O processo inflamatório tem um papel fundamental na gênese e desenvolvimento da aterosclerose, sendo que a disfunção endotelial é considerada um dos estágios iniciais da aterogênese. Por meio da inibição da enzima hidroxi-metil-glutaril coA redutase (HMGCR), as estatinas reduzem a biossíntese do colesterol e a formação de isoprenóides, produtos intermediários da síntese do colesterol que são importantes na modificação pós-transcricional de GTPases pequenas que estão envolvidas na disfunção endotelial e inflamação vascular. A ezetimiba é um inibidor da absorção do colesterol através da inibição da proteína NPC1L1. Com a finalidade de esclarecer os mecanismos moleculares da inibição da síntese e da absorção do colesterol sobre a modulação de biomarcadores inflamatórios e de adesão celular foram utilizados modelos in vitro com células endoteliais (HUVEC) e monócitos (células THP-1), e in vivo com células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de indivíduos hipercolesterolêmicos (HC). O efeito das estatinas, atorvastatina e sinvastatina, e da ezetimiba na expressão de RNAm e proteínas de moléculas de adesão endoteliais e moduladores do processo inflamatório, como citocinas e óxido nítrico (NO), foi estudado em células HUVEC. O efeito desses fármacos sobre a expressão de moléculas de adesão monocitárias foi estudado em células THP-1. O efeito da terapia hipolipemiante sobre essas moléculas foi também estudada em CMSP de HC tratados com ezetimiba (10 mg/dia/4 semanas), sinvastatina (10 mg/dia/8 semanas) e sinvastatina combinada com ezetimiba (10 mg de cada/dia/4 semanas). A expressão de RNAm foi avaliada por RT-qPCR. A expressão de moléculas de adesão na superfície de células THP-1 e HUVEC foi estudada por citometria de fluxo. A quantificação de citocinas secretadas no sobrenadante de células HUVEC e no plasma dos HC foi analisada pela tecnologia Milliplex. A quantificação do perfil lipífico, Proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) e NO foi realizada por métodos laboratoriais convencionais. O papel do NO na modulação dos marcadores inflamatórios pelas estatinas foi também estudada, usando modelo de células HUVEC com NOS3 silenciado por interferência de RNAm e também por meio do uso do inibidor da síntese do óxido nítrico, L-NAME. Também foi avaliado o efeito de hipolipemiantes na expressão dos microRNAs (miRs) 221, miR-222 e miR-1303 em células HUVEC por meio do stem-loop RT-qPCR. O tratamento com atorvastatina e sinvastatina reduziu a expressão de RNAm e proteínas das moléculas de adesão LSelectina, PSGL-1 e VLA-4, em células THP-1 pré-tratadas com TNFα por 12 h. A ezetimiba reduziu a expressão de L-Selectina apenas no nível transcricional. Em células HUVEC, as estatinas diminuíram a expressão de RNAm de IL1B e SELP, entretanto aumentaram a de VCAM1. A ezetimiba reduziu a expressão de RNAm do IL1B. Entretanto as expressões de SELE, MMP9, IL6 e MMP9 não foram afetadas pelos tratamentos. A expressão das proteínas ICAM-1 e P-Selectina, na superfície de células HUVEC, foi diminuída pelo tratamento com as estatinas, mas não pela ezetimiba. Da mesma forma, a secreção das citocinas IL-6 e MCP-1 foram reduzidas pelas estatinas, entretanto a secreção de IL-8 não foi modificada por nenhum dos tratamentos. A expressão de NOS3 e a liberação de NO em células HUVEC foi aumentada pelas estatinas, porém não foi estimulada pela ezetimiba. Entretanto, os efeitos antiinflamatórios exercidos pelas estatinas foram independentes dessa via devido a que estes efeitos foram mantidos em células HUVEC com NOS3 silenciado por interferência de RNAm. Apesar de que o efeito sobre ICAM-1 e MCP-1 foi atenuado quando as células foram simultaneamente tratadas com L-NAME, os efeitos das estatinas parecem ser independentes da liberação de NO. As estatinas e a ezetimiba reduziram a expressão do miR-221, em células HUVEC. A expressão do miR-222 foi reduzida só pelo tratamento com atorvastatina. A expressão do miR-1303 não foi modulada pelos tratamentos hipolipemiantes. Em pacientes HC, a terapia de associação da sinvastatina e ezetimiba demonstrou melhorar o perfil lipídico de forma mais efetiva que ambas monoterapias. Da mesma forma, o tratamento combinado resultou em maior beneficio pela redução da expressão de RNAm em CMSP e da concentração plasmática das proteínas IL-1 β, MCP-1, IL-8 e TNFα. A expressão de ICAM1 foi diminuída apenas no nível transcricional, entretanto a expressão de RNAm mas não da proteína do TNFα foi também reduzida pela sinvastatina em monoterapia. Não houve modulação de RNAm ou proteínas de outros marcadores estudados no modelo in vivo. Por outro lado, os efeitos anti-inflamatórios observados nos indivíduos HC foram independentes da modulação de PCRus e NO que não foram modificados pelos tratamentos hipolipemiantes. Neste estudo, foram confirmados os propostos efeitos pleiotrópicos das estatinas em modelos células de monócito e endotélio vascular in vitro e