Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Una fecundación exitosa depende, entre otras cosas, de la capacidad que tengan los espermatozoides de experimentar la reacción acrosómica. Este fenómeno es esencial para una adecuada interacción gamética y posterior fecundación del ovocito. El espermatozoide de perro al ser sometido a criopreservación puede verse afectado alterando negativamente este proceso y por tanto, su capacidad fecundante. En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en espermatozoides congelados de perro a través de la actividad enzimática de la acrosina, mediante dos métodos de evaluación: hidrólisis de gelatina en placa y por espectrofotometría, la hidrólisis de esteres de bajo peso molecular (BAEE). La obtención de semen se realizó a partir 5 machos adultos sanos, mediante estimulación manual del pene. Se utilizó la segunda fracción espermática de cada eyaculado, midiendo su volumen en copa recolectora y la motilidad espermática se evaluó en forma subjetiva al microscopio de contraste de fases. La concentración espermática se determinó mediante recuento en la cámara de Neubauer, de acuerdo a las técnicas estandarizadas en el laboratorio. Se trabajó con semen fresco (control) y semen congelado proveniente de los mismos machos. El pellet obtenido de cada muestra se ajustó a una concentración de 200x106 de esp/ml, incubándolas por períodos de 0, 30, 60 y 90 minutos a temperatura ambiente (21°C) para inducir la capacitación de los espermatozoides. Luego de cada tiempo de capacitación se realizó la medición de la actividad enzimática de acrosina a través de hidrólisis de gelatina en placa y espectrofotometría de esteres de bajo peso molecular (BAEE). 7 Los resultados obtenidos en relación a la actividad enzimática de acrosina durante la capacitación espermática en perros se describieron en términos de promedios, y se evaluaron mediante análisis de varianza ANOVA y LSD Fisher a posteriori. Se realizaron 5 replicas experimentales y se usó 1 eyaculado por perro en promedio. En relación al tipo de población espermática, los espermatozoides congelados y frescos (control) presentaron diferencias (P < 0,05) en relación al tamaño de los halos de digestión, observándose un diámetro promedio de halo mayor en espermatozoides frescos en comparación a los congelados de acuerdo a los tiempos de capacitación. Al evaluar la actividad enzimática de acrosina a través de la hidrólisis de BAEE, se observó que durante los diferentes tiempos de capacitación en los espermatozoides frescos, la actividad enzimática de acrosina presentó variaciones (P<0,05) con mayor actividad enzimática en los espermatozoides a partir de los 60 min, mientras que en espermatozoides congelados la mayor actividad se observó al tiempo 0 de capacitación (no capacitados) (P <0,05). La actividad enzimática de acrosina en espermatozoides congelados sería menor que en los espermatozoides frescos, tanto en su actividad proteolítica en gelatina, como en espectrofotometría con BAEE. Además, la actividad de proacrosina/acrosina en espermatozoides caninos frescos se vería aumentada a través del tiempo de capacitación a diferencia de los espermatozoides congelados donde no se observó diferencias entre los diferentes tiempos de incubación en medio capacitante, por lo que se sugeriría que los espermatozoides frescos podrían retener mayores cantidades de acrosina que aquellos congelados/descongelados, lo que se traduciría en una acción más gradual en el tiempo observándose la mayor liberación de enzima entre los tiempos 60 y 90 minutos. / Proyecto Fondecyt 1060602-1080618

Orientador: Rosicleire Verissímo-Silveira / Resumo: Brycon orbignyanus conhecido popularmente como piracanjuba é uma espécie de interesse para piscicultura por seu comportamento agressivo, carne saborosa e crescimento rápido. Contudo a espécie encontra-se na categoria de ameaçada de extinção, devido a fragmentação do habitat com a construção de hidrelétricas, e consequente destruição do habitat, além da sobrepesca. Diante da importância desta, buscou-se compreender por meio de análises estereológicas, histológicas em conjunto com o Índice gonadossomático (IGS) as alterações e correlações dos parâmetros testiculares da espécie em 3 diferentes idades, para uma melhor compreensão do desenvolvimento reprodutivo da espécie, desde as fases iniciais. Para isso utilizou-se o índice (IGS), na determinação do período reprodutivo e suas fases. Para isso 30 exemplares de B. orbignyanus com idade de 1 a 3 anos, oriundos da Estação de Aquicultura da Usina Hidrelétrica Mário Lopes Leão, A.E.S - Tietê, localizada na cidade de Promissão-SP (21° 17′ 49″ S, 49° 47′ 0″ W), foram capturados. Após a coleta, os animais foram insensibilizados e eutanasiados em solução de benzocaína (CEUA-FEIS-UNESP Nº12/2017). Após anestesiados os testículos foram retirados, sendo posteriormente processados para microscopia de luz. Os processamentos e a análises do material biológico após a coleta foram realizadas no Laboratório de Ictiologia Neotropical - LINEO, no Departamento de Biologia e Zootecnia do campus da UNESP-FEIS de Ilha Solteira/SP. A análise histológic... