O presente estudo teve como objetivos comparar o sêmen de cães jovens e senis, por avaliação morfo-funcional, estresse oxidativo e quantificação de produtos avançados de glicação (AGEs); comparar a congelabilidade seminal de cães jovens e senis e verificar a ação dos produtos avançados de glicação, oxidação proteica e estresse oxidativo na criopreservação seminal de cães senis. Foram selecionados 22 cães, alocados em dois grupos experimentais de acordo com a idade: Grupo Jovem (n=11) e Grupo Senil (n=11). Os grupos foram adicionalmente subdivididos em Grupo Sêmen Fresco e Grupo Sêmen Criopreservado. A divisão etária foi realizada de acordo com o porte dos animais, sendo porte pequeno considerado senil a partir de 8 anos de idade, porte médio a partir de 7 anos de idade e porte grande acima de 6 anos de idade. Independentemente do porte, os cães jovens em idade reprodutiva foram considerados entre 1 e 5 anos de idade. O Grupo Fresco foi submetido a avaliações seminais imediatas, incluindo volume, cor, aspecto do ejaculado, concentração espermática e análise computadorizada da motilidade (CASA). Logo após, foram realizadas avaliações morfo-funcionais, incluindo atividade mitocondrial dos espermatozoides, estresse oxidativo lipídico, estresse oxidativo proteico, dosagem de produtos avançados de glicação e dosagem de concentração proteica, citometria de fluxo utilizando as sondas fluorescentes para a avaliação espermática da integridade de membrana plasmática e acrossomal e de potencial de membrana mitocondrial e análise de fragmentação de DNA. O Grupo Congelado foi submetido ao protocolo de congelação em uma etapa e após, no mínimo uma semana, as amostras foram descongeladas a 37ºC por 30 segundos e, então, avaliadas quanto à concentração espermática, análise computadorizada da motilidade (CASA) e as mesmas avaliações morfo-funcionais realizadas para o Grupo Jovem. Como resultados, os machos do Grupo Jovem apresentaram maior escore de libido, parâmetros da motilidade espermática, alta atividade mitocondrial dos espermatozoides e menores valores de atividade mitocondrial média, defeitos espermáticos totais, defeitos espermáticos maiores e gota citoplasmática proximal. No sêmen fresco, o Grupo Jovem obteve maiores valores de integridade da membrana acrossomal dos espermatozoides e baixo potencial de membrana mitocondrial, assim como menores valores de integridade da membrana plasmática e acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial. No sêmen descongelado, o Grupo Jovem apresentou maiores valores de integridade de membrana acrossomal dos espermatozoides. No sêmen de cães jovens, o Sub-grupo Fresco obteve maiores valores de integridade de membrana acrossomal e integridade de membrana acrossomal com lesão de membrana plasmática. No sêmen de cães senis, o Sub-grupo Fresco apresentou maiores valores de integridade de membrana acrossomal, integridade de membrana plasmática e acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial, assim como menor porcentagem de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial. Na comparação entre os sub-grupos, houve maiores valores para parâmetros da motilidade espermática, integridade de membrana plasmática com lesão de acrossomo, médio potencial de membrana mitocondrial, integridade de membrana plasmática, alta atividade mitocondrial e estresse oxidativo no Sub-grupo Descongelado, além de maiores valores de amplitude de deslocamento lateral da cabeça, espermatozoides estáticos, lesão de membrana acrossomal e plasmática, média atividade mitocondrial e concentração de proteínas no pellet de espermatozoides. A partir de tais resultados, é possível concluir que o sêmen de cães senis apresenta qualidade inferior ao de cães jovens, bem como reduzida congelabilidade. Nos cães senis, possivelmente, a falha na eliminação da gota citoplasmática dos espermatozoides promova disfunções mitocondriais, culminando na alteração da motilidade espermática. Por fim, as avaliações de parâmetros oxidativos não se mostram acuradas para a avaliação do impacto da senescência reprodutiva. / This study aimed to compare the semen of young and senile dogs, through the evaluation of morphological and functional attributes, oxidative stress and quantification of advanced glycation ending products (AGEs); compare the seminal freezability of young and senile dogs and evaluate the effects of advanced glycation ending products, oxidation protein and oxidative stress on seminal cryopreservation of senile dogs. Twenty two dogs were selected and allocated into two experimental groups according to their age: Young Group (n=11) and Senile Group (n=11). These groups were additionally divided into Fresh Semen Group and Frozen Semen Group. Age distribution was performed according to the size of the animals, being small animals considered senile from 8 years of age onwards, medium size from 7 years old and large size over 6 years old. Regardless of the body size, dogs were considered young if they were at reproductive maturity from 1 to 5 years old. The Fresh Group was subjected to immediate seminal assessments, including volume, color, aspect of the ejaculate, sperm concentration and computer analysis of sperm motility (CASA). Then morpho-functional assessments were carried out, including sperm mitochondrial activity, lipid oxidative stress, protein oxidative stress, dosage of advanced glycation ending products and of protein concentration, flow cytometry using fluorescent probes to evaluate plasmatic and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation analysis. The semen from the Frozen Group was submitted to one step freezing protocol and samples were thawed after not less than 1 week at 37°C for 30 seconds and evaluated for sperm concentration, motility computerized analysis (CASA) and same the morpho-functional analysis performed for the Young Group. Male dogs from the Young Group presented higher libido score, parameters of sperm motility, percentage of sperm with high mitochondrial activity and lower percentage of sperm of medium mitochondrial activity, total spermatic defects, major spermatic defects and proximal cytoplasmic droplet. For the fresh semen of the Young Group, higher values of acrosomal membrane integrity and low mitochondrial membrane potential, as well as lower values of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential were noticed. In the post-thaw semen, the Young Group showed higher values of spermatic acrosomal membrane integrity. For the semen of young dogs, the Fresh Group had higher values of acrosomal