O uso abusivo de substâncias psicoativas cresce a cada dia em diferentes segmentos da sociedade mundialmente. Aumentos significativos no número de ocorrências de óbito com envolvimento de tais substâncias têm sido reportados nas últimas décadas. A classe dos opiáceos está figurada entre as substâncias de maior prevalência nesse contexto. Em toxicologia forense, análises toxicológicas conduzidas em amostras postmortem podem auxiliar se substâncias químicas tiveram influência no óbito. A realização dessas análises e interpretação dos resultados obtidos nesses casos é bastante complexa devido à deterioração sofrida pelos cadáveres, e também pela ocorrência de um fenômeno denominado redistribuição postmortem, responsável pela transferência de substâncias após a morte a favor de gradiente de concentração. Em geral, as substâncias são transferidas de órgãos como fígado, coração, pulmões, e trato gastrointestinal, para locais de menor concentração, afetando principalmente o sangue da região central e órgãos adjacentes. O humor vítreo, apesar de considerado um espécime não-convencional, pode ser bastante útil, principalmente em casos onde não há amostras sanguíneas disponíveis para coleta. Esse espécime se apresenta como uma matriz menos propensa à decomposição bacteriana, além de ser menos afetado pela redistribuição postmortem por sua localização mais afastada dos sítios centrais. Desta forma, um método para quantificação de opiáceos (morfina livre e total, codeína e 6-acetilmorfina) em sangue (cardíaco e periférico) e em humor vítreo humanos coletados postmortem foi desenvolvido e validado. O método mostrou ser preciso, eficiente e sensível, com limite de quantificação de 10 ng/ml. Amostras de 7 casos postmortem com envolvimento de opiáceos foram analisadas com o intuito de verificar correlação nas concentrações entre os sítios, e possível ocorrência do fenômeno de redistribuição. / The abuse of psychoactive substances grows every day worldwide in different segments of the society. Significant increases in the number of drug-related deaths have been reported in recent decades. The class of opiates is one of the most prevalent substances in this context. In forensic toxicology, toxicological analyses are performed in postmortem samples to evaluate whether chemical substances were involved in the death. The completion of this analysis and interpretation of results are very complex due to the deterioration suffered by the corpses, and also by the occurrence of the phenomenon called postmortem redistribution, responsible for the transfer of substances along a concentration gradient after death. In general, the transference of the substances occurred from organs such as liver, heart, lungs and gastrointestinal tract to sites of low concentrations, mainly affecting the blood from central sites and adjacent organs. By this reason, the collection of blood from two different sites of the body for comparison is highly recommendable. Despite being considered a non-conventional specimen, vitreous humor can be quite useful, especially in cases where no blood samples are available for collection. This specimen is usually less prone to bacterial decomposition, and it\'s also less affected by postmortem redistribution due to its location further away from central sites. Thus, a method to quantify opiates (free and total morphine, codeine and 6- monoacetylmorphine) in postmortem blood (cardiac and peripheral) and in vitreous humor samples was developed and validated. The method showed good accuracy, efficiency and sensibility, with limit of quantification of the 10 ng/ml. Seven samples of postmortem cases with opiates involvement were analyzed to verify the correlation in the concentrations of the sites, and possible occurrence of the redistribution phenomenon.

O objetivo deste estudo foi analisar o plasma sanguíneo correspondente ao período de transição, de vacas Holandesas de alta produção e sua relação com o desempenho reprodutivo. Para isso, este plasma foi analisado com emprego do equipamento de espectrômetro de massas híbrido triplo quadrupolo/tempo-de-vôo, para identificação dos Lipídios. As alterações metabólicas e hormonais ocorridas durante esta fase, nas vacas leiteiras, afetam diretamente a saúde e o desempenho produtivo e reprodutivo das mesmas. Nesse período, ocorre o balanço energético negativo, caracterizado pelo aumento da mobilização de reservas energéticas, normalmente do tecido adiposo, para atender às demandas voltadas à produção de leite. Neste projeto, propõe-se o estudo da condição metabólica, principalmente sob um contexto lipidômico, durante o período de transição e início de lactação de vacas leiteiras em dois grupos de produção (Alta: ≥ 45,9 kg leite/dia e Média: 30-45,8kg leite/dia), nos períodos de Inverno e Verão que se tornaram prenhes ou não aos 150 dias de experimento (após 3 IATF), em um contexto multidisciplinar, visando o melhor entendimento, tanto do desempenho produtivo, como do reprodutivo e na elaboração de estratégias de manejo, para aplicação nos rebanhos leiteiros no Brasil. Foram utilizadas 31 vacas da raça Holandesa, multíparas e gestantes, com parto previsto para 21 dias após o início do período de avaliação experimental. Os animais foram avaliados durante o período pré-parto até 150 dias de lactação. Nas amostras foram analisadas variáveis plasmáticas, conhecidamente ligadas às condições metabólicas (energética, proteica e enzímica). Estes valores serão utilizados como guias na utilização da abordagen ômica (lipidômica), com finalidade de identificar biomarcadores lipídicos descritivos do metabolismo destes animais. Todos os dados obtidos foram analisados por métodos estatísticos convencionais e por estatística multivariada, utilizando técnicas como PCA (Principal Component Analisis) e OPLS (Orthogonal Projection on Latent Structures) e ferramentas de bioinformática, a fim de identificar quais metabólitos são mais descritivos do metabolismo destes animais, bem como a interação das diferentes vias metabólicas. Concluí-se que ao final do período de transição, o plasma de vacas pós-parto que contenham maiores quantidades de fosfatifilcolinas, principalmente 36:2 e 36:4, podem obter melhores chances de se tornarem prenhes à 1IATF. Estas fosfatidilcolinas podem ser consideradas como bons biomarcadores lipídicos devido à sua interferência com a maior síntese de lipoproteínas VLDL, evitando assim, a ocorrência de fígado gorduroso, característico desse período. Além disso, estas moléculas podem auxiliar no processo de monitoramento de alguns parâmetros metabólicos alterados, normalmente observados durante o balanço energético negativo / The aim of this study was to analyze the corresponding blood plasma in transitional period of Holstein cows with high production and its relation to the reproductive performance. Therefore, this plasma was analyzed with the use of a triple quadrupole mass spectrometer time-of-flight, for identification of lipids. In dairy cows, the metabolic and hormonal changes during this phase, directly affect the health and productive and reproductive performance. In this period, the negative energy balance is characterized by increased mobilization of energy reserves, usually by fat, due the demands on milk production. In this project, we proposed the study of metabolic condition, especially under a lipidomic context, during the transition period and early lactation dairy cows on two milk productions (High: ≥ 45.9 kg milk/day and Medium: 30 -45,8kg milk/day) during the periods, winter and summer, of cows that became pregnant or not in the 150 days of the experiment (after 3 IATF), in a multidisciplinary context, for get better understand the both productions performances, the reproductive and developing management strategies for application in dairy herds in Brazil. They used 31 Holstein cows, multiparous and pregnants, with calving expected to 21 days after the beginning of the experimental evaluation period. The animals were evaluated during ante partum