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Brycon orbignyanus popularly known as piracanjuba, is a species of fish farming interest because of its aggressive behavior, delicious meat and rapid growth. the species is threatened of extinction, due to habitat fragmentation with the construction of hydroelectric, consequent habitat destruction, and overfishing. Considering the importance of this, we sought to understand, through stereological and histological analyzes, the changes and correlations of testicular parameters of the species at three different ages, together with the gonadosomatic index (GSI), for a better understanding of the reproductive development of the species, since the initial stages. For this purpose, the index (GSI) was used to determine the reproductive period and its phases. A total of 30 specimens of B. orbignyanus, aged 1 to 3 years old, were collected from the Aquaculture Station of the Mário Lopes Leão Hydroelectric Power Plant, AES - Tietê, located in the city of Promissão - SP (21 ° 17 '49 "S, 49 ° 47'0 "W). After collection, the animals were desensitized and anesthetized in benzocaine solution (CEUA-FEIS-UNESP Nº12 / 2017). After anesthesia, the testicles were removed and later processed for light microscopy. Processing and analysis of the biological material after the collection were carried out at the Neotropical Ichthyology Laboratory - LINEO, at the Biology and Animal Science Department of the UNESP-FEIS campus of Ilha Solteira / SP. Histological analysis allowed the identification of th... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Marion Burkhardt de Koivisto / Banca: Gisele Mingoti / Banca: Cássia Orlandi / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o empacotamento da cromatina e morfometria da cabeça de espermatozoides criopreservados de touros Bos taurus indicus da raça Nelore de diferentes idades e a influência do grau de compactação da cromatina na produção in vitro de embriões (PIV). Foram utilizados 40 animais mantidos em centro de coleta e processamento de sêmen (CCPS) e distribuídos em três grupos: Grupo Jovens (entre 1,8 e 2 anos), Grupo Adultos (entre 3,5 e 7 anos) e Grupo Senis (entre 8 e 14,3 anos). Os ejaculados foram congelados de acordo com os padrões pré-estabelecidos do CCPS. Utilizou-se a coloração de azul de toluidina, que permite a avaliação simultânea da cromatina e morfometria da cabeça espermática, a cromomicina A3 (CMA3) para analisar a protaminação espermática e a PIV para o desenvolvimento embrionário. O azul de toluidina foi avaliado pela microscopia óptica e a CMA3 pelo citômetro de fluxo. Na PIV foram realizadas quatro repetições por grupo, com 25 a 30 oócitos em cada repetição. A análise seminal revelou que espermatozoides de touros jovens obtiveram maiores valores de área (A), perímetro (P) e largura (L) quando comparados a adultos e senis (Jovens: A=1848,5±119,79, P=10,23±0,29, L=1,95±0,1; Adultos: A=1672,9±104,46, P=9,86±0,33, L=1,81±0,06; Senis: A=1723,1±124,41, P=9,97±0,33, L=1,83±0,09; P<0,0001) e apresentaram maior deficiência de protaminação quando analisado pela CMA3 (Jovens: 1,57±0,76; Adultos: 1,09±0,63, Senis: 0,90±0,59; P<0,05). Da mesma forma, variáveis de tamanho (A, P, L) e protaminação espermática, avaliado pela CMA3, obtiveram correlação negativa com a idade e positiva com a elipsidade (P<0,05). Espermatozoides com anormalidades na cromatina obtiveram maior área quando comparado àqueles sem alteração de cromatina (P<0,0001). Não houve diferença significativa na PIV quando sêmen com maior e menor parcela de alteração de cromatina foi ... / Abstract: The aim of this study was to evaluate chromatin condensation and sperm head morphometry of cryopreserved semen samples from Bos taurus indicus bulls of different ages and the influence of the degree of chromatin condensation on in vitro embryo production (IVP). A total of 40 animals kept in an Artificial Insemination Centre were divided into three groups: Young Group (1.8 to 2 years), Adult Group (3.5 to 7 years) and Senile Group (8 to 14.3 years). The ejaculates were frozen in accordance with established standards of the Artificial Insemination Centre. The thawed semen samples were evaluated with toluidine blue, which analyzes the chromatin condensation and sperm head morphometry simultaneosly, chromomicin A3 (CMA3) to analyze the protamination and in vitro embryo production to analyze the embryonic development. The toluidine blue was evaluated by optical microscopy and the CMA3 by flow cytometry. Semen analyses revealed that spermatozoa of young bulls had higher values of area (A), perimeter (P) and width (W) when compared to adults and senile (Young: A = 1848.5 ± 119.79, P = 10. 23 ± 0.29, W = 1.95 ± 0.1; Adults: A = 1672.9 ± 104.46, P = 9.86 ± 0.33, W = 1.81 ± 0.06; Senile: A = 1723.1 ± 124.41, P = 9.97 ± 0.33, W = 1.83 ± 0.09; P<0.0001) and had higher protamination deficiency when analyzed with CMA3 (Young: 1.57 ± 0.76, Adults: 1.09 ± 0.63, Senile: 0.90 ± 0.59, P<0.05). Variable size (A, P, W) and sperm protamination evaluated by CMA3 showed negative correlation with age and a positive with ellipticity (P<0.05). Spermatozoa with abnormal chromatin obtained larger area when compared to those with normal chromatin (P<0.0001). There was no significant difference in IVP using semen with higher and lower altered chromatin condensation, evidencing that the proportion of spermatozoa with abnormal chromatin (4 to 16.15%) did not affect the embryonic development. Our results indicate that sperm head of young bulls are ... / Mestre

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Banca: Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis / Resumo: Os procedimentos durante a sexagem pelo citômetro de fluxo garantem a acuidade de 85%, mas causam danos na viabilidade espermática que levam a baixa taxa de prenhez após os 90 dias. Os objetivos dessa Dissertação foram: 1) caracterizar a expressão gênica diferencial em transcriptoma de espermatozoides congelados pelo método convencional, sexados por centrifugação em gradiente de densidade ou sexados por citometria de fluxo; 2) comparar as taxas de clivagem e de blastocistos produzidos in vitro de bovinos utilizando sêmen convencional, sexado por citometria de fluxo ou por centrifugação em gradiente de densidade. Os grupos experimentais para sêmen e embriões foram: 1) grupo controle: sêmen convencional submetido ao gradiente de PercollTM 45/90% e respectivos embriões produzidos com esse sêmen; 2) grupo gradiente: centrifugação em gradiente de densidade e respectivos embriões produzidos