Orientador: Cezinande de Meira / Resumo: O presente estudo teve como objetivo descrever o perfil proteico do embrião equino e do fluido uterino durante a fase inicial do reconhecimento materno da gestação. Foram utilizadas 10 éguas, sem anormalidades uterinas, de 5 a 8 anos de idade. O acompanhamento folicular diário foi realizado até a detecção de um folículo (35 mm) para indução da ovulação, o dia seguinte realizava a inseminação artificial e posteriormente o D0 sendo o dia da ovulação da égua. O líquido uterino foi colhido, usando tampão vaginal comercial de humanos nos dias 7 (D7), 10 (D10) e 12 (D12) de gestação. Nos mesmos períodos, após a retirada do tampão vaginal, os embriões foram colhidos por fluxo retrógrado utilizando-se tampão fosfato-salina pH 7,2. O processamento do líquido uterino foi de centrifugação e dos embriões foram sonicação e centrifugação para proteômica. A concentração de proteína total foi determinada e uma alíquota (50 µg) foi digerida “in solution” com tripsina, seguida da análise por espectrometria de massas. Após a análise estatística multivariada, foram identificadas 171 proteínas, sendo 29 no embrião e 142 no líquido uterino. Foram encontradas 15 proteínas mais abundantes nos embriões, sendo 10 no D10 e 5 no D12. Já no líquido uterino, 6 proteínas foram mais abundantes no D7, 3 no D10 e 6 no D12. As principais funções moleculares foram atividade catalítica e de ligação e os processos biológicos mais significativos foram o processo celular e metabólico. Este estudo descreveu proteína... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to describe the protein profile of the equine embryo and uterine fluid, during the maternal recognition of pregnancy. Ten mares from 5 to 8 years of age, without uterine abnormalities were used. Daily follicular monitoring was performed until the detection of the preovulatory follicle (35 mm) to induce ovulation, the next day performed artificial insemination and then D0 was the mare's ovulation day. The uterine fluid was collected using commercial human vaginal tampon at 7 (D7), 10 (D10) and 12 (D12) of the gestation. In the same moments, after withdraw vaginal tampon, the embryos were collected by retrograde flushing using phosphate-saline buffer pH 7.2. The processing of the uterine fluid was centrifugation and the embryos were sonicated and centrifuged for proteomics. The total protein concentration was determined and an aliquot (50 µg) was digested “in solution” with trypsin, followed by analysis by mass spectrometry. After data analysis by multivariate statistical, 171 proteins were identified, 29 in the embryo and 142 in the uterine fluid. Fifteen abudant proteins were found in the embryos, 10 proteins in the D10 and 5 in the D12. In the uterine fluid, 6 proteins were more abundant in the D7, 3 in the D10 and 6 in the D12. The main molecular functions were catalytic and binding activity and the most significant biological processes were the cellular and metabolic processes. This study described proteins that were abundants in the uterine fluid... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Robson Francisco Carvalho / Resumo: Adenocarcinoma ductal do pâncreas (PDAC) é extremamente agressivo, possui prognóstico desfavorável e não existem biomarcadores satisfatório para a doença ou identificação de indivíduos com alto risco de morbidade e mortalidade. A complexidade celular e molecular do câncer de pâncreas leva a inconsistências nas validações clínicas de muitas proteínas que foram avaliadas como biomarcadores prognósticos da doença. O secretoma tumoral desempenha um papel crucial na proliferação e metástase de células PDAC, bem como na resistência a tratamentos terapêuticos, que juntos contribuem para um pior resultado clínico. Assim, a enorme quantidade de dados proteômicos do câncer de pâncreas que foram gerados a partir de diferentes tipos de amostras e técnicas de espectrometria de massa pode ser integrada para a seleção de proteínas secretadas compartilhadas relevantes para o diagnóstico e prognóstico da doença. O objetivo do presente estudo foi realizar uma meta-análise combinando dados do proteoma do câncer de pâncreas e secretome publicamente para identificar novos potenciais biomarcadores de doenças. Realizamos uma meta-análise integrando dados de espectrometria de massa obtidos de duas revisões sistemáticas da literatura sobre câncer de pâncreas, que selecionaram independentemente 20 estudos do secretoma e 35 do proteoma. Em seguida, realizamos análises de predição de proteínas secretadas usando sete ferramentas ou bancos de dados “in silico”, que identificaram 39 proteínas compartilhada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is extremely aggressive, has an unfavorable prognosis and there are no satisfactory biomarkers for the disease or identification of individuals at high risk of morbidity and mortality. The cellular and molecular complexity of pancreatic cancer leads to inconsistences in clinical validations of many proteins that have been evaluated as prognostic biomarkers of the disease. Tumor secretome plays a crucial role in PDAC cell proliferation and metastasis, as well as in resistance to therapeutic treatments, which together contribute to a worse clinical outcome. Thus, the massive amount of proteomic data from pancreatic cancer that have been generated from different studies can be integrated into the selection of shared secreted proteins relevant to the prognosis of the disease. The aim of the present study was to perform a metaanalysis combining pancreatic cancer proteome and secretome publicly data to identify new potential disease biomarkers. We performed a meta-analysis integrating mass spectrometry data obtained from two systematic reviews of the pancreatic cancer literature, which independently selected 20 studies of the secretome and 35 of the proteome. Next, we performed prediction analyses of secreted proteins using seven “in silico” tools or databases, which identified 39 proteins shared between the secretome and the proteome data. Notably, the expression of 31 genes of these proteins was upregulated in pancreatic adenocarcinoma samp... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As microcistinas constituem uma família de heptapeptídeos cíclicos com cerca de 70 variantes caracterizadas. São biossintetizadas em condições específicas por cianobactérias, principalmente em corpos d\'água eutrofizados. Apresentam organotropismo ao fígado e DL50 entre 50-500 µg.kg-1 peso (rato, i.p.). A exposição aguda pode impactar a saúde humana ao desarranjar o parênquima hepatocelular por hiperfosforilação do citoesqueleto e produzir intenso sangramento, podendo levar à morte por choque hipovulêmico um homem adulto e são promotoras tumorais, quando ocorre exposição crônica, por inibição de fosfatases 1 e 2A. Os congêneres das microcistinas apresentam toxicidades distintas e é importante caracterizá-los em corpos d\'água para se estimar o risco à saúde humana. Na literatura, não há convergência quanto à forma de extração das toxinas, preparo das amostras para análise e condições cromatográficas para o isolamento e quantificação. Neste trabalho, diversas análises foram conduzidas para se determinar as melhores formas de extração das toxinas, clean up da amostra e condições cromatográficas para amostras de campo ou cultura de cianobactérias. A extração hidro-alcoólica (MeOH:H2O, 3:1, v/v) parece ser a melhor forma de extração, seguida de partição líquido-líquido para amostras de campo (florações) e extração em fase sólida (cartuchos C18) para algas cultivadas em laboratório. Por meio de isolamento por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detectores UV-VIS e pela análise do padrão de fragmentação das moléculas por espectrometria de massas (MS) com ionização por eletrospray em Tandem (ESI-MS/MS) determinou-se a presença das variantes de microcistinas MC-RR, MC-LR, MC-YR e MC-hRhR na amostra de água do Reservatório Billings e [Asp3]MC-LR na cepa Microcystis aeruginosa BCCUSP 235. Este método parece ser adequado para a extração e caracterização de microcistinas presente em corpos d\'água e em cultura de laboratório e a variante MC-hRhR foi caracterizada pela primeira vez na literatura mundial. / It is well known that eutrophicated lakes and water reservoirs can be a serious concern to wildlife, domestic livestock and human health since cyanobacterial blooms are prone to occur. Some cyanobacteria (blue-green algae) species which form bloom may biosynthesize a family of hepatotoxic peptides named microcystins under certain circumstances, related specially to nitrogen: phosphorus ratio, temperature, pH and light intensity of the water body. There are at least 70 variants of microcystins with different toxicity, DL50 ranging from 50 to 500 µg.kg-1 (in mouse, i.p.). Acute exposure provoke hyperphosphorylation of the cytoskeleton, in liver cells, leading to cellular disruption with haemorrhage and the long term exposure can cause tumor promotion by inactivation of serine/threonine phosphatases 1 and 2A (PP1 and PP2A). Therefore, it is very important to determine and quantify microcystin variants present in water reservoirs. There are several methods available to evaluate qualitative and quantitatively microcystin and its variants in water reservoir and estimate human risks. Such methods comprise biological, biochemical and physico-chemical assays. In this work, we have isolated and analyzed hepatotoxins by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with photodiode array (PDA) detector and their structures were elucidated by Tandem - MS/MS with eletrospray ionization (ESI-MS/MS). MC-RR, MC-LR, MC-YR and MC-hRhR were determined in samples collected at Billings reservoir and [Asp3]MC-LR was found in the strain Microcystis aeruginosa BCCUSP 235. The procedures developed herein can be a powerful tool for isolation and determination of microcistin and its derivatives founded in water reservoirs. Also, we have described for the first time a new variant of microcistin: MC-hRhR.

Este trabalho visa determinar a estrutura e a reatividade de íons [C2H5S]+, fragmentos comuns em espectros de massa, através de reações íon-molécula em fase gasosa. Identificaram-se diferentes estruturas isoméricas, para íons com composição formal [C2,H5,S]+, com reatividades distintas. Verificou-se que os íons [C2H5S]+ obtidos por fragmentação do íon molecular do metiletilsulfeto reagem por três caminhos independentes com seu precursor neutro: a) abstração de hidreto; b) transferência de carga; c) transferência de próton. A cinética desta reação, estudada por ressonância ciclotrônica de íons por transformada de Fourier, sugere a presença de mais de um isômero do íon reagente. As reações de abstração de hidreto e transferência de próton são consistentes com as estruturas CH2=S+-CH3 e CH3CH=SH+, respectivamente, enquanto que a reação de transferência de carga indica a presença do cátion tioetóxi (CH3CH2S+), estável apenas em estado triplete. Estudos usando CD3SC2H5 demonstram que a reação de transferência de carga é promovida por cátions formados a partir da quebra da ligação C-S. Cálculos indicam que durante este caminho de fragmentação há uma tendência de se formar um íon em estado triplete, no entanto, é a primeira vez que se demostra isto experimentalmente. Isolando individualmente cada um dos diversos isômeros, verificou-se que o íon sulfônio reage essencialmente por abstração de hidreto e/ou transferência de grupos metilênicos, enquanto que o tioacetaldeído protonado e o tiirano protonado reagem, principalmente, por transferência de próton. Dependendo da forma como os íons são obtidos (ionização química ou eletrônica), e das propriedades termoquímicas dos substratos, verifica-se que estes íons podem reagir por outros caminhos, provavelmente por um mecanismo de isomerização bimolecular. A observação de que é possível gerar íons CH3CH2S+, no estado