period to 150 days of lactation. Samples were analyzed by parameters, known to be linked to metabolic conditions (energy, protein and enzyme). These values will be used as guides in a ohmic approach (lipidomics), with the purpose of identifying biomarkers describe lipid metabolism of these animals. All data were analyzed by conventional statistical methods and multivariate statistics, using techniques such as PCA (Principal Component Analysis) and OPLS (Orthogonal Projection on Latent Structures) and bioinformatics tools to identify which metabolites are more descriptive of the metabolism of these animals as well as the interaction of different metabolic pathways. It can be concluded that the end of the transition period, the plasma post-partum cows containing larger amounts of phosphatidylcholines, especially 36:2 and 36:4, may best chance of becoming pregnant in 1IATF. These phosphatidylcholines may be considered a good lipid biomarkers interfering with the highest synthesis of VLDL, thereby avoiding the occurrence of fatty liver characteristic of that period. Therefore, these molecules can be used for monitoring the process of change of some metabolic parameters normally observed during negative energy balance

Neste estudo foi realizada a avaliação de seis substâncias sintéticas resultantes de processos industriais e de atividades antropogênicas dietilftalato, dibutilftalato, nonilfenol, pentaclorofenol, bisfenol A e benzo[a]pireno os quais possuem capacidade de interferir negativamente no funcionamento normal do sistema endócrino de animais e de seres humanos (xenoestrógenos), em águas tratada e bruta de quatro municípios do Vale do Paraíba paulista. Para tanto, utilizou-se um método analítico de alta seletividade e sensibilidade, sendo a determinação por cromatografia gasosa acoplada ao detector de espectrometria de massas (GC/MS), precedida da concentração das amostras pelo método SPE (extração em fase sólida). Como não são suficientes apenas boas técnicas analíticas para garantir a qualidade dos dados gerados e a confiabilidade dos resultados, a metodologia desenvolvida foi submetida ao processo de validação, onde foram avaliados os parâmetros: seletividade, especificidade, linearidade, faixa linear de trabalho, limites de detecção e quantificação, precisão, exatidão, recuperação e robustez, além da incerteza na medição. Os resultados demonstraram que o método proposto é adequado para quantificação das amostras do rio Paraíba do Sul, e pela sua aplicação foi constatada a presença de todos os poluentes estudados tanto na água bruta quanto na potável em pelo menos um dos três períodos de amostragem, sendo as maiores concentrações mensuradas nas águas brutas e no período seco. Estes resultados evidenciam que as atividades antrópicas na região influenciam a qualidade da água do recurso hídrico estudado, bem como a qualidade da água de distribuição. / The evaluation of six synthetics substances from industrials process and anthropogenic activities - diethyl phthalate, dibuthyl phthalate, nonylphenol, pentachlorophenol, bisphenol A and benzo[a]pyrene which one can interfer negatively in normal function of the endocrine system from animals and humans (xenoestrogens), was carried out in this study in drinking water and raw water on four cities at region of Paraíba do Sul River. An analytical method with high selectivity and sensitivity, with determination by gas chromatography coupled to mass spectrometry detector (GC/MS), preceded of samples concentration through the SPE technique was used. Good analytical techniques are not enough to ensure quality and reliability of the generated data results. For this, the methodology was submitted to the validation process, where parameters evaluated were: selectivity, specificity, linearity, work range, detection and quantification limits, precision, accuracy, robustness, percentage of recovery and uncertainty in measurement. The validation results showed that proposed method is suitable to quantify Paraíba do Sul river samples, and by its application could observe presence of all studied pollutants in drinking and raw water in one of the three sampling periods at least, and the highest measured concentrations were in raw water at dry periods. These results evidence that the anthropic activities at region are influencing the water quality of the studied water resource, as well as the quality of water for public supply.

Estudos prévios demonstraram que as atividades biológicas do veneno da serpente Bothrops jararaca sofrem significantes modificações ontogenéticas. Neste estudo é apresentada uma análise comparativa do proteoma, peptidoma e transcriptoma da glândula de veneno de filhotes e adultos de B. jararaca, correlacionando os resultados obtidos com algumas características funcionais dos venenos. Venenos de 694 filhotes de até duas semanas de idade e 110 adultos, provenientes do Estado de São Paulo foram extraídos e liofilizados para as análises proteômicas/peptidômicas e funcionais. O mRNA de glândulas de veneno de 20 filhotes e 10 adultos foi obtido para a contrução de bibliotecas de cDNA e a análise de Expressed Sequence Tag (ESTs). Demonstramos que a atividade hemorrágica é similar para os venenos de filhotes e adultos, enquanto que o veneno de adultos é discretamente mais letal para camundongos; entretanto, o veneno de filhotes mostrou-se extremamente mais letal para aves, uma característica que pode garantir proteção contra potenciais predadores nas fases iniciais de vida da espécie. A atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de 10 vezes mais alta que aquela verificada para o veneno de adultos e é atribuída sobretudo à atividade de metaloproteinases. Essas diferenças nas atividades funcionais se refletiram nos diferentes perfis verificados por eletroforese bidimensional e identificação de spots de proteínas por digestão tripsínica in-gel seguida de análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem, zimografia com gelatina, imunocoloração utilizando anticorpos específicos anti-proteinases, e glicoproteínas com afinidade pela concanavalina -A. A comparação dos venenos por derivatização com tags isóbaros (iTRAQ) e a análise das ESTs revelaram diferenças claras entre os níveis de toxinas presentes nos venenos e as metaloproteinases foram a classe de toxinas mais expressa, além de serem as toxinas cujos perfis estruturais apresentaram maior mudança, como ilustrado pelo quociente PIII/PI, que é maior nos venenos de filhotes. Dimorfismo sexual foi detectado em diversas classes de toxinas no veneno de adultos por análises proteômicas e transcriptômicas e, surpreendentemente, o fator de crescimento de nervo foi detectado apenas no veneno/glândula de veneno de machos. A análise glicoproteômica mostrou que N-glicosilações parecem ser as modificações pós-traducionais mais proeminentes nas toxinas de B. jararaca, e os perfis de N-glicosilação apresentaram-se distintos para as proteínas dos venenos de filhotes e adultos. Entretanto, a composição de N-glicanos não variou entre as amostras, indicando que diferenças na utilização de motivos de N-glicosilação poderiam explicar as diferenças nos níveis de glicosilação observados pelos diferentes perfis eletroforéticos dos venenos. A análise da fração peptídica dos venenos de filhotes e adultos por espectrometria de massas resultou num perfil similar de Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), que foram detectados em suas formas canônicas e também com novas seqüências, cujas estruturas primárias sugerem um processamento da proteína precursora em sítios até então não descritos. Acreditamos que este seja o estudo mais abrangente sobre a variabilidade do veneno de uma serpente já realizado e os resultados demonstram que há uma relação clara entre as alterações ontogenéticas na dieta e tamanho corporal e o proteoma/peptidoma do veneno desta espécie. / Previous studies have demonstrated that the biological activities displayed by the venom of the snake Bothrops jararaca undergo a