com esse sêmen; 3) grupo citometria: sêmen sexado pelo citometro de fluxo, submetido ao mini gradiente de PercollTM 45/90% e respectivos embriões produzidos com esse sêmen. O RNA total foi extraído dos espermatozoides (20 x 10 6 células) obtendo-se 400 ng RNA/ 20 x 10 6 células/ animal, ou seja, 20 fg RNA por espermatozoide. Entretanto, não foi posível a construção da biblioteca de cDNA, provavelmente, devido ao alto grau de degradação do RNA. Os Complexos cumulus oócito (COCs) classificados como graus 1, foram aspirados de folículos antrais de 3 a 8 mm de diâmetro a partir de ovários de abatedouros e maturados durante 18 horas em estufa a 38,5°C, 100% de umidade e atmosfera de 5% de CO2 em ar. Os oócitos maturados serão colocados em contato com os espermatozoides previamente preparados para fecundação e incubados por 20 horas em 5% de CO2, na temperatura de 38,5°C. Os prováveis zigotos serão lavados por três vezes em meio SOF (meio sintético de fluido de oviduto) sem SFB e sem glicose e cultivados e transferidos... / Abstract: The procedures for sexing by flow cytometry guarantee the accuracy of 85%, but cause damage in sperm viability leading to lower pregnancy rate after 90 days of pregnancy. The objectives of this study were: 1) to characterize differential gene expression in transcriptome of spermatozoa frozen by conventional method, sexed by density gradient centrifugation, by flow cytometry. 2) Compare blastocyst and cleavageratesproduced in vitro by conventional semen sexed by flow cytometry and by density gradient centrifugation. The experimental groups for semen and embryos were: 1) control group: conventional semen subjected to PercollTM gradient of 45/90% and their embryos produced with this semen, 2) gradientgroup: centrifugation in density gradient and their embryos produced with this semen, 3) cytometry group: semen sexed by flow cytometer, subjected to PercollTMmini gradient 45/90% and their embryos produced with this semen. Total RNA was extracted from sperm (20 x 10 6 cells) and it was possible to extract 400 ngRNA/ 20x10 6 cells/animal or it means, 20 fg of RNA per spermatozoa. However cDNA libraries were not built, probably due a high RNA degradation. The cumulus oocyte complexes (COCs) were classified as grade 1, aspirated from antral follicles with 3-8 mm in diameter, ovariesfromslaughterhouse were used and matured for 18 hours in an incubator at 38.5°C, 100% humidity and atmosphere of 5% of CO2 in air. The matured oocytes are going to be placed in contact with the prepared spermatozoa for fertilization and incubated for 20 hours in 5% CO2 at a temperature of 38.5 °C. Presumptive zygotes are going to be washed three times in SOF (half synthetic oviduct fluid) without FBS and without glucose, cultivated and transferred to plates with four wells containing 500 ul of the same medium used for washing zygotes after fertilization. Embryonic development was evaluated 7-8 days after fertilization. The cleavage and blastocysts rates were ... / Mestre

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Lúcia Galvão de Albuquerque / Coorientador: Maria Cristina Thomas / Coorientador: Robson Carlos Antunes / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Banca: Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis / Banca: Jeffrey Frederico Lui / Banca: Janete Apparecida Desidério / Resumo: A suplementação de vitaminas e minerais pode melhorar a fertilidade do sêmen de suínos. No entanto, os resultados têm se mostrado contraditórios, pois as avaliações do sêmen normalmente são subjetivas. A avaliação mais precisa poderia ser obtida pela análise de transcritos relacionados a fertilidade dos espermatozoides. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito de suplementação intramuscular de vitaminas e minerais sobre a qualidade de sêmen e analisar a expressão de alguns transcritos pelo método de qPCR. Para tal, coletas de sêmen de nove machos foram avaliadas segundo a motilidade, concentração e resistência ao resfriamento e submetidas à extração do RNA. Após 60 dias, seis machos sofreram a aplicação de suplementos minerais-vitamínicos comerciais (Selenphós® e Zimag®). Outros três machos não receberam a suplementação e foram utilizados como controle. Os 60 dias foram considerados para respeitar o ciclo espermatogênico. Após este período, outras coletas de sêmen de cada macho foram realizadas e submetidas aos mesmos procedimentos. Os genes alvo escolhidos para acessar a qualidade dos espermatozoides foram: Bcl-2l que é um gene anti apoptótico; gene ativador da proteína de proteção ao choque térmico (HSP 90); gene da enzima peroxiredoxina 5, protetora contra danos oxidativos e gene inibidor da acrosina, relacionado a capacitação espermática. Os resultados mostraram aumento do número de dias em que as amostras de sêmen diluídas com diluente comercial, resfriadas a 15-18ºC, permaneciam com motilidade acima de 70% após a suplementação com vitaminas e minerais. A concentração dos espermatozoides e volume dos ejaculados, após a suplementação, também melhorou, atingindo taxas de 52 e 57%, respectivamente. Porém, os transcritos para os genes estudados não apresentaram diferença de expressão antes e depois do tratamento com as vitaminas e minerais / Abstract: Vitamin and mineral supplementation could improve the swine semen fertility. However, the results, until now, are controversial because of the subjectivity of the analyses. A precise evaluation could be achieved by the analyses of the spermatozoa transcripts important for the boar fertility. The present work proposes to evaluate the effect of intramuscular vitamin and mineral supplementation on semen quality by analyzing some spermatozoa transcripts, using qPCR methodology. The semen collection of nine boars were evaluated for motility, concentration and resistance to cold, and then, submitted to RNA extraction. After