triplete, cuja vida média é de pelo menos centenas de milisegundos sugere a possibilidade da observação de outros cátions semelhantes. / This thesis describes a series of simple gas-phase ion-molecule reactions of [C2H5S]+ ions aimed at elucidating the structure of these ions. Different isomeric structures were identified according to their reactivity. These ions obtained by electron ionization from CH3SC2H5 at 13 eV undergo three distinct low pressure reactions with the parent neutral: hydride abstraction, proton transfer and charge transfer. The kinetics of these reactions studied by FT-ICR techniques suggests the [C2H5S]+ species to be a mixture of isomers. While hydride abstraction and proton transfer are consistent with CH2=S+-CH3 and CH3CH=SH+, the observed charge transfer argues for the presence of thioethoxy cation (CH3CH2S+), predicted to be stable only in the triplet state. Studies using CD3SC2H5+ show that charge-transfer reactions are promoted by cations originating from a S-C bond cleavage. Calculations of the primary fragmentation pathways of the molecular ion reveal the tendency to generate triplet thioethoxy cation. However, this is the first time that these long lived cations have been observed experimentally. The reactions of each isolated isomer show that the sulfonium ion reacts basically by hydride abstraction and methylene transfer, while protonated tioacetaldehyde and protonated tiirane react by proton transfer. Depending on how the [C2H5S]+ ions are obtained ( chemical or electronic ionization) and the thermochemical properties of the neutral substrates, these ions undergo different reaction pathways, probably by a bimolecular isomerization mechanism. The observation of these long-lived cations suggests that other thioalkoxy cations may also be amenable to experimental observation.

Orientador: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Resumo: A pitiose, cujo agente etiológico é o oomiceto Pythium insidiosum, é uma doença emergente que ocorre principalmente em países tropicais e subtropicais, afetando diversas espécies animais, sendo mais frequente em cavalos no Brasil e humanos na Tailândia. A doença é difícil de diagnosticar, porque as hifas do patógeno são frequentemente confundidas com mucormicoses ou entomoftoromicoses em cortes histológicos. Além disso, não há antígeno eficiente e específico que possa ser utilizado para o diagnóstico rápido e o tratamento eficiente da pitiose em diferentes espécies. Os antígenos são moléculas que o sistema imunológico reconhece, tornando essas moléculas importantes alvos para o diagnóstico de micro-organismos. Para a identificação de antígenos, a imunoproteômica é considerada uma ferramenta poderosa. Nesse sentido, investigamos quais antígenos de P. insidiosum são reconhecidos pelo soro de equinos no Brasil e por soro de pacientes tailandeses com pitiose, a fim de encontrar proteínas semelhantes que possam ser utilizadas para futuros testes de diagnóstico ou terapia para pitiose. Para identificar as proteínas imunorreativas de P. insidiosum, foram utilizadas abordagens imunoproteômicas, técnica de Western blot, seguida pela identificação de antígenos por espectrometria de massas. Consequentemente, foi possível identificar 23 antígenos reconhecidos entre os soros de equinos e humanos. Sete antígenos foram correspondentes aos soros em ambas espécies: heat shock cognate 70 KDa p... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Pythiosis, whose etiological agent is the oomycete Pythium insidiosum, is an lifethreatening disease that occurs mainly in tropical and subtropical countries, affecting several animal species, being more frequent in horses in Brazil and humans in Thailand. The disease is difficult to diagnose, because the pathogen's hyphae are often confused with Mucorales or Entomophthorales fungi in histological sections. In addition, there is no efficient and specific antigen that can be used for the rapid diagnosis and efficient treatment of pythiosis in different species. Antigens are molecules that the immune system recognizes, making these molecules important targets for the diagnosis of microorganisms. For the identification of antigens, immunoproteomics is considered a powerful tool. In this sense, we investigated which P. insidiosum antigens are recognized by horses in Brazil and Thai humans’ serum with pythiosis, in order to find similar proteins that could be used for future diagnostic tests or therapy approaches for pythiosis. To identify the immunoreactive proteins of P. insidiosum, immunoproteomic approaches were used, using the Western blot technique followed by the identification of antigens by mass spectrometry. Consequently, it was possible to identify 23 antigens recognized between the serum of horses and humans. Seven antigens were similar to the two types of serum, being heat shock cognate 70 KDa protein, heat shock 70 KDa protein, glucan 1,3-beta-glucosidase, fructosebi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Neste trabalho sintetizamos e monitoramos a purificação de ftalocianinas sulfonadas de zinco, utilizadas como drogas terapêuticas no tratamento do câncer, utilizando eletroforese capilar com detecção por fluorescência induzida por laser e espectrometria de massas. O primeiro capítulo discute a implementação de um sistema de eletroforese capilar acoplado a um espectrômetro Raman dotado de um detector do tipo CCD. Para este sistema foi desenvolvido um sistema de injeção eletrocinética próprio. Neste capítulo discutimos também o efeito de binning do CCD permitiu alcançar limites de detecção da ordem de 10-11 mol.L-1. O capítulo 2 enfoca a síntese e purificação das ftalocianinas multisulfonadas de zinco e a análise dos produtos purificados por eletroforese capilar. Foram analisados cátions, ânions e contaminantes orgânicos. Este estudo mostrou que os métodos de purificação descritos na literatura como \"salting-out\", a lavagem ácido - base, extração por soxhlet e