Tesis por compendio / [EN] In vitro production (IVP) of embryos has multiple applications, including the development of transgenic / genetically modified animals that are of broad utility in the biomedical field and could reach to be so in agriculture. In this sense, the intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with transfected sperm, such as somatic cell nuclear transfer (SCNT) with transfected cells, have proved to be valid strategies to generate animals with stably integrated exogenous DNA, capable of transmitting to their offspring. However, to make it feasible the availability of a large number of IVP embryos it's necessary. Despite the development of IVP systems of pig embryos for these strategies in the last decades, and a high variety of protocols, there are still some critical issues that limit embryonic development and therefore its application on a large scale. The main objective of this thesis has then pursued, optimizing the ICSI and SCNT protocols in order to improve the viability of IVP porcine embryos. The initial approach was to address the study both in vitro maturation (IVM) and oocyte activation within the SCNT frame. To this end, the most efficient electrical activation protocol under our working conditions was selected from among three proposals, and we then studied the effect of serum supplement on IVM medium, noticing that it doesn't increase the development of partenogenetic embryos produced by electrical activation nor of those produced by SCNT. Moreover, and in order to optimize the ICSI technique, different aspects such as Ca2+ concentration in the microinjection medium, sperm pretreatment with Triton X-100 (TX) and the addition of cysteine or caffeine supplements to the in vitro culture (IVC) medium post-ICSI, were studied in order to promote sperm nucleus decondensation and oocyte activation. Noticing that: i) the concentration of Ca2+ did not influence the cleavage rate, or the development of partenogenic embryos from microinjected oocytes without sperm (sham injection); ii) caffeine did not increase either the pronuclear formation neither the subsequent embryo development, in combination with TX sperm pre-treatment it reduced oocyte activation and embryo development rates; iii) the pronuclear formation was not increased by the sperm pre-treatment with TX nor by the cysteine treatment, regardless of the time of the study assessment. / [ES] La producción in vitro (PIV) de embriones goza de múltiples aplicaciones, entre las que cabe destacar la obtención de animales transgénicos/modificados genéticamente que resultan de amplia utilidad en el ámbito biomédico y podrían llegar a resultarlo en el agropecuario. En este sentido, tanto la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) con espermatozoides transfectados, como la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) con células transfectadas, han demostrado ser estrategias válidas para generar animales con ADN exógeno integrado de manera estable, capaces de transmitirlo a su descendencia. Sin embargo, para lograrlo es necesario disponer de un gran número de embriones PIV. A pesar del desarrollo durante las últimas décadas de sistemas de PIV de embriones de porcino para estas estrategias, y la disponibilidad de gran variedad de protocolos, persisten aún ciertos puntos críticos que limitan el desarrollo embrionario y por lo tanto su aplicación a gran escala. El objetivo principal de esta tesis ha perseguido por lo tanto, la optimización de los protocolos de ICSI y SCNT con el fin de mejorar la viabilidad de los embriones PIV de porcino. El planteamiento inicial consistió en abordar el estudio tanto de la maduración in vitro (MIV) como de la activación oocitaria en el marco de la SCNT. Para ello se seleccionó de entre tres propuestas de activación artificial, el protocolo de activación eléctrica (que resultó ser el más eficiente bajo nuestras condiciones de trabajo), y se estudió a continuación el efecto del suplemento de suero en el medio de MIV, constatando que no se incrementaba el desarrollo de embriones partenogenotas producidos mediante activación eléctrica ni de aquellos producidos mediante SCNT. Por otra parte, y con el fin de optimizar la técnica de ICSI se abordaron diferentes aspectos como la concentración de Ca2+ en el medio de microinyección, el pre-tratamiento espermático con Triton X-100 (TX), así como la adición de suplementos de cafeína o cisteína al medio de cultivo in vitro (CIV) pos-ICSI, con el fin de favorecer la descondensación del núcleo espermático y la activación oocitaria. Observando que: i) la concentración de Ca2+ no influyó en la tasa de división, ni en la de desarrollo de embriones partenogenotas procedentes de oocitos microinyectados sin espermatozoide (sham injection); ii) la cafeína no incrementó la formación pronuclear ni en el desarrollo embrionario posterior, y en combinación con el pre-tratamiento espermático con TX redujo la activación oocitaria y el desarrollo embrionario; iii) la formación pronuclear no se vio incrementada por el pre-tratamiento espermático con TX ni por el tratamiento con cisteína, independientemente del momento de la evaluación estudiado. / [CA] La producció in vitro (PIV) d'embrions gaudeix de múltiples aplicacions, entre les quals cap assenyalar l'obtenció d'animals transgènics/modificats genèticament que resulten d'àmplia utilitat en el àmbit biomèdic y podrien arribar a ser-ho en el àmbit agropecuari. En aquest sentit, tant la injecció intracitoplasmàtica d'espermatozoïds (ICSI) amb espermatozoïds transfectats, com la transferència nuclear de cèl.lules somàtiques (SCNT) amb cèl.lules transfectades, han demostrat ser estratègies vàlides per a l'obtenció d'animals amb ADN exogen integrat de manera estable, capaços de transmetrela a la seva descendència. No obstant això, per aconseguir-ho és necessari disposar d'un gran nombre d'embrions PIV. Malgrat el desenvolupament durant les últimes dècades de sistemes de PIV d'embrions de porcí per a aquestes estratègies, i la disponibilitat de gran varietat de protocols, persisteixen encara certs punts crítics que limiten el desenvolupament embrionari i per tant la seva aplicació a gran escala. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha perseguit per tant, l'optimització dels protocols d' ICSI i SCNT per tal de millorar la viabilitat dels embrions PIV de porcí. El plantejament inicial va consistir en abordar l'estudi tant de la maduració in vitro (MIV) com de l'activació oocitària en el marc de la SCNT. Per a això es va seleccionar entre tres propostes d'activació artificial, el protocol d'activació elèctrica (que va resultar ser el més eficient sota les nostres condicions de treball), i es va estudiar a continuació l'efecte del suplement de sèrum en el medi de MIV, constatant que no va incrementar el desenvolupament d'embrions partenogenotes produïts mitjançant activació elèctrica ni d'aquells produïts mitjançant SCNT. D'altra banda, i per tal d'optimitzar la tècnica de l'ICSI es van abordar diferents aspectes com la concentració de Ca2 + en el medi de microinjecció, el pretractament espermàtic amb Triton X-100 (TX), així com l'addició de suplements de cafeïna o cisteïna al mitjà de cultiu in vitro (CIV) pos-ICSI, per tal d'afavorir la descondensació del nucli espermàtic i l'activació oocitària. Observant que: i) la concentració de Ca2+ no va influir en la taxa de divisió, ni en la de desenvolupament d'embrions partenogenotes procedents d'oòcits microinjectats sense espermatozoïd (sham injection); ii) la cafeïna no va incrementar la formació pronuclear ni en el desenvolupament embrionari posterior, i en combinació amb el pretractament espermàtic amb TX va reduir l'activació oocitària i el desenvolupament embrionari; iii) la formació pronuclear no es va veure incrementada pel pretractament espermàtic amb TX ni pel tractament amb cisteïna, independentment del moment de l'avaluació estudiat. / García Mengual, ME. (2016). OPTIMIZACIÓN DE LAS ESTRATEGIAS REPRODUCTIVAS DE MICROMANIPULACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES PORCINOS [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61448 / Compendio

Bothrops atrox é uma serpente de grande importância ecológica devido a sua ampla distribuição geográfica no vasto e diversificado habitat amazônico. Informações sobre a biologia reprodutiva de B. atrox são escassas e pontuais, sendo a maioria dos dados provenientes de serpentes mantidas em cativeiro. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo descrever o ciclo reprodutivo de B. atrox, bem como as estratégias reprodutivas relacionadas a este ciclo tais como: maturidade e dimorfismo sexual, fecundidade, estocagem de espermatozoides e hipertrofia do segmento sexual renal nos machos. Além disso, o trabalho visou ainda relacionar tais estratégias com as condições ambientais (temperatura e precipitação). Para tanto, foram examinados 325 espécimes de B. atrox, sendo machos e fêmeas (maduros e imaturos), provenientes da Amazônia brasileira, preservados em nove coleções herpetológicas. Resultados mostraram haver diferenças relacionadas ao dimorfismo sexual: filhotes machos exibiram a coloração da ponta da cauda amarela, enquanto fêmeas apresentaram a ponta da cauda com coloração escura. Foi também observado que filhotes machos possuíram pigmentação escura na região gular e fêmeas apresentaram coloração clara. As fêmeas adultas foram significativamente maiores que os machos e atingiram a maturidade sexual com maiores tamanhos corpóreos. A vitelogênese foi sazonal (janeiro a agosto), entretanto, não houve sincronia entre a ocorrência de fêmeas prenhes e o período de nascimento dos filhotes. Assim, a extensão observada no ciclo reprodutivo das fêmeas foi possível devido à estocagem de espermatozoides, já que a cópula é sazonal. O ciclo reprodutivo dos machos foi descontínuo, sazonal semi-sincrônico. A produção de espermatozoides ocorreu ao longo do ano, no entanto, a espermiogênese foi observada principalmente no início da estação chuvosa (IEC) e a regressão testicular no início da estação seca (IES). Estocagem de espermatozoides nos ductos deferentes foi observada durante todos os meses do ano e o segmento sexual renal apresentou hipertrofia no IEC e final da estação chuvosa (FEC), sincronizado, portanto com a espermiogênese. Dessa forma, as condições ambientais (temperatura e pluviosidade) foram fundamentais na determinação do tipo de ciclo reprodutivo em B. atrox. Fêmeas prenhes foram encontradas durante vários meses do ano e o pico da atividade testicular ocorreu na estação chuvosa / Bothrops atrox is a snake of large ecological importance due to its wide geographic distribution in the vast and diversified Amazonian habitat. Information about the reproductive biology of B. atrox are scarce and punctual, with most information derived from snakes kept in captivity. Thus, this paper aimed to describe the reproductive cycle of B. atrox, as well as reproductive strategies related to this cycle as: maturity and sexual dimorphism, fecundity, sperm storage, and the hypertrophy of sexual segment of the kidney in males. Moreover, this work also aimed to relate such strategies with environmental conditions (temperature and precipitation). For that, it were examined 325 specimens of B. atrox, being males and females (mature and immature) from the Brazilian Amazon, preserved in nine herpetological collections. Results showed some differences related to sexual dimorphism: neonates males had the coloration of the tail tip yellow, whereas females showed the tail tip with dark coloration. It was also observed that neonate males had dark pigmentation in the throat region, whereas neonate females showed lighter coloration. Adult females were significantly larger than males, and attained sexual maturity at larger body sizes than males. Vitellogenesis was seasonal (January to August), however, there was no synchrony between the occurrence of pregnant females and birth periods. Thus, the extent observed in the female reproductive cycle was possible due to the sperm storage, since mating is seasonal. Male reproductive cycle was discontinuous, seasonal semi-synchronous. Sperm production occurred throughout the year, however, spermiogenesis was observed mainly in the beginning of the rainy season (BRS) and testicular regression in the beginning of the dry season (BRS). Sperm storage in the ductus deferens was observed during all months of the year and the sexual segment of the kidney presented hypertrophy in BRS and in the end of the rainy season (ERS), thus synchronized with spermiogenesis. Therefore, environmental conditions (temperature and rainfall) were essential in determining the type of reproductive cycle of B. atrox. Pregnant females were found during several months of the year and the peak of testicular activity occurred in rainy season

Durante a injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) seleciona-se um espermatozoide móvel e morfologicamente normal para injeção em ovócito maduro. Evidências recentes indicam que mesmo espermatozoides aparentemente normais podem ocultar defeitos em nível molecular. O principal objetivo deste trabalho foi a descrição de um novo método capaz de selecionar espermatozoides maduros a partir de amostras não processadas em procedimento de ICSI. Em um estudo comparativo e prospectivo testou-se uma gota estendida modificada. A \"gota estendida com mecanismo contracorrente\" - GEMC foi montada em uma placa de ICSI padrão a partir de seis gotas de meio de cultivo (10 ?L). O posicionamento e união precisa das gotas deram origem a dois reservatórios e um canal, resultando em um fluxo de líquido através do canal. A adição de uma solução de PVP (polivinilpirrolidona) gerou um gradiente de viscosidade no final do circuito. Amostras seminais foram obtidas de 40 pacientes inférteis. Cada amostra seminal foi dividida em 4 alíquotas: uma alíquota para o processamento por centrifugação em gradiente de densidade (CGD), uma alíquota para a GEMC utilizando amostras não processadas, uma alíquota para a GEMC utilizando amostras processadas e uma