membrane integrity and acrosomal membrane integrity with plasma membrane damage. In the semen of senile dogs, the Fresh Group presented higher values of acrosomal membrane integrity, plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential, as well as lower percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential. Comparing sub-groups, higher values for sperm motility parameters, plasma membrane integrity with acrosome injury, medium mitochondrial membrane potential, plasmatic membrane integrity, high mitochondrial activity and oxidative stress was noticed for the Thawed group, as well as greater values of lateral displacement amplitude of the sperm head, static spermatozoa, acrosomal and plasmatic membrane lesions, medium mitochondrial activity and protein concentration in the spermatozoa pellet. Based on the present results, it is possible to conclude that the semen of senile dogs presents inferior quality compared to young dogs, as well as less freezability. The possible failure to eliminate the sperm cytoplasmic droplet in senile dogs sperm promotes mitochondrial dysfunctions, culminating to alterations on sperm motility. Finally, the evaluation of oxidative parameters is not feasible for the impact evaluation of reproductive senescence.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T18:29:37Z No. of bitstreams: 1 117110033.pdf: 882213 bytes, checksum: 12c52b9fad305c8e13e54eeab7fca3ac (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T18:29:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 117110033.pdf: 882213 bytes, checksum: 12c52b9fad305c8e13e54eeab7fca3ac (MD5) Previous issue date: 2013-04-26 / A centrifugação por gradiente de Percoll ® é o método mais utilizado para a seleção de sêmen bovino para a fecundação in vitro (FIV), no entanto, até o momento não existe nenhum estudo que indique uma força de centrifugação capaz de remover com sucesso o plasma seminal e outros constituintes, sem causar perdas na recuperação espermática ou danos funcionais aos espermatozoides obtidos no pellet. O presente estudo foi desenvolvido para verificar o efeito de diferentes forças de centrifugação na seleção espermática por gradientes de Percoll ® , através de avaliação de parâmetros de qualidade espermática e posterior desenvolvimento e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV). Parâmetros de estresse oxidativo também foram avaliados para verificar uma possível relação com os achados na avaliação de esperma. No experimento 1, amostras de sêmen de quatro touros foram homogeneizadas e submetidas a centrifugação em gradientes descontínuo de Percoll ® (30,60 e 90%) em diferentes forças: F1 (9000 X g), F2 (6500 X g), F3 (4500 X g) e F4 (2200 X g). No Experimento 2, as amostras de sêmen de cada touro foram processadas individualmente e centrifugadas em: F1 (9000 X g) e F4 (2200 X g). Todas as amostras espermáticas foram avaliadas quanto a concentração, motilidade, vigor, morfologia, espécies reativas de oxigênio (EROs) e integridade da membrana plasmática, sendo no experimento 2 avaliados ainda a peroxidação lipídica, defesas antioxidantes e desenvolvimento embrionário. Não foi observada diferença na concentração espermática nos sêmens submetidos a diferentes forças centrifugação. No Experimento 1, a percentagem de espermatozoides móveis foi superior (p <0,05) após centrifugação em F3 e F4 e a produção de EROs de F1 foi superior (p <0,05) em comparação com outras forças. No Experimento 2, quando o sêmen de cada touro foi processado individualmente, não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros de qualidade espermática, peroxidação lipídica, defesas antioxidantes, taxa de clivagem e tempo médio da primeira clivagem entre F1 e F4. No entanto, o aumento da força de centrifugação reduziu a taxa de penetração e a fertilização normal (P<0,05). Este trabalho demonstrou pela primeira vez que a força de centrifugação de 2200 X g aumentou a penetração e a taxa de fecundação em relação à força de centrifugação habitual (9000 X g) utilizadas na separação de espermatozoides por gradientes descontínuos Percoll ® em bovinos. Estes resultados sugerem que esta força de centrifugação pode ser utilizada com sucesso na PIV de embriões bovinos, uma vez que não reduz a recuperação de espermatozoides e aumenta a taxa de fecundação. / Centrifugation by Percoll® gradient is the most widely used method in the preparation of bull sperm for the purpose of in vitro fertilization, however at the moment, no scientific study determined the best centrifugation speed to remove seminal plasma and other constituents, i.e. the speed at which the loss of sperm cells is minimized and where the spermatozoa in the pellet still remain functional. The present study was designed to examine the efficiency of different centrifugation forces in sperm separation Percoll by methods evaluating sperm quality parameters and subsequent development and quality of bovine in vitro production (IVP) embryos. Additionally, we evaluated oxidative stress parameters to verify a possible relationship with the findings in the sperm evaluation. In Experiment 1, the semen samples from each bull were pooled and submitted to centrifugation in discontinuous gradients Percoll (30,60 and 90%) at different forces: F1 (9000 X g), F2 (6500 X g), F3 (4500 X g) and F4 (2200 X g). In Experiment 2, the semen samples from each bull were done separately and submitted to: F1 (9000 X g) and F4 (2200 X g). All sperm samples were evaluated to the concentration, motility, vigor, morphology, reactive oxygen species (ROS) and integrity of the plasma membrane, and in experiment 2 also were evaluated lipid peroxidation, antioxidants assays and embryo development. No difference was observed in the concentration of sperm submitted to different centrifugation forces. In Experiment 1, the total percentage of motile sperm was increased (p < 0.05) after centrifugation in F3 and F4 and the ROS production to F1 was superior (p < 0.05) compared to other forces. In Experiment 2, when the bull semen was processed individually, no significant difference was observed in the sperm quality parameters assessment, lipid peroxidation, antioxidants assays, cleavage rate and average time of the first cleavage between F1 and F4, sires or interaction between them after Percoll. However, the increased force centrifugation reduced the rate of penetration and normal fertilization (P < 0.05). This work demonstrated for the first time that 2200 X g centrifugation force enhanced the penetration and fertilization rates in relation to usual centrifugation force (9000 X g) using sperm separation by discontinuous Percoll gradients in bovine. These findings suggest that this centrifugation force could be used with successful in the bovine IVP embryo since it does not reduce sperm recuperation and increases the fecundation rate.