Orientadores: Mary Anne Heidi Dolder, Karina Carvalho Mancini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T15:52:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moya_JulianaSiqueira_M.pdf: 6061809 bytes, checksum: 3498b49d3b5da2af4c020b2cec6420ed (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Iporangaia pustulosa (Arachnida: Opiliones) é uma espécie de opilião pertencente à subordem Laniatores. Machos adultos desta espécie tiveram seus aparelhos reprodutores dissecados, e seus testículos e vesículas seminais processados para microscopias de luz e eletrônicas de transmissão (convencional e citoquímica - E-PTA) e varredura. O aparelho reprodutor de I. pustulosa é composto por um testículo tubular, dois ductos deferentes que se unem em uma grande vesícula seminal. O testículo apresenta cistos com células germinativas em diferentes fases de desenvolvimento. A espermiogênese é centrípeta e caracterizada por: (1) ausência de formação de flagelo; (2) centro cinético reduzido a dois centríolos do tipo 9+0; (3) formação de manchete de microtúbulos, que auxiliam na compactação nuclear e na determinação da forma celular; (4) gradual compactação cromatínica nas diferentes fases das espermátides até a total compactação nos espermatozóides; (5) desenvolvimento de uma invaginação citoplasmática em direção ao núcleo, desprovida de organelas; (6) acrossomo formado a partir de vesículas do Golgi, composto por uma vesícula acrossomal, um material denso sub-acrossomal, mitocôndrias e pequenas vesículas associadas; (7) espermatozóides ovais, aflagelados, com membrana plasmática ondulada. Pelo método de E-PTA foram detectadas proteínas básicas em diferentes estruturas ao longo do desenvolvimento da espermiogênese. Os espermatozóides formados são liberados dos cistos no centro do testículo e são armazenados na vesícula seminal. Dispersos pela luz da vesícula, os espermatozóides apresentam os mesmos componentes observados no testículo, porém adquirem projeções extracelulares aderidas às ondulações da membrana recobrindo a superfície celular, exceto na região do acrossomo. Essas projeções são adquiridas gradualmente ao longo da extensão da vesícula seminal e são recobertas por um material amorfo na extremidade semelhante a um glicocálice. A espermiogênese de I. pustulosa e a morfologia dos espermatozóides testiculares e vesiculares são semelhantes ao descrito para a espécie Vonones sayi, também pertencente à sub-ordem Laniatores. Por não ocorrer formação de axonema durante a espermiogênese, os espermatozóides de I. pustulosa são aflagelados e tais projeções podem estar envolvidas no transporte do espermatozóide, sua ancoragem no interior da fêmea ou ainda no reconhecimento do óvulo / Abstract: Iporangaia pustulosa (Arachnida: Opiliones) is a harvestman species belonging to the Laniatores suborder. Adult males of this species had their reproductive tracts dissected and their testis and seminal vesicles were processed for light, transmission (routine preparations and cytochemistry: E-PTA) and scanning electron microscopy. The reproductive tract of I. pustulosa is composed of a tubular testis and two deferent ducts that connect to a large seminal vesicle. The testis presents cysts of germ cells in different developmental stages. Spermiogenesis in I. pustulosa is centripetal and characterized by (1) the lack of flagellum formation; (2) the kinetic center reduced to two centrioles of the 9+0 type; (3) the microtubule manchette formation; (4) the gradual chromatin condensation from spermatids to spermatozoa; (5) the cytoplasmic invagination development, without organelles, that extends into the nucleus; (6) the acrosome formed by Golgi vesicles, composed of acrossomal vesicles, a subacrosomic dense material, associated mitochondria and small vesicles; (7) the oval aflagellated spermatozoa, with a wavy plasma membrane. With the E-PTA method, basic proteins were detected in different structures throughout spermiogenesis. The spermatozoa are released from the cysts in the center of the testis and are kept in the seminal vesicle lumen. There, the spermatozoa present the same components observed in the testis, however they acquire extracellular projections, which adhere to the wavy membrane covering the cell surface, except in the acrosome area. These projections are acquired gradually along the seminal vesicle length and are covered by an amorphous material on their tips, resembling a glycocalix. The spermiogenesis of I. pustulosa as well as the morphology of testicular and seminal vesicle spermatozoa are similar to that described for Vonones sayi, also belonging to the Laniatores suborder. As axoneme formation does not occur during the spermiogenesis, I. pustulosa spermatozoa are aflagellated and their projections could help to transport sperm along the male and female reproductive tracts, anchor the spermatozoa inside the female and/or play a role