alíquota para controle. Nos grupos GEMC uma média de 200 espermatozoides foram consecutivamente coletados, sem seleção, no reservatório de captura utilizando-se uma micropipeta de injeção como no procedimento convencional de ICSI. A morfologia espermática foi avaliada e demonstrou melhora, comparando-se com os controles, em todos os tratamentos utilizados. A imaturidade da cromatina foi avaliada utilizando-se o teste do azul de anilina. Em relação à imaturidade, 100% dos homens obtiveram melhores resultados tanto após o preparo por CGD quanto utilizando o método GEMC. Isto se refletiu em uma redução das formas imaturas de 28.65 ± 8.97% no sêmen fresco para 17.29 ± 7.72% após processamento por CGD (P < 0.01). Uma redução ainda maior nas formas imaturas foi obtida após o método GEMC quando comparado com o processamento por CGD: 0.89 ± 1.31% (P < 0.01) utilizando-se sêmen fresco e 1.05 ± 1.63% (P < 0.01) utilizando-se amostras processadas. Um novo método unindo seleção e captura de espermatozoides em um mesmo procedimento de ICSI foi descrito e testado. O método GEMC seleciona espermatozoides de forma fácil e permite o uso direto de amostras não processadas em procedimentos de ICSI. Este método seleciona espermatozoides maduros com mais eficiência do que o processamento por CGD. Novos estudos são necessários para se analisar o impacto do método nas taxas de fertilização, desenvolvimento embrionário, gravidez, implantação e abortamento / During intracytoplasmic sperm injection (ICSI) a motile spermatozoon with normal morphology is visually selected for insemination of an oocyte. Recent evidence indicates that even though the sperm appears morphologically normal, a possibility of defects at the molecular level still exists. The main objective of this work was to describe a novel approach capable of selecting mature spermatozoa from unprocessed semen sample in a one-step ICSI procedure. A modified extended drop was tested in a prospective comparative study. The \"Gota Estendida com Mecanismo Contracorrente - GEMC\" (Positive Rheotaxis Extended Drop - PRED) was assembled on a standard ICSI dish and consisted of six culture medium droplets (10 ?L). The precise merging of the drops created two reservoirs and a channel therefore the fluid flew through the channel. The addition of a PVP solution created a viscosity gradient in the final sector of the circuit. Semen samples were taken from 40 subfertile men. Each semen sample was divided into four aliquots: one aliquot for density gradient centrifugation (DGC), one aliquot for GEMC using fresh semen, one aliquot for GEMC using processed semen and one aliquot for the control. In GEMC a mean of 200 spermatozoa were collected consecutively, without selection, from the outlet reservoir with an injecting pipette as for conventional ICSI procedure. Sperm morphology was assessed and resulted in improvement compared to controls in all treatments. Chromatin immaturity was assessed using aniline blue assay. Regarding to chromatin immaturity, 100% of men had better results after DGC preparation and GEMC approach. This was reflected in a mean reduction from 28.65 ± 8.97% uncondensed chromatin in the native ejaculates to 17.29 ± 7.72% in DGC processed semen (P < 0.01). An even greater reduction was achieved after GEMC approach showing a mean of 0.89 ± 1.31% uncondensed chromatin compared to DGC processed sample (P < 0.01). A novel one-step ICSI approach joining sperm selection and recovery was developed and tested. This GEMC approach can select sperm easily and permits the direct use of native semen in ICSI. This approach can select sperm with lower chromatin immaturity than DGC method. Further studies need to access its relation to fertilization, embryo development, pregnancy, implantation and miscarriage rates

Incrementar a eficiência do processo de refrigeração do sêmen é de grande interesse na reprodução da espécie equina, à medida que a população de equinos cresce, também aumenta a demanda para a comercialização e transporte de sêmen refrigerado. Esse trabalho foi realizado para verificar os efeitos de diferentes diluidores para refrigeração de sêmen equino a 5°C sobre a cinética, membranas, morfologia e cromatina espermáticas durante 12 horas de armazenagem. Foram utilizados quatro ejaculados de quatro garanhões de diferentes raças, colhidos em intervalos semanais. Imediatamente após a colheita, o sêmen in natura foi avaliado quanto ao movimento espermático utilizando-se o sistema computadorizado de análise espermática (CASA), integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando-se sondas fluorescentes (PI, H342, FITCPSA e JC-1, por microscopia de epifluorescência), morfologia espermática por microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) e desnaturação da cromatina pela coloração de Azul de Toluidina. Logo após as análises, o sêmen foi diluído usando-se três diluidores diferentes: SMT, à base de leite desnatado e meio de Tyrode (adaptado de: PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, diluidor contendo BSA (adaptado de: GIBB et al., 2011) e SMK, à base de leite desnatado (KENNEY et al., 1975; controle), em seguida foi envasado em bisnagas na concentração de 50 x 106 sptz/mL e refrigerado a 5°C em caixas BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP), durante um período de 12 horas. O sêmen foi analisado 5 minutos após a diluição (T0), 4 (T4), 8 (T8) e 12 horas (T12) após a refrigeração quanto ao movimento espermático, integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, morfologia espermática e desnaturação da cromatina. A análise estatística foi realizada empregando-se o programa computacional Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.). Para todas as variáveis foi utilizada a análise de variância (ANOVA). Para comparação das médias, foi utilizado o método de Tukey sendo considerado o nível de significância de 5%. Foram observadas interações entre tempo X tratamento para a maioria das características de cinética espermática. Dentre os efeitos encontrados dos diluidores, destaca-se que SMT e SMK foram superiores na preservação das motilidades total e progressiva e porcentagem deespermatozoides rápidos em detrimento ao diluidor BSAG. Quanto à preservação das membranas o diluidor SMT (56,6±18,7%) foi significativamente superior ao SMK (49,6±18,6%), que por sua vez foi superior ao BSAG (25,8±14,8%) quanto à porcentagem de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal íntegras e alto potencial mitocondrial (PIAIA). Comportamento semelhante foi observado para o percentual de membrana plasmática e de potencial de membrana mitocondrial. Contrariamente, a membrana acrossomal não foi afetada pela refrigeração do sêmen a 5ºC por até 12 horas independente do diluidor. Foi encontrado maior percentual de defeitos totais quando o sêmen foi refrigerado utilizando o diluidor BSAG (50±12,4%) do que SMT (42,6±11,2%) e SMK (41,8±12,4%). Quando se avaliou a cromatina espermática não foram notados efeitos do tempo de refrigeração nem dos diluidores; todavia, ao