em pacientes HC. Por outro lado, apesar de ser menos potente que as estatinas foi mostrado que a inibição da absorção do colesterol tem também um efeito anti-inflamatório. A redução adicional do colesterol causado pela combinação das terapias hipolipemiantes outorga um maior beneficio cardiovascular em pacientes hipercolesterolêmicos. / The inflammatory process has a key role in the genesis and development of atherosclerosis and the endothelial disfunction is considered as a first step in atherogenesis. By inhibiting the hydroxyl-methyl-glutaryl coA reductase (HMGCR)m statins reduce the cholesterol synthesis and isoprenoid generation, which are intermediary products of cholesterol synthesis with important role in posttranscriptional modifications of small GTPases that are involved in endothelial disfunction and vascular inflammation. The ezetimibe is an inhibitor of cholesterol absorption by inhibiting the NPC1L1 protein. To clarify the molecular mechanisms of the inhibition of cholesterol synthesis and absorption modulating inflammatory and cell adhesion biomarkers we used in vitro models of endothelial cells (HUVEC) and monocytes (THP-1), and an in vivo model of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from hypercholesterolemic (HC) patients. The effect of the statins, atorvastatin and simvastatin, and the ezetimibe on mRNA and protein expression of endothelial adhesion molecules and modulators of the inflammatory process, as citokynes and nitric oxide (NO), was analyzed in HUVEC. The effect of these drugs on the expression of monocyte adhesion molecules was also studied in THP-1. The influence of hypolipemiant therapy on the adhesion molecules was also analyzed in PBMC from HC treated with ezetimibe (10 mg/day/4-weeks), simvastatin (10 mg/day/8-weeks) and simvastatin combined with ezetimibe (10 mg each/day/4-weeks). The mRNA expression was evaluated by RT-qPCR. The expression of adhesion molecules on the surface of THP-1 and HUVEC cells was analyzed flow cytometry. The citokynes in the supernatants of HUVEC were quantified using the milliplex technology. The Lipid profile, high-sensivity PCR (hsPCR) and NO were determined by conventional laboratory methods. The role of the NO on the statin-modulation of inflammatory markers was also studied using a model with silenced NOS3 by interference of mRNA and by the use of the inhibitor of NO synthesis, L-NAME. The effect of hypolipemiants on the expression of microRNAs (miRs) 221, miR-222 and miR-1303 was also evaluated in HUVEC using the stem-loom RT-qPCR. Atorvastatin and simvastatin reduced the mRNA and protein expression of the adhesion molecules L-Selectin, PSGL-1 and VLA-4 in THP-1 cells pre-treated with TNFα for 12 h. The ezetimibe reduced the L-Selectin expression only at transcriptional level. In HUVEC, statins diminished IL1B and SELP mRNA expression, whereas VCAM1 was increased. The ezetimibe reduced the IL1B mRNA expression. However, SELE, MMP9, IL6 and MMP9 mRNA expressions were not affected by the treatments. The protein expression of ICAM-1 and P-Selectin on the surface of HUVEC was reduced by statins, but not by the ezetimibe. Similarly, IL-6 and MCP-1 secretion were reduced by statins, whereas IL-8 secretion was not modified by the treatments. The NO release and NOS3 expression in HUVEC was increased by the statins, however it was not stimulated by ezetimibe. Moreover, the anti-inflammatory statin effects were independent of this pathway due to statin effects were maintained in HUVEC with silenced NOS3. Although the statin effect on ICAM-1 and MCP-1 were attenuated by L-NAME co treatment, the statin effects seem to be independent of NO release. Statins and ezetimibe reduced miR221 in HUVEC. miR-222 expression was reduced only by atorvastatin. miR-1303 was not affected by the treatments. In HC patients, the improvement of the lipid profile simvastatin combined with ezetimibe was more efficient than both monotherapies. Similarly, the association therapy was better in reducing the mRNA expression in PBMC and plasma concentration of IL-1β, MCP-1, IL-8 and TNFα. ICAM1 expression was reduced only at transcriptional level, whereas mRNA but not protein expression of TNFα was also reduced by the simvastatin monotherapy. There was no modulation mRNA or protein expression of other studied markers in the in vivo model. Additionally, the anti-inflammatory effects observed in the HC were independent of PCRus or NO modulation, which were not altered by the hypolipemiant treatments. In this study, the proposed plitropic effects of statins were confirmed in monocytes and endothelial cells in vitro and in HC patients. Moreover, although it was less potent than statins, an anti-inflammatory effect was also observed for the inhibition of cholesterol absorption. An additional reduction of the cholesterol caused by combined hypolipemiant therapies gives a greater cardiovascular beneffict in hypercholesterolemic patients.