in oocyte recognition / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Durante o processo de criopreservação de sêmen, os espermatozóides sofrem alguns danos que resultam na diminuição da fertilidade deste. O presente estudo foi realizado a fim de avaliar o efeito da utilização, combinada de duas curvas de congelamento com dois diluentes comerciais sobre a criopreservação de sêmen eqüino. Foram analisados 20 ejaculados. As amostras foram avaliadas, pela motilidade progressiva e total do sêmen pós-descongelamento e pela integridade e funcionalidade da membrana dos espermatozóides. A combinação entre curva automatizada e Botu- Crio® apresentou as maiores médias, nas análises de motilidade total (55,53%) e progressiva (17,25%), após o descongelamento. O diluente Botu-Crio® ,isoladamente, apresentou também os melhores resultados quando foram realizadas as análises de integridade (CFDA/PI) e funcionalidade de membrana pelo teste hiposmótico. / During semen cryopreservation, sperm cells were submitted to some deleterious events leading to membrane damage which result in fertility decrease. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing rates and the use of two commercial extenders as cryoprotectants (FR-5® and Botu-Crio®) on the total and progressive motility, integrity and functionality of spermatic membranes during the cryopreservation of equine semen. Twenty ejaculates were analyzed. The total and progressive motility of fresh and postthawing semen samples were evaluated by the patterns assays. The function of plasmatic membrane was measured by the hipoosmotic swelling test. The integrity of plasmatic membrane was evaluated using CFDA/PI fluorescent probes. There were significant differences between the two freezing techniques and/or between cryoprotectants for all assessed parameters. The combined used between Botu-Crio® and automated curves showed better results in total and progressive post-thawing motility. The extender Botu-Crio®, alone, showed better results in order to preserve the membrane integrity and function.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-11T19:23:04Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jane Porfírio Rocha - 2004.pdf: 370129 bytes, checksum: b81520b5ddabb24c93613beb9a4564e1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-12T09:28:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jane Porfírio Rocha - 2004.pdf: 370129 bytes, checksum: b81520b5ddabb24c93613beb9a4564e1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-12T09:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jane Porfírio Rocha - 2004.pdf: 370129 bytes, checksum: b81520b5ddabb24c93613beb9a4564e1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2004-03-01 / Studied in this work maturation in vitro oocytes collected from ovaries obtained from a slaughterhouse, without any hormonal stimulation and, comparing these data at different stages of maturation between heifers and old cows. The culture medium used for maturation was the In Vitro Fertilization (Scandinavian IVF Science AB. Sweden), where similar results were observed for the two age, presenting a significant correlation (r = 0.9991 and p <0.0001) for stages of maturation, despite the maturing rate for new cows have better 50.5%, and for the old cows of 31.3%, there was no statistical difference. The same is repeated for the fertilization of young cows to 98.1% and 86% for old cows. For the blastocyst formation rate, 17.14% to 22.58% and old cows to young cows. We tested two types of cryopreservation for embryos in the blastocyst stage, the ultra-fast freezing, using dimethyl sulfoxide-cryoprotector (DMSO), and the computerized slow freezing with cryo chambers - Australian, using glycerol as cryoprotector. Embryos at the new cows DMSO showed a 14% survival rate and 73% glycerol, and the old cows were 31% DMSO and 63% glycerol. The rehydration rate of re-expansion of blastocysts after thawing was 15% with 15% DMSO and 38% glycerol for old cows and 14% DMSO and 55% glycerol for new cows. Spontaneous Hatching was observed only for the embryos thawed freezing with glycerol for young cows. In the statistical calculation was no significance between the results of survival, to total frozen and thawed embryos, between the slow freezing methods and the ultra-fast slow cryopreservation method using glycerol as a cryoprotector. / Estudou-se neste trabalho a maturação de oócitos in vitro, coletados de ovários obtidos em abatedouro, sem qualquer tipo e estimulação hormonal, comparando estes dados em seus diferentes estágios de maturação entre novilhas e vacas velhas. O meio de cultura utilizado para a maturação foi o In Vitro Fertilization (Scandinavian IVF Science AB. Sweden), onde se observou resultados similares para as duas idades, apresentando uma correlação significativa (r = 0,9991 e p < 0,0001) para os estágios de maturação, apesar da taxa de