significant ontogenetic shift. In this investigation, we performed comparative proteomic, peptidomic and transcriptomic analyses of venoms and venom glands from newborn and adult specimens of B. jararaca and correlated the results with the evaluation of functional venom features. Venoms from 694 two-week old newborns and 110 adults from São Paulo state were milked and lyophilized for functional and proteomic/peptidomic analyses. Additionally, mRNA was obtained from the venom glands of 20 newborns and 10 adults and used for the construction of cDNA libraries and Expressed Sequence Tag (ESTs). We demonstrate that newborn and adult venoms have similar hemorrhagic activities, while the adult venom has a slightly higher lethal activity upon mice; however, the newborn venom is extremely more potent to kill chicks, a feature that might ensure protection against potential predators in early stages of B. jararaca life. Interestingly, the coagulant activity of the newborn venom upon human plasma is ten times higher than that of the adult venom and is contributed mainly by metalloproteinases. Differences in functional activities were clearly reflected in the venom different profiles of two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and protein spot identification by in-gel trypsin digestion followed by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gelatin zimography, immunostaining using specific anti-proteinase antibodies, and concanavalin A-binding proteins. The venom comparison by isobaric tag peptide labeling (iTRAQ) and ESTs analysis revealed clear differences in toxin levels. The metalloproteinases were detected as the toxin class most expressed in the venoms in addition to being the toxins whose structural profile most changed, as illustrated by the ratio P-III/P-I class being higher in newborn venoms. Sexual dimorphism has been detected in various adult venom toxin classes by proteomic and transcriptomic analyses and, interestingly, the nerve growth factor was detected only in the male venom gland/venom. The glycoproteomic analysis showed that N-glycosylation seems to be the most prominent post-translational modification in B. jararaca toxins and the N-glycosylation profiles differed for newborn and adult venom toxins. Nevertheless, the N-glycan composition between the samples did not vary indicating that differences in the utilization of the N-glycosylation motif could be the explanation for the differences in the glycosylation levels indicated by the differential electrophoretic profiles of venom proteins. The analysis of the peptide fraction of newborn and adult venoms by mass spectrometry revealed a similar profile of Bradykinin Potentiating peptides (BPPs), however these were detected in the venoms showing their canonical sequences and also novel sequences corresponding to BPPs processed from their precursor protein at sites so far not described. To the best of our knowledge, this is the most comprehensive study on a snake venom variation and the results clearly demonstrate a relationship between the ontogenetic shift in diet and animal size, and the venom proteome/peptidome in B. jararaca species

O uso de codornas japonesas (Coturnix coturnix japonica) como modelo animal para estudos relacionados a indústria avícola está crescente em decorrência do aumento no consumo de carne e ovos. O ovo possui várias aplicações e a sua funcionalidade está correlacionada com a composição química e, mais especificamente, com seu alto valor proteico. Contudo, o ovo é um alimento altamente perecível, pois pode perder sua qualidade rapidamente entre o período de estocagem e consumo. A qualidade do ovo pode ser afetada por condições ambientais como tempo e temperatura de estocagem. Parâmetros convencionais como pH, massa e a unidade Haugh são usados para a avaliação da qualidade do ovo. Além disso, técnicas analíticas podem ser utilizadas para a avaliação de qualidade em diversas matrizes alimentares. Assim, o presente trabalho tem como objetivos a avaliação e identificação de proteínas presentes em ovos de codorna japonesa submetidos a diferentes tempos e temperaturas de estocagem empregando técnicas eletroforéticas e espectrometria de massas, além de, ferramentas estatísticas. Durante estocagem à 0-21 dias, observou um aumento no pH, diminuição na massa do ovo e uma mudança significativa no proteoma das amostras nos períodos de 14 a 21 dias. Além disso, os resultados de análise de componentes principais (PCA) demostraram a influência da temperatura pela formação de 4 grupos independentes para amostras de albúmen e 3 grupos para as amostras de plasma e fração granular, respectivamente. Para o plasma, as amostras estocadas à 25 °C e controle se agruparam. Já para a fração granular, o agrupamento ocorreu entre as amostras estocadas a 25 °C com a 37 °C, demonstrando similaridade entre si. As proteínas com os níveis significativamente (p <0.05) alterados durante a estocagem pertencem as famílias serpina (ovalbumina), transferrina (ovotransferrina), inibidores Kazal tipo de protease (ovoinibidor). Para a ovotransferrina, proteína encontrada em todas as amostras foi observado a formação de isoformas no albúmen, plasma e fração granular nas amostras estocadas a 37 °C, sendo um bom indicador de controle de qualidade. Por fim, para as amostras de albúmen fracionadas por OFFGEL e analisadas por 1D-PAGE foi observado a formação de isoformas tanto para a ovalbumina quanto para a ovotransferrina bem como a degradação de ovoinibidor nas amostras estocadas por 21 dias a 37 °C, fatos que podem estar associados ao desbaste. Esses eventos afirmam a influência do tempo e temperatura de estocagem na qualidade do ovo de codorna. / The use of Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) as animal model for studies related to the poultry industry is becoming more common due to the increased consumption of meat and eggs. The egg has a variety of applications and its functionality is correlated to the chemical composition and, more specifically, its high protein value. However, the egg is a highly perishable food, and it can lose its quality between the period of storage and consumption. The egg quality can be affected by environmental conditions such as storage time and temperature. Conventional parameters such as pH and Haugh unit mass are used for egg quality assessment. Furthermore, analytical techniques can be used for quality assessment in various food matrices. This study aims to review and to identify proteins present in Japanese quail eggs submitted at different times and storage temperatures using electrophoretic techniques and mass spectrometry techniques, as well as statistical tools. During storage at 0-21 days, observed an increase in pH, decrease in egg mass and a significant change in the proteome of samples during the 14 to 21 day period. Moreover, the principal component analysis results (PCA) have shown the influence of temperature because of the formation of the four groups to albumin samples and three groups for the plasma and granules fraction samples, respectively. In plasma, the samples stored at 25 ° C and clustered control. As for the granule fraction pooling occurred between samples stored at 25 ° C to 37 ° C, showing similarities among them. The proteins with significant levels (p <0.05) of change during the storage belong to serpin family (albumin), transferrin (ovotransferrin), Kazal type protease inhibitors (ovoinhibitor). Ovotransferrin, a protein isoform found in albumin, plasma and granules fraction samples and was observed the formation of more isoforms in samples stored at 37 ° C, a good to quality control lost indicator. Finally, for the albumen samples that were fractionated by OFFGEL and analyzed by 1D-PAGE, the formation of both isoforms to ovalbumin was observed as well as ovotransferrin and ovoinhibitor degradation in samples stored for 21 days at 37 ° C that can be associated to thinning. These events affirm the influence of time and storage temperature on quail egg quality.