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T20:08:58Z No. of bitstreams: 1 127110020.pdf: 531553 bytes, checksum: 0170d654c8a7662821baf128927374e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T20:08:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 127110020.pdf: 531553 bytes, checksum: 0170d654c8a7662821baf128927374e8 (MD5) Previous issue date: 2014-08-12 / A técnica de seleção espermática para fecundação in vitro (FIV) deve proporcionar além, da recuperação eficiente de espermatozoides, a manutenção da integridade celular. Diversos métodos vêm sendo propostos para a seleção de espermatozoides bovinos destinados a FIV, sendo o método de centrifugação em gradientes de densidade descontínuos de Percoll® o mais utilizado. Em bovinos esta técnica de seleção vem sendo amplamente modificada no que se refere ao volume, número de gradientes, tempo e força de centrifugação, visando aumentar a recuperação espermática, proporcionando um melhor rendimento da dose. Contudo, a etapa de centrifugação, presente nestes protocolos, pode causar danos irreversíveis aos espermatozoides e assim influenciar nas taxas de fecundação. O presente estudo teve como objetivo determinar a influência da força e do tempo de centrifugação, assim como a associação do meio Cushion Fluid® na segunda centrifugação na seleção espermática por gradientes de Mini Percoll® modificado, através da avaliação de características morfofuncionais, formação de espécies reativas ao oxigênio (EROs), defesas antioxidantes, taxa de fecundação in vitro e desenvolvimento embrionário em três experimentos. No experimento I, um pool contendo sêmen de dois touros Bos taurus taurus com fertilidade conhecida foi submetido ao método de separação por Mini Percoll®, sendo as amostras divididas em quatro grupos e submetidos a duas forças (2200 ou 9000 X g) e dois tempos de centrifugação (1 e 3 minutos). No experimento II e III, um pool de sêmen de dois touros Bos taurus taurus com fertilidade conhecida foram processados pelo método de Mini Percoll® modificado, sendo adicionado uma quantidade de 150μL de Cushion Fluid® (Minitübe, Tiefenbach, Germany) durante a segunda centrifugação. Foram realizadas avaliações morfofuncionais e bioquímicas das amostras do sêmen destinado a FIV, assim como a capacidade fecundante e o desenvolvimento embrionário dos oócitos fecundados com os espermatozoides selecionados. No primeiro experimento foi observada uma melhora no vigor dos espermatozoides após o gradiente de Mini Percoll®, para todos os tratamentos. No segundo experimento, a taxa de recuperação espermática não diferiu entre os tratamentos, sendo 42,0% ± 4,9 para T1 e 38,6% ± 3,6 para T2 (grupo com adição do Cushion Fluid® na segunda centrifugação):. Na morfologia espermática o T2 (5,1 ± 1,1) apresentou menor taxa de espermatozoides com defeitos maiores do que os tratamentos T0 (Pré-Percoll) e T1 (8,8 ± 0,8 e 5,8 ± 1,0). Neste mesmo experimento, os níveis de EROs apresentaram-se aumentados (P < 0,05) no meio com Cushion Fluid® (T2), no entanto, a avaliação das defesas antioxidantes não diferiram entre os tratamentos. No experimento III, não foram observadas diferenças na taxa de fecundação. Este trabalho demonstrou que o uso de uma menor força e tempo (2200 X g/1 min.) de centrifugação pode ser utilizado sem interferir nas taxas de recuperação espermática. O uso do meio Cushion Fluid® durante a centrifugação de espermatozoides bovinos não influenciou a taxa de fecundação e desenvolvimento embrionário até 48 horas. / The technique of sperm selection for in vitro fertilization (IVF) should provide addition, the sperm efficient recovery, the maintenance of cellular integrity. Several methods have been proposed for bovine sperm selection for IVF, and the discontinuous density gradients Percoll® ( Sigma Aldrich – St. Louis MO, USA) centrifugation method on the most used. In cattle this selection technique has been extensively modified with respect to the volume, number of gradients, time, and centrifugal force, to increase the sperm recovery, providing a better yield of the dose. However, the centrifugation step present in these protocols, may cause irreversible damage to sperm and thus influence fertilization rate. The present study aimed to determine the influence of centrifugation force and time, as well as the association of the Cushion Fluid® centrifugation on sperm selection by gradients Mini Percoll® modified by evaluating morphological and functional characteristics, ROS formation, antioxidant defenses, rate of in vitro fertilization and embryo development. Three experiments carry out. In experiment I, a pool containing two semen Bos taurus taurus bulls was subjected Mini Percoll® separation method, samples being divided into four groups, with two centrifugal forces (2200 or 9000 X g) and two times (1 and 3 min). In experiment II and III, the pool has been processed by the Mini Percoll® modified method, being added to an amount of 150μLix of Cushion Fluid® (Minitübe, Tiefenbach, Germany) in the second centrifugation in the treated group. Morphofunctional and biochemical evaluation of semen samples for IVF, as well as the fertilizing capacity and embryo development of oocytes fertilized with sperms were selected performed. In the first experiment an improvement was observed in the vigor of sperm after gradient Mini Percoll® for all treatments. In the second experiment, the recovery rate sperm did not differ between treatments (T1: 42.0 ± 4.9 and T2 (with adding Cushion Fluid® the second centrifugation): 38.6 ± 3.6). In sperm morphology T2 (5.1 ± 1.1) showed a lower sperm rate with major defects than T0 (Pre-Percoll) and T1 (8.8 ± 0.8 and 5.8 ± 1.0 treatments ). In this same experiment, ROS levels were presented increased (P <0.05) in the medium with Cushion Fluid® (T2), however, the evaluation of antioxidant defenses did not differ between treatments. In experiment III, no differences in fertilization rate were observed. This study demonstrated that the use of a smaller force and time (2200 X g / 1 min.) to centrifugation can be used without interfering with the sperm recovery rate. The use of the medium Cushion Fluid® during centrifugation of bovine sperm did not influence the fertilization rate and embryo development to 48 hours.