percolação em coluna, quando utilizados independentemente, não são suficientes para purificar as ftalocianinas. É necessário um processo de purificação combinado. Fizemos várias combinações dos processos de purificação e verificamos que o melhor resultado foi obtido para a combinação entre lavagem ácido - base e a percolação em coluna de sílica-gel. No capítulo 3 foram avaliados vários meios eletrolíticos para a análise das ftalocianinas de zinco, lutécio e disprósio como citrato e CAPS, a utilização de aditivos como SDS ao tampão citrato. A utilização de SOS como aditivo ao citrato numa concentração que variou de 3 a 75 mmol.L-1 mostrou uma interessante interação entre as ftalocianinas da amostra com diferentes cargas e as micelas de SDS (as micelas já existem em meio aquoso de citrato com 7 mmol.L-1 de SDS como aditivo). Esta interação será discutida em termos de k\' (fator capacidade) e conseqüentemente seu coeficiente de partição com as micelas. Neste: capítulo também discutiremos a atribuição dos eletroferogramas baseados na espectroscopia de massas obtidos em meio neutro, alcalino e ácido das ftalocianinas sulfonadas de zinco, disprósio e lutécio. / In this work, the synthesis, purification and analysis of sulphonated metallo-phthalocyanines, used as therapeutical drugs in the therapy of cancer, were proposed. The analysis was conducted by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection as well as mass spectrometry. The first chapter discusses the implementation of a capillary electrophoresis system coupled to a Raman spectrometer, comprising a CCD detector, which was actually used as a fluorescence detector. An electronic device was also built to allow electrokinetic injections. Besides the characterization of the homemade system, it is also detailed in this chapter, the effect of the CCD binning on the detection limit of the Zn-tetrasulfonated phthalocyanine, which is in the order of 10-11 mol L-1. Chapter 2 focuses on the synthesis and purification strategies for the Zn-disulfonated phthalocyanine, monitored by capillary electrophoresis. Among the contaminants, inorganic cations and anions were screened as well as organic species in the final product, by using different wavelengths and discrete electrolytes. This study showed that purification procedures known in the literature as salting-out, acid-base wash, Soxhlet extraction and percolation through silica gel column, when used as a single procedure, are not sufficient to purify the synthetic product. Several combinations of two procedures were attempted and the best results were obtained when the acid-base wash followed by a percolation in silica gel column was employed. In Chapter 3, several electrolyte systems for the capillary electrophoresis and mass spectrometry analysis of zinc, luthecium and dysprosium di- and tetra-sulfonated phthalocyanines were evaluated. An interesting correlation between the mass spectrometry results and the species in the electropherogram was done for citrate and CAPS buffer, in neutral, basic and acidic media. Moreover, the addition of SDS in the citrate buffer, in the concentration range of 3 to 150 mmol.L-1, revealed an interesting interaction between the phhthalocyanine, charged to different degrees, and the micelle. SDS micelles occur in the citrate buffer in a concentration above 7 mmol.L-1 SDS. This interaction was discussed in terms of retention factor, k\' and partition coefficient, K.

A proteína dermicidina (DCD) é codificada por um gene localizado na porção 12q13 do cromossomo 12, presente apenas em primatas e humanos. A proteína é secretada por células de glândulas da pele, melanócitos, neurônios e células epiteliais da mama normal. Alguns estudos inciais revelaram a participação da proteína DCD em processos oncogênicos nos carcinomas de mama, próstata e melanoma pela sua capacidade de atuar como um fator de crescimento e sobrevivência celular. Nos estudos realizados no nosso laboratório mostramos que a DCD é expressa em células normais da pele, placenta, cérebro e em vários tumores, incluindo os carcinomas de mama e melanoma maligno. Ensaios biológicos e bioquímicos mostraram que o \"knockdown\" da expressão de DCD no melanoma maligno G-361 via RNA de interferência (RNAi) diminuiu significativamente o crescimento in vitro em cultura celular e a formação de tumores em camundongos Nude. Resultados similares foram obtidos quando camundongos Nude transplantados com células de melanoma G-361 foram tratados com anticorpos policlonais de coelhos contra a proteína DCD. Para compreender melhor o papel da proteína DCD na transformação de células de melanoma G-361 foram feitos ensaios de microarranjo de DNA para identificar os genes diferencialmente expressos entre as sublinhagens pLKO (controle) e IBC-I que expressa o shRNA para o mRNA da DCD. Entre os 374 genes alterados pelo silenciamento, encontramos 162 com expressão aumentada e 212 com a expressão reduzida. Os estudos de bioinformática pelo software MetaCore mostraram que o silenciamento do gene DNA modula as vias canônicas e redes de sinalização mediadas pelo receptores e ligantes da família BAFF/APRIL que contralam a ativação do fator de transcrição NF-kB, bem como para histonas envolvidas na remodelação da cromatina. Os níveis de expressão de mRNA de 9 genes de interesse foram validados por ensaios de RT-qPCR. Em uma segunda fase do estudo, foram analisadas as proteínas presentes em extratos nuclares dos clones pLKO e IBC-I de melanoma maligno G-361 por espectrometria de massas. Nos extratos proteicos da sublinhagem pLKO foram identificadas 74 proteínas nucleares, enquanto que na sublinhagem IBC-I foram identificadas 31 proteínas. Um grupo de 21 proteínas foi identificado em ambas sublinhagens. Estudos de bioinformática pelo programa STRING revelou que 14 das proteínas identificadas na sublinagem G-361-pLKO faziam interações diretas ou indiretas com a DCD. A rede formada por estas proteínas tem como centro a proteína