this period, six of these boars received an intramuscular supplement of vitamins and minerals (Zimag® and Selenphos®). Another three animals did not receive the supplementation for control. After 60 days, other semen collections were done and submitted to the same processes of analyses and RNA extraction. The target genes to access spermatozoa quality was:: Bcl-2l, an ant apoptotic gene; gene that active the heat shock protein (HSP 90), a protein related to the capacity of the spermatozoa to react to heat stress; the gene for the ant oxidant enzyme PRDX5; the gene of acrosin inhibition, related to sperm capacitation. There was a improvement on the number of days that the semen samples, diluted on BTS and stored at the 15-18o C temperature, showed an acceptable motility above 70% after the treatment with vitamins an minerals. The concentration of the spermatozoids and volume of the ejaculation increased about 52 and 57 %, respectively, but there was no difference on transcripts expression for the studied genes after the vitamin and mineral treatment / Doutor

Els trastorns genòmics són un grup de malalties genètiques causades per reorganitzacions cromosòmiques de segments de DNA de més de 1Kb que resulten de la inestabilitat del genoma en regions que presenten una arquitectura genòmica particular, caracteritzada per la presència de duplicacions segmentals (low-copy repeats – LCR). Els LCR afavoreixen el malaparellament d’aquestes regions durant la meiosi fent-les susceptibles a la recombinació homòloga no al·lèlica (non-allelic homologous recombination – NAHR) que genera diferents tipus de reorganitzacions cromosòmiques en funció de la orientació dels LCR, del número i tipus de cromàtides implicades en la recombinació. Entre les reorganitzacions cromosòmiques generades per NAHR, les delecions i duplicacions són les causants de la majoria de trastorns genòmics. Mentre que el risc de recurrència de trastorns genòmics s’ha establert per consens en ser inferior al 0.5%, recentment s’han descrit haplotips específics que podrien predisposar a aquestes regions a la NAHR i per tant incrementar el risc de transmetre certs trastorns genòmics a la descendència. Aquests haplotips de predisposició a la NAHR poden ser inversions de les regions crítiques o bé variacions del número de còpies dels blocs d’homologia que formen els LCR. La tècnica d'hibridació in situ fluorescent (FISH) en nuclis descondensats d'espermatozoides proporciona una eina útil per estimar la freqüència de NAHR a través dels seus productes. Pel que fa a l’anàlisi d’haplotips de predisposició, la tècnica de FISH sobre fibres estirades cromatina (Fiber-FISH), que permet obtenir una resolució de fins a 1 Kb, presenta un gran potencial per l’anàlisi de l’arquitectura genòmica dels LCR complexes. Així doncs, en aquest treball es va analitzar la freqüència de delecions i duplicacions de les regions 7q11.23, 15q11-q13 i 22q11.2, així com la freqüència d’inversions de la regió 15q11-q13 mitjançant FISH en espermatozoides en una sèrie d’individus control i de tres poblacions problema que consistien en pares amb descendència afecta per tres trastorns genòmics causats per deleció: la síndrome de Prader-Willi (SPW), la síndrome de Williams-Beuren (SWB) i la síndrome de DiGeorge (SDG). A més, es va utilitzar la tècnica de fiber-FISH per mapar LCR complexes. Les dades obtingudes en la població control varen indicar unes freqüències similars de delecions i duplicacions de les regions analitzades i unes freqüències d’inversions de la regió 15q11-q13 que eren un grau de magnitud superiors a les anteriors. Es van observar increments significatius d’anomalies cromosòmiques en espermatozoides d’individus amb descendència afecta per trastorns genòmics: en la població de pares amb descendència afecta per la SPW, 4 dels 16 individus van mostrar increments de delecions i inversions, mentre que 6 dels individus presentaven increments de delecions. Els resultats van suggerir que els increments d’anomalies en espermatozoides són independents de l’origen genètic de la SPW en la descendència. Aquests increments són un reflex de la inestabilitat que presenta la regió 15q11-q13 que la predisposa a diferents tipus de reorganitzacions cromosòmiques. En la població de pares amb descendència afecta per la SWB, 3 dels 15 individus mostraven increments significatius de delecions, mentre que en la població de pares amb descendència afecta per la SDG es van observar increments en 2 dels 10 individus analitzats. Aquests individus s’han de considerar de risc, en el sentit que presenten un risc incrementat de transmetre una anomalia cromosòmica a la descendència. L’anàlisi de les freqüències de delecions i duplicacions de diferents regions en aquests individus van mostrar que els increments d’anomalies cromosòmiques observats en espermatozoides d’individus amb descendència afecta per trastorns genòmics poden tenir el seu origen en la presència d’haplotips de predisposició o en un increment generalitzat de la susceptibilitat a la NAHR. Els increments significatius de delecions i inversions en espermatozoides d’individus amb descendència afecta per trastorns genòmics indiquen un increment de la freqüència del fenomen de NAHR intracromàtide. Es va demostrar que la tècnica de Fiber-FISH permet mapar LCR complexes i avaluar la presència de diferents haplotips. Els estudis de FISH en espermatozoides, dirigits a determinar la incidència de delecions i duplicacions, aporten una informació valuosa en el consell genètic reproductiu en pares amb descendència afecta per trastorns genòmics. Un resultat de FISH en espermatozoides alterat, independentment del valor numèric, s’interpretarà com l’evidència d’anomalies en el procés de recombinació i és indicatiu d’un factor de risc. / Genomic disorders are a group of human diseases caused by chromosomal reorganizations of