A hemorragia gerada por metaloproteinases de venenos de serpentes é um fenômeno complexo que resulta na ruptura de capilares e extravasamento de sangue. O HF3 (fator hemorrágico 3) é uma metaloproteinase da classe P-IIIa, extremamente hemorrágica, isolada do veneno da serpente Bothrops jararaca. Análises de sua atividade proteolítica sobre proteínas isoladas mostraram que componentes do plasma e da matriz extracelular são hidrolisados pelo HF3. Estudos que utilizaram abordagens proteômicas para analisar os efeitos do HF3 na derme e plasma de camundongos evidenciaram novos alvos desta metaloproteinase, incluindo proteínas intracelulares, extracelulares e plasmáticas. Entretanto, os mecanismos envolvidos na alta atividade hemorrágica apresentada pelo HF3, principalmente no que se diz respeito ao papel da clivagem de proteínas plasmáticas no contexto da hemorragia, ainda não são conhecidos. Assim, o objetivo principal deste estudo foi analisar o degradoma do HF3 no plasma humano. Paralelamente, também realizamos a análise da atividade do HF3 sobre as proteínas do plasma da B. jararaca. Para tanto, abordagens para a depleção das proteínas mais abundantes e enriquecimento de proteínas pouco abundantes do plasma humano foram utilizadas visando minimizar o intervalo de concentração dinâmica de proteínas, e assim permitir a avaliação da atividade proteolítica do HF3 sobre um amplo espectro de proteínas, e possibilitar a detecção dos produtos de degradação por espectrometria de massas. Dessa forma, quatro amostras de plasma humano foram utilizadas neste estudo: plasma total, plasma depletado de albumina, plasma depletado das 20 proteínas mais abundantes e plasma enriquecido de proteínas pouco abundantes. A incubação das amostras de plasma humano com o HF3 foi realizada na proporção enzima:substrato 1:100 (p/p), por 2 h a 37°C. Decorrido o tempo de incubação, as frações peptídica e proteica foram analisadas. A identificação dos peptídeos presentes na fração peptídica do plasma, por espectrometria de massas, revelou os produtos oriundos da hidrólise de proteínas pelo HF3, e permitiu a análise dos pontos de clivagem. O efeito do HF3 sobre o plasma enriquecido de proteínas pouco abundantes também foi analisado por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, seguida de digestão de proteínas in gel com tripsina, e identificação das proteínas presentes em bandas diferenciais, por espectrometria de massas. Considerando todas as abordagens utilizadas neste estudo, 62 proteínas plasmáticas foram identificadas como tendo sido clivadas pelo HF3. Algumas destas proteínas corroboram estudos anteriores e outras são consideradas como candidatas a substrato desta metaloproteinase. Dentre os novos alvos, destacam-se proteínas da cascata da coagulação sanguínea e do sistema complemento, além de inibidores de proteinases, sugerindo que esta metaloproteinase pode agir de maneira desregulada, não sendo inibida pelos inibidores plasmáticos, e causando o desequilíbrio da hemostasia. A atividade do HF3 sobre as proteínas do plasma da B. jararaca foi verificada pela sua incubação com o plasma total, resultando na geração de poucos peptídeos que, no entanto, não resultaram em identificação de substratos da metaloproteinase por espectrometria de massas. Em conjunto, nossos dados reforçam achados prévios sobre o repertório de substratos do HF3 no plasma humano, apontam novos substratos e fornecem pistas para a compreensão da atividade hemorrágica do HF3 / Hemorrhage induced by snake venom metalloproteinases is a complex phenomenon resulting in capillary disruption and blood extravasation. HF3 (hemorrhagic factor 3) is an extremely hemorrhagic, P-IIIa class metalloproteinase, isolated from the venom of Bothrops jararaca. The analysis of its proteolytic activity on isolated proteins showed that plasma and extracellular matrix proteins are hydrolyzed by HF3. Studies using proteomic approaches to analyze the effects of HF3 in the mouse skin and plasma showed new targets of this metalloproteinase, including intracellular, extracellular and plasma proteins. However, the mechanisms involved in the hemorrhagic process generated by HF3, particularly the role of the cleavage of plasma proteins in the context of the hemorrhage, remain not fully understood. Thus, the main objective of this study was to analyze the degradome of HF3 in human plasma. In parallel, we also carried out the analysis of the activity of HF3 on B. jararaca plasma. For this purpose, approaches for the depletion of the most abundant proteins and for the enrichment of low abundant proteins of the human plasma were used to minimize the dynamic range of protein concentration, in order to assess the proteolytic activity HF3 on a wide spectrum of proteins, and to detect the degradation products by mass spectrometry. Thus, four samples of human plasma were used in this study: whole plasma, albumin-depleted plasma, plasma depleted of the 20 most abundant proteins, and plasma enriched of low abundance proteins. Incubation of these samples with HF3 was carried out at a 1:100 (w/w) enzyme-to-substrate ratio, for 2 h, at 37°C. After the incubation time, the protein and peptide fractions were analyzed. The identification of peptides present in the plasma peptide fraction by mass spectrometry revealed the products from the hydrolysis of proteins by HF3 and allowed the analysis of the cleavage sites. The effect of HF3 on the sample of plasma enriched of low-abundance proteins was also analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by in gel protein digestion with trypsin of differential bands and identification by mass spectrometry. Considering all the approaches used in this study, 62 plasma proteins were identified as cleaved by HF3. Some of these proteins corroborate previous studies and others are considered as substrate candidates of HF3. Among the new targets, there are proteins of the coagulation cascade and of the complement system, as well as plasma proteinase inhibitors, suggesting that this metalloproteinase escapes inhibition and may act in an unregulated fashion causing the imbalance of hemostasis. The activity of HF3 on B. jararaca plasma proteins was analyzed by its incubation with whole plasma, as described above, and resulted in the generation of a low number of peptides, which, however, did not result in the identification of any substrate by mass spectrometry. Taken together, our data confirm previous findings on the repertoire of substrates of HF3 in the human plasma and suggest new substrate candidates that may contribute to the understanding of the hemorrhagic effect of HF3.