O presente estudo teve como objetivos comparar o sêmen de cães jovens e senis, por avaliação morfo-funcional, estresse oxidativo e quantificação de produtos avançados de glicação (AGEs); comparar a congelabilidade seminal de cães jovens e senis e verificar a ação dos produtos avançados de glicação, oxidação proteica e estresse oxidativo na criopreservação seminal de cães senis. Foram selecionados 22 cães, alocados em dois grupos experimentais de acordo com a idade: Grupo Jovem (n=11) e Grupo Senil (n=11). Os grupos foram adicionalmente subdivididos em Grupo Sêmen Fresco e Grupo Sêmen Criopreservado. A divisão etária foi realizada de acordo com o porte dos animais, sendo porte pequeno considerado senil a partir de 8 anos de idade, porte médio a partir de 7 anos de idade e porte grande acima de 6 anos de idade. Independentemente do porte, os cães jovens em idade reprodutiva foram considerados entre 1 e 5 anos de idade. O Grupo Fresco foi submetido a avaliações seminais imediatas, incluindo volume, cor, aspecto do ejaculado, concentração espermática e análise computadorizada da motilidade (CASA). Logo após, foram realizadas avaliações morfo-funcionais, incluindo atividade mitocondrial dos espermatozoides, estresse oxidativo lipídico, estresse oxidativo proteico, dosagem de produtos avançados de glicação e dosagem de concentração proteica, citometria de fluxo utilizando as sondas fluorescentes para a avaliação espermática da integridade de membrana plasmática e acrossomal e de potencial de membrana mitocondrial e análise de fragmentação de DNA. O Grupo Congelado foi submetido ao protocolo de congelação em uma etapa e após, no mínimo uma semana, as amostras foram descongeladas a 37ºC por 30 segundos e, então, avaliadas quanto à concentração espermática, análise computadorizada da motilidade (CASA) e as mesmas avaliações morfo-funcionais realizadas para o Grupo Jovem. Como resultados, os machos do Grupo Jovem apresentaram maior escore de libido, parâmetros da motilidade espermática, alta atividade mitocondrial dos espermatozoides e menores valores de atividade mitocondrial média, defeitos espermáticos totais, defeitos espermáticos maiores e gota citoplasmática proximal. No sêmen fresco, o Grupo Jovem obteve maiores valores de integridade da membrana acrossomal dos espermatozoides e baixo potencial de membrana mitocondrial, assim como menores valores de integridade da membrana plasmática e acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial. No sêmen descongelado, o Grupo Jovem apresentou maiores valores de integridade de membrana acrossomal dos espermatozoides. No sêmen de cães jovens, o Sub-grupo Fresco obteve maiores valores de integridade de membrana acrossomal e integridade de membrana acrossomal com lesão de membrana plasmática. No sêmen de cães senis, o Sub-grupo Fresco apresentou maiores valores de integridade de membrana acrossomal, integridade de membrana plasmática e acrossomal e alto potencial de membrana mitocondrial, assim como menor porcentagem de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial. Na comparação entre os sub-grupos, houve maiores valores para parâmetros da motilidade espermática, integridade de membrana plasmática com lesão de acrossomo, médio potencial de membrana mitocondrial, integridade de membrana plasmática, alta atividade mitocondrial e estresse oxidativo no Sub-grupo Descongelado, além de maiores valores de amplitude de deslocamento lateral da cabeça, espermatozoides estáticos, lesão de membrana acrossomal e plasmática, média atividade mitocondrial e concentração de proteínas no pellet de espermatozoides. A partir de tais resultados, é possível concluir que o sêmen de cães senis apresenta qualidade inferior ao de cães jovens, bem como reduzida congelabilidade. Nos cães senis, possivelmente, a falha na eliminação da gota citoplasmática dos espermatozoides promova disfunções mitocondriais, culminando na alteração da motilidade espermática. Por fim, as avaliações de parâmetros oxidativos não se mostram acuradas para a avaliação do impacto da senescência reprodutiva. / This study aimed to compare the semen of young and senile dogs, through the evaluation of morphological and functional attributes, oxidative stress and quantification of advanced glycation ending products (AGEs); compare the seminal freezability of young and senile dogs and evaluate the effects of advanced glycation ending products, oxidation protein and oxidative stress on seminal cryopreservation of senile dogs. Twenty two dogs were selected and allocated into two experimental groups according to their age: Young Group (n=11) and Senile Group (n=11). These groups were additionally divided into Fresh Semen Group and Frozen Semen Group. Age distribution was performed according to the size of the animals, being small animals considered senile from 8 years of age onwards, medium size from 7 years old and large size over 6 years old. Regardless of the body size, dogs were considered young if they were at reproductive maturity from 1 to 5 years old. The Fresh Group was subjected to immediate seminal assessments, including volume, color, aspect of the ejaculate, sperm concentration and computer analysis of sperm motility (CASA). Then morpho-functional assessments were carried out, including sperm mitochondrial