se comparar com o sêmen in natura notou-se um aumento no percentual de espermatozoides com desnaturação intermediária da cromatina após 12 horas de refrigeração a 5ºC com o diluidor BSAG. Conclui-se que a refrigeração do sêmen equino a 5ºC altera a cinética espermática de forma oscilante entre os diluidores no decorrer do tempo até 12 horas. Os diluidores SMT e o SMK preservam melhor a cinética, integridade de membranas e morfologia espermática do que o diluidor BSAG. / To develop the efficiency of cooling semen is the great advantage in the equine reproduction, as according to the equine population to grow up, too increase the demand to market and transport of cooling semen. This experiment was performed to verify the effects of different extenders to equine cooling semen at 5°C on the sperm kinetic, membranes, morphology and chromatin during 12 hours of storage. Were utilized four ejaculates from four stallions of different breeds, collected a week. Immediately after the collection, the in natura semen was evaluated as the sperm movement using the Computer-Assisted Semen Analysis (CASA), integrity of plasma and acrossomal membranes and mitochondrial membrane potential, using the fluorescent probes (PI, H342, FITC-PSA and JC-1, by epifluorescência microscopy), sperm morphology by microscopy of differential interference contrast (DIC) and chromatin denaturation by Toluidine blue. As soon as finished the analyses, the semen was diluted using three different extenders: SMT, skim milk based and Tyrode medium (adapted from PADILLA; FOOTE, 1991), BSAG, extender containing BSA (adapted from GIBB et al., 2011) and SMK, skim milk based (KENNEY et al., 1975; control), following was packed in flasks at 50 x 106sperm/mL concentration and cooling at 5°C in BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu-SP) box, during 12 hours. The semen was analyzed 5 minutes after dilution (T0), 4 (T4), 8 (T8) and 12 hours (T12) after cooling about sperm movement, plasma and acrossomal membranes integrity and mitochondrial membrane potential sperm morphology and chromatin denaturation. The statistical analysis was performed using Statistical Analysis System (SAS inst. Inc.) software. To all variables was utilized the analysis of variance (ANOVA). To media comparison was utilized the Tukey method, considering the significant level at 5%. Were observed interactions between times X treatment to majority of sperm kinetic characteristic. Among the found effects of the extenders, it was detached that SMT and SMK were superior to preserve total and progressive motility and percentage of rapid sperm in detriment to BSAG extender. It about the membranes preservation the SMT extender (56.6±18.7%) was significantly superior to SMK (49.6±18.6%), which was superior to BSAG (25.8±14.8%) as percentage of sperm with plasma and acrossomal membranes integrity and high mitochondrial potential (PIAIA). Behavior similar was observed to the plasma membrane integrity and potential mitochondrial membrane percentage. Contrary, The acrossomal membrane was not affected by semen cooling at 5ºC until 12 hours independently of the extender. It was found major percentage of defect total to cooling semen using BSAG (50±12.4%) extender compared to SMT (42.6±11.2%) and SMK (41.8±12.4%). When evaluated the sperm chromatin were not found effect of the cooling time neither of the extenders; however, when compared to in natura semen notice an increase on the percentage of spermatozoa with moderate chromatin denaturation after 12 hours of cooling at 5ºC with BSAG extender. It was concluded that the equine semen cooling at 5ºC change the sperm kinetic oscillating way among extenders during the time until 12 hours. The SMT and SMK extenders are better to preserve the sperm kinetic, membranes integrity and morphology than BSAG extender.

A espermatogênese é um processo orquestrado e coordenado pelo qual os espermatozoides são produzidos. Ao final deste processo, o excesso de citoplasma presente nas espermátides é fagocitado, permanecendo um resíduo denominado de gota citoplasmática. Os espermatozoides em fase de maturação apresentam gota, que migra da região proximal para regiões mais distais da célula espermática. Estudos relacionam o remanescente citoplasmático à proteção antioxidante e à ativação metabólica de espermatozoides imaturos. Os mecanimos fisiológicos da maturação e os status oxidativo e metabólico em células epididimárias de bovinos são pobremente elucidados. Desta forma, foram realizados dois experimentos com o objetivo de caracterizar o status oxidativo e metabólico de espermatozoides bovinos durante a maturação espermática, e os possíveis papéis da gota citoplasmática envolvidas nesse processo. Para tal, amostras espermáticas foram recuperadas dos três segmentos epididimários (Cabeça, corpo e cauda) e submetidas às avaliações de cinética espermática (CASA) e testes morfofuncionais. Foram avaliadas as atividades das enzimas antioxidantes SOD e GPx e mensurados os níveis de ATP em cada amostra epididimária. Espermatozoides recuperados da cauda do epidídimo apresentaram maior porcentagem de células móveis e progressivas e elevados níveis de ATP em comparação aos demais grupos. As células provenientes do corpo apresentaram maior susceptibilidade à peroxidação lipídica e membranas plasmática e acrossomal lesionadas. Foi nesse segmento que também observamos a migração da gota e o início da aquisição da motilidade, e correlação negativa entre gota distal e susceptibilidade à peroxidação. Em amostras da cabeça, houve correlação positiva entre produção de EROs e níveis de ATP, e alto PMM; e correlação negativa entre atividade da SOD e susceptibilidade à peroxidação lipídica em amostras da cabeça. Não foram observadas diferenças significativas em relação ao potencial de membrana mitocondrial (PMM) e a atividade da SOD e da GPx entre os diferentes segmentos. Por meio dos principais resultados, pudemos sugerir que as células presentes na cauda do epidídimo apresentam o aparato energético ativo, devido à alta porcentagem de células móveis e níveis de ATP. As amostras provenientes do corpo evidenciam que é neste segmento em que a motilidade se inicia e que ocorre os principais remodelamentos de membrana. As correlações observadas nos permitem inferir que as mitocôndrias de espermatozoides bovinos imaturos já estivessem ativas desde o início da maturação, produzindo energia e EROs. Além disso, a correlação nos mostra o papel protetor da SOD contra à peroxidação lipídica. Paralelamente, sugerimos que a gota participe firmemente da ativação da motilidade e desempenhe papel antioxidante contra as EROs. Assim, concluímos que as modificações celulares inerentes ao processo de maturação e a presença da gota citoplasmática sejam cruciais no status oxidativo e metabólico de espermatozoides bovinos imaturos, afim desenvolver a capacidade fecundante do espermatozoide. / Spermatogenesis is an orchestrated and coordinated process by which sperm are produced. In the end of this process, the excess cytoplasm present