Introdução: As CYP3A4 e CYP3A5 são enzimas do citocromo P450 responsáveis pela biotransformação de esteróides endógenos e vários fármacos, entre eles as estatinas. Polimorfismos nos genes CYP3A4 e CYP3A5 (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D) foram associados com diferenças na resposta hipolipemiante de indivíduos tratados com atorvastatina e sinvastatina. Neste estudo foram avaliados os efeitos de hipolipemiantes sobre a expressão e a atividade de CYP3A4 e CYP3A5, em linhagens celulares HepG2 e Caco-2 e em CMSP de indivíduos hipercolesterolêmicos, e sua relação com variantes de CYP3A4 e CYP3A5. Métodos: Foram analisados 99 indivíduos normolipidêmicos (NL) e 139 hipercolesterolêmicos (HC). Os HC foram tratados com atorvastatina (10 mg/dia/4 semanas). A genotipagem das variantes CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D foi feita por PCR-RFLP ou sequenciamento. A análise da expressão de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 foi avaliada por PCR em tempo real quantitativo (PCRq). As proteínas totais de HepG2 foram avaliadas por Western Blotting. A atividade de CYP3A4 e CYP3A5 in vivo foi avaliada pela relação entre cortisol e seu metabólito, 6&#946;-hidróxicortisol, na urina (razão 6&#946;OH-cortisol/cortisol), por CLAE. Resultados: O perfil de expressão basal de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 é diferente entre HepG2 e Caco-2. Caco-2 expressa 31 vezes mais CYP3A4 e 122 vezes mais CYP3A5 que HepG2. Em células HepG2 tratadas por 12 h, a atorvastatina 20 &#181;M aumentou a expressão de CYP3A4 em 10 vezes, em relação ao controle (p=0,006). Após 24 h de tratamento, atorvastatina (1-20 &#181;M) aumentou a expressão de CYP3A4 em 5 a 8 vezes, nas HepG2 (p< 0,001). Para CYP3A5, a exposição por 12 h à atorvastatina 20 &#181;M aumentou a expressão em 4 vezes em relação ao controle ( p<0,001). A exposição à sinvastatina 1,0 &#181;M por 24 h aumentou a expressão de CYP3A4, em 2 vezes (p<0,01), em HepG2. Também se observou que, nesse tempo de tratamento, a sinvastatina (0,1 &#181;M a 10 &#181;M) aumentou a expressão de CYP3A5 em 2 a 4 vezes (p<0,05). A linhagem HepG2 apresenta alelos funcionais (CYP3A4*1A e CYP3A5*1A) em homozigose. A linhagem Caco-2 apresenta os alelos não funcionais CYP3A5*3C e CYP3A5*1D, em heterozigose. Também foi avaliada a expressão das proteínas CYP3A4 e CYP3A5 por Western Blotting, em células HepG2, após atorvastatina (0,1 a 20 &#181;M) e sinvastatina (0,01 a 10 &#181;M) por 12 e 24 h. O perfil de expressão das proteínas não diferiu com os tratamentos. Nas células mononucleares do sangue periférico (CMSP), a expressão de RNAm basal de CYP3A4 é cerca de 2,5 a 9,6 vezes maior que a expressão de CYP3A5 (p< 0,05). Observou-se correlação da expressão de CYP3A4 e CYP3A5 nessas células, antes (r2 = 0,22; p< 0,0001) e após o tratamento (r2 = 0,58; p<0,0001) com atorvastatina. A expressão basal de RNAm de CYP3A4 e CYP3A5 é maior nos indivíduos (NL) que nos indivíduos (HC) (p<0,05). A atorvastatina não influenciou a expressão de CYP3A4 e CYP3A5 em CMSP (p> 0,05). Os indivíduos NL apresentam atividade de CYP3A4 e CYP3A5 basal maior que os indivíduos HC- (p<0,0001). O tratamento com atorvastatina não alterou a atividade de CYP3A4 e CYP3A5 nos HC (p>0,05). As variantes gênicas estudadas (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D) como grupos haplotípicos não afetaram a resposta ao tratamento, a expressão de RNAm ou a atividade de CYP3A4 e CYP3A5, embora o haplótipo AGT tenha expressão basal de RNAm de CYP3A5 menor que os portadores de haplótipos GAT e GAC (p<0,005). Conclusão: Os resultados deste trabalho nos permitem concluir que a atorvastatina e a sinvastatina, mas não a ezetimiba, influenciam a expressão de CYP3A4 e CYP3A5 in vitro, em linhagem derivada de hepatócitos (HepG2), e que este efeito não foi reproduzido em linhagem derivada de enterócitos (Caco-2). A expressão de CYP3A4 e CYP3A5 tem grande variabilidade interindividual, independente do grupo haplotípico de cada indivíduo, e que não é influenciada pela atorvastatina. / Background: CYP3A4 and CYP3A5 are enzymes from the cytochrome P450 resposible for the biotransformation of endogenous steroids and several drugs, e.g. statins. Polymorphisms in CYP3A4 and CYP3A5 (CYP3A4*1B, CYP3A5*3C and CYP3A5*1D) have been associated with variation of lipid-lowering response in individuals treated with atorvastatin and simvastatin. In this study we evaluated the effect of hypolipemiants on expression and activity of CYP3A4 and CYP3A5, in HepG2 and Caco-2 cell lines as well as peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in hypercholesterolemic individuals, and their relationship with CYP3A4 and CYP3A5 variants. Methods: We analyzed 99 normolipidemic individuals (NL) and 139 hypercholesterolemic (HC). HC subjects were treated with atorvastatin (HC, 10 mg/day/4 weeks). Analysis of CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D variants was performed with PCR-RFLP or sequencing assays and mRNA expression of CYP3A4 and CYP3A5 with Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) was performed . Total protein content was extracted from HepG2 for Western Blotting experiments. Activity of CYP3A4 and CYP3A5 in vivo was evaluated by 6&#946;OH-cortisol and cortisol ratio in urine samples, by HPLC-UV method. Results: Baseline mRNA expression is different for HepG2 and Caco-2. Caco-2 expresses 31 times more CYP3A4 and 122 times more CYP3A5 than HepG2. In HepG2 cells treated for 12h, atorvastatin 20 &#181;M increased CYP3A4 expression in 10 times, when compared to the control (p=0.006). After 24h treatment, atorvastatin (1-20 &#181;M) increased CYP3A4 mRNA expression in 5 to 8 times, in HepG2 (p< 0.001). To CYP3A5, exposure for 12h to atorvastatin 20 &#181;M increased expression in 4 times when compared to the control (p<0.001). Exposure to simvastatin 1.0 &#181;M for 24 h increased CYP3A4 expression in 2 times, (p<0.01), in HepG2. With