O dipiridamol (DIP), 2,6-bis(dietanolamina)-4,8-dipiperidinapirimida-[5,4-d] pirimidina), é conhecido por seu efeito vasodilatador coronariano e antiagregante plaquetário, exibindo também um potente efeito antioxidante fortemente inibidor da peroxidação lipídica. Além disso, tem efeito importante na proteção das células contra radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo oxigênio molecular singlete O2(1Δg). Tem sido sugerido que DIP é um eficiente antioxidante comparável à vitamina E. No presente trabalho, a supressão de O2(1Δg), pelo DIP e derivados foi analisada em acetonitrila (ACN) e em meio aquoso ácido. A excitação do azul de metileno (AM) através da técnica de laser flash fotólise foi feita em 532 nm e a emissão de luz monomolecular do O2(1Δg) foi monitorada em 1270 nm. As constantes bimoleculares de supressão obtidas em ACN são consistentes com uma eficiente supressão física, apresentando valores próximos do limite difusional (kt = 3,4-6,8x108 M-1s-1). O processo de supressão ocorre via o mecanismo reversível de transferência de cargas com a formação do exciplex. Cálculos de ΔGet associado à supressão de O2(1Δg) corroboram com uma transferência de elétrons incompleta. Em soluções aquosas ácidas (pH=3,0) os valores de kt obtidos para o DIP e derivados são 20 vezes maiores quando comparados com os valores em ACN. Os dados de supressão de O2(1Δg) são consistentes com os dados eletroquímicos. As propriedades eletroquímicas do DIP em ACN são caracterizadas por dois processos consecutivos de um elétron cada, com potenciais de meia onda de 0.30V e 0.67V vs SCE. No entanto, em meio aquoso ácido uma única onda de oxidação é observada envolvendo um processo com à perda de dois elétrons (0.80 V vs SCE). A eletrooxidação do DIP leva a formação de produtos não-fluorescentes e uma considerável mudança no espectro de absorção. Os produtos da eletrooxidação foram parcialmente caracterizados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a espectrometria de Massas (HPLC/MS). Os espectros de massas dos produtos da eletrooxidação apresentaram picos com m/z de 472, 269 e 519. O mecanismo responsável pelo efeito antioxidante de muitos compostos é geralmente estudado por laser flash fotólise (LFP), EPR, eletroquímica e experimentos de fotoquímica. A fotoquímica do DIP não é conhecida em detalhes. Neste trabalho, a fotólise do DIP em ACN e meio aquoso ácido em pH=3.0 foi estudada. Em meio aquoso ácido DIP foi oxidado pela fotosensibilização com AM e pela reação com uma fonte química de O2(1Δg), N,N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-1,4 naftalenodipropanamida (DHPNO2). A fotooxidação ocorre predominantemente pelo mecansimo do tipo II, onde o DIP é oxidado pelo O2(1Δg), mas alguns produtos com baixa intensidade e m/z de 472 foram observados em meio ácido, o que está de acordo com a eletrooxidação. Por outro lado, em ACN, DIP é fotodegradado pelo mecansimo do tipo I, via geração de radicais ou por espécies excitadas no estado triplete, como observado através de EPR. Contudo, a oxidação produz a mesma espécie nos dois solventes. O produto obtido na reação de fotooxidação foi analisado por HPLC/MS. O dioxetano é formado como um intermediário da reação de fotooxidação. O produto formado com m/z de 269 corresponde a metade da molécula do DIP ligado a um átomo de oxigênio. A conclusão é que o DIP é fotooxidado envolvendo O2(1Δg) em soluções aquosas ou oxigênio molecular em ACN. A caracterização completa dos fotoprodutos ajudará a entender melhor a química e as propriedades antioxidantes deste composto. Outro trabalho envolvendo a hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus (HbGp) foi desenvolvido. Análises de MALDI-TOF-MS foram realizadas para obter informações sobre a massa molecular das diferentes subunidades da HbGp na forma oxi. Os experimentos foram realizados para a proteína na forma íntegra em pH 7,0, para a proteína parcialmente dissociada em pH 9.0, e para o monômero d na forma pura. Além disso, experimentos foram realizados para a proteína íntegra tratada com 2-mercaptoetanol para monitorar o efeito da redução das ligações disulfetos, responsáveis em manter a estabilidade do trímero (abc) na molécula nativa. Os resultados são comparados com a hemoglobina homóloga de Lumbricus terrestris (HbLt) e algumas tentativas de atribuição de massas são feitas para algumas subunidades. Para o monômero d duas isoformas majoritárias de idênticas proporções com massas de 16,355+-25 e 16,428+-24 Da foram observadas. A redução das pontes disulfeto produz a dissociação do trímero e novos picos correspondentes aos monômeros a, b e c são observados, apresentando massas moleculares de 18,258+-30 Da, 16,492+-24 Da e 17,363+-17 Da, respectivamente. Duas cadeias linkers para HbGp foram também observadas em 25,817+-50 e 26,761+-16 Da. Finalmente, os trímeros (abc) foram observados em 51-52 kDa. Esta caracterização parcial representa um passo importante na caracterização das subunidades desta hemoglobina gigante. O