in the spermatids is phagocytosed, remaining a called cytoplasmic droplet. Spermatozoa in the stage of maturation present cytoplasmic droplet, which migrates from the proximal region to more distal regions in sperm cell. Studies relate the cytoplasmic remnant to the antioxidant protection and to metabolic activation of immature sperma. The physiological mechanisms of maturation and the oxidative and metabolic status of bovine epididymal cells are poorly elucidated. Thus, two experiments aimed to characterize the oxidative and metabolic status of bovine sperm during epididymal maturation, and the possible cytoplasmic droplet roles involved in this process. For this, sperm samples were recovered from the three epididymal segments (Caput, corpus and cauda) and submitted to spermatic kinetics analysis (CASA) and morphofunctional tests. The activities of the antioxidant enzymes SOD and GPx were evaluated and the levels of ATP in each epididymal sample. Sperm cells recovered from the cauda of the epididymis showed a higher percentage of motile and progressive cells and high levels of ATP compared to the other groups. Cells from the corpus showed elevated susceptibility to lipid peroxidation and lesioned plasma and acrosomal membranes. It was in this segment that we also observed the migration of cytoplasmic droplet and the beginning of the acquisition of motility, and negative correlation between distal droplet and susceptibility to peroxidation. In samples from the caput, there was a positive correlation between ROS production and ATP levels, and high PMM; and negative correlation between SOD activity and susceptibility to lipid peroxidation in caput samples. No significant differences were observed in relation to mitochondrial membrane potential (PMM) and SOD and GPx activity among the different segments.By means of the main results, we could suggest that cells present in the cauda of the epididymis present the active energy apparatus, due to the high percentage of mobile cells. Samples from the corpus show that is in this segment that the motility begins and the main membrane remodeling occurs. The observed correlations allow us to infer that mitochondria of immature bovine sperm are already active since the beginning of maturation, producing energy and ROS. In addition, the correlation shows us the protective role of SOD against lipid peroxidation. In parallel, we suggest that cytoplasmic droplet participates firmly in the activation of motility and plays an antioxidant role against ROS. Thus, we conclude that the cellular modifications inherent in the sperm maturation process and the presence of cytoplasmic droplet are crucial in the oxidative and metabolic status of immature bovine spermatozoa, in order to develop fecundant capacity.

Do ponto de vista da produtividade, a fertilidade é um dos parâmetros de maior importância em um rebanho bovino comercial e esta é influenciada por vários fatores, entre eles estão as condições do trato reprodutivo das fêmeas e a qualidade do sêmen utilizado. O influxo de células inflamatórias no local da deposição do sêmen logo após a inseminação artificial (IA) pode ser intensificada na presença de maior número de espermatozoides lesados durante a IA, caracterizando uma endometrite. Este estudo foi conduzido em três experimentos. Com o objetivo de comparar os métodos de colheita de material endometrial por escova ginecológica (EU) e lavado uterino (LU), bem como a interferência destes procedimentos na hemodinâmica uterina, foi proposto o Experimento 01, onde pode-se constatar que ambas as técnicas permitem o recolhimento de amostras em quantidade e qualidade suficiente para contagem, e que a porcentagem de células polimorfonucleares obtidas pela técnica LU foi superior a EU. Maior fluxo sanguíneo das artérias uterinas foi encontrado no momento de 4 horas após a realização de LU, sugerindo que este influencia na resposta vascular inflamatória. Para avaliar o efeito da LU após a IA em Tempo Fixo (IATF) na fertilidade dos animais, executou-se o Experimento 02 e constatou-se que não há diferença no índice de prenhez entre os animais submetidos ou não à LU, demonstrando que a técnica não interfere na taxa de fertilidade. Com o intuito de investigar a interferência da qualidade do sêmen na fertilidade, resposta inflamatória e hemodinâmica uterina, foi proposto o Experimento 03, onde foi possível observar influência da qualidade do sêmen sobre a taxa de prenhez, verificou-se maior porcentagem de vacas prenhes quando inseminadas com sêmen com maiores percentuais de espermatozoides apresentando integridade das membranas plasmática e acrossomal e função mitocondrial (PIAIC). Notou-se ainda a ocorrência de endometrite em 65,3 % dos animais, os quais apresentaram taxa de prenhez inferior aos que não apresentaram inflamação. Pode-se concluir que a qualidade do sêmen e a endometrite interferem na taxa de fertilidade bovina. / When productivity is taking into account, fertility is one of the most important parameters in a commercial herd. It is influenced by several factors, especially by the conditions of the female reproductive tract and the quality of the semen used. The influx of inflammatory cells at the site of semen deposition after artificial insemination (AI) can be intensified by the deposition of a greater number of dead spermatozoa during AI, which characterized endometritis. This study was conducted in three different experiments. In order to compare the methods of collection of endometrial sampling by swab using a gynecological brush (GB) or uterine flushing (UF), as well as the interference of these procedures in uterine hemodynamics, we designed experiment 01. Our results reveal that both techniques allow collecting samples with good quality and sufficient quantity to be counted; moreover, the average percentage of polymorphonuclear cells obtained by UF was greater compared to those obtained by GB. It may be noted that the increased blood flow was observed in samples collected four hours after the UF procedure, suggesting that it may have an influence on the vascular inflammatory response. To evaluate the effect of uterine flushing after AIFT on animal fertility we designed the experiment 02. Our results revealed that there is no statistical difference in pregnancy rates between flushed and non flushed animals, showing that the UF does not interfere with fertility rate. Experiment 03 was designed in order to assess the inflammatory response induced by different qualities of semen and their interference on uterine hemodynamic and fertility. There was an influence of semen quality on pregnancy rates: higher percentage of pregnancy was found in the group of cows inseminated with semen with plasma and acrossome membrane integrity and mitochondrial function (PIAIC). Endometritis was noticed in 65.3% of the cows and these animals presented lower pregnancy rate compared to those that did not show an inflammatory response. We concluded that semen quality and endometritis interferes with fertility rate in bovine species.