the 24h treatment,simvastatin (0.1 &#181;M - 10 &#181;M) CYP3A5 showed increased mRNA expression in 2 to 4 times (p<0.05). HepG2 cell line carries homozygous functional alleles (CYP3A4*1A e CYP3A5*1A). Caco-2 carries heterozygous CYP3A5*3C and CYP3A5*1D. We evaluated the protein expression of CYP3A4 and CYP3A5 with Western Blotting in HepG2 cells, after atorvastatin (0.1 - 20 &#181;M) and simvastatin (0.01 - 10 &#181;M) for 12 and 24 h. The proteins profile did not change with statins treatment. In PBMC, baseline mRNA expression of CYP3A4 is approximately 2.6 to 9.5 times higher than CYP3A5 (p< 0.05). There was a correlation in expression between CYP3A4 and CYP3A5, before (r2 = 0.22; p< 0.0001) and after treatment (r2 = 0.58; p<0.0001) with atorvastatin. Baseline mRNA expression of CYP3A4 and CYP3A5 is higher in (NL) than in (HC) (p<0.05). Atorvastatin treatment did not increase CYP3A4 and CYP3A5 mRNA in PBMC (p>0.05). CYP3A4/5 activity was higher in NL subjects than in HC (p<0.0001). Atorvastatin treatment did not affect CYP3A4/5 activity in HC (p>0.05). The studied variants CYP3A4*1B, CYP3A5*3C e CYP3A5*1D analyzed as a haplotype block did not affect response to treatment, mRNA expression or activity of CYP3A4 and CYP3A5. However, AGT haplotype showed lower CYP3A5 mRNA expression levels when compared to GAC and GAT haplotypes at baseline (p<0.05). Conclusion: The results of this study allow us to conclude that atorvastatin and simvastatin, but not ezetimibe, influence the expression of CYP3A4 and CYP3A5 mRNA in vitro in HepG2 cell line, but this effect was not reproduced in Caco-2 cell line or PBMC. CYP3A4 and CYP3A5 present great interindividual variability, despite the individual´s haplotype and is not influenced by atorvastatin.

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marissa Giovanna Schamne.pdf: 3175915 bytes, checksum: cd148ffb822e2d056d16fd1b808434b1 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Currently Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease, and yet there is no effective therapy to control the progression of the disease, current treatments only relieve symptoms. The aim of this study was to evaluate the neuroprotective ability of statins on dopaminergic neurons from rats injured by the neurotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA), which was used as an animal model for PD. In order to test this hypothesis, the animals underwent stereotaxic surgery for infusion of 6-OHDA into the medial forebrain bundle in order to cause the death of dopaminergic neurons. Two different methodologies were used in this study regarding dopaminergic injury, 1) bilateral infusions for tests of social recognition, preference for sucrose, forced swimming test and open field, 2) unilateral infusion for test rotational behavior. The animals were treated for 10 days (3 days before surgery and for 7 days after) with vehicle, simvastatin or pravastatin 10 mg/kg. Statins with two different solubility were tested to evaluate if the effect occurs only on the central nervous system or if there is a peripheral effect too. In the social recognition test the animals 6-OHDA treated with statins had a significantly better performance than those of group 6-OHDA+vehicle. In the forced swimming test, animals 6-OHDA treated with statins spent less time immobile compared with animals of the 6-OHDA+vehicle. In the rotational behavior test the number of contralateral rotations in animals 6-OHDA treated with statins was significantly smaller when compared with animals of group 6-OHDA+vehicle. These results suggest that statins may have decreased the death of dopaminergic neurons. To confirm this hypothesis, the Western Blot test was performed for expression of the enzyme tyrosine hydroxylase (TH). It’s still necessary to conduct further tests to confirm the neuroprotective potential of statins. / A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum na atualidade, e ainda não há nenhuma terapia eficaz para controlar a progressão da doença, os tratamentos atuais apenas aliviam os sintomas. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade neuroprotetora das estatinas sobre os neurônios dopaminérgicos de ratos com lesão pela neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) como modelo animal da DP. Para testar tal hipótese, os animais foram submetidos à cirurgia estereotáxica para a infusão de 6-OHDA no feixe prosencefálico medial (FPM) a fim de provocar a morte de neurônios dopaminérgicos. Duas metodologias diferentes foram empregadas neste estudo para a lesão dopaminérgica, 1) infusão bilateral para os testes de reconhecimento social, preferência à sacarose, natação forçada e campo aberto, 2) infusão unilateral para o teste do comportamento rotatório. Os animais foram tratados durante 10 dias (3 dias antes da cirurgia e por mais 7 dias após) com veículo, sinvastatina ou pravastatina na dose de 10 mg/kg. Foram testadas duas estatinas com solubilidades diferentes para avaliar se o efeito acontece apenas sobre o sistema nervoso central ou se há efeito periférico. No teste do reconhecimento social os animais dos grupos 6-OHDA tratados com as estatinas tiveram um desempenho significativamente melhor do que os animais do grupo 6-OHDA+veículo. No teste da natação forçada, os animais do grupo 6-OHDA tratados com estatinas ficaram menos tempo imóveis quando comparados com os animais do grupo 6-OHDA+veículo. No teste do comportamento rotatório, o número de rotações contralaterais dos animais lesionados e tratados com as estatinas foi significativamente menor quando comparado com os animais do grupo 6-OHDA+veículo. Esses resultados sugerem que as estatinas possam ter diminuído a morte de neurônios dopaminérgicos. Para confirmar essa hipótese, foi realizada a técnica de Western Blot para a expressão da enzima tirosina hidroxilase (TH) no FPM. Mais alguns testes precisam ainda ser realizados para confirmar o potencial neuroprotetor das estatinas.