maturação para as vacas novas se apresentarem melhores 50,5%, e para as vacas velhas de 31,3%, não houve diferença estatística. O mesmo se repete para a taxa de fertilização de 98,1% para vacas novas e 86% para vacas velhas. Para a taxa de formação de blastocisto, 17,14% para vacas velhas e 22,58% para vacas novas. Foram testados dois tipos de criopreservação para embriões em estágio de blastocisto, o congelamento ultra-rápido, usando o crioprotetor dimetil-sufóxido (DMSO), e o congelamento lento computadorizado com criocâmara - Australiana, usando glicerol como crioprotetor. Os embriões das vacas novas pelo DMSO apresentaram uma taxa de sobrevida de 14% e com glicerol de 73%, e para as vacas velhas foram de 31% com DMSO e 63% com glicerol. As taxas de reidratação de re-expansão do blastocisto pós-descongelamento foram de 15% com 15% com DMSO e 38% com glicerol para vacas velhas e 14% com DMSO e 55% com glicerol para vacas novas. O Hatching espontâneo foi observado apenas para os embriões descongelados do congelamento com glicerol para vacas novas. No calculo estatístico houve significância entre os resultados de sobrevida, para o total de embriões congelados e descongelados, entre os métodos de congelamento lento e o ultra-rápido método de criopreservação lento, usando o glicerol como crioprotetor.

A criação de aves em cativeiro pode ser uma ferramenta importante de auxílio à conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, a reprodução natural em cativeiro nem sempre é viável, e os animais que se encontram pareados muitas vezes não oferecem descendentes geneticamente interessantes para a manutenção da espécie em longo prazo. Na tentativa de contornar tais problemas, biotécnicas como a colheita de sêmen, inseminação artificial e criopreservação de gametas podem ser ferramentas interessantes no manejo genético de populações ex situ e in situ. Nesse sentido, a padronização de uma técnica de colheita de sêmen, bem como o conhecimento sobre parâmetros seminais das diferentes espécies são de extremo valor para programas de reprodução assistida. Por se tratar de espécies silvestres, a colheita por eletroestimulação encaixa-se bem às necessidades devido ao fato de não exigir treinamento prévio dos animais e ser de rápida execução. Neste trabalho verificamos a importância deste método na colheita de sêmen de animais não condicionados, visto que a pré-estimulação resultou em amostras seminais apenas em Anseriformes, e, já a eletroestimulação, possibilitou a obtenção de sêmen em todas as ordens em que foi testada, em pelo menos uma espécie de cada ordem. Observou-se uma tendência a sazonalidade da produção espermática para a maioria das espécies em que foi possível obter amostras de sêmen, sendo que apenas urubu rei, cisne do pescoço preto e pato coscoroba tiveram amostras em três ou quatro estações do ano. Por fim, oferecemos alguns dados a respeito das características seminais encontradas nessas espécies. Acreditamos que os resultados dessa pesquisa servirão como base não apenas para o estabelecimento de programas de inseminação artificial, como também para a formação de bancos de germoplasma para espécies raras ou ameaçadas no Brasil. / Breeding birds in captivity can be an important tool to aid conservation of endangered species. However, the natural reproduction in captive is not always viable, and animals that are matched often do not offer genetically interesting offspring to maintain the species in the long term. In the attempt to overcome these problems, biotechniques such as semen collection, artificial insemination and gamete cryopreservation can be interesting tools for the genetic maintenance of ex situ and in situ populations. In this regard, the standardization of a semen collection technique and the knowledge of seminal parameters for different species are extremely valuable for assisted reproduction programs. Since those are wild species, semen collection by electro stimulation fits well into the needs due to the fact that it does not require prior training of animals and the execution is fast. In this work we verified the importance of this method in the collection of semen from unconditioned animals, since pre-stimulation resulted in seminal samples only in Anseriformes, and the electrical stimulation enables obtaining semen of all orders that were tested in at least one species of each order. Seasonality of sperm production was observed for most of the species from which it was possible to obtain semen samples. Only vulture king, black neck swan and coscoroba duck had samples at three or four seasons of the year. Finally, we offer some data about the seminal characteristics found in these species. We believe that the results of this research will serve as a basis not only for the establishment of artificial insemination programs, but also for the formation of germplasm banks for rare or endangered species in Brazil..