La présente Thèse représente une importante contribution à la connaissance de l’ultrastructure de la spermiogenèse et du spermatozoïde des Digènes. Nous présentons des nouvelles données spermatologiques concernant huit espèces appartenant à sept familles et superfamilles de Digènes. Ils s’agissent de Brachycoelium salamandrae (Gorgoderoidea : Brachycoeliidae), Diplodiscus subclavatus (Paramphistomoidea : Diplodiscidae), Elstia stossichianum et Wardula capitellata (Microscaphidioidea : Mesometridae), Euryhelmis squamula (Opisthorchioidea : Heterophyidae), Mediogonimus jourdanei (Microphalloidea : Prosthogonimidae), Robphildollfusium fractum (Lepocreadioidea : Gyliauchenidae), et Rubenstrema exasperatum (Plagiorchioidea : Omphalometridae). Les résultats obtenus sur la spermiogenèse et/ou le spermatozoïde sont comparés avec le reste de Digènes. De plus, nous discutons de l’importance de certains caractères ultrastructuraux pour une meilleure compréhension des relations phylogénétiques chez les Digènes. La spermiogenèse chez les Digènes est assez homogène. Cependant, il y a certains aspects comme la variabilité du nombre de bandes du corps intercentriolaire et l’angle de rotation flagellaire qui méritent une attention particulière. Concernant le spermatozoïde, nous avons proposé, après une analyse précise des données spermatologiques disponibles, sept modèles de spermatozoïde chez les Digènes. Les caractères du spermatozoïde les plus utiles pour l’établissement de ces modèles sont : (a) le type d’axonème/es (patron 9+‘1’ des Trepaxonemata, 9+‘1’ spécial et 9+0), (b) l’extrémité antérieure du spermatozoïde (avec un ou deux axonèmes), (c) la présence/absence de l’association « expansion latérale+ornementations externes+microtubules corticaux » ou « ornementations externes+microtubules corticaux », (d) la présence ou l’absence d’ornementations externes et leur localisation sur le spermatozoïde, (e) le patron des microtubules corticaux parallèles, absents ou disposés en un ou deux champs, et (f) le caractère terminal dans l’extrémité postérieure du spermatozoïde (noyau, axonème ou microtubules corticaux). D’autres caractères comme les corps épineux ou les boutons cytoplasmiques ornementés peuvent avoir une importance particulière pour certains taxons. La récente description des corps épineux suppose une reconsidération de certaines études anciennes où ces structures peuvent être mal interprétés ou considérés comme des artéfacts. Les boutons cytoplasmiques ornementes sont un nouveau caractère trouvé chez les Mesometridae (E. stossichianum et W. capitellata). Les spermatozoïdes des espèces étudiées dans cette thèse appartiennent aux modèles 1, 2 ou 3. Le modèle 1, caractérisé par la présence de l’association « expansion latérale+ornementations externes+microtubules corticaux », est présent chez Diplodiscus subclavatus, Elstia stossichianum et Wardula capitellata. De plus, la plupart des Echinostomatoidea, Paramphistomoidea et Pronocephaloidea présentent ce modèle. Le modèle 2 est caractérisé par l’association « ornementations externes+microtubules corticaux » et par une extrémité postérieure du spermatozoïde contenant le noyau. Il est présent chez Brachycoelium salamandrae, Robphildollfusium fractum et Rubenstrema exasperatum. Finalement, Euryhelmis squamula et Mediogonimus jourdanei présentent un spermatozoïde du modèle 3 comme chez certains Opisthorchioidea et certaines familles telles que les Allocreadiidae, Deropristidae, Lepocreadiidae et Troglotrematidae. Le modèle 3 diffère du modèle 2 par l’extrémité postérieure contenant un axonème. Le modèle 4 est similaire aux modèles 2 et 3, mais l’extrémité postérieure contient seulement des microtubules corticaux. Il est présent chez les Opecoelidae et Opistholebetidae. Le modèle 5 exhibe un seul champ (ventral) de microtubules corticaux et ne présente pas l’association « ornementations externes+microtubules corticaux ». Il est observé chez les Faustulidae, Hemiuridae et les Lecithasteridae. Le modèle 6 est observé chez les schistosomes. Ils présentent un spermatozoïde aberrant, non filiforme, avec un seul axonème du type 9+‘1’ spécial. Finalement, le modèle 7, caractérisé par la présence d’axonèmes du type 9+0 et par l’absence de microtubules corticaux, est établit seulement pour Didymozoon sp. / The present Thesis represents a contribution to the knowledge about the ultrastructure of spermiogenesis and of the mature spermatozoon of digeneans. We present for the first time spermatological data concerning eight species belonging to seven families and superfamilies: Brachycoelium salamandrae (Gorgoderoidea: Brachycoeliidae), Diplodiscus subclavatus (Paramphistomoidea: Diplodiscidae), Elstia stossichianum and Wardula capitellata (Microscaphidioidea: Mesometridae), Euryhelmis squamula (Opisthorchioidea: Heterophyidae), Mediogonimus jourdanei (Microphalloidea: Prosthogonimidae), Robphildollphusium fractum (Lepocreadioidea: Gyliauchenidae), and Rubenstrema exasperatum (Plagiorchioidea: Omphalometridae). A global analysis of the spermatological characteristics of these species and those already described in the Digenea, allow us to establish seven sperm models within digeneans. The importance of several ultrastructural characteristics, combined with the proposed models are discussed in order to contribute to a better understanding of digenean phylogenetic relationships.