activity, lipid oxidative stress, protein oxidative stress, dosage of advanced glycation ending products and of protein concentration, flow cytometry using fluorescent probes to evaluate plasmatic and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential and DNA fragmentation analysis. The semen from the Frozen Group was submitted to one step freezing protocol and samples were thawed after not less than 1 week at 37°C for 30 seconds and evaluated for sperm concentration, motility computerized analysis (CASA) and same the morpho-functional analysis performed for the Young Group. Male dogs from the Young Group presented higher libido score, parameters of sperm motility, percentage of sperm with high mitochondrial activity and lower percentage of sperm of medium mitochondrial activity, total spermatic defects, major spermatic defects and proximal cytoplasmic droplet. For the fresh semen of the Young Group, higher values of acrosomal membrane integrity and low mitochondrial membrane potential, as well as lower values of plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential were noticed. In the post-thaw semen, the Young Group showed higher values of spermatic acrosomal membrane integrity. For the semen of young dogs, the Fresh Group had higher values of acrosomal membrane integrity and acrosomal membrane integrity with plasma membrane damage. In the semen of senile dogs, the Fresh Group presented higher values of acrosomal membrane integrity, plasma and acrosomal membrane integrity and high mitochondrial membrane potential, as well as lower percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential. Comparing sub-groups, higher values for sperm motility parameters, plasma membrane integrity with acrosome injury, medium mitochondrial membrane potential, plasmatic membrane integrity, high mitochondrial activity and oxidative stress was noticed for the Thawed group, as well as greater values of lateral displacement amplitude of the sperm head, static spermatozoa, acrosomal and plasmatic membrane lesions, medium mitochondrial activity and protein concentration in the spermatozoa pellet. Based on the present results, it is possible to conclude that the semen of senile dogs presents inferior quality compared to young dogs, as well as less freezability. The possible failure to eliminate the sperm cytoplasmic droplet in senile dogs sperm promotes mitochondrial dysfunctions, culminating to alterations on sperm motility. Finally, the evaluation of oxidative parameters is not feasible for the impact evaluation of reproductive senescence.

Aunque el cultivo de langostino blanco genera cuantiosas divisas en el norte del Perú, la aplicación de tecnologías como la criopreservación, la cual conlleva múltiples ventajas en relación al mejoramiento genético y la conservación de la biodiversidad, aún no han sido implementadas. El objetivo del presente estudio fue desarrollar protocolos optimizados de vitrificación para la criopreservación el espermatóforo y la masa espermática de Litopenaeus vannamei. Inicialmente se evaluó la sobrevivencia espermática en tres soluciones de extensión: solución salina libre de calcio (SS Ca-free), solución de Ringer (SR) y solución buffer fosfato (SBP), con la finalidad de obtener el mejor medio dilutor. Para la formulación de la solución crioprotectora se evaluó la citotoxicidad de 4 crioprotectores permeables: dimetilsulfóxido (DMSO), metanol (MeOH), 2-propanol y dicloruro de magnesio (MgCl2) a las concentraciones de 10, 15, 20 y 30% (v/v) durante 15, 30 y 60 min de exposición; 4 crioprotectores no permeables: leche descremada (10%), polietilenglicol (5%), manitol (5%) y sacarosa (0.2 M); y la suplementación con soluciones complejas: yema de huevo, extracto crudo de Aloe vera, suero bovino fetal y suero de ternero al 10%. La viabilidad espermática fue determinada mediante la técnica de tinción vital con eosina-nigrosina. De acuerdo con los resultados obtenidos se concluye que la vitrificación de espermatozoides de Litopenaeus vannamei es eficiente considerando que las soluciones compuestas por SS Ca-free, MgCl2 15%, extracto de Aloe vera 10%, leche descremada 10% y 5%, durante 30 y 15 min de exposición resultaron en porcentajes de viabilidad espermática post-descongelamiento de 85.12 ± 4.69% para el espermatóforo y 72.24 ± 17.50% para la masa espermática, respectivamente. Adicionalmente, la fertilidad de los espermatozoides criopreservados con extracto de Aloe vera fue confirmada mediante inseminación artificial (IA), observándose individuos normales hasta la fase de nauplio. En la presente investigación se reporta por primera vez el uso del extracto de Aloe vera como crioprotector en la formulación de protocolos de criopreservación de crustáceos. Los protocolos de criopreservación descritos en esta tesis son los primeros reportados para langostinos en el Perú. / Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Perú). Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt) / Tesis