efeito dos surfactantes aniônico dodecilsulfato de sódio (SDS) e catiônico cloreto de cetiltrimetilamonio (CTAC) na estrutura oligomérica de HbGp foi estudado por MALDI-TOF-MS. Uma efetiva interação do surfactante catiônico CTAC com as duas isoformas de monômero d, d1 e d2, na proteína íntegra bem como no monômero puro d foi observada. Até 10 moléculas de CTAC são ligadas a cada isoforma do monômero. Diferentemente, o espectro de massas obtido para o sistema SDS-HbGp mostrou que a interação SDS-HbGp é significativamente menos efetiva quando comparada ao sistema CTAC-HbGp. / Dipyridamole (DIP), 2,6-bis(dietanolamina)-4,8-dipiperidinapirimida-[5,4-d] pirimidina) is known for its vasodilating and antiplatelet aggregation activity, exhibiting also a potent antioxidant effect, strongly inhibiting lipid peroxidation. In the present work, the quenching of singlet molecular oxygen, O2(1Δg), by dipyridamole, RA47 and RA25 was analyzed in acetonitrile and aqueous acid solutions. Bimolecular quenching constants in acetonitrile (ACN) are consistent with an efficient physical quenching, presenting values slightly lower than the diffusion limit (kt = 3,4-6,8x108 M-1s-1). The quenching process occurs probably, via reversible charge transfer with the formation of an exciplex. Calculation of ΔGet associated to O2(1Δg) quenching corroborates with uncomplete electron transfer. In aqueous acid solutions (pH=3,0) the kt values for DIP and derivatives are 20-fold smaller as compared to ACN. The electrochemical properties of DIP in ACN are characterized by two consecutive one-electron processes with halfwave oxidation potentials of 0,30V and 0,67V vs SCE. However, in aqueous acid medium a single oxidation wave is observed involving a two-electron process (0,80 V vs SCE). Therefore, O2(1Δg) quenching is consistent with electrochemical data. The eletrooxidation of DIP leads to nonfluorescent products and a considerable change in the absorption spectra occurs. The mass spectrum of eletrooxidation products of DIP showed peaks with m/z 472, 269 and 519. In this work the photolysis of DIP in acetronitrile (ACN) and aqueous solutions at pH 3,0 was examined. In aqueous acid solutions DIP was oxidized by photosensitization with methylene blue and by a reaction with a clean chemical source of O2(1Δg), N,N\'-di(2,3-dihydroxypropyl)-1,4 naphtalenedipropanamide (DHPNO2). Photooxidation occurs predominantly by type II mechanism, where DIP is oxidized by O2(1Δg). Some products with low intensity and m/z of 472 were observed, in agreement with eletrooxidation. On the other hand, in ACN, DIP is photooxidated by type I mechanism via radicals generation or by excited triplet state species, as observed by EPR. However, the oxidation produces the same species in both solvents. A dioxetane can be formed as an intermediate of the reaction of the photo-oxidation. The observed product, with m/z 269, can correspond to half of the DIP molecule with an attached oxygen atom or the DIP molecule with two oxygen atom with two protons. The conclusion at this stage is that DIP is photooxidated involving either O2(1Δg) in aqueous solution or molecular oxygen in ACN. Another work involving the giant extracelular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) was performed. MALDI-TOF-MS analysis of the different subunits from the HbGp in the oxy- form was made. The results are compared to those reported for the homologous hemoglobin of Lumbricus terrestris (HbLt) and some tentative assignments are made for the observed polypeptides. The monomer d is found to exist in, at least, two major forms of identical proportions with masses of 16.355+-25 and 16.428+-24 Da, respectively. Two minor forms were also observed around 16 kDa for the monomers. Upon disulfide bonds reduction the peak associated to the trimer is absent in the mass spectrum, and new peaks assigned tentatively to the monomers a, b and c are observed. Their molecular masses were 18.258+-30 Da, 16.492+-24 Da and 17.363+-17 Da, respectively. Two Linker chains for HbGp were also observed at 25.817+-50 and 26.761+-16 Da. Finally, trimers (abc) were observed at 51-52 kDa. This partial characterization, performed for the first time, is an important step in the characterization of subunits of this giant hemoglobin. The effects of anionic sodium dodecyl sulfate (SDS) and cationic cethyltrimethylammonium chloride (CTAC) on the oligomeric structure of HbGp were also studied by MALDI-TOFMS. The data obtained with this technique show an effective interaction of cationic surfactant CTAC with the two isoforms of monomer d, d1 and d2, both in the whole protein as well as in the pure isolated monomer. The results show that up to 10 molecules of CTAC are bound to each isoform of the monomer. Differently, the mass spectra obtained for SDS-HbGp system showed that the interaction is, probably, significantly less effective as compared to CTAC-HbGp one. The acid pI of the protein around 5,5 is, probably, responsible for this behavior.