La présente Thèse constitue une contribution à la connaissance de l’ultrastructure de la spermiogenèse et du spermatozoïde chez les Cestodes. Nous y présentons de nouvelles données spermatologiques ultrastructurales d’espèces appartenant à six ordres différents : Acanthobothrium crassicolle Wedl, 1855 (Tetraphyllidea), Aporhynchus menezesi Noever et al., 2010 (Trypanorhyncha), Barsonella lafoni de Chambrier et al., 2009 (Proteocephalidea), Clestobothrium crassiceps (Rudolphi, 1819) (Bothriocephalidea), Echinobothrium euterpes (Neifar et al., 2001) (Diphyllidea) et Molluscotaenia crassiscolex (von Linstow, 1890) (Cyclophyllidea). Les résultats obtenus sur la spermiogenèse et le spermatozoïde sont comparés avec ceux de Cestodes déjà étudiés, spécialement avec ceux appartenant aux ordres objet de notre étude. Enfin, nous discutons sur l’utilité des différents caractères spermatologiques ultrastructuraux en Taxonomie, Systématique et Phylogénie. L’étude spermatologique de Clestobothrium crassiceps constitue le premier travail fait sur le genre Clestobothrium et la onzième espèce de l’ordre Bothriocephalidea récemment créé. Les résultats obtenus sont comparés avec ceux des autres espèces de cet ordre, mais aussi avec ceux des Diphyllobothriidea, l’autre ordre créé à partir de l’ancien ordre des Pseudophyllidea. Concernant la spermiogenèse, les caractères les plus intéressants sont le type II de spermiogenèse et le corps intercentriolaire très réduit. On peut remarquer aussi le type II de spermatozoïde qui présente un anneau de microtubules corticaux, probablement une autapomorphie pour les Bothriocephalidea. L’étude ultrastructurale du Diphyllidea Echinobothrium euterpes montre la formation de deux flagelles de longueur différente. Dans les stades avancés de la spermiogenèse, après la fusion proximodistale, l’axonème court disparaît pour donner naissance à un spermatozoïde présentant un seul axonème. La spermiogenèse est du type I et le spermatozoïde correspond au type IV. Autres caractères intéressants chez les Diphyllidea sont la forte réduction ou absence de microtubules corticaux et la présence de masses denses associées aux centrioles dans la zone de différentiation. Ce dernier caractère peut être une synapomorphie pour les espèces de cet ordre. Aporhynchus menezesi présente un type I de spermiogenèse et un type I de spermatozoïde. Notre étude apporte les premières données chez la superfamille des Gymnorhynchoidea. Nous confirmons chez les Trypanorhyncha l’absence de corps en crête et la présence d’un arc de microtubules corticaux dans le spermatozoïde. L’étude de Acanthobothrium crassicolle est le troisième dans ce genre et confirme le type I de spermiogenèse et le type II de spermatozoïde. Ce type de spermatozoïde constitue la plus importante différence entre les onchobothriidés et les phyllobothriidés. Nous confirmons aussi la présence d’un arc de microtubules corticaux. Cependant, il est observé une hétérogénéité au niveau du corps intercentriolaire chez les Tetraphyllidea-Onchobothriidae. Barsonella lafoni est la septième espèce de l’ordre Proteocephalidea dont l’ultrastructure du spermatozoïde est analysée. Elle montre le patron I pour la spermiogenèse et aussi pour le spermatozoïde. Ces résultats sont concordants avec ceux des autres espèces étudiées, sauf Sandonella sandoni. Un corps intercentriolaire réduit et un arc de microtubules corticaux sont des caractères constamment présents chez les proteocephalidés étudiés. Chez B. lafoni nous avons décrit pour la première fois la présence d’un matériel dense aux électrons dans la zone de différentiation pendant les stades initiaux de la spermiogenèse. Il s’agit d’un caractère typique des ordres basaux des Eucestoda. Finalement, Molluscotaenia crassiscolex suit le type IV de spermiogenèse et son spermatozoïde est du type VI. Ces deux patrons coïncident chez les autres dilepididés étudiés. La morphologie particulière du corps en crête est le caractère le plus intéressant. Il est partiellement détaché dans sa partie moyenne. Nos résultats sont comparés avec les Dilepididae s.l. / The present Thesis constitutes a contribution to the knowledge of ultrastructure of spermiogenesis and the spermatozoon of cestodes. New spermatological data concerning species belonging to six orders of Eucestoda are presented. These species are Clestobothrium crassiceps (Rudolphi, 1819) (Bothriocephalidea), Echinobothrium euterpes (Neifar et al., 2001) (Diphyllidea), Aporhynchus menezesi Noever et al., 2010 (Trypanorhyncha), Acanthobothrium crassicolle Wedl, 1855 (Tetraphyllidea), Barsonella lafoni de Chambrier et al., 2009 (Proteocephalidea), and Molluscotaenia crassiscolex (von Linstow, 1890) (Cyclophyllidea). The obtained results on spermiogenesis and the spermatozoon are compared with the available data on the remaining eucestodes, particularly with the orders discussed in the present study. Moreover, the usefulness of different spermatological characters for Taxonomy, Systematics and Phylogeny is discussed.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / funcionais nos espermatozoides e o nivel seminal de peroxidacao lipidica. Metodo: Um estudo transversal foi realizado incluindo 156 pacientes normozoospermicos. Apos a coleta do semen por masturbacao, uma aliquota foi utilizada para a analise seminal e outra para a avaliacao da atividade mitocondrial, da integridade do acrossoma e da integridade do DNA dos espermatozoides. O volume remanescente de semen foi centrifugado e o plasma seminal sobrenadante foi utilizado para a avaliacao do nivel seminal de peroxidacao lipidica e para a analise proteomica. Posteriormente, os pacientes foram divididos em percentis (15%) para formacao dos grupos experimentais de cada estudo: Estudo 1 - alta (grupo controle) e baixa (grupo alterado) atividade mitocondrial dos espermatozoides, Estudo 2 - alta (grupo controle) e baixa (grupo alterado) integridade do acrossoma dos espermatozoides, Estudo 3 - baixa (grupo controle) e alta (grupo alterado) fragmentacao do DNA dos espermatozoides e Estudo 4 - baixo (grupo controle) e alto (grupo alterado) niveis seminais de peroxidacao lipidica. A analise proteomica foi realizada utilizando LCMS/MS. Os grupos foram comparados por meio de analise univariada (teste t de Student) e analise multivariada (PLS-DA e analise discriminante). As proteinas significantes foram posteriormente submetidas a analise de enriquecimento funcional. Resultados: Nos estudos 1, 2, 3 e 4 foram observadas 506, 493, 474 e 629 proteinas, respectivamente. As funcoes enriquecidas no estudo 1 foram detoxificacao de EROs e ligacao a NADP (controle) e atividade de oxidoredutase intramolecular, catabolismo de aminoglicanos, inibicao de endopeptidases, lisossomos e resposta imune de fase aguda (alterado). As principais funcoes enriquecidas no estudo 2 foram resposta imune (controle) e inibicao de fosfolipase, metabolismo do acido araquidonico, exocitose, resposta inflamatoria aguda, resposta ao peroxido de hidrogenio e transporte lisossomal (alterado). As principais funcoes enriquecidas no estudo 3 foram metabolismo de carboidratos, regulacao de lipoproteinas, regulacao negativa da apoptose, metabolismo de hormonios, atividade de metalopeptidases, ligacao ao NAD e lisossomos (controle) e biossintese de prostaglandinas e ligacao a acidos graxos (alterado). As principais funcoes enriquecidas no estudo 4 foram biossintese de acidos graxos insaturados, atividade de oxidantes e antioxidantes e