As condições do trato reprodutivo da fêmea, assim como a qualidade do sêmen são fatores que interferem na fertilidade. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a resposta inflamatória uterina e a taxa de prenhez em éguas, considerando hemodinâmica uterina e citologia endometrial após a inseminação artificial (IA) com sêmen congelado de alta e baixa qualidade. Para o presente estudo foram realizados dois experimentos. No Experimento 1 foram utilizadas 15 éguas distribuídas de forma aleatória em quatro grupos: CT - controle: mimetização do procedimento de IA (n=7), DIL: infusão intrauterina de diluidor a base de leite desnatado (n=7), ALTA: IA com sêmen de alta qualidade (n=7), e BAIXA: IA com sêmen de baixa qualidade (n=7). A avaliação uterina foi realizada por ultrassonografia transretal com Doppler nos modos Espectral e Color-flow em sete momentos: prévio à indução da ovulação (TIO), imediatamente antes da IA (TIA), 2 (T2), 6 (T6), 12 (T12), 24 (T24) e 48 horas (T48) após a IA. Foram considerados os valores de índice de resistência (RI) da artéria uterina e de escore de vascularização (EV) uterino. A citologia uterina foi realizada 6 h após a IA. No Experimento 2 foram utilizadas 12 éguas, e seus ciclos foram distribuídos nos tratamentos: CT - controle: mimetização do procedimento de IA (n=8), DIL: infusão intrauterina de diluidor (n=8), ALTA: IA com sêmen de alta qualidade (n=8), e BAIXA: IA com sêmen de baixa qualidade (n=8). O delineamento experimental foi em Quadrado Latino 4X4. A avaliação uterina foi realizada por ultrassonografia transretal com Doppler modos Espectral e Color-flow em três momentos: prévio à indução da ovulação (TIO), imediatamente antes da IA (TIA) e 6 horas (T6) após a IA. A citologia uterina foi realizada 6 h após a IA. Neste experimento foi considerada a taxa de prenhez comparando-se os ciclos utilizados para os grupos ALTA e BAIXA. O diagnóstico de gestação foi realizado 14 dias após a ovulação. Foi utilizado o procedimento misto (PROC MIXED) do SAS (Versão 9.3) para a análise estatística e foi considerada diferença significativa quando p &le;0,05. No Experimento 1, não foi encontrada diferença estatística entre os grupos para os valores de hemodinâmica uterina RI e EV. Houve aumento significativo de células inflamatórias no endométrio de éguas inseminadas com sêmen de baixa qualidade, porém não diferiu do grupo de éguas inseminadas com sêmen de alta qualidade. No Experimento 2, não houve diferença estatística entre os grupos para os valores de RI, mas se observou maior EV uterino nos grupos inseminados com sêmen de alta e de baixa qualidade quando comparados com o grupo controle. Na citologia uterina não foi encontrada diferença estatística. A taxa de prenhez para os grupos ALTA (81,82%) e BAIXA (54,55%) não foi estatisticamente diferente. Conclui-se que a deposição de sêmen no útero, leva a um processo inflamatório do endométrio, e esta pode alterar a hemodinâmica uterina detectável por ultrassonografia Doppler em éguas. Não existe diferença significativa na resposta inflamatória entre as qualidades de sêmen. A inseminação com sêmen congelado de menor qualidade não altera a taxa de prenhez, mas são necessários mais estudos para verificar esta diferença. / The female reproductive tract soundness, as well as semen quality are factors that interfere in fertility. The aims of this study were to evaluate inflammatory uterine response and pregnancy rate in mares, considering uterine hemodynamics and endometrial cytology after artificial insemination (IA) with frozen semen of high and low quality. Two experiments were executed for the present study. For Experiment 1, fifteen mares were randomly distributed between four groups: CT - control: mimic of the procedure of IA (n=7), DIL: intrauterine infusion of skim milk semen extender (n=7), ALTA: IA with high quality semen (n=7), and BAIXA: IA with low quality semen (n=7). Uterine evaluation was done using transrectal Doppler ultrasonography by Spectral and Color-flow modes on seven moments: immediately before ovulation induction (TIO), immediately before AI (TIA), 2 (T2), 6 (T6), 12 (T12), 24 (T24) and 48 (T48) hours after IA. There were considered the numerical values of resistance index (RI) of uterine arteries and vascularity scores (EV) of uterine horns. Endometrial cytology was done at 6 h after IA. On Experiment 2, were used 12 mares which their cycles were distributed between the treatments: CT - control: only mimic of IA procedure (n=8), DIL: intrauterine infusion of semen extender (n=8), ALTA: IA with high quality semen (n=8), and BAIXA: IA with low quality semen (n=8). The experimental design was a Latin Square. Uterine evaluation was done using transrectal Doppler ultrasonography by Spectral and Color-flow modes on three moments: before ovulation induction (TIO), immediately before AI (TIA) and 6 hours (T6) after IA. Endometrial cytology was done at 6 h after IA. In this experiment it was considered the pregnancy rate comparing the cycles for groups ALTA e BAIXA. The pregnancy diagnosis was done 14 days after ovulation. It was used the Mixed Procedure (PROC MIXED) from SAS (Version 9.3) for statistical analysis and significant difference was considered when p&le;0.05. On Experiment 1, no statistical difference was found between the groups for uterine hemodynamic values RI and EV. There was a significant increase of inflammatory cells on the mares inseminated with low quality semen, however it wasnt different from the group if mares inseminated with high quality semen. On Experiment 2, there was no statistical difference between the groups for RI values, but the uterine EV was higher for the groups inseminated with high and low quality when compared with the control group. There was no statistical difference on endometrial cytology. There was no statistical difference on pregnancy rate for the groups ALTA (81,82%) and BAIXA (54,55%). As a conclusion, the deposition of semen in the uterus causes an inflammatory process on the endometrium, and it could alter uterine dynamics detected by Doppler ultrasonography in mares. It does not exist significant difference on the inflammatory response between semen qualities. Low quality frozen-semen insemination does not alter pregnancy rate, but more studies are necessary in order to verify this difference.

Estudos recentes avaliaram o papel do Magnetic Activated cell Sorting (MACS, separação celular por ativação magnética) para reduzir a percentagem de espermatozoides apoptóticos e melhorar a qualidade seminal. No entanto, a eficiência do uso do MACS isoladamente, antes ou depois do processamento seminal pelos métodos clássicos, como o centrifugação em gradiente de densidade (DGC), ainda não foi estabelecida, de modo que o protocolo de uso do método não foi adequadamente estabelecido. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar se o MACS sozinho, antes (MACS-DGC) ou depois do processamento seminal pelo DGC (DGC-MACS) melhora a seleção espermática quando comparado ao processamento pelo DGC. Realizou-se um estudo prospectivo experimental avaliando amostras de sêmen de 15 homens saudáveis. A mesma amostra foi dividida em 4 alíquotas e processada por: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC e MACS. Após o processamento, foram analisadas a integridade do DNA espermático pelo método TUNEL - TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (marcação de quebras no DNA por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase) assim como a concentração de