Orientador: Marion Burkhardt de Koivisto / Banca: Letícia Zoccolaro Oliveira / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Resumo: O objetivo deste trabalho foi verificar as alterações que ocorrem nas células espermáticas durante o processo de criopreservação nas diferentes subespécies Bos taurus e Bos indicus. Analisou-se o ejaculado de 20 animais (10 de cada subespécie) quanto à motilidade, morfologia espermática, integridade de membrana plasmática e acrossoma, peroxidação lipídica, condensação da cromatina e morfometria da cabeça do espermatozoide no sêmen fresco e após criopreservação/descongelamento. Nas avaliações com sêmen fresco, a subespécie Bos taurus mostrou resultados de motilidade superior quando comparada aos zebuínos (68,00%±6,32% e 63,00%±4,83% respectivamente, p<0,05). Os animais europeus mostraram melhor congelabilidade do sêmen, pois seus espermatozoides, de maneira geral, foram menos afetados pelo processo de criopreservação (B. taurus - Motilidade (%): 38,00±7,88, HIPO (%): 40,4±6,45, Área: 11556,14±2055,46, Perímetro: 25,17±1,87, Largura: 5,22±0,96, Fourier 2: 7867,27±1965,47; B. indicus - Motilidade: 30,00±4,71, HIPO: 27,5±6,98, Área: 12416,06±2232,06, Perímetro: 26,02±2,02, Largura: 5,31±0,97, Fourier 2: 8536,77±2058,21). Foi observado que a criopreservação causa danos em todas as estruturas espermáticas, independentemente da subespécie, indicando que avanços nesta técnica ainda são necessários / Abstract: This study aimed to verify the changes that occur in sperm cells during the process of cryopreservation between the different subspecies Bos taurus and Bos indicus. Semen from 20 animals (10 of each subspecies) fresh and after cryopreservation / thawing, were analyzed for motility, sperm morphology, plasma membrane and acrosome integrity, lipid peroxidation, chromatin condensation and sperm head morphology. The fresh semen evaluations results of the subspecies Bos taurus showed higher motility when compared to Zebu (68.00% ± 6.32% and 63.00% ± 4.83% respectively). European animals showed better freezability semen, in general, because their sperm were less affected by the cryopreservation process (B. taurus - Motility (%): 38.00 ± 7.88, HYPO (%): 40.4 ± 6.45, Area : 11556.14 ± 2055.46, Perimeter: 25.17 ± 1.87, Width: 5.22 ± 0.96, Fourier 2: 7867.27 ± 1965.47;1 B. indicus - Motility: 30.00 ± 4.71, HYPO: 27.5 ± 6.98, area: 12416.06 ± 2232.06, Perimeter: 26.02 ± 2.02, Width: 5.31 ± 0.97, Fourier 2: 8536.77 ± 2058.21). It was observed that cryopreservation damages all sperm structures, regardless of subspecies, indicating that improvements in this technique are still needed / Mestre

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen eqüino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas, pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu- Crio® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio® ,isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico. / During semen cryopreservation, sperm cells were submitted to some deleterious events leading to membrane damage which result in fertility decrease. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing rates and the use of two commercial extenders as cryoprotectants (FR-5® and Botu-Crio®) on the total and progressive motility, integrity and functionality of spermatic membranes during the cryopreservation of equine semen. Twenty ejaculates were analyzed. The total and progressive motility of fresh and postthawing semen samples were evaluated by the patterns assays. The function of plasmatic membrane was measured by the hipoosmotic swelling test. The integrity of plasmatic membrane was evaluated using CFDA/PI fluorescent probes. There were significant differences between the two freezing techniques and/or between cryoprotectants for all assessed parameters. The combined used between Botu-Crio® and automated curves showed better results in total and progressive post-thawing motility. The extender Botu-Crio®, alone, showed better results in order to preserve the membrane integrity and function.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-25T09:51:00Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 467608 bytes, checksum: 415cfc97bb8e785d82d9258a9338dec2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T09:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 467608 bytes, checksum: 415cfc97bb8e785d82d9258a9338dec2 (MD5) Previous issue date: 2015-11-19 / Análises seminais por meio da associação de sondas fluorescentes possibilitam a avaliação dos diversos compartimentos da célula espermática, simultaneamente, oferecendo um prognóstico mais acurado frente ao caráter subjetivo de alguns testes de rotina. Neste estudo foi utilizada a associação de três sondas fluorescentes com objetivo de avaliar a integridade da membrana plasmática (iodeto de propídio e Hoechst 33342) e o potencial de membrana mitocondrial (MitoTracker red), em sêmen fresco e descongelado de cão. Os resultados obtidos foram comparados aos resultados dos testes de rotina. Todos os testes demonstraram capacidade em detectar queda de qualidade seminal pós- descongelamento. A associação das sondas fluorescentes iodeto de propídio (IP), Hoechst 33342 (H33342) e MitoTracker red (CMXRos) mostrou-se eficaz na distinção de diferentes populações de espermatozoides em ejaculados descongelados de cão doméstico. Foram distintas 4 populações: IC (membrana plasmática íntegra e com potencial de membrana mitocondrial), IS (membrana plasmática íntegra e sem potencial de membrana mitocondrial), LC (membrana plasmática lesada e com potencial de