Neste trabalho foram estudadas duas abordagens para a obtenção de novos metabólitos secundários a partir de fungos. Na primeira, o ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) e cinco análogos foram sintetizados. Sua atividade como modificadores epigenéticos foi avaliada em oito linhagens fúngicas do ambiente marinho. Os fungos Penicillium sp. e Acremonium sp. apresentaram modificações no seu perfil metabolómico quando foram crescidos em pequena escala em presença do derivado 4F-SAHA, enquanto Microphaeropsis sp. apresentou modificação em presença do 3AM-SAHA. O fungo P. decaturense foi crescido em maior escala e os compostos de interesse foram isolados. Na segunda abordagem, uma nova estratégia de extração utilizando mistura de resinas XAD 2-4-7 permitiu a extração e posterior isolamento de seis novos alcaloides peptídicos (72-77) e dois peptídeos (78-79) a partir da fração aquosa do meio de cultivo do fungo antártico Penicillium solitum IS1-A. Utilizando a mesma metodologia, o metabolismo secundário do fungo antártico Thelebolus globosus E2 foi estudado. A partir de seu extrato metanólico do meio liquido PDB foram isoladas a ciclopenina (86) e o ciclopenol (87) e foram detectados os alcaloides viridicatina (88) e viridicatol (89). O fungo Thelebolus globosus mostrou-se produtor de estatinas, sendo isoladas como composto majoritário a mevastatina (90). / In this work two approaches to obtain new secondary metabolites from fungi were studied. Suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) and five analogues were synthesized and assessed as epigenetic modifiers in eight marine-derived fungi. The fungus Penicillium sp. and Acremonium sp. presented changes in their metabolomic profile when they were grown on a small scale in presence of 4F-SAHA derivative and Microphaeropsis sp. presented a modification in the presence of the 3 AM-SAHA. In the second approach a new extraction strategy using XAD 2-4-7 resin mixture allowed the extraction and subsequent isolation of six new peptide alkaloids (72-77) and two peptides (78-79) from the aqueous fraction of the culture medium of the Antarctic fungus Penicillium solitum IS1-A. Using the same methodology, the secondary metabolism of the Antarctic fungus Thelebolus globosus E2 was studied. From the methanolic extract of the PDB liquid medium cyclopenine (86) and cyclopenol (87) were isolated and the viridicatine (88) and viridicatol (89) alkaloids were detected. The fungus Thelebolus globosus was shown to be a producer of statins, mainly of mevastatin (90).

Encefalite auto-imune experimental (EAE) é o modelo animal da doença humana esclerose múltipla. Foi demonstrado que as estatinas podem ter efeitos benéficos na EAE. Diversos mecanismos de ação foram descritos para explicar esses efeitos, entre eles: estímulo a expressão de HO-1, inibição da expressão de Toll-like receptors (TLR) e inibição da produção de citocinas de padrão Th1. Estudamos o efeito de uma estatina, a sinvastatina, na evolução clínica da EAE e seus mecanismos de ação. Também avaliamos o papel do TLR4 na EAE. O tratamento com sinvastatina melhorou a evolução clínica da EAE nas doses de 1 e 5 mg/kg/dia. A análise do infiltrado celular no SNC mostrou mudança do padrão de diferenciação dos linfócitos com menor porcentagem de células produtoras de IL-17 nos grupos tratados em relação aos controles. Os animais TLR-4 -/- apresentaram melhor evolução da doença. Concluímos que o tratamento com sinvastatina melhora a evolução clínica da EAE através da inibição da produção de IL-17 e que animais TLR-4 -/- têm melhor desfecho clínico na EAE que os controles. / Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is considered the experimental model for the human multiple sclerosis disease. It has been demonstrated that statins, used as lipid-lowering agents, can have beneficial effects on EAE. Several actions have been described to explain these effects: enhancement of HO-1 expression, inhibition of Toll-like receptors expression and inhibition of Th1 cytokines. We have investigated the effect of a statin, simvastatin, on EAE clinical development and the mechanisms behind those effects. Simvastatin treatment ameliorated EAE clinical outcome at doses 1 and 5 mg/kg/day. SNC cellular infiltrates analysis showed altered pattern of differentiation with decreased percentage of IL-17-producing T lymphocytes in treated group comparing with controls. TLR4 -/- mice showed better clinical development. We concluded that simvastatin treatment ameliorates EAE clinical outcome through inhibition of IL-17 production. Mice TLR4 -/- have better EAE clinical outcome than WT controls.

