines IL-1, IL-6 and IL-8. iii This study extend the knowledge of the actions of the venom of the scorpion Tityus serrulatus on bronchial epithelial and endothelial cells thus demonstrating changes in pulmonary physiology that may contribute to a better treatment strategy of scorpion envenomation. / O escorpionismo é considerado um problema mundial de saúde pública, sendo a espécie Tityus serrulatus a principal causadora de acidentes graves no Brasil. Os sintomas do envenenamento pelo escorpião Tityus serrulatus vão desde dor local até reações sistêmicas severas, como disfunção cardíaca e edema pulmonar agudo, sendo este a principal causa de morte. A quantidade de veneno inoculado, idade, condições físicas e fatores genéticos das vítimas relacionam-se com a gravidade dos sintomas apresentados pelos pacientes. As células endoteliais, em condições fisiológicas, desempenham papel protetor do sistema cardiovascular. Em caso de disfunção ou lesão desse tecido há repercussão sobre a estrutura vascular, tecido adjacente e, por fim sobre o sistema cardiovascular. Já, nas células epiteliais brônquicas após injúria, ocorre mecanismo de reparo mediado por citocinas e fatores de crescimento, ocorrendo também proliferação e diferenciação celular após o dano epitelial. Assim, o presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito modulador do veneno do escorpião Tityus serrulatus em células endoteliais e células epiteliais brônquicas, analisando a viabilidade destas células e o mecanismo de inflamação pela qual são acometidas. Para tanto, as células em estudo foram cultivadas e incubadas em placas de cultura com o veneno do escorpião Tityus serrulatus, em diferentes concentrações e em diferentes períodos de tempo. O mecanismo inflamatório foi avaliado através da dosagem de citocinas no sobrenadante destas células. Os resultados demonstraram que o veneno de Tityus serrulatus alterou a viabilidade de i monocamadas das células epiteliais brônquicas e células endoteliais, sendo que esse efeito foi mais evidente nas células epiteliais brônquicas. Ainda, os resultados demonstraram que o veneno induz a liberação das citocinas IL-1, IL-6 e IL-8. Estes estudos ampliam o conhecimento das ações do veneno do escorpião Tityus serrulatus nas células endoteliais (tEnd) e epiteliais brônquicas (BEAS), comprovando assim alterações na fisiologia pulmonar que poderão contribuir para uma melhor estratégia de tratamento do envenenamento escorpiônico.

O timo é um órgão linfoide primário essencial para a manutenção da tolerância central através da seleção e eliminação de células T autoreativas. Precursores de células T, oriundas da medula óssea, chegam ao timo e migram do córtex para região da medula. As células epiteliais medulares tímicas (mTECs) expressam em sua superfície antígenos de tecidos periféricos (em inglês tissue-restricted antigens ou TRAs) que representam autoantígenos de todos os tecidos do corpo. Atuando como um fator de transcrição não clássico em células mTEC, o gene Autoimmune Regulator (Aire) desempenha um papel na expressão dos TRAs, cuja proteína codificada libera a RNA polimerase II (RNA Pol II) ancorada na cromatina e regula a expressão de mRNAs na glândula timo. A função biológica deste gene está ligada à indução de tolerância imunológica central impedindo o aparecimento de doenças autoimunes. Isso é resultado da seleção negativa de timócitos (precursores de células T) autoreativos que interagem fisicamente com as mTECs. Os timócitos autoreativos que reconhecem os TRAs como elementos estranhos são eliminados por apoptose. O co-cultivo de mTECs com timócitos representa um sistema-modelo in vitro adequado para se aproximar da interação celular que ocorre dentro do timo. Os resultados anteriores do nosso laboratório demonstraram que além do controle de mRNA de TRAs, o gene Aire também participa da modulação de miRNAs em mTECs uma vez que estas espécies de RNA são transcritas pela RNA Pol II. Continuando com essa linha de estudos, neste trabalho nós demonstramos pela primeira vez que