Plaquetas são fragmentos celulares anucleados, derivados de megacariócitos, que estão envolvidos em diversos processos fisiológicos e patológicos, como coagulação, inflamação, trombose, aterosclerose, e metástase e angiogênese tumorais. Para executar estas funções, plaquetas ativadas secretam uma fração solúvel de moléculas presentes em seus conteúdos granulares, que passam a interagir com outras moléculas e células adjacentes ao local da injúria, e com os próprios receptores plaquetários. No entanto, os mecanismos que regem a secreção em plaquetas ainda são pouco conhecidos. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi analisar comparativamente a agregação de plaquetas ativadas por dois diferentes agonistas enzimáticos: a trombina, um dos mais importantes agonistas plaquetários, e a PA-BJ, uma serinoproteinase do veneno da Bothrops jararaca, que assim como a trombina, ativa plaquetas através dos receptores PAR-1 e PAR-4. Neste estudo foram utilizadas abordagens de espectrometria de massas e de bioinformática para caracterizar alterações nos proteomas do sedimento de plaquetas não ativadas e ativadas, e também, para em paralelo analisar as frações proteicas e peptídicas presentes no sobrenadante (secretoma). Nas análises do sedimento de plaquetas ativadas tanto por PA-BJ quanto por trombina, foi verificada a menor abundância das proteínas PBP, PF4, proteína S, fibronectina, fator V e alfa-1 antitripsina, entre outras, e que também foram identificadas no sobrenadante (secretadas), e o aumento de abundância das proteínas ADAM-10, tromboxano A2 sintase, integrina αlIb, miosina-9 e fosforilase b, que estão diretamente envolvidas na ativação/agregação. Por outro lado, verificamos que na secreção plaquetária induzida por trombina ocorreu o aumento de abundância de proteínas envolvidas na regulação da formação do coágulo, como a proteína S, PAI1 e antitrombina III, sugerindo que nos eventos disparados pela trombina, exista uma regulação rigorosa de sua ação no local da injúria vascular. Já na secreção induzida por PA-BJ, verificamos o aumento significativo das proteínas amiloide beta A4 e do fibrinogênio, envolvidas na ativação/agregação plaquetária, além da liberação e ativação de MMP1, indicando que esta metaloproteinase atue sinergicamente com a PA-BJ para a formação e estabilização do agregado plaquetário. Nas análises do secretoma de plaquetas não ativadas, identificamos pela primeira vez, a presença das proteínas catalase, anidrase carbônica, inibidor de elastase leucocitária e a glicoproteína rica em histidina, que estão envolvidas na inibição e regulação da ativação plaquetária. A análise da fração peptídica do sobrenadante plaquetário permitiu avaliar pela primeira vez o degradoma gerado no processo de agregação por PA-BJ e trombina. O conjunto de peptídeos resultante da ativação plaquetária pela PA-BJ é maior e mais complexo do que aquele gerado pela ação da trombina, sugerindo que as vias ativadas por ambas sejam diferenciais e sujeitas a diferentes controles de regulação da proteólise. Além disso, a degradação seletiva de algumas proteínas, e o conjunto de peptídeos gerados, poderiam ter um papel no controle da ativação e agregação plaquetárias. Em conjunto, nossos resultados demostram que, embora a PA-BJ e a trombina induzam a agregação plaquetária mediada pelos receptores PAR-1 e PAR-4, estas enzimas induzem vias diferentes, alterando a secreção plaquetária para levar à agregação. / Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes which are involved in many physiological and pathological processes, such as coagulation, inflammation, thrombosis, atherosclerosis, and tumor angiogenesis and metastasis. To perform these functions, activated platelets secrete a soluble fraction of molecules present in their granules, which then interact with other molecules and cells adjacent to the site of injury, and with platelet receptors. However, the mechanisms governing secretion in platelets are still poorly understood. Therefore, the objective of this study was to comparatively analyze the aggregation of platelets activated by two different enzyme agonists: thrombin, one of the most important platelet agonists, and PA-BJ, a serine proteinase from Bothrops jararaca venom, which, like thrombin, causes platelet aggregation mediated by the receptors PAR-1 and PAR-4. For this purpose, approaches of mass spectrometry and bioinformatics were used to characterize changes in the proteome of non-activated and activated platelets, and also to analyze proteins and peptides present in the supernatant of aggregated platelets (secretome). In the analysis of the sediment of platelets activated by PA-BJ and thrombin, various proteins, such as PBP, PF4, protein S, fibronectin, factor V, and alpha-1 antitrypsin, were detected in lower abundance while they were also identified as secreted, in the supernatant; likewise, proteins that are directly involved in the activation/aggregation, such as ADAM-10, thromboxane A2 synthase, integrin αIIb, myosin-9 and phosphorylase b were identified in higher abundance in platelets activated by PA-BJ and thrombin. Moreover, we found that in the thrombin-induced platelet secretion there was increased abundance of proteins involved in the regulation of blood clot formation, such as protein S, and antithrombin III PAI1, suggesting that in the events triggered by thrombin, there is strict regulation of its action at the site of vascular injury. In the analysis of the secretion induced by PA-BJ, we found a significant increase in amyloid beta A4 protein and fibrinogen, which are involved in the platelet activation/aggregation, in addition to the release and activation of MMP-1, indicating that this metalloproteinase acts synergistically with PA-BJ in the formation and stabilization of the platelet thrombus. In the analysis of the non-activated platelet secretome, we identified for the first time the presence of catalase, carbonic anhydrase, leukocyte elastase inhibitor and histidine-rich glycoprotein, which are involved in the inhibition and regulation of platelet activation. The analysis of the peptide fraction of the supernatant of activated platelets enabled the characterization, for the first time, of the degradome generated in the process of aggregation by thrombin and PA-BJ. The resulting set of peptides generated upon platelet activation by PA-BJ is larger and more complex than that generated by the action of thrombin, suggesting that the pathways activated by both are differential and are subject to different controls of proteolysis. Furthermore, the selective degradation of some proteins, and the set of generated peptides could play a role in the control of platelet activation and aggregation. Taken together, our findings demonstrate that although both PA-BJ and thrombin induce platelet aggregation via PAR-1 and PAR-4, these enzymes activate different pathways to cause platelet secretion and aggregation.