Orientador: Álvaro Takeo Omori / Disseração (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Quimica, 2012.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As doenÃas cardiovasculares (CVDs) compreendem um amplo espectro de doenÃas do coraÃÃo e vasos sanguÃneos (artÃrias e veias), entre as quais se incluem a doenÃa das artÃrias coronÃrias, o ataque cardÃaco, a angina, a sÃndrome coronariana aguda, o aneurisma da aorta, arritmias cardÃacas, a doenÃa cardÃaca congÃnita, a insuficiÃncia cardÃaca e a doenÃa cardÃaca reumÃtica. Entre os principias fÃrmacos que tratam as doenÃas cardiovasculares estÃo: (i) as estatinas, que atuam inibindo a 3-hidroxi-3-metilgluratil coenzima A (HMG-CoA) redutase no processo de conversÃo da HMG-CoA em mevalonato, numa das etapas da biossÃntese do colesterol. Observa-se em ensaios clÃnicos que a aÃÃo das estatinas pode diminuir os nÃveis de colesterol de baixa densidade (LDL) entre 20\% e 60\%, reduzindo os eventos coronarianos em atà 1/3 no perÃodo de cinco anos; (ii) a aspirina, com a qual hà mais de 400 preparaÃÃes nos EUA e se produz cerca de 20 mil toneladas anualmente. ApÃs mais de um sÃculo de prÃtica clÃnica, a aspirina continua sendo a droga antitrombÃtica, antitÃrmica, analgÃsica e antiproliferativa mais amplamente recomendada. Ela age bloqueando a biossÃntese de hormÃnios inflamatÃrios prostanÃides atravÃs da inibiÃÃo das enzimas ciclooxigenase COX-1 e COX-2; (iii) os anti-hipertensivos, para os quais a Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) à o principal alvo (inibidores da ECA estÃo no mercado a mais de 20 anos) visando o combate das pressÃes arteriais elevadas, que provocam alteraÃÃes nos vasos sanguÃneos e na musculatura do coraÃÃo, e levam a hipertrofia do ventrÃculo esquerdo do coraÃÃo, acidente vascular cerebral, infarto do miocÃrdio, morte sÃbita, insuficiÃncias renal e cardÃaca, etc. A hipertensÃo arterial (HTA) ou hipertensÃo arterial sistÃmica (HAS), conhecida popularmente como pressÃo alta, à uma das doenÃas com maior prevalÃncia no mundo moderno. A ECA atua na regulaÃÃo da pressÃo sanguÃnea via conversÃo do decapeptÃdeo angiotensina I no potente vasopressor angiotensina II e tambÃm pela inativaÃÃo da bradicinina, sendo componente central do Sistema Renina-Angiotensina-Aldeosterona (SRAA), que controla a pressÃo sanguÃnea e tem forte influÃncia nas funÃÃes relacionadas ao coraÃÃo e os rins, bem como na contraÃÃo dos vasos sanguÃneos. Nesta tese realiza-se um estudo da bioquÃmica quÃntica de estatinas (atorvastina, rosuvastatina, cerivastatina, mevastatina, sinvastatina e fluvastatina), da aspirina/bromoaspirina e de anti-hipertensivos (captopril, enalapril, lisinopril, ramipril, trandolapril e perindopril) levando-se em conta dados cristalogrÃficos dos seus sÃtios de ligaÃÃo nas proteÃnas HMGR, COX-1 (o da aspirina foi simulado partindo-se dos dados da bromoaspirina) e ECA, respectivamente. As simulaÃÃes computacionais foram realizadas considerando-se a Teoria do Funcional de Densidade (DFT) na aproximaÃÃo da densidade local (LDA) e funcional de troca e correlaÃÃo PWC, com energia de interaÃÃo entre os resÃduos das proteÃnas circunscritos ao sÃtio de ligaÃÃo de raio r e os fÃrmacos calculada atravÃs do mÃtodo de fracionamento molecular com capas conjugadas (MFCC). Os resultados obtidos para as estatinas sugerem que: (i) as mais (menos) eficazes sÃo a atorvastatina e a rosuvastatina (sinvastatina e fluvastatina), o que està de acordo com a clÃnica e valores dos seus Ãndices de concentraÃÃes inibitÃrias IC50; (ii) sÃtios de ligaÃÃo com raios de pelo menos 12 à (alÃm do raio de 9,5 à sugerido pela anÃlise estrita de dados cristalogrÃficos) devem ser considerados para que resÃduos importantes como E665, D767, e R702 sejam considerados para que as eficiÃncias das estatinas sejam corretamente explicadas. Para a aspirina/bromoaspirina utilizou-se um refinamento quÃntico de segunda ordem dos dados cristalogrÃficos para se demonstrar que a energia de ligaÃÃo de ambos com a COX-1 sÃo aproximadamente a mesma, o que explica resultados experimentais de IC50 similares. A existÃncia de resÃduos atrativos e resulsivos à destacada, mostrando-se que Arg120 à o resÃduo que mais atrai o Ãcido salicÃlico apÃs acetilaÃÃo da Ser530, seguido de Ala527, Leu531, Leu359 e Ser353; por outro lado, Glu524 à o resÃduo repulsivo mais efetivo (intensidade comparÃvel ao Arg120), nunca tendo sido antes considerado como resÃduo importante no sÃtio de ligaÃÃo da aspirina/bromoaspirina na COX-1. Finalmente, no caso dos anti-hipertensivos, obtÃm-se que à necessÃrio se considerar raios do sÃtio de ligaÃÃo de 16 à para se obter que o lisinopropil e o ramipril (trandolapril e perindopril) apresentam as maiores (menores) energias de ligaÃÃo, o que explica a maior (menor) constante de inibiÃÃo dos mesmos entre os anti-hipertensivos estudados para a ACE da Drosophila melanogaster.