membrana mitocondrial) e LS (membrana plasmática lesada e sem potencial de membrana mitocondrial). Esta associação permitiu também quantificar e qualificar as injúrias causadas às membranas plasmáticas das células espermáticas, pelo processo de congelamento/descongelamento, nesta espécie. Foi observada correlação (p<0,05) entre a coloração das sondas fluorescentes e a avaliação da motilidade espermática e teste hiposmótico. Desta forma, sugere-se a inclusão da combinação de sondas fluorescentes nos protocolos de análise de sêmen, como teste complementar aos testes convencionais, tornando mais precisa a avaliação das injúrias à célula espermática desta espécie. Entretanto, nem os testes de rotina e nem as sondas fluorescentes são hábeis em predizer a capacidade do espermatozoide de ligar-se ao ovócito, evento crucial para a fecundação. Assim, faz-se importante a adoção de testes de ligação entre espermatozoides e ovócitos nas pesquisas referentes à avaliação dos protocolos de congelamento/descongelamento do sêmen. Embora o status metabólico dos ovócitos, assim como o efeito fêmea, limitem a exatidão das interpretações, tem-se buscado substratos de ligação mais homogêneos e de mais fácil obtenção. Neste contexto, a membrana perivitelina do ovo de galinha (MPOG) tem se demonstrado eficiente na avaliação da capacidade de ligação do sêmen em diversas espécies. O teste de ligação de espermatozoides à MPOG apresenta comportamento semelhante aos resultados dos testes de rotina da avaliação do sêmen, assim como os testes com as sondas fluorescentes, apresentando diferença quando comparados sêmen fresco e sêmen descongelado (p<0,05). Neste estudo, o teste hiposmótico correlacionou-se positivamente com o número de espermatozoides ligados à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha. O comportamento da MPOG e das sondas, entre os tratamentos, demonstraram sensibilidade da membrana em distinguir sêmens de diferentes potenciais de ligação (p < 0,05) nesta espécie. / Seminal analysis by means of the association of fluorescent probes allows for the simultaneous evaluation of several compartments of the spermatic cell, offering a more accurate prognostic when compared to the subjective character of some routine tests. In this study, the association of three fluorescent probes was used with the goal of evaluating the integrity of plasma membrane (propidium iodide and Hoechst 33342) and mitochondrial membrane potential (Mito Tracker red), in dog semen, both fresh and frozen. The attained results were compared to those of routine tests. All tests showed the capacity of detecting a drop in seminal quality after being unfrozen. The association of the fluorescent probes propidium iodide (IP), Hoechst 33342 (H33342) and Mito Tracker red (CMXRos) showed efficiency when differentiating sperm populations in the frozen semen of domestic dogs. There were four distinct populations: IC (intact plasma membrane and with mitochondrial membrane potential), IS (intact plasma membrane without mitochondrial membrane potential), LC (injured plasmatic membrane with mitochondrial membrane potential) and LS (injured plasmatic membrane without mitochondrial potential). This association also allows the quantification and qualification of the injuries caused on the sperm cell by the freezing/thawing process in this species. A correlation was observed between the coloring of the fluorescent probe and the evaluation of sperm motility and hypo- osmotic swelling test (p<0,05). However, the attained results with the probes showed a higher precision rate when detecting injuries to the spam cells thus suggesting the inclusion of the combination of fluorescent probes in semen analysis protocols, once evidence shows greater efficiency when compared to routine tests. Consequently, the inclusion of the combination of the fluorescent probes in the semen analysis is suggested as a complementary test, making the evaluation of the injuries to the spermatic cell of this species more precise. However, neither the routine tests nor the fluorescent probes are capable of predicting spermatozoon’s capability to bind to the oocyte, an crucial event to fecundation. Therefore, it is important to introduce biding assays between spermatic cells and oocytes in the research that refer to the evaluation of the freezing/ thawing semen protocols. Although the oocytes metabolic status, like the ‘’female effect’’, limit the accuracy of the interpretations, substrate binding that are more homogeneous and easier to obtain are being pursued. In this context, the perivitelline layer of the egg yolk has demonstrated to be efficient in evaluating the binding capacity of sperm in a number of species. The binding tests of sperm to the MPOG shows a behavior that is similar to the results obtained from semen’s routine evaluation tests, as well as the test with the fluorescent probes, presenting a difference when comparing fresh with unfrozen semen (p<0,05). In this study, the hypoosmotic test correlated positively to the number of spermatozoon connected to the perivitelline layer of the egg yolk. The behavior the MPOGs and that of the probes, between other treatments, demonstrated the membrane’s sensibility in distinguishing semen of different potential binding (p<0,05) in this species.