espermatozoides, a motilidade progressiva e a morfologia, segundo os últimos critérios adotados pela Organização Mundial da Saúde. A percentagem de dano ao DNA foi significativamente menor no grupo MACSDGC, quando comparado com DGC e MACS, e semelhante a do grupo DGC-MACS. A concentração de espermatozoides recuperados nos grupos de DGC e MACS foi similar e significativamente maior do que MACS-DGC e DGC-MACS, que foram semelhantes entre si. A motilidade progressiva dos espermatozoides recuperados foi semelhante nos grupos MACS-DGC e DGC e significativamente maior do que nos grupos DGC-MACS e MACS. O percentual de espermatozoides com morfologia normal foi significativamente maior no grupo MACS-DGC quando comparado ao DGC-MACS e MACS, e semelhante quando comparado com DGC. Desta forma, evidenciou-se que ambos os métodos combinados promovem a recuperação de espermatozoides com menor percentagem de dano ao DNA espermático. O MACS isoladamente ou aplicado após o DGC promove redução significativa dos espermatozoides progressivos recuperados, assim como da percentagem de espermatozoides com morfologia normal. Todavia, o MACS aplicado antes do DGC promove a recuperação de amostras com elevada percentagem de espermatozoides com motilidade progressiva e morfologia normal, aliada a baixa percentagem de DNA fragmentado, sugerindo ser o melhor protocolo de uso desta metodologia, cuja importância clínica precisa ser avaliada em estudos clínicos bem delineados. / Recent studies evaluated the role of Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) in order to reduce the percentage of apoptotic sperm and improve seminal quality. However, the effectiveness of using MACS alone, before or after seminal processing by classical methods, such as the density gradient centrifugation (DGC), has not yet been established. Thus, the role of the present study was evaluate whether: MACS alone, before (MACS-DGC) or after seminal processing by DGC (DGC-MACS) improves sperm selection when compared to DGC. A prospective experimental study was conducted evaluating semen samples from 15 healthy men. The same sample was divided into 4 aliquots and processed by: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC and MACS. After processing, the integrity of the sperm DNA was analyzed by TUNEL - TdT - mediated dUTP method Nick End Labeling (marking DNA breaks by dUTP and deoxynucleotidyl terminal transferase), sperm concentration, progressive motility and morphology according to the last criteria adopted by the World Health Organization. The percentage of DNA damage was significantly lower in the MACS-DGC group, when compared to DGC and MACS, and similar to the DGC-MACS group. The concentration of spermatozoa recovered in the DGC and MACS groups was similar and significantly higher than MACS-DGC and DGC-MACS, which were similar to each other. The progressive motility was similar in the MACS-DGC and DGC groups and significantly higher than in the DGC-MACS and MACS groups. The percentage of spermatozoa with normal morphology was significantly higher in the MACS-DGC group when compared to DGC-MACS and MACS, and similar when compared to DGC. Thus, it was evidenced that both methods combined promote the recovery of spermatozoa with a lower percentage of DNA damage. MACS alone or applied after the DGC promotes a significant reduction of the progressive sperm retrieved, as well as the percentage of spermatozoa with normal morphology. However, the MACS applied before the DGC promotes the recovery of samples with a higher percentage of spermatozoa with progressive motility and normal morphology, combined with low percentage of fragmented DNA, suggesting to be the best protocol, whose clinical importance needs to be evaluated in well-delineated clinical studies.