p53, uma proteína chave na regulação do programa de morte celular e sobrevivência ao estresse oxidativo. Por outro lado, notou-se que a maioria das proteínas identificadas no extrato nuclear da sublinhagem IBC-I é da família das histonas e que poderiam atuar em complexos de remodelação da cromatina nas células G-361-IBC-I. Nossos resultados nos possibilitaram sugerir que futuros estudos sobre a expressão das histonas e suas modificações pós-traducionais poderão ajudar a desvendar o possível papel da DCD na regulação epigenética do melanoma e em outros tipos de cânceres / Dermcidin (DCD) is a human gene mapped to chromosome 12q13 region, only identified in primates and humans, and normally expressed in the eccrine glands of skin and brain. Several studies have confirmed that DCD-derived peptides contribute to innate and immune surveillance and in the oncogenic processes of breast, prostate and skin cancers, as revealed by its role as a growth factor and cell survival. We have further explored DCD function and its tumorigenic potential on skin melanocytes by specifically knocking down its expression in G-361 malignant melanoma cells via expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA. Biological and biochemical assays showed that the \"knockdown\" in the expression of DCD in G-361-pLKO control clone and a G-361-IBC-I clone expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA decreased significantly the in vitro growth in cell culture and tumor formation in nude mice. Similar results were obtained treating nude mice bearing G-361 melanoma xenografts with rabbit polyclonal antibodies against DCD protein. Here, we present a DNA microarray-based study that identified the genes that are up- and down-regulated in a G-361-pLKO control clone and a G-361-IBC-I clone expressing constitutively short hairpin RNA against DCD mRNA. A total of 372 genes differentially expressed were identified; being 162 genes up-regulated and 212 genes down-regulated. Bioinformatic studies showed that DCD gene silencing modulates canonical pathways and signaling networks mediated APRIL/BAFF receptors and ligands and NF-kB signaling pathway as well as chromatin remodeling mediated by histone family. The mRNA expression levels of 9 genes of interest were validated by RT-qPCR assays. Next we analyzed the proteins present in nuclear extracts from G-361- pLKO and G-361-IBC-I clones by mass spectrometry. We identified 74 proteins in the G-361-pLKO clone and 31 proteins in the G-361-IBC-I. A group of 21 proteins was identified in both sublineages. Bioinformatics analyses by STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) platform showed that a small portion of the proteins identified only in G-361- pLKO cells was predicted to interact directly with DCD. The network formed by these proteins is centered in the p53 protein, a key regulator of survival and cell death program in response to DNA damage and oxidative stress. On the other hand, this network was completed abrogated using the nuclear protein from G-361-IBC-I because of absence of DCD protein. Since most of the proteins identified in nuclear extracts are of the histone family, it is likely that they are acting in the chromatin-remodeling complexes which are important to remodel nucleosomes of the G-361-IBC-I cells. Our results allowed us to suggest that future studies on the expression of histones and their posttranslational modifications may help to unravel the possible role of DCD in the epigenetic regulation of melanoma and other cancers

Introdução: A apneia obstrutiva do sono (AOS) é uma condição clínica comum, embora subdiagnosticada na prática clínica, que está associada de forma independente com um aumento na morbimortalidade cardiovascular. Evidências recentes sugerem que o aumento do risco cardiovascular atribuído à AOS pode ser parcialmente explicado pela desregulação metabólica. No entanto, pouco se sabe sobre o perfil metabólico detalhado destes pacientes e se estes metabólitos podem servir como potenciais biomarcadores para a AOS. Objetivos: O objetivo primário do estudo foi avaliar o perfil metabólico de pacientes com AOS por meio de diferentes estratégias metabolômicas. Como objetivo secundário, avaliamos se o painel de metabólitos selecionados poderia agregar valor diagnóstico ao uso de questionários tradicionalmente empregados para a triagem da AOS. Métodos: Participantes do sexo masculino sem doença cardiovascular prévia ou uso de medicamentos foram submetidos à polissonografia noturna e divididos em 2 grupos pareados por idade e índice de massa corpórea (IMC): sem AOS (índice de apneia e hipopneia [IAH] < 15 eventos/h) e com AOS (IAH >= 15 eventos/h). Além da avaliação clínica, foi aplicado dois questionários para triagem da AOS usados na prática clínica (questionário Berlim e o escore NoSAS). A quantificação de aminoácidos (AA) no plasma foi realizada por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS²) previamente desenvolvido e validado no Grupo Fleury. Para as análises metabolômicas e lipidômicas foram utilizados cromatografia gasosa acoplado a espectrometria de massas (GC-MS) e cromatografia líquida (LC) off-line com detecção por ionização/dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI-MS), respectivamente. Para avaliação dos marcadores que estariam associados à AOS foram utilizados teste t de student (p < 0,05) e VIP score > 2 (predição de variável de importância). A sensibilidade e especificidade foram avaliadas por meio da curva receiver operating characteristic (ROC) e modelos de regressão logística em associação com o melhor questionário de triagem para a AOS. Resultados: 53 participantes foram estudados (16 sem AOS e 37 com AOS). Como proposto, a idade média (36 ± 6 vs. 39 ± 7 anos) e o IMC (30,3 ± 3,5 vs. 30,6 ± 3,4 kg/m2) foram semelhantes entres os grupos sem e com AOS, respectivamente. A quantificação dos AA permitiu observar uma diferença significante nos níveis de ácido glutâmico, que