DNA segments longer than 1 Kb resulting from the genomic instability of regions that show specific architectural features, characterized for the presence of low-copy repeats (LCR). LCR favor the mispairing of these regions during meiosis thus increasing their susceptibility to non-allelic homologous recombination (NAHR) that triggers different types of chromosomal rearrangements according with the LCR orientation, the number and type of chromatids involved in the event. Among the chromosomal rearrangements generated by NAHR, the most frequently involved in genomic disorders are deletions and duplications. NAHR events are thought to be sporadic, thus the risk of recurrence have been established in less than 0.5%. However, there have been recently described some haplotypes that could predispose these regions to NAHR thus increasing the risk of transmission of certain genomic disorders to the offspring. Those predisposing haplotypes are both inversions of the critical regions and copy-number variations of the blocks that build the flanking LCRs. The use of fluorescence in situ hybridization (FISH) on decondensed sperm nuclei provides a useful tool to estimate the frequency of NAHR events throughout its products. Besides, the methodology of FISH on stretched DNA fibers (Fiber-FISH) that allow a resolution up to 1 Kb, has a great potential for mapping complex LCRs. In this work we analyzed the frequency of deletions and duplications of the 7q11.23, 15q11-q13 and 22q11.2 regions, plus the frequency of 15q11q13 inversions using sperm-FISH in a series of control individuals and in three populations consisting on fathers with a deletion-caused genomic disorder affected offspring: Prader-Willi syndrome (PWS), Williams-Beuren syndrome (WBS) and DiGeorge syndrome (DGS). Furthermore, we used the Fiber-FISH methodology to study complex LCR. Data obtained in the control population showed equivalent frequencies of sperm deletions and duplications in the regions analyzed and frequencies of 15q11q13 inversions that were an order of magnitude higher than the previous anomalies. We observed significant increases of sperm anomalies in some individuals with genomic disorders affected offspring: in the populations of PWS fathers, 4 out of 16 subjects showed higher frequencies of deletions and inversions, while 6 subjects showed increases of deletions. Results suggested that the increases of sperm anomalies are independent of the genetic origin of the PWS in the offspring. The significant increases of sperm anomalies are a reflex of the genomic instability of the 15q11-q13 region that makes it prone to different types of chromosomal rearrangements. In the populations of WBS fathers, 3 out of 15 individuals showed significant increased frequencies of anomalies and in the population of DGS fathers we observed 2 out of 10 subjects that showed higher frequencies of anomalies. These subjects should be considered risky individuals, because they show an increased risk of transmission of genomic disorders to the offspring. From the analysis of deletions and duplications of different regions in each individual, our results pointed out that the increased frequencies of sperm anomalies had their origin in the presence of predisposing haplotypes and a generalized susceptibility to NAHR events. The significant increases of sperm deletions and inversions suggested that the fathers with genomic disorders affected offspring have an increased frequency of the intrachromatid NAHR mechanism. There have been demonstrated the potential of the Fiber-FISH methodology to map complex LCRs and for the assessment of variable haplotypes. The methodology of sperm-FISH for analyzing the incidence of deletions and duplications, offers valuable information for the reproductive genetic counseling in fathers with offspring affected by a genomic disorder. An altered sperm-FISH result, independently of the numerical value, will be interpreted as the evidence of anomalies in the process of recombination and, therefore, indicates a risk factor.

La major part del treball està enfocat en l'estudi de les proteïnes nuclears bàsiques espermàtiques, també anomenades protamines.Les protamines són proteïnes que tenen la funció de compactar el DNA espermàtic nuclear per a mantenir-lo en un volum reduït. L'estudi d'aquestes proteïnes ens dóna un idea sobre quins són els minims requeriments per interaccionar amb el DNA, com s'estructura la cromatina espermàtica, etc. Un dels aspectes més interessants és la extraordinària variabilitat evolutiva que presenten. Les protamines són el grup de proteïnes més heterogeni que cumpleixen una mateixa funció.Els resultats de l'estructura primària d'aquestes molècules i el seu estudi tant dins del seu context taxonòmic com biològic, ens dóna un millor coneixement de l'evolució de les proteïnes.CAPÍTOL III.A. Eledone cirrhosaEl grup dels Cefalòpodes presenta fonamentalment dos grans grups: els decàpodes (sèpies i calamars) i els pops.Eledone cirrhosa és un pop que pertany a la família Octopodidae. En aquest primer capítol hem estudiat el procés de nucleomorfogènesi de l'espermatozoide, així com la protamina que s'encarrega de mantenir la forma tan rígida i espiralitzada del nucli. L'aspecte més interessant és l'estadi on l'espermàtida presenta un nucli allargat, amb una cromatina condensada i secció cilíndrica, nucli doblegat diverses vegades, i envoltat per una sèrie de microtúbuls amb una disposició molt estreta vers al nucli. Aquests microtúbuls entren en contracció i exerceixen unes forces en el nucli de tal manera que el posen recte i al mateix temps l'espiralitzen. Destaca la presència d'una estructura que anomenen "complexe periacrosomal" que podria ser un centre de reorganització d'aquests microtúbuls.S'han purificat nuclis espermàtics i s'ha vist que el DNA està compactat per una sola protamina. Aquesta