As elevadas taxas de colesterol plasmático representam um grande risco à saúde, uma vez que podem causar doenças cardiovasculares. Para o tratamento e prevenção da dislipidemia são utilizados medicamentos reguladores do colesterol, como as estatinas. Embora eficazes e extensamente utilizados, esses fármacos apresentam efeitos adversos se administrados na dosagem errada. Assim, faz-se necessário o desenvolvimento de um método de monitorização terapêutica a fim de se ajustar a concentração desses compostos no sangue. Este trabalho visa o desenvolvimento de um método para análise de pravastatina (PRA), atorvastatina (AT), fluvastatina (FLV) e sinvastatina (SV) em plasma humano usando cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). Na etapa de preparo de amostras, de forma inédita, utilizou-se a técnica microextração por sorvente empacotado (MEPS) para a análise de plasma humano contendo quatro estatinas. Para a otimização das condições de extração avaliaram-se, por experimentos univariados, parâmetros como fase extratora, composição do solvente de eluição e de lavagem. Outros fatores como volume de amostra, ciclos de amostragem, ciclos de eluição e etapas de eluição foram avaliados empregando-se planejamento experimental multivariado. A extração foi realizada utilizando-se uma fase estacionária C18 Chromabond como sorvente. O método MEPS-LC-MS/MS desenvolvido foi validado baseando-se nas recomendações da agência nacional de vigilância sanitária (ANVISA) e apresentou linearidade, seletividade, precisão, exatidão e recuperação adequadas para as estatinas, excetuando-se para a sinvastatina. A faixa de linearidade obtida foi de 10-200 ng mL-1 (FLV e AT) e 20-200 ng mL-1 (PRA). Os limites de quantificação obtidos foram da ordem de 10 ng mL-1 (AT e FLV) e 20 ng mL-1 (PRA). Desta forma o método desenvolvido poderá ser utilizado para a determinação dos níveis de pravastatina, fluvastatina e atorvastatina em amostras de plasma humano. / Elevated plasma cholesterol level is a risk factor for coronary diseases, which are the most deadly sickness according to the World Health Organization (WHO). In order to fight the hypercholesterolemia in patients, statins are a well-established class of drugs to be prescribed. Even though they are efficient, some side effects can be associated with statin therapy, especially when interactions with other drugs occur. In these cases, monitoring the concentration can optimize the drug dosage to therapeutic effectiveness whilst minimizing the adverse effects. The aim of this work was to develop a method for analysis of pravastatin (PRA), atorvastatin (AT), fluvastatin (FLV) and simvastatin (SV) in human plasma. The experimental means chosen to attain the goal was liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and for the sample preparation, microextraction by packed sorbent (MEPS). To optimize the extraction conditions, parameters such as sorbent, elution and washing solution were evaluated. Other parameters such as sampling, elution cycles, sample volume and elution steps were evaluated using multivariate experimental design. The extraction was performed using C18 Chromabond as sorbent. The method was validated based on ANVISA recommendations and featured appropriated linearity, selectivity, accuracy, precision, and recovery, except for simvastatin. The calibration curve in plasma was obtained in the concentration range 10-200 ng mL-1 (FLV and AT) and 20-200 ng mL-1 (PRA) and the limit of quantification (LOQ) was 10 ng mL-1 (FLV and AT) and 20 ng mL-1 (PRA). The method developed proved to be suitable for the analysis of pravastatin, fluvastatin and atorvastatin in human plasma sample, but not simvastatin, and it can contribute to a more efficient usage of the statins in the treatment of hypercholesterolemia.

Neste trabalho foram estudadas duas abordagens para a obtenção de novos metabólitos secundários a partir de fungos. Na primeira, o ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) e cinco análogos foram sintetizados. Sua atividade como modificadores epigenéticos foi avaliada em oito linhagens fúngicas do ambiente marinho. Os fungos Penicillium sp. e Acremonium sp. apresentaram modificações no seu perfil metabolómico quando foram crescidos em pequena escala em presença do derivado 4F-SAHA, enquanto Microphaeropsis sp. apresentou modificação em presença do 3AM-SAHA. O fungo P. decaturense foi crescido em maior escala e os compostos de interesse foram isolados. Na segunda abordagem, uma nova estratégia de extração utilizando mistura de resinas XAD 2-4-7 permitiu a extração e posterior isolamento de seis novos alcaloides peptídicos (72-77) e dois peptídeos (78-79) a partir da fração aquosa do meio de cultivo do fungo antártico Penicillium solitum IS1-A. Utilizando a mesma metodologia, o metabolismo secundário do fungo antártico Thelebolus globosus E2 foi estudado. A partir de seu extrato metanólico do meio liquido PDB foram isoladas a ciclopenina (86) e o ciclopenol (87) e foram detectados os alcaloides viridicatina (88) e viridicatol (89). O fungo Thelebolus globosus mostrou-se produtor de estatinas, sendo isoladas como composto majoritário a mevastatina (90). / In this work two approaches to obtain new secondary metabolites from fungi were studied. Suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) and five analogues were synthesized and assessed as epigenetic modifiers in eight marine-derived fungi. The fungus Penicillium sp. and Acremonium sp. presented changes in their metabolomic profile when they were grown on a small scale in presence of 4F-SAHA derivative and Microphaeropsis sp. presented a modification in the presence of the 3 AM-SAHA. In the second approach a new extraction strategy using XAD 2-4-7 resin mixture allowed the extraction and subsequent isolation of six new peptide alkaloids (72-77) and two peptides (78-79) from the aqueous fraction of the culture medium of the Antarctic fungus Penicillium solitum IS1-A. Using the same methodology, the secondary metabolism of the Antarctic fungus Thelebolus globosus E2 was studied. From the methanolic extract of the PDB liquid medium cyclopenine (86) and cyclopenol (87) were isolated and the viridicatine (88) and viridicatol (89) alkaloids were detected. The fungus Thelebolus globosus was shown to be a producer of statins, mainly of mevastatin (90).