foram maiores nos pacientes com AOS (83,5 ± 22,5 ?M) quando comparados ao grupo sem AOS (66,7 ± 24,5 uM), p=0,023. A avaliação do perfil metabolômico resultou em 28 analitos significantes. Seis desses analitos foram provenientes da análise por GC-MS: pacientes com AOS apresentaram maiores níveis de 6-deoxi-D-glicose; 2,6-difenil-1,7-diidrodipirrolo [2,3-b:3\',2\'-e] piridina, ácido 9 (Z)-hexadecenóico e ácido araquidônico e menores níveis de 5,5\'-bifitalato e glutamina quando comparados ao grupo sem AOS (p < 0,05). A análise lipidômica (LC off-line e MALDI-MS) resultou em 22 lipídios significantes subdivididos nas seguintes classes: ceramidas (Cer), fosfatidiletanolamina (PE), lisofosfatidilcolina (LPC), e esfingomielina (SM) com níveis mais elevados em pacientes com AOS em comparação ao grupo sem AOS (p < 0,05). Diacilglicerol (DAG), fosfatidilcolina (PC) e ácido fosfatídico (PA) tiveram níveis significativamente diminuídos nos pacientes com AOS em comparação aos sem AOS. Em relação ao objetivo secundário, o questionário com melhor desempenho para triar a AOS foi o escore NoSAS com uma área sob a curva (AUC) de 0,724. A combinação dos 4 metabólitos (ácido glutâmico, glutamina, 6-deoxi-D-glicose e ácido araquidônico) ou dos 3 lipídios (LPE 35:1, SM d18:1/12:0 e LPC 27:1) selecionados pelo modelo de regressão logística ao escore NoSAS positivo resultou em uma AUC de 0,917 e 0,951, respectivamente, para a detecção da AOS. Conclusão: A aplicação da metabolômica permitiu a identificação de potenciais biomarcadores precoces para a AOS em homens jovens. Estes achados não são explicados por fatores de confusão como a idade, IMC e composição corporal. Este estudo confirma o achado de que os questionários habitualmente usados para a triagem da AOS não apresentam um bom desempenho. A combinação dos metabólitos selecionados aumentou a sensibilidade e especificidade para detecção da AOS em relação ao questionário isolado. Neste contexto, novos estudos são necessários para avaliar se estes biomarcadores poderão ser úteis para a predição do risco cardiovascular e melhora do diagnóstico da AOS / Introduction: Obstructive sleep apnea (OSA) is a common clinical condition, although frequently underdiagnosed in clinical practice. OSA is independently associated with an increased risk of cardiovascular morbidity and mortality. Recent evidence suggests that the cardiovascular risk attributed to OSA may be partially explained by metabolic dysregulation. However, little is known about the detailed metabolic profile of these patients and whether these metabolites may serve as potential biomarkers for OSA. Objectives: The primary objective of the study was to evaluate the metabolic profile of OSA patients through different metabolomics strategies. As a secondary objective, we evaluated whether the panel of selected metabolites could improve diagnostic value to the use of questionnaires traditionally used for OSA screening. Methods: Male participants with no previous cardiovascular diseases and under no medications were submitted to a nocturnal polysomnography and divided into 2 groups matched by age and body mass index (BMI): no OSA (apnea and hypopnea index [AHI] < 15 events/h) an OSA (AHI >= 15 events/h). In addition to the clinical evaluation, was applied two questionnaires to screening OSA in the clinical practice (Berlin questionnaire and the NoSAS score). The quantification of amino acids (AA) in plasma was performed by liquid chromatography coupled to sequential mass spectrometry (LC-MS/MS) previously developed and validated in the Fleury Group. To the metabolomics and lipidomics analysis, we used gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and off-line liquid chromatography (LC) with matrix-assisted laser ionization/desorption detection (MALDI-MS), respectively. Student\'s t test (p < 0.05) and VIP score >2 (significance variable prediction) were used to evaluate the markers associated with OSA. Sensitivity and specificity were evaluated using the receiver operating characteristic (ROC) curve and logistic regression models in association with the best screening questionnaire for OSA. Results: 53 participants were studied (16 with no OSA and 37 with OSA). As proposed, mean age (36 ± 6 vs. 39 ± 7 years) and BMI (30.3 ± 3.5 vs. 30.6 ± 3.4 kg/m2) were similar between the groups without and with OSA, respectively. The quantification of AA showed a significant difference in the glutamic acid levels, which were higher in patients with OSA (83.5 ± 22.5 ?M) when compared to the group with no OSA (66.7 ± 24.5 ?M), p=0.023. Metabolomics profile analysis resulted in 28 significant analytes. Six of these analytes came from GC-MS analysis: patients with OSA had higher levels of 6-deoxy-D-glucose, 2,6-diphenyl-1,7-dihydrodipyrrolo [2,3-b:3\',2\'-e] pyridine, 9-hexadecenoic acid (Z) and arachidonic acid and lower levels of 5,5\'-biphthalide and glutamine when compared to the no OSA group (p < 0.05). The lipidomics analysis (LC off-line and MALDI-MS) resulted in 22 significant lipids subdivided into the following classes: glycerophosphoethanolamine (PE), lysophosphosphatidylcholine (LPC), and sphingomyelin (SM) with higher levels in patients with OSA when compared to the no OSA group (p < 0.05). Diaglycerol (DAG), glycerophosphocholine (PC) and phosphatidic acid (PA) had significantly decreased levels in patients with OSA compared to those with no OSA. Regarding to the secondary endpoint, the best performing questionnaire for screening OSA was the NoSAS score with an area under the curve (AUC) of 0.724. The combination of the 4 metabolites (glutamic acid, glutamine, 6-deoxy-D-glucose and arachidonic acid) or the 3 lipids (LPE 35:1, SM d18:1/12:0 and LPC 27:1) previously selected by logistic regression model to the NoSAS positive score resulted in an AUC of 0.917 and 0.951, respectively, for the OSA detection. Conclusion: The application of metabolomics strategies allowed the identification of potential early biomarkers for OSA in young male subjects. These findings are not explained by confounding factors such as age, BMI and body composition. This study confirms previous findings that the questionnaires commonly used for screening OSA do not have a good performance. The combination of the selected metabolites increased the sensitivity and specificity to OSA detection in relation to the use of sleep questionnaire only. In this context, further studies are necessary to assess whether these biomarkers may be useful for predicting cardiovascular risk and improving the OSA diagnosis