proteïna s'ha purificat i seqüenciat, i s'ha vist que és una proteïna extraordinàriament rica en cisteïna, aminoàcid que forma ponts disulfurs de manera que estabilitza la forma espiral del nucli i el manté rígid.S'han fet experiments de detecció dels ponts disulfur tant en cues com en nuclis espermàtics, mitjançant el marcatge amb MMNA, i s'ha demostrat que són aquests enllaços covalents els que procuren la rigidesa al nucli.CAPÍTOL III.B. Octopus vulgarisQuan es va estudiar el contingut proteic nuclear d' Eledone cirrhosa, només es coneixien, a més a més, les protamines de les sèpies i calamars. Així doncs, varem decidir estudiar el què passava en un altre pop, Octopus vulgaris, espècie que pertanya a la mateixa família que l'anterior.Tot i la pròxima posició taxonòmica, les protamines d'.O. vulgaris presenten una estructura primària més propera als decàpodes que a E. cirrhosa.A l'igual que ocorre amb els decàpodes, les protamines d' O. vulgaris provenen de molècules precursores, arribant-se a trobar restes de precursors en l'espermatozoide madur. A més a més, les protamines d'aquest pop comparteixen més similarituds amb les protamines de les sèpies i calamars que amb l'altre pop, particularment l'elevada basicitat representada per només l'arginina i la seva organització en clusters. Entre els resultats obtinguts en aquesta part és important resaltar el fet de l'enorme simplicitat que la protamina principal d' O. vulgaris presenta, constituïda per només tres tipus d'aminoàcids diferents, i organitzada en clusters del tipus (GRn)m, proteïna que es troba fosforilada en la gònada i es defosforila en l'epidídim.Comparació entre les protamines dels CefalòpodesHem comparat les protamines dels cefalòpodes conegudes per així millor poder entendre el tipus d'evolució que han seguit. Suggerim tres tipus de canvis de tipus evolutiu per les protamines dels cefalòpodes:- Petits canvis en la molècula (mutacions puntuals, petits indels, etc). Aquests canvis s'expliquen en les protamines dels decàpodes, on es mostra que totes dues protamines són homòlogues, presentant un orígen comú, on el gen ancestral es va duplicar i posteriorment cada còpia es va modificar experimentant petites mutacions a nivell de proteïna.- Canvis importants que continuen respectant el model d'organització de la molècula. Aquest canvis es mostren quan es comparen les protamines dels decàpodes amb les protamines d'O. vulgaris. Encara que no es pot garantir una homologia (origen comú) per totes elles, sí que presenten una organització molt similar.- Canvis repentins que afecten a tota la protamina i per tant canvien al complert el model molecular d'organització. És el que s'ha pogut observar en la divergència de la protamina d'Eledone respecte les protamines d'Octopus i respecte les protamines dels decàpodes. Aquesta divergència està associada amb canvis a diferents nivells, corn la forma nuclear, l'estructura i forma de l'espermatozoide, el tipus de fecundació, etc. La protamina d'E. cirrhosa no és homòloga amb la resta de protamines dels cefalòpodes. És un model nou de protamina que ha aparegut simultàniament amb un nou model d'espermatozoide.CAPÍTOL III.C. Murex brandarisEn aquest treball hem completat l'estudi de caracterització de les protamines del cenogastròpode Murex brandaris , i d'aquesta manera hem pogut fer una comparació més exhaustiva pel que fa referència a les protamines dels arqueogastròpodes, mol.luscs amb fecundació externa (vers la fecundació interna dels cenogastròpodes).CAPÍTOL III.D. Subordre GasterosteoideiEl grup de peixos ossis Gasterosteiformes representa un grup que ha sofert una ràpida evolució. L'espècie ancestral d'aquest grup era marina, i a causa d'una desglaciació soferta a finals del Pleistocè es van formar bona part dels llacs de la Columbia Britànica (Canadà), donant-se una invasió d'algunes formes marines cap aquests nous nitxos ecològics lliures, espècies que van sofrir una ràpida especiació/ adaptació.Hem pogut comparar diferents poblacions que pertanyen a una mateixa espècie, diferents espècies que pertanyen a un mateix gènere, diferents gèneres que pertanyen a una mateixa família, i diferents famílies que pertanyen a un mateix subordre, i això ens ha permés arribar a la conclusió de que l'ancestre de la protamina dels Gasterosteiformes podria tenir un origen comú a la protamina ancestral de l'ordre Perciformes, protamina típica de peixos ossis.CAPÍTOL III.E. Dicentrarchus labraxEn aquest darrer apartat hem fet un estudi preliminar de l'activitat descondensadora present en l'oòcit de l'espècie D. labrax front l'espermatozoide de la mateixa espècie un cop s'ha donat la fecundació.Els resultats mostren que existeix una activitat de desplaçament de la protamina nuclear espermàtica quan es fan incubacions amb extractes d'oòcits, inflant-se la cromatina espermàtica. Aquesta activitat és possiblement atribuïble a diverses proteïnes presents en l'oòcit, i no només a una sola (nucleoplasmina). Aquestes proteïnes, però, s'han de caracteritzar i s'ha de fer un estudi més profund del tema.CAPÍTOL IV. DISCUSSIÓProposem que les proteïnes espermàtiques bàsiques (protamines) s'han de considerar almenys, dintre de tres nivells d'organització diferents, on la selecció natural actuaria sobre cadascun d'ells, impedint, afavorint o provocant diferents tipus de canvis. Aquests tres nivells d'organització serien:- Nivell molecular: interacció DNA-SNBP. Aquest és el nivell més simple on sempre s'han estudiat les protamines a nivell evolutiu. Petits canvis es donen per millorar la interacció de la protamina amb el DNA, canvis que poden ser neutres. Quan es comparen les estructures primàries que han sofert una divergència evolutiva, es pot establir una relació d'homologia.