Orientador: Fabiana Ferreira de Souza / Banca: Eunice Oba / Banca: Maria Isabel Mello Martins / Resumo: Apesar da citometria ser um método eficiente para sexagem espermática, nos cães pode ser considerada de difícil aplicação, em vista do alto custo da aplicação da técnica e da baixa recuperação espermática após a separação. Por esta razão, o presente trabalho visou avaliar a viabilidade espermática, a taxa de recuperação e a porcentagem de espermatozoides de cães contendo o cromossomo X ou Y após a centrifugação em três gradientes descontínuos de densidade e estudou três técnicas de extração de DNA espermático para determinar a % de células X ou Y pela PCR quantitativa (qPCR). Foram avaliadas 30 amostras de sêmen canino (10 cães) utilizando os protocolos de centrifugação em gradiente descontínuo de densidade (Percoll® - 30 a 90% associado ao Nycodenz® e Ficoll). Os espermatozoides foram avaliados pré e pós-centrifugação quanto à motilidade (CASA - Computer-Aided Semen Analyzer), concentração inicial e concentração recuperada, morfologia espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal, e função mitocondrial. Após a separação, as células foram submetidas a três protocolos de extração de DNA, um não comercial (fenol:clorofórmio, M1) isolado ou associado a um kit preparatório (M2) e dois comerciais com mini-colunas de extração (M3 e M4) e, posteriormente, à qPCR com os primers contra os genes SRY (AF_107021.1) e Fator IX (NM_001003323.2). O protocolo M1 recuperou maior concentração de DNA e com maior qualidade permitindo a execução da qPCR. Dentre os gradientes de densidade, o Ficoll manteve maior qualidade espermática após a centrifugação, embora o enriquecimento de X ou Y não tenha sido observado em nenhum dos métodos estudados. A extração de DNA utilizando o fenol:clorofórmio foi o método que extraiu maior quantidade e de maior qualidade para a aplicação na qPCR / Abstract: Despite cytometry to be an effective method for sperm sexing, in dogs can be considered of difficult application, given the high cost of the technical implementation and low sperm recovery after separation. Therefore, this study aimed to evaluate the sperm viability, recovery rate and the percentage of sperm dogs containing the X or Y after centrifugation three discontinuous density gradients. Furthermore, aimed to study three DNA extraction techniques for sperm cells to determine the percentage of bearing cells of the X or Y chromosome for quantitative real-time PCR (qPCR). Thirty samples (10 dogs) of canine semen were evaluated using centrifugation discontinuous density gradient protocols (Percoll® - 30 to 90% associated to Nycodenz® and Ficoll). The sperm were evaluated before and after centrifugation for motility (CASA - Computer Aided Semen Analyzer), initial concentration and recovered concentration, sperm morphology, integrity of plasma and acrosomal membranes, and mitochondrial function. After separation, the cells were subjected to three DNA extraction protocols, a non-commercial using phenol:chloroform (M1) alone or combined with a preparatory kit (M2) and two commercial with extraction mini-columns (M3 and M4). Next, the DNA samples were subjected to qPCR using two primers (SRY - AF_107021.1 and Factor IX - NM_001003323.2). M1 protocol recovered greater concentration of DNA with higher quality and allowing the execution of qPCR. Among the density gradients, Ficoll maintained higher sperm quality after centrifugation, although the X or Y enrichment was not observed in any of the studied methods / Mestre

Orientadora: Profª. Drª. Renata Simões / Coorientador: Prof. Dr. Arnaldo Rodrigues dos Santos Júnior / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, São Bernardo do Campo, 2017. / O Brasil ocupa o segundo lugar mundial como produtor no agronegócio. O país se destaca como um dos maiores exportadores de carne e atende ao mercado internacional exigente com animais geneticamente superiores para crescimento, acabamento de carcaça e precocidade sexual. O rebanho nacional é composto por 80% de gado da raça Nelore (Bos taurus indicus) e 20% restantes abrangem outras raças, dentre elas animais Angus e Wagyu (ambos Bos taurus taurus). O Wagyu tem se destacado devido aos resultados produtivos e de qualidade de carne, porém o exame andrológico desses animais revelou incoerência em relação às características padrões que classificam bons reprodutores. Os touros Wagyu apresentam menor circunferência escrotal e esta característica parece estar relacionada com o menor peso corporal e menor idade à puberdade. Contudo, quando comparado à touros da mesma idade e de outras raças e subespécies, a qualidade seminal e a produção espermática são muito semelhantes. Estas diferenças evidentes entre raças, particularmente as encontradas na raça Wagyu levaram ao objetivo principal deste estudo, que foi avaliar possíveis diferenças nas características espermáticas e hormonais, em touros Wagyu quando comparadas às mesmas características de touros das subespécies Nelore e Angus. Foi realizada avaliação espermática por meio de citometria de fluxo, performance seminal pelas técnicas CASA e TBARS, bem como dosagens séricas dos níveis de testosterona e hormônio luteinizante (LH). Sobre