O propacetamol é um pró-fármaco do acetoaminofeno, administrado por via intravenosa, utilizado para o controle da febre e da dor do período perioperatório em terapias do tipo multimodal. No organismo o propacetamol é hidrolisado rapidamente pelas esterases plasmáticas em dietilglicina e acetoaminofeno, seu metabólito ativo, cujo mecanismo de ação é a inibição da síntese de prostaglandinas resultantes da hidrólise do ácido araquidônico pela enzima ciclo-oxigenase 2. Em altas doses, o acetoaminofeno sofre oxidação pela isoforma CYP2E1 do sistema de enzimas do citocromo P450 biotransformando-se em N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI), um metabólito extremamente reativo e hepatotóxico. Embora seu amplo uso e boa tolerabilidade, observa-se um número reduzido de dados literários sobre o prófármaco alvo ou possíveis metabólitos. Assim, inicialmente investigou-se a aplicação de protocolos existentes na literatura visando à síntese do cloridrato de propacetamol, sendo a rota sintética estabelecida em dois passos reacionais. Logo, uma metodologia clássica usando catálise com iodeto foi eficiente em gerar o pró-fármaco com rendimento global de 25%. Além disso, um método assistido por micro-ondas foi testado a fim de melhorar o rendimento e otimizar as condições reacionais. Este protocolo permitiu isolar o pró-fármaco desejado em excelente rendimento comparado a outras abordagens sintéticas descritas na literatura. Este método também apresenta algumas vantagens adicionais como a ausência de catalisador e um menor volume de solvente no meio reacional. Logo, o cloridrato de propacetamol foi sintetizado em 10 minutos a 120°C com 98% de rendimento. Depois de sintetizado, o pró-fármaco foi submetido à avaliação do efeito antipirético mostrando-se eficiente na inibição da febre estimulada por lipopolissacarídeo (LPS) na dose de 600 mg/kg de massa corpórea, a qual equivale à dose de 300 mg/kg de acetaminofeno. Na última parte deste trabalho foram realizados ensaios de metabolismo in vitro por meio de reações microssomais, a fim de identificar a formação de metabólitos via espectrometria de massas por captura de íons (ion trap), os quais mostraram que o principal metabólito foi o acetaminofeno, já que o uso da estratégia de pró-fármacos em química medicinal objetiva a liberação de fármacos pelo metabolismo enzimático. Portanto, os estudos realizados são considerados satisfatórios, visto que a síntese assistida por microondas foi o melhor método para o preparo do cloridrato de propacetamol em excelente rendimento e a atividade antipirética foi confirmada por meio de ensaios farmacológicos in vivo. Além disso, o presente trabalho pode contribuir com o estudo de metabolismo in vitro usando a espectroscopia de massas como ferramenta analítica na identificação de metabólitos. / Propacetamol is an acetaminophen prodrug of intravenous administration used to control fever and pain of perioperative period in multimodal analgesia therapy. After injection, it is completely converted by plasma esterases into dietylglycine and acetaminophen, its active metabolite whose mechanism of action is the inhibition of prostaglandins, which arose from hydrolysis of arachidonic acid by cyclooxygenase 2. In overdose, acetaminophen is converted to N-acetil-p-benzoquinone imine (NAPQI) by biotransformation mediated by P450 enzymes, mainly CYP2E1. This toxic metabolite is highly reactive and responsible for hepatic injury. The propacetamol has a good tolerability and a wide use, although there are restricted number of articles about it and its possible metabolites. We started the work by investigating the application of some methods described in literature to synthesize the propacetamol hydrochloride in two reaction steps. Thus, a classical methodology using iodine as catalyst was efficient to produce the prodrug in 25% global yield. In addition, a microwave-assisted method was tested to enhance the yield and optimize the reaction conditions. To our delight, it has allowed the isolation of the desired prodrug in excellent yield compared to other synthetics approaches described in literature. This method also has some extra advantages such as the absence of catalyst and lower solvent volume in reaction medium. Therefore, propacetamol hydrochloride was synthesized in 10 min at 120°C in 98% reaction yield. The synthesized molecule was undergone a pharmacologic evaluation and the prodrug was efficient in inhibiting fever induced by LPS. The dosage of propacetamol (600mg/kg) was equivalent to acetaminophen (300mg/kg) to inhibit fever until four hours after administration. The last part of this research was the in vitro metabolism essay by means of microssomal reaction in order to determine the metabolite formation through ion trap tandem mass spectrometry. That essay showed that the main produced metabolite was acetaminophen since the use of prodrug strategy in medicinal chemistry aims the drug release by enzymatic metabolism. In summary, the performed studies may be seen as satisfactory since the microwave-assisted synthesis was the best way to prepare propacetamol hydrochloride in an excellent yield and the antipyretic activity was confirmed by in vivo pharmacologic essays. Furthermore, the present work may contribute with an in vitro metabolism study using mass spectrometry as analytical tool for metabolite identification.