- Nucli espermàtic considerat com a una identitat. De vegades ocorre que entre dues espècies properes es dóna un canvi en la forma del nucli espermàtic. En aquest cas és el nucli el que rep la pressió de la selección natural, pressió que afecta indirectament a la protamina present en e1 nucli. La protamina canvia per tal de permetre la nova forma nuclear.- L'espermatozoide senser com a una unitat irreductible. El cas d'E. cirrhosa ens dóna un exemple d'aquest nivell. L'aparició, disposició, activitat i destrucció dels microtúbuls que actuen al llarg de l'espermiogènesi d'aqueste espècie, juntament amb d'altres processos, ha de seguir un control coordinat juntament amb la síntesi d'una protamina, la seva entrada al nucli, interacció amb el DNA i el control final de la formación dels enllaços disulfur. Cadascun de tots aquests aconteixements porta a l'aparició d'un tipus nou d'espermatozoide, processos que només tenen sentit si es donen en el seu context biològic. La selecció natural ha actuat sobre l'espermatozoide sencer, sobre tota la cèl.lula sensera com si fos un únic nivell d'organització.Analitzem també cinc mecanismes principals que permeten els canvis en la evolució de les protamines, i finalment discutim alguns casos particulars de protamines riques en cisteïna i protamines que provenen de molècules precursores. / The main objective of our work has been to examine some protamines which are special cases to study for the better understanding of the chemist and the ways which protamines have evolved.The study of the spermiogenesis and the protamine of the octopus "Eledone cirhosa" has allowed us to understand some of the cellular processes that module the final shape of the sperm nucleus, and the need of a disteine rich protamine. The protamines of another octopus have also been studied ("Octopus vulgaris"), in order to establish the main characteristics of the evolved changes in the protamine model of the cephalopod molluscs.The final primary structure of the protamines of "Murex brandaris" cenogastropod has been established. "M. brandaris" protamines apparently are not homologous to their ancestral protamines (those of Archaeogastropods), and may have arisen from the multiplication of an ancestral minigen. The protamines are synthesized as precursors, which suffer a large number of small N-terminus deletions that take place at the same time as the chromatin condensation process.On the other hand, we have studied a group of bony fishes that has had a very fast evolution: "Gasterosteoidei" suborder. We have chosen this group of fish as well as the geographical region (British Columbia, Canada) for the following reasons: The ancestral species of "Gasterosteus" were exclusively sea forms and remained invariable for 5-6 millions years.However, at the end of the Pliocene an invasion took place into the recently formed lakes. When sea forms invaded the lakes, they found a high variety of free ecological niches that caused the species "G. aculeatus" to evolve quickly. Subsequently, in a short period of time, a hundred new species appeared. Due to the fact that we are in front of a group of quick evolution and because of the knowledge of bony fish protamines, we decided to study the primary structure of 4 protamines belonging to different populations.To finish, we have also studied the removing activity of the sperm chromatin by "Dicentrarchus labrax" oocytes, being a preliminary study of the descondensating activity of the sperm chromatin present inside the oocytes of a species not studied at present.

El objetivo de la presente tesis fue estudiar qué factores pueden explicar la variabilidad existente en la congelabilidad espermática entre eyaculados, la integridad del ADN en los espermatozoides descongelados, la posibilidad de adaptar el protocolo de criopreservación a las necesidades cada verraco y, el posible papel del plasma seminal en la congelabilidad espermática. Los resultados revelaron que el verraco es el factor más importante capaz de explicar la diferente susceptibilidad entre eyaculados para soportar el proceso de criopreservación y que la variabilidad dentro de un mismo verraco es baja. El grado de fragmentación del ADN de los espermatozoides porcinos descongelados es relativamente bajo, y ligeros ajustes en la concentración de glicerol y la velocidad de descongelación, permiten mejorar la supervivencia espermática, especialmente de aquellos eyaculados considerados como "malos congeladores. Finalmente, la suplementación del medio de congelación con plasma seminal de individuos con buena congelabilidad tiene un efecto beneficioso sobre la congelabilidad espermática. / The aim of this thesis was to study which factors could explain part of the ejaculate variation in sperm freezability, the incidence of DNA fragmentation in frozen-thawed boar spermatozoa, whether different boars require modifications in the freezing and thawing protocol to enhance sperm cryosurvival and, the possible role of seminal plasma in boar sperm freezability. The results revealed that boar is the most important factor explaining the different susceptibility among ejaculates to sustain cryopreservation and that the intra-boar variability is relatively low. The overall DNA damage in frozen-thawed boar sperm is low and slight adjustment of the glycerol concentration and warming rate provides a better sperm cryosurvival, particularly in those ejaculates which are considered as "bad" freezers. Finally, supplementation of freezing media with seminal plasma from males with "good" freezability, has a beneficial effect on post-thaw sperm cryosurvival