o presente estudo, levantamos a necessidade de mais estudos focados nestas três diferentes raças de gado de corte, com maior número de animais avaliados para de fato compreendermos os aspectos fisiológicos que fazem com que o touro Wagyu seja descrito na literatura como um destaque quanto a precocidade sexual, quando comparado a touros das demais raças. Desta forma poderemos aplicar este conhecimento no melhoramento genético do plantel nacional, otimizando assim a cadeia produtiva e consequentemente, o mercado pecuário atual. / Brazil ranks second in the world as a producer in agribusiness. The country stands out as one of the largest meat exporters and caters to the demanding international market with genetically superior animals for growth, carcass finishing and sexual precocity. The national herd is composed of 80% of Nelore cattle (Bos taurus indicus) and the remaining 20% includes other breeds, including Angus and Wagyu (both Bos taurus taurus). Wagyu has stood out due to the productive and meat quality results, but the andrological examination of these animals revealed incoherence in relation to the standard characteristics that classify good breeding. Wagyu bulls have lower scrotal circumference and this feature seems to be related to lower body weight and younger age at puberty. However, when compared to bulls of the same age and other breeds and subspecies, seminal quality and sperm production are very similar. These differences between breeds, particularly those found in the Wagyu breed, led to the main objective of this study, which was to evaluate possible differences in sperm and hormonal characteristics in Wagyu bulls when compared to the same characteristics of Nelore and Angus subspecies bulls. Sperm evaluation was performed by means of flow cytometry, seminal performance by CASA and TBARS techniques, as well as serum levels of testosterone and luteinizing hormone (LH) levels. On the present study, we raised the need for more studies focused on these three different breeds of beef cattle, with a higher number of animals evaluated to actually understand the physiological aspects that make the Wagyu bull described in the literature as a highlight sexual precocity when compared to bulls of the other races. In this way we can apply this knowledge in the genetic improvement of the national stock, thus optimizing the productive chain and, consequently, the current livestock market.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa el efecto antioxidante de la harina de Myrciaria dubia “camu camu” como protector de la actividad mitocondrial de espermatozoides de ratón, frente al daño producido por los campos electromagnéticos de extremadamente baja frecuencia (CEM-FEB). La evaluación se realiza con individuos de la cepa albina Swiss, divididos en 7 grupos de 5 individuos machos cada uno. Se les administra la suspensión de Myrciaria dubia en concentraciones de 50 y 75 mg/Kg de peso corporal respectivamente durante 35 días consecutivos, a un grupo expuesto a CEM-FEB y no expuesto por cada concentración. Un quinto grupo es simuladamente expuesto a CEM-FEB, mientras que los grupos controles positivo y negativo, son el grupo expuesto y no expuesto a CEM-FEB respectivamente. Al día treinta y seis, los ratones son sacrificados para establecer los parámetros espermáticos y el índice de actividad mitocondrial en los gametos masculinos, siguiendo las pautas de Hrudka, (1979). La exposición de ratones a CEM-FEB causa una disminución significativa (p<0.05) en los parámetros espermáticos de vitalidad, integridad de membrana plasmática y en la actividad mitocondrial. No se observan efectos significativos en la movilidad; por el contrario la concentración espermática aumenta significativamente. Ambos tratamientos antioxidantes con Myrciaria dubia paralelos a la exposición a CEM-FEB, causan una recuperación significativa (p<0.05) de los espermatozoides epididimarios frente al daño inducido por el campo magnético (710µT). Los resultados se analizan utilizando la prueba Comparaciones múltiples con un nivel de significancia del 95% (p<0.05). Se concluye que la suspensión del fruto de Myrciaria dubia “camu camu”, contrarresta los efectos dañinos de los campos magnéticos de baja frecuencia, en la espermatogénesis de ratón. / Tesis

Human infertility is considered a serious disease of the the reproductive system that affects more than 10% of couples worldwide,and more than 30% of reported cases are related to men. The crucial step in evaluating male in fertility is a semen analysis, highly dependent on sperm morphology. However,this analysis is done at the laboratory manually and depends mainly on the doctor’s experience. Besides,it is laborious, and there is also a high degree of interlaboratory variability in the results. This article proposes applying a specialized convolutional neural network architecture (U-Net),which focuses on the segmentation of sperm cells in micrographs to overcome these problems.The results showed high scores for the model segmentation metrics such as precisión (93%), IoU score (86%),and DICE score of 93%. Moreover,we can conclude that U-net architecture turned out to be a good option to carry out the segmentation of sperm cells.