Made available in DSpace on 2016-03-15T14:15:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 193.pdf: 2264919 bytes, checksum: c2992c0155b41e4820d083853210e2b7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Introdução: No Brasil, a utilização dos agrotóxicos é extremamente relevante no modelo de desenvolvimento do setor agrícola, em consequência disso, o país é hoje o maior consumidor mundial de agrotóxicos. Grande parte destes agentes apresenta capacidade de desregulação do sistema endócrino humano, resultando em alterações nos níveis de hormônios sexuais, causando efeitos adversos, principalmente sobre o sistema reprodutivo, tais como, câncer de mama e ovário, desregulação de ciclo menstrual, câncer de testículo e próstata, infertilidade, declínio da qualidade seminal e malformação de órgãos reprodutivos. Objetivos: Avaliar a exposição aos agrotóxicos em adultos moradores na área rural do município de Farroupilha, RS, e os possíveis impactos desta exposição nos níveis de hormônios reprodutivos de homens e mulheres e na qualidade do sêmen de adultos jovens. Metodologia: Para atender a estes objetivos gerais, foram realizados dois estudos transversais, com objetivos específicos, populações e metodologias de coleta particulares. No estudo um, foram investigados adultos de ambos os sexos, trabalhadores rurais e seus familiares, com idades compreendidas entre 18 e 69 anos, residentes na área rural do município de Farroupilha, RS. Já no estudo dois, jovens moradores rurais e urbanos, com idade entre 18 e 23 anos participaram da investigação. Foram coletadas amostras de sangue e sêmen para mensurar níveis de atividade de colinesterases, níveis de hormônios sexuais e outros parâmetros bioquímicos, além de parâmetros espermáticos. Também foram aplicados questionários para identificar possíveis fatores associados aos desfechos reprodutivos. (...) Conclusão: Os achados são sugestivos de que exposições crônicas a agrotóxicos interferem na regulação dos hormônios sexuais em adultos, bem como na qualidade seminal dos jovens da área rural do município de Farroupilha-RS. (...) / Introduction: In Brazil, the use of pesticides is extremely relevant in the model used of the sector, as a result, the country is the first consumer of pesticides the world nowadays. Most of these agents have the capacity to deregulation of the human endocrine system, resulting in changes in the secretion of sex hormones, causing adverse effects, especially on the reproductive system, such as breast and ovarian cancer, disruption of the menstrual cycle, testicular cancer and prostate, infertility, decline in sperm quality and malformation of reproductive organs. Objectives: To evaluate the pesticide exposure among adults living in the rural area of Farroupilha, RS city and the possible impacts of this exposure on the levels of reproductive hormones in men and women and in semen quality of young adults. Methodology: To answer general questions, two cross-sectional studies, with specific objectives, methodologies and populations were performed. In the first study, adults of both sexes, rural workers and their families, aged between 18 and 69 years, living in the rural area of Farroupilha, RS were investigated. In the second study, young rural and urban, aged between 18 and 23 years participated in the investigation. Biological samples of blood and semen were collected to measure levels of cholinesterase activities, levels of sex hormones, biochemical levels and sperm parameters. Questionnaires were administered to identify possible factors associated with reproductive outcomes. (...) Conclusion: These findings are suggestive that chronic exposures to pesticides interfere with the regulation of sex hormones in adults, as well as seminal quality of young people from rural area of Farroupilha, RS. (AU)^ien

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:19:01Z : No. of bitstreams: 1 000848335.pdf: 450896 bytes, checksum: 254cf2241fa631bdd6305dfc15135dab (MD5) / O objetivo deste trabalho foi verificar as alterações que ocorrem nas células espermáticas durante o processo de criopreservação nas diferentes subespécies Bos taurus e Bos indicus. Analisou-se o ejaculado de 20 animais (10 de cada subespécie) quanto à motilidade, morfologia espermática, integridade de membrana plasmática e acrossoma, peroxidação lipídica, condensação da cromatina e morfometria da cabeça do espermatozoide no sêmen fresco e após criopreservação/descongelamento. Nas avaliações com sêmen fresco, a subespécie Bos taurus mostrou resultados de motilidade superior quando comparada aos zebuínos (68,00%±6,32% e 63,00%±4,83% respectivamente, p<0,05). Os animais europeus mostraram melhor congelabilidade do sêmen, pois seus espermatozoides, de maneira geral, foram menos afetados pelo processo de criopreservação (B. taurus - Motilidade (%): 38,00±7,88, HIPO (%): 40,4±6,45, Área: 11556,14±2055,46, Perímetro: 25,17±1,87, Largura: 5,22±0,96, Fourier 2: 7867,27±1965,47; B. indicus - Motilidade: 30,00±4,71, HIPO: 27,5±6,98, Área: 12416,06±2232,06, Perímetro: 26,02±2,02, Largura: 5,31±0,97, Fourier 2: 8536,77±2058,21). Foi observado que a criopreservação causa danos em todas as estruturas espermáticas, independentemente da subespécie, indicando que avanços nesta técnica ainda são necessários / This study aimed to verify the changes that occur in sperm cells during the process of cryopreservation between the different subspecies Bos taurus and Bos indicus. Semen from 20 animals (10 of each subspecies) fresh and after cryopreservation / thawing, were analyzed for motility, sperm morphology, plasma membrane and acrosome integrity, lipid peroxidation, chromatin condensation and sperm head morphology. The fresh semen evaluations results of the subspecies Bos taurus showed higher motility when compared to Zebu (68.00% ± 6.32% and 63.00% ± 4.83% respectively). European animals showed better freezability semen, in general, because their sperm were less affected by the cryopreservation process (B. taurus - Motility (%): 38.00 ± 7.88, HYPO (%): 40.4 ± 6.45, Area : 11556.14 ± 2055.46, Perimeter: 25.17 ± 1.87, Width: 5.22 ± 0.96, Fourier 2: 7867.27 ± 1965.47;1 B. indicus - Motility: 30.00 ± 4.71, HYPO: 27.5 ± 6.98, area: 12416.06 ± 2232.06, Perimeter: 26.02 ± 2.02, Width: 5.31 ± 0.97, Fourier 2: 8536.77 ± 2058.21). It was observed that cryopreservation damages all sperm structures, regardless of subspecies, indicating that improvements in this technique are still needed