resposta celular ao estresse termico (alterados). Nos estudos 1, 2, 3 e 4 foram sugeridos 8, 6, 8 e 7 biomarcadores seminais de atividade mitocondrial, integridade acrossoma, fragmentacao de DNA e peroxidacao lipidica, respectivamente. Conclusoes: O perfil proteomico do plasma seminal reflete alteracoes funcionais dos espermatozoides e o nivelseminal de peroxidacao lipidica e diversas funcoes pos-genomicas estao relacionadas as alteracoes estudadas. Proteinas relacionadas as alteracoes funcionais dos espermatozoides e ao nivel seminal de peroxidacao lipidica constituem potenciais biomarcadores seminais para cada alteracao / Objective: To verify if the seminal plasma proteomic profile reflects sperm functional alteration and semen lipid peroxidation levels. Method: A cross-sectional study was performed including 156 normozoospermic patients. After semen retrieval by masturbation, an aliquot was utilized for semen analysis and another for evaluation of sperm mitochondrial activity, acrosome integrity and DNA fragmentation. The remaining semen volume was centrifuged and the supernatant seminal plasma was utilized for semen lipid peroxidation levels evaluation, and proteomic analysis. Patients were divided into percentiles (15%) to form the experimental groups: Study 1 – high (control group) and low (altered group) sperm mitochondrial activity; Study 2 – high (control group) and low (altered group) sperm acrosome integrity; Study 3 – low (control group) and high (altered group) sperm DNA fragmentation; Study 4 – low (control group) and high (altered group) semen lipid peroxidation levels. Proteomic analysis was performed by a LC-MS/MS approach. Groups were compared using univariate (Student’s t test) and multivariate (PLS-DA and discrimant analysis) analyses. Differentially expressed proteins were then utilized for functional enrichment analysis. Results: 506, 493, 474, and 629 proteins were observed in studies 1, 2, 3, and 4, respectively. Enriched functions in study 1 were reactive oxygens species detoxification, and NADP binding (control group), and intramolecular oxidoreductase activity, aminoglycans catabolism, endopeptidases inhibition, lysosomes, and acute-phase response (altered group). In study 2, main enriched functions were acute-phase response (control group), and phospholipase inhibition, arachidonic acid metabolism, exocytosis, regulation of acute inflammatory response, response to hydrogen peroxide and lysosomal transport (altered group). In study 3, main enriched functions were carbohydrates metabolism, lipoprotein regulation, negative regulation of apoptosis, hormone metabolism, metalopeptidases activity, NAD binding, and lysosomes (control group), and prostaglandin biosynthesis, and fatty acid binding (altered group). In study 4, enriched functions were unsaturated fatty acid biosynthesis, oxidants and antioxidants activity, and cellular response to heat stress (altered group). In total, 8, 6, 8, and 7 seminal biomarkers were proposed for studies 1 (mitochondrial activity), 2 (acrosome integrity), 3 (DNA fragmentation), and 4 (lipid per oxidation), respectively. Conclusions: The seminal plasma proteomic profile reflects sperm functional alterations and semen lipid perodixation levels, and several post-genomic functions are related to the studied alterations. Proteins related to sperm functional alterations, and semen lipid peroxidation levels constitute potential seminal biomarkers for each alteration. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

The present study was to evaluate the reproductive performance of broiler breeders fed different levels of protein and metabolizable energy treated with three different diets, varying amounts of metabolizable energy and crude protein. In one treatment, the heavy broiler breeders were fed a diet with 13.8% CP and 2750 Kcal / kg, 22 to 66 weeks of age. In treatment two, the roosters received the same ration provides for the females, being from 22 to 36 weeks of age containing 15% CP from 36 to 60 weeks, 15.2% CP and 60 to 66 weeks, 14% CP, all diets contained 2850 Kcal / kg. In treatment three, the breeding males fed a diet with15% CP and 2700 Kcal / kg from 22 to 66 weeks is old. The semen was collected from 16 rooster each treatment in three different ages of week, 34, 38, 43, 48 and 51 weeks. The semen collected was subjected to staining protocol with toluidine blue and subsequently evaluated by computer image analysis, with measurements of area, perimeter, homogeneity and intensity of compaction of chromatin in each head of spermatozoa. The roosters fed with high protein (15%) showed improve results in terms of compression and density of the heads of sperm chromatin. This same group had values of spermatozoa size smaller, which indicates minor morphological changes. It wasn t possible to correlate the onset and fertility with other data, as in this study there was no significant difference between treatments (p >0.05). Concerning the age of the rooster, regardless of the diet used, all treatments showed changes in chromatin compaction, and the roosters fed with 13.8% crude protein and 2750 Kcal / kg, showed greater changes in chromatin compaction. This can explain the decrease in fertility, usually observed in the field after this period, in flocks of broiler breeders. / O presente estudo teve como objetivo avaliar a morfometria e a compactação de cromatina em espermatozóides de reprodutores tratados com diferentes níveis de proteínas, e comparar as análises de compactação de cromatina com fertilidade e eclodibilidade, analisando a eficiência reprodutiva de galos reprodutores de corte. No tratamento um, os galos reprodutores pesados, foram alimentados com uma ração com 13,8% de Proteína Bruta (PB) e 2750 Kcal de EM/Kg, de 22 a 66 semanas de idade. No tratamento dois, os galos receberam a mesma ração fornecida para as fêmeas, sendo das 22 a 36 semanas de idade contendo 15% de PB, das 36 a 60 semanas, 15.2% de PB e das 60 a 66 semanas, 14% de PB, todas as dietas continham 2850 de Kcal de EM/Kg. No tratamento tres, os machos reprodutores foram alimentados com uma ração 15% de PB e 2700 Kcal de EM/Kg, de 22 a 66 semanas de idade. O sêmen de 16 galos foi coletado de cada tratamento, em três idades diferentes: 34, 38, 43, 48 e 51 semanas. O sêmen coletado foi submetido a protocolo de coloração com azul de toluidina, e posteriormente avaliado por análise de imagem computacional, com mensurações da área, perímetro, homogeneidade e intensidade da compactação da cromatina dentro de cada cabeça do espermatozóide. Os galos alimentados com elevado nível de proteína (15%) apresentaram melhores resultados em relação à compactação e a homogeneidade da cromatina das cabeças dos espermatozóides. Este mesmo grupo apresentou valores de tamanho de espermatozóides menores, o que indica menores alterações morfológicas. Não foi possível correlacionar a eclosão e fertilidade com os demais dados, pois neste estudo não houve diferença significativa entre os três tratamentos (p>0.05). Em relação à idade do galo reprodutor, independente da dieta utilizada, todos os tratamentos apresentaram alterações na compactação da cromatina, sendo que os galos alimentados com 13.8% de proteína bruta e 2750 Kcal de EM/Kg, apresentaram maiores alterações na compactação da cromatina. O que pode explicar a queda na fertilidade, geralmente observada no campo, após este período, em plantéis de matrizes pesadas. / Mestre em Ciências Veterinárias