Aire também modula a expressão de long noncoding RNAs (lncRNAs) em mTECs. Para isto fizemos uso da estratégia da perda de função analisando a expressão dessa espécie de RNA, assim como de mRNAs, em células mTEC Aire +/+ e mTEC Aire nocautes (KO Aire -/-) obtidas pela edição gênica por Crispr-Cas9. O transcriptoma dessas células que passaram ou não por adesão com timócitos, foi então analisado por hibridizações com microarrays. Isso evidenciou que Aire e adesão celular influenciam a expressão tanto de mRNAs como de lncRNAs. A reconstrução de redes de interação lncRNAs-mRNAs possibilitou evidenciar uma nova via de regulação pós-transcricional em células mTEC. / The thymus is a primary lymphoid organ essential for the maintenance of central tolerance through the selection and elimination of autoreactive T cells. Precursors of T cells, originating from the bone marrow, reach the thymus and migrate from the thymic cortex to the medullary region. Thymic medullary epithelial cells (mTECs) express on their surface tissue-restricted antigens (TRAs) that represent autoantigens of all tissues in the body. Acting as a non-classical transcription factor in mTEC cells, the Autoimmune regulator (Aire) gene plays a role in the expression of TRAs, whose encoded protein releases the RNA polymerase II (RNA Pol II) anchored in the chromatin and regulates the expression of mRNAs in the thymus gland. The biological function of this gene is associated to the induction of central immune tolerance preventing the onset of autoimmune diseases. This is a result of negative selection of autoreactive thymocytes (T cell precursors) that interact physically with mTECs. Self-reactive thymocytes that recognize TRAs as foreign elements are eliminated by apoptosis. The co-culture of mTECs with thymocytes represents an appropriate in vitro model system to approximate the cellular interaction that occurs within the thymus. Previous results from our laboratory demonstrated that in addition to the control of TRA mRNAs, Aire also participates in the modulation of miRNAs in mTECs since these RNA species are transcribed by RNA Pol II. Continuing with this line of studies, in this study we demonstrate for the first time that Aire also modulates the expression of long non-coding RNAs (lncRNAs) in mTECs. For this, we used the loss-of-function strategy to analyze the expression of this RNA species, as well as mRNAs in mTEC Aire + / + or Aire knockout mTEC cells (KO Aire - / -) obtained by the gene editing by Crispr-Cas9. The transcriptome of these cells, whether or not adhered to thymocytes, was then analyzed by microarray hybridizations. This demonstrated that Aire and cell adhesion influence the expression of both mRNAs and lncRNAs. The reconstruction of lncRNAs-mRNAs interaction networks made possible to evidence a new post-transcriptional regulation pathway in mTEC cells.

O crosstalk entre timócitos e células epiteliais tímicas é crucial para o desenvolvimento das células T e estabelecimento da tolerância central. Células tímicas epiteliais medulares (mTECs) contribuem para a autotolerância por meio da expressão ectópica de antígenos restritos aos tecidos (TRAs). A expressão de TRAs em mTECs é altamente dependente do gene Autoimmune Regulator (Aire). Por meio do reconhecimento de TRAs com alta afinidade, células T autoreativas são selecionadas negativamente do pool de timócitos em desenvolvimento. Apesar do papel de Aire na indução da tolerância central ser bem conhecido, os mecanismos celulares e moleculares precisos do processo permanecem obscuros. Nesse estudo, hipotetizamos que perturbações na expressão do gene Aire influenciam a adesão entre mTECs e timócitos, o que poderia resultar em um desequilíbrio na imunotolerância a antígenos próprios. Um ensaio funcional realizado com timócitos frescos, extraídos de um timo normal de camundongo e cocultivados com células epiteliais tímicas medulares da linhagem mTEC 3.10, demonstrou que a inibição do gene Aire por meio de RNA de interferência reduziu significativamente a