O sucesso da terapia endodôntica depende da limpeza, anti-sepsia, escultura e obturação hermética dos canais radiculares, no entanto, o preparo biomecânico não gera redução microbiana suficiente na totalidade dos casos. Devido à inconfiabilidade inerente ao tratamento, parte dos casos ainda resulta em insucesso. As pastas de hidróxido de cálcio vêm sendo empregadas com a finalidade de ampliar a eficiência anti-séptica do tratamento dos canais radiculares além de estimular a recuperação dos tecidos afetados pela infecção endodôntica. O digluconato de clorexidina tem sido empregado na endodontia devido ao amplo espectro de ação principalmente contra \"Enterococcus faecalis\" e \"Candida albicans\" e vem sendo adicionado às pastas de hidróxido de cálcio uma vez que as virtudes de um complementam as deficiências do outro. No entanto, devido à estrutura molecular da clorexidina e aos níveis elevados de pH promovidos pelo hidróxido de cálcio, há indícios de risco sistêmico na sua utilização por causa da provável decomposição da clorexidina em radicais livres e para-cloroanilina que está classificada como possível agente carcinogênico em humanos pela IARC. O presente estudo teve como objetivo investigar quimicamente, por meio da Espectrometria de Massas (ESI-TOF-MS) e Cromatografia Líquida (HPLC), a solução de digluconato de clorexidina a 0,2% isolada ou misturada ao hidróxido de cálcio. As análises foram realizadas logo em seguida ao preparo das amostras e após os períodos de 7 e 14 dias de armazenamento à temperatura de 36,5 ºC. Constatou-se que a solução de digluconato de clorexidina isolada foi decomposta em diferentes subprodutos, inclusive em para-cloroanilina oferecendo riscos sistêmicos. Em contato com o hidróxido de cálcio, a decomposição da clorexidina é total com formação de diferentes compostos. Apesar de não ter sido demonstrada a presença de para-cloroanilina na pasta medicamentosa, o elevado número de espécies reativas possui alto potencial de dano sobre o material genético das células do paciente afetadas pela medicação intracanal. É imperativo estabelecer vínculos diagnóstico-terapêuticos precisos por meio do desenvolvimento de protocolos clínicos que restrinjam o uso dessas medicações intracanais a quadros clínicos com infecção endodôntica disseminada e periodontites apicais persistentes. É necessário desenvolver estratégias mais eficientes que utilizem processos biomecânicos de maior eficácia e medicações intracanais efetivas que não ofereçam riscos locais e sistêmicos para que se contemplem os objetivos do tratamento dos canais radiculares com previsibilidade e segurança. / The success of endodontic therapy depends upon root canal cleanliness, antisepsis, sculpture, and hermetic obturation. However, biomechanical preparation does not always provide an adequate microbial reduction. Due to the inherent unreliability of the treatment, some cases still are unsuccessful. Calcium hydroxide pastes have been used with the aim to improve antisepsis effectiveness in root canal treatments, in addition to stimulating the recovery of tissues affected by endodontic infection. Chlorhexidine digluconate has been used in endodontics due to its broad action spectrum, mainly against \"Enterococcus faecalis\" and \"Candida albicans\", and has been added to calcium hydroxide pastes so that the advantages of one would compensate for the other\'s deficiencies. However, the structure of the chlorhexidine molecule in addition to the high pH values promoted by calcium hydroxide pose a systemic risk in its use due to the likely decomposition of chlorhexidine into free radicals and para-chloroaniline, which International Agency for Research on Cancer (IARC) has classified as a possible carcinogenic agents in humans. The purpose of the present study was to perform a chemical analysis of chlorhexidine digluconate at 0.2%, isolated or mixed to calcium hydroxide, using Mass Spectrometry and High- Efficiency Liquid Chromatography. The analyses were performed shortly after the samples were prepared, and after 7 and 14 days of storage at 36.5 ºC. It was found that the isolated chlorhexidine digluconate solution formed different byproducts, including para-chloroaniline, posing systemic risks. In contact with calcium hydroxide, chlorhexidine decomposes completely and forms different compounds. Though the study did not demonstrate the presence of para-chloroaniline in the medication paste, the high number of reactive species poses a high risk over the genetic material of the host cells affected by intracanal medication. It is mandatory to establish a precise diagnostic-therapeutic relation by developing clinical protocols that would restrict the use of these intracanal medications to clinical conditions with disseminated endodontic infection and persistent apical periodontitis. There is a need for more efficient strategies that use more effective biomechanical processes and intracanal medications that do not offer any local or systemic risk so root canal treatment goals can be considered with predictability and safety.