O ozônio (O3) é um poderoso oxidante e quantidades significativas podem ser formadas em ambientes urbanos, como resultado de uma série de eventos fotoquímicos, sendo um risco para a saúde humana. Devido a sua reatividade química, o ozônio é capaz de promover modificações oxidativas em diversas biomoléculas, tais como, DNA, proteínas e lipídios. As reações do O3 com biomoléculas geram quantidades significativas de O2 (1Δg). Sendo assim, essas reações são caracterizadas pela transferência de um átomo de oxigênio do O3 ao substrato oxidado. Devido à regra de conservação do Spin, isto requer que o dioxigênio gerado nesta reação esteja no seu estado singlete. Neste específico mecanismo, a formação do hidrotrióxido tem sido frequentemente assumida como um importante intermediário da ozonização. Ainda, constatou-se o elevado potencial mutagênico do O3 sobre o DNA, levando, principalmente, à substituição de suas bases. A frequência das substituições das bases foi essencialmente localizada no par G: C\'s (75%), uma característica das espécies reativas de oxigênio, como o O2 (1Δg). No entanto, os mecanismos pelos quais O3 causa danos ao DNA ainda não foram completamente elucidados. No presente trabalho, as evidências espectroscópicas na geração do O2 (1Δg) foram obtidas através da emissão de luz bimolecular na região vermelha do espectro (λ = 634 nm) e através da emissão de luz monomolecular na região do infravermelho próximo (λ = 1270 nm ) durante a reação de O3 com dGuo e 8-oxodGuo. Além disso, desenvolveu-se uma metodologia para a geração de ozônio isotopicamente marcado com átomo de oxigênio-18 a partir do 18O2 (3Σg-). Deste modo, as evidências da formação dos diastereoisômeros da spiroiminodihidantoina, tanto a isotopicamente marcada no 18O quanto a não marcada, juntamente com a 8-oxodGuo, imidazolona e oxazolona, foram detectados como produtos de oxidação das reações com 18O3. Para tal observação, análises foram realizadas por HPLC acoplado ao espectrômetro de massas. Ademais, a detecção do 18O2 (1Δg) durante a decomposição do 18O3 foi obtida por captação química do O2 (1Δg) pelo derivado de antraceno, EAS, detectando o endoperóxido corresponde com a adição de dois átomos de 18O na posição 9,10 do antraceno. Além disso, mais uma evidência da presença do O2 (1Δg) foi inequivocamente demonstrada pela caracterização do espectro de emissão no infravermelho próximo. / Ozone (O3) is a potent oxidant and significant amounts can be formed in urban environments as a result of a series of complex photochemical events. It is a threat for human health. Due its chemical reactivity towards biological targets, ozone is able to promote oxidative modification in several biomolecules, such as DNA, proteins and lipids. Reactions of O3 with biomolecules are able to generate in high yields of singlet molecular oxygen [O2 (1Δg)]. The transfer of one oxygen atom from O3 to the oxidized substrate characterizes these reactions. Spin conservation rules require that the dioxygen generated in this reaction has to be in its singlet state. In this specific mechanism, hydrotrioxide has often been assumed as important intermediates in the ozonization process. In addition, ozone has been established as a powerful mutagenic agent, and the most observed mutation is in G:C transversion. This kind of transversion is typical in reactions involving DNA and reactive oxygen species, such as O2 (1Δg). However, the mechanisms by which O3 causes DNA damage have not yet been fully elucidated. In the present research, spectroscopic evidence for the generation of O2 (1Δg) was obtained by measuring the dimol light emission in the red spectral region (λ = 634 nm) and the monomol light emission in the near-infrared region (λ=1270 nm). Both measuements were done during interaction of O3 with dGuo and 8-oxodGuo. In addition, a system was built to produce isotopically labeled ozone with 18O. Thefore, in the same system that 8-oxodGuo, imidazolone and oxazolone, 18O-labeled and unlabeled diastereoisomeric spiroiminodihydantoin nucleosides were detected as the oxidation products with 18O3. In that case, analyses by HPLC coupled to mass spectrometry were performed. Moreover, in the O3 decomposition the formation of 18O-labeled O2 (1Δg) from 18O-labeled ozone was obtained by chemical trapping of O2 (1Δg) with EAS anthracene derivative and detected the corresponding 18O-labeled EAS endoperoxide. More evidence of the presence of O2 (1Δg) was unequivocally demonstrated by the direct characterization of the near-infrared light emission spectrum.

Metabólitos secundários produzidos por actinobactérias são uma inesgotável fonte de compostos com potentes atividades biológicas e estruturas intrínsecas. O desenvolvimento em instrumentação analítica tem contribuído significantemente para acelerar o processo de identificação e caracterização desses metabólitos bioativos. Sem dúvida alguma, a espectrometria de massas (MS) e o seu acoplamento com técnicas de separação, especialmente a cromatografia líquida (UHPLC-MS), tem sido reconhecida como a técnica mais eficiente em análises de produtos naturais. Nesta dissertação foi explorado o potencial da espectrometria de massas como ferramenta analítica para a identificação e caracterização estrutural de fitotoxinas produzidas por actinobactérias isoladas da rizosfera de plantas da caatinga. Foram produzidos noventa extratos de actinobactérias, dos quais quinze apresentaram alguma atividade para o bioensaio da Lemna minor e seis apresentaram atividade para o bioensaio da Chlorella vulgaris. Os extratos brutos ativos das actinobactérias Caat 7-38, Caat 8-6 e Caat 5-29 foram selecionados para caracterização dos compostos ativos, os quais foram isolados empregando o fracionamento guiado por bioensaios. No extrato bruto Caat 7-38, a actinomicina D foi identificada como fitotoxina, ao passo que para o extrato bruto Caat 8-6, foi possível inferir a atividade fitotóxica à presença do griseorhodin A. Já para o extrato bruto Caat 5-29, o composto identificado com atividade fitotóxica apresenta uma estrutura inédita, provavelmente pertencente à classe das anguciclinonas. Foi realizado ainda um estudo para avaliar o efeito da adição de terras raras ao meio de cultivo da actinobacteria Caat 7-38. Para os meios de cultivos contendo neodímio e, principalmente, lantânio ocorreu uma superprodução da actinomicina D, indicando assim, o grande potencial da aplicação das terras raras nos estudos de micro-organismos. / Secondary metabolites produced by actinomycetes are an inexhaustible source of compounds with potent biological activities and intrinsic structures. The development analytical instrumentation has contributed significantly to accelerate the identification and characterization of these bioactive metabolites. Undoubtedly, mass spectrometry (MS) and its coupling with separation techniques, especially liquid chromatography (UHPLC-MS) has been recognized as the most \"efficient\" technique in natural product analysis. In this work was explored the potential of mass spectrometry as an analytical tool for identification and structural characterization of phytotoxins produced by actinomycetes isolated from the rhizosphere of plants from the Caatinga biome. Ninety actinomycetes extracts were produced, of which fifteen showed some activity for the bioassay with Lemna minor and six showed activity for the bioassay with Chlorella vulgaris. The crude active extract of actinomycetes Caat 7-38, Caat 8-6 and Caat 5-29 were selected to characterize the active compounds, which were isolated using bioassay-guided fractionation. In the crude extract Caat 7-38, actinomycin D was identified as phytotoxin, while for crude extract Caat 8-6, it was possible to infer phytotoxic activity to the presence of griseorhodin A. For the crude extract Caat 5-29, the compound identified with phytotoxic activity presents a new structure, probably belonging to the class of anguciclinones. A study to evaluate the effect of addition of rare earths to the culture medium of actinobacteria Caat 7-38 was also carried out. To the culture medium containing neodymium and especially lanthanum occurred overproduction of actinomycin D, thus indicating the great potential of application of rare earths in the studies of microorganisms.