capacidade das mTECs de promover a adesão dos timócitos. Análises por microarray revelaram que o silenciamento do gene Aire nas células mTEC 3.10 causou a modulação de mais de 1000 genes, alguns que codificam TRAs, outros que codificam proteínas envolvidas na adesão celular, como VCAM-1, e também outros que codificam moléculas coestimuladoras como CD80. Esses resultados contribuem para uma melhor compreensão do papel de Aire no controle da adesão mTEC-timócitos, a qual constitui um processo essencial para a seleção negativa de timócitos autoreativos / The crosstalk between thymocytes and thymic epithelial cells is critical for T cell development and the establishment of central tolerance. Medullary thymic epithelial cells (mTECs) contribute to self-tolerance through the ectopic expression of tissuerestricted antigens (TRAs) in the thymus. TRAs expression in mTECs is largely dependent on Autoimmune Regulator (Aire) gene. Through the recognition of TRAs with high affinity, developing autoreactive T cells are negatively select from the pool of developing thymocytes. Although the role of Aire in the induction of central tolerance is well known, the precise cellular and molecular mechanisms remain unclear. In this study, we hypothesize that disturbance in Aire gene expression influences adhesion between mTECs and thymocytes, which could result in an imbalance in immune-tolerance to self-antigens. A functional assay performed with fresh thymocytes dissociated from a normal mouse thymus and co-cultured with a medullary thymic epithelial cell line named mTEC 3.10, demonstrated that Aire RNAi knockdown significantly decreased the ability of mTECs to promote thymocyte adhesion. Microarray analysis revealed that Aire knockdown of the murine mTEC 3.10 cell line led to the modulation of more than 1000 genes, some of them coding for TRAs, others for proteins involved in cell adhesion like VCAM-1 and also for costimulatory molecules like CD80. These results contribute to a better understanding of the role of Aire in the control of mTEC-thymocyte adhesion, which is an essential process for negative selection of autoreactive thymocytes

Submitted by PPG Pediatria e Sa?de da Crian?a (pediatria-pg@pucrs.br) on 2018-05-21T13:12:10Z No. of bitstreams: 1 Vers?o completa da disserta??o-stefaniemuraro.pdf: 4426933 bytes, checksum: 5733e09060e6e08135de26c11374b171 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2018-05-28T17:29:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Vers?o completa da disserta??o-stefaniemuraro.pdf: 4426933 bytes, checksum: 5733e09060e6e08135de26c11374b171 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-28T17:34:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vers?o completa da disserta??o-stefaniemuraro.pdf: 4426933 bytes, checksum: 5733e09060e6e08135de26c11374b171 (MD5) Previous issue date: 2018-03-16 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Respiratory syncytial virus (RSV) is a major cause of diseases of the respiratory tract in humans being mainly associated with bronchiolitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and asthma exacerbation. RSV infection occurs primarily in pulmonary epithelial cells and, once infection is established, an innate immune response is triggered and mainly neutrophil recruitment is induced. Neutrophils can extrude neutrophil extracellular traps (NETs) capable of entrapping and inactivate a multitude of microorganisms because of its composition and due to the stringy nature of DNA fibers. Recently, was demonstrated that RSV particles and its fusion (F) protein were able to induce the release NETs coated with neutrophil elastase and myeloperoxidase, both antimicrobial peptides. Also, was observed that the excessive formation of NETs can have negative consequences to the host, such as airway obstruction during RSV infection. Therefore, the aim was to evaluate the mechanisms involved in NET formation induced by RSV infection of neutrophils, alveolar epithelial cells (A549) or lung fibroblasts (MRC5). Human