El objetivo del presente estudio fue determinar el tiempo máximo para recuperar y criopreservar espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo de caninos post orquiectomía. Los testículos/epidídimos fueron obtenidos después de la orquiectomía de 20 caninos adultos aparentemente saludables con edades entre 1 y 8 años. Los testículos/epidídimos fueron colocados en cloruro de sodio al 0.9% y almacenados a 5ºC durante 0, 24, 48 y 72 horas. Los espermatozoides fueron recuperados al cortar la cola del epidídimo suspendido en dilutor Tris-citrato-fructosa. Para el proceso de criopreservación, a la muestra diluida (espermatozoides + dilutor) se le añadió yema de huevo (20%) y glicerol (5%). La nueva dilución fue envasada en pajillas de 0.5ml, las cuales fueron sometidas a una curva de enfriamiento para luego ser colocadas en nitrógeno líquido. Los parámetros evaluados fueron: Motilidad total, motilidad progresiva e integridad funcional de membrana; parámetros que fueron analizados antes y después de la criopreservación. Adicionalmente se obtuvieron datos sobre morfología y concentración, evaluadas sólo antes de la criopreservación. Todos los parámetros evaluados disminuyeron gradualmente a medida que aumentó el tiempo de almacenamiento, los cuales al ser evaluados a las 48 horas de almacenamiento, antes y después del proceso de criopreservación, no variaron significativamente con respecto a los evaluados a las 0 horas. Sin embargo, cabe resaltar que todos los valores obtenidos después del proceso de criopreservación fueron marcadamente inferiores a los obtenidos antes del proceso. / The aim of this study was to determine the maximum time to recover and cryopreserve sperm from the tail of the epididymis of canine post-orchiectomy. The testes/epididymides were obtained by orchiectomy of 20 apparently healthy adult dogs between 1 to 8 years old. The testes/epididymides were placed in sodium chloride 0.9% and stored at 5 ° C for 0, 24, 48 and 72 hours. Sperm were recovered by cutting the tail of the epididymis dilutor suspended in Tris-citrate-fructose. For the cryopreservation process, the diluted sample (sperm + dilutor) was added egg yolk (20%) and glycerol (5%). The new dilution was packaged in 0.5ml straws, which were subjected to a cooling curve to be later placed in liquid nitrogen. The parameters evaluated were: Total motility, progressive motility and membrane functional integrity; parameters were analyzed before and after cryopreservation. Additionally, data were obtained on morphology and concentration, evaluated just before the cryopreservation. All evaluated parameters decreased gradually when the storage time increased. Such parameters to be evaluated at 48 hours of storage, before and after the cryopreservation process, did not differ significantly from those evaluated at 0 hours. However, it is noted that all values obtained after the cryopreservation process were markedly lower than those obtained before process.

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de cuatro combinaciones de dos agentes crioprotectores permeantes más dos no permeantes sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para esto, primero (Experimento 1) se seleccionó, entre tres dilutores (A, B y C), el más adecuado para ser usado en la segunda parte (Experimento 2), en la cual se evaluaron las siguientes combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes: 1)Glicerol - Trehalosa, 2)Glicerol - Sacarosa, 3)Etilenglicol - Trehalosa y 4)Etilenglicol - Sacarosa sobre la calidad del semen ovino post-descongelamiento. Para tal efecto, se realizaron 6 repeticiones para el Experimento 1 y 8 repeticiones para el Experimento 2. Cada repetición constó de 4 eyaculados cada una. En el experimento 1 se encontró que el Dilutor A mantenía mejor la motilidad progresiva y viabilidad e integridad acrosomal post-descongelamiento (69% y 63%) en comparación con el Dilutor B (37% y 35%) y el Dilutor C (23% y 23%). Por lo cual, el Dilutor A fue empleado en el experimento 2. En el experimento 2 se encontró que la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad acrosomal, la termoresistencia y la integridad de membrana plasmática post-descongelamiento fue mejor en los grupos con glicerol-sacarosa (64%; 56%; 40% y 63%) y glicerol-trehalosa (64%; 58%; 38% y 60%) en comparación con los grupos con etilenglicol-sacarosa (48%; 42%; 25% y 37%) y etilenglicol-trehalosa (44%; 38%; 27% y 40%). Lo cual demuestra que el glicerol es un mejor crioprotector permeante en comparacion con el etilenglicol. Sin embargo, no existe diferencia en el uso de sacarosa o trehalosa. Se concluye que un dilutor con las características del dilutor A, utilizando glicerol más trehalosa o sacarosa constituye una buena alternativa para la criopreservación de semen ovino. / The objective of the study was to evaluate the effect of four combinations of two permeant and two non permeant cryoprotectant agents on the quality of post thaw ram semen. In Experiment 1, three extender were evaluated (A, B, and C) in order to have th ebetter one for the next step. In Experiment 2, different combinations of cryoprotectant agents were evaluated as follow: 1) Glycerol–Trehalose, 2) Glycerol–Sucrose, 3) Ethyleneglycol-Trehalose, and 4) Ethyleneglycol–Sucrose. In this way, 6 assays for Experiment 1 and 8 assays for the Experiment 2 were carry out. In each assay, 4 ejaculated were mixed to work as an original sample. Percentages of motility, viability and acrosomal integrity in extender A were higher (69% and 63%) than extender B (37% and 35%) and extender C (23% and 23%). Therefore, extender A was used for experiment 2. In the experiment 2, motility, viability and acrosomal integrity, thermoresistance, and plasmatic membrane integrity were higher in groups Glycerol-sucrose (64%; 56%; 40%, and 63%) and Glycerol-trehalose (64%; 58%; 38%, and 60%) in comparison with groups Ethileneglycol-sucrose (48%; 42%; 25% and 37%) and Ethileneglycol-trehalose (44%; 38%; 27% and 40%). However, there is not significative differences between sucrose or trehalose. In conclusion, an extender with characteristics of extender A, it means, using glycerol plus trehalose or sucrose constitute a good alternative for cryopreservation of ram semen.