COSTA, Roner Ferreira da. Bioquímica quântica das estatinas, aspirina e anti-hipertensivos. 2011. 185 f. Tese (Doutorado em Física) - Programa de Pós-Graduação em Física, Departamento de Física, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by Edvander Pires (edvanderpires@gmail.com) on 2015-05-29T22:17:20Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_rfcosta.pdf: 5384677 bytes, checksum: b7096c8a3fe046f09eec5640166b7cba (MD5) / Approved for entry into archive by Edvander Pires(edvanderpires@gmail.com) on 2015-05-29T22:18:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_rfcosta.pdf: 5384677 bytes, checksum: b7096c8a3fe046f09eec5640166b7cba (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-29T22:18:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_rfcosta.pdf: 5384677 bytes, checksum: b7096c8a3fe046f09eec5640166b7cba (MD5) Previous issue date: 2011 / As doenças cardiovasculares (CVDs) compreendem um amplo espectro de doenças do coração e vasos sanguíneos (artérias e veias), entre as quais se incluem a doença das artérias coronárias, o ataque cardíaco, a angina, a síndrome coronariana aguda, o aneurisma da aorta, arritmias cardíacas, a doença cardíaca congênita, a insuficiência cardíaca e a doença cardíaca reumática. Entre os principias fármacos que tratam as doenças cardiovasculares estão: (i) as estatinas, que atuam inibindo a 3-hidroxi-3-metilgluratil coenzima A (HMG-CoA) redutase no processo de conversão da HMG-CoA em mevalonato, numa das etapas da biossíntese do colesterol. Observa-se em ensaios clínicos que a ação das estatinas pode diminuir os níveis de colesterol de baixa densidade (LDL) entre 20\% e 60\%, reduzindo os eventos coronarianos em até 1/3 no período de cinco anos; (ii) a aspirina, com a qual há mais de 400 preparações nos EUA e se produz cerca de 20 mil toneladas anualmente. Após mais de um século de prática clínica, a aspirina continua sendo a droga antitrombótica, antitérmica, analgésica e antiproliferativa mais amplamente recomendada. Ela age bloqueando a biossíntese de hormônios inflamatórios prostanóides através da inibição das enzimas ciclooxigenase COX-1 e COX-2; (iii) os anti-hipertensivos, para os quais a Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) é o principal alvo (inibidores da ECA estão no mercado a mais de 20 anos) visando o combate das pressões arteriais elevadas, que provocam alterações nos vasos sanguíneos e na musculatura do coração, e levam a hipertrofia do ventrículo esquerdo do coração, acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio, morte súbita, insuficiências renal e cardíaca, etc. A hipertensão arterial (HTA) ou hipertensão arterial sistêmica (HAS), conhecida popularmente como pressão alta, é uma das doenças com maior prevalência no mundo moderno. A ECA atua na regulação da pressão sanguínea via conversão do decapeptídeo angiotensina I no potente vasopressor angiotensina II e também pela inativação da bradicinina, sendo componente central do Sistema Renina-Angiotensina-Aldeosterona (SRAA), que controla a pressão sanguínea e tem forte influência nas funções relacionadas ao coração e os rins, bem como na contração dos vasos sanguíneos. Nesta tese realiza-se um estudo da bioquímica quântica de estatinas (atorvastina, rosuvastatina, cerivastatina, mevastatina, sinvastatina e fluvastatina), da aspirina/bromoaspirina e de anti-hipertensivos (captopril, enalapril, lisinopril, ramipril, trandolapril e perindopril) levando-se em conta dados cristalográficos dos seus sítios de ligação nas proteínas HMGR, COX-1 (o da aspirina foi simulado partindo-se dos dados da bromoaspirina) e ECA, respectivamente. As simulações computacionais foram realizadas considerando-se a Teoria do Funcional de Densidade (DFT) na aproximação da densidade local (LDA) e funcional de troca e correlação PWC, com energia de interação entre os resíduos das proteínas circunscritos ao sítio de ligação de raio r e os fármacos calculada através do método de fracionamento molecular com capas conjugadas (MFCC). Os resultados obtidos para as estatinas sugerem que: (i) as mais (menos) eficazes são a atorvastatina e a rosuvastatina (sinvastatina e fluvastatina), o que está de acordo com a clínica e valores dos seus índices de concentrações inibitórias IC50; (ii) sítios de ligação com raios de pelo menos 12 Å (além do raio de 9,5 Å sugerido pela análise estrita de dados cristalográficos) devem ser considerados para que resíduos importantes como E665, D767, e R702 sejam considerados para que as eficiências das estatinas sejam corretamente explicadas. Para a aspirina/bromoaspirina utilizou-se um refinamento quântico de segunda ordem dos dados cristalográficos para se demonstrar que a energia de ligação de ambos com a COX-1 são aproximadamente a mesma, o que explica resultados experimentais de IC50 similares. A existência de resíduos atrativos e resulsivos é destacada, mostrando-se que Arg120 é o resíduo que mais atrai o ácido salicílico após acetilação da Ser530, seguido de Ala527, Leu531, Leu359 e Ser353; por outro lado, Glu524 é o resíduo repulsivo mais efetivo (intensidade comparável ao Arg120), nunca tendo sido antes considerado como resíduo importante no sítio de ligação da aspirina/bromoaspirina na COX-1. Finalmente, no caso dos anti-hipertensivos, obtém-se que é necessário se considerar raios do sítio de ligação de 16 Å para se obter que o lisinopropil e o ramipril (trandolapril e perindopril) apresentam as maiores (menores) energias de ligação, o que explica a maior (menor) constante de inibição dos mesmos entre os anti-hipertensivos estudados para a ACE da Drosophila melanogaster.