neutrophils were infected with RSV and were able to induce NETs release only after 3 hours of stimulation indicating classical NETosis. Next was characterized NETs formation during infection associating DNA extrusion with MPO, NE and F protein of RSV. Was also observed NADPH oxidase and PAD4 dependence and PI3K/AKT, ERK and p38 MAPK pathways during infection. The inhibition of these signaling pathways, PAD4 and ROS production abolished NET formation. Considering a possible involvement of necroptosis during NETs production, were tested MLKL and RIPK inhibitors and evaluated LDH release in the supernatant of infected neutrophils. Neutrophils released LDH and depend on necroptosis induction to produce NETs. Likewise, neutrophils were co-cultured with A549 or MRC5 cells infected with RSV. Both A549 and MRC5 cells triggered NET release by human neutrophils in a virus concentration-dependent manner, the opposite occurs when used UV-inactivated virus. Briefly, RSV induces the classical/ROS-dependent NETosis by human neutrophils, and this effect relies on specific kinases activity. Furthermore, neutrophils are able to recognize pulmonary cells infected by RSV, releasing NETs. Thus, NETs release control could be crucial for minimizing tissue inflammation caused by RSV infection. / O v?rus sincicial respirat?rio (VSR) ? uma das principais causas de doen?as do trato respirat?rio em humanos sendo associado principalmente com bronquiolite, doen?a pulmonar obstrutiva cr?nica (DPOC) e exacerba??o de asma. O VSR infecta principalmente c?lulas epiteliais pulmonares e, uma vez que a infec??o ? estabelecida, uma resposta imune inata ? desencadeada e ocorre o recrutamento de c?lulas do sistema imune, principalmente neutr?filos. Os neutr?filos podem liberar redes extracelulares de neutr?filos (NETs) capazes de capturar e inativar uma grande quantidade de microrganismos devido ? sua composi??o e natureza fibrosa das fibras de DNA. Recentemente, foi demonstrado que part?culas do VSR al?m da prote?na de fus?o (F) do v?rus foram capazes de induzir a libera??o de NETs revestidas com elastase neutrof?lica e mieloperoxidase, ambos pept?deos com atividade antimicrobiana. Al?m disso, observou-se que a forma??o excessiva de NETs pode ter consequ?ncias negativas para o hospedeiro, como a obstru??o das vias a?reas durante a infec??o por VSR. Portanto, o objetivo foi avaliar os mecanismos envolvidos na forma??o de NET induzida pela infec??o por RSV em neutr?filos humanos, c?lulas epiteliais alveolares (A549) ou fibroblastos pulmonares (MRC5). Neutr?filos humanos foram infectados com VSR e foram capazes de induzir a libera??o de NETs somente ap?s 3 horas de infec??o, indicando uma NETose cl?ssica. Em seguida, foi caracterizada a forma??o de NETs durante a infec??o associando a extrus?o de DNA com as prote?nas MPO, NE e com a prote?na F do VSR. Tamb?m se observou a depend?ncia de NADPH oxidase e PAD4 e das vias de sinaliza??o PI3K / AKT, ERK e p38 MAPK durante a infec??o. A inibi??o dessas vias de sinaliza??o, da produ??o de PAD4 e de EROs aboliu a forma??o de NET. Considerando um poss?vel envolvimento da necroptose na produ??o de NETs, foram utilizados inibidores de MLKL e RIPK1 e foi avaliada a libera??o de LDH no sobrenadante de neutr?filos infectados. Os neutr?filos liberaram LDH e dependeram da ativa??o da necroptose para produzir NETs. Do mesmo modo, os neutr?filos foram co-cultivados com c?lulas A549 ou MRC5 infectadas com VSR. Ambas as c?lulas A549 e MRC5 desencadearam a libera??o de NET por neutr?filos humanos de uma maneira dependente da concentra??o de v?rus, o oposto ocorreu quando usado um v?rus UV-inativado. Resumidamente, o VSR induz a NETose cl?ssica / dependente de EROs em neutr?filos humanos, e este efeito depende de atividade espec?fica de quinases. Al?m disso, os neutr?filos s?o capazes de reconhecer c?lulas pulmonares infectadas pelo VSR, induzindo a libera??o NETs. Assim, o controle de libera??o de NETs pode ser crucial para minimizar a inflama??o do tecido causada pela infec??o por VSR.