O objetivo deste estudo foi avaliar, em crianças de creches públicas e filantrópicas do município de São Paulo, a prevalência de cárie dental e os fatores de risco relacionados à presença de cárie e presença de altos níveis de estreptococos mutans (SM). Foram incluídas variáveis denominadas sociodemográficas, condições de gestação e nascimento, variáveis fisiológicas do estado nutricional, aleitamento materno e alimentação complementar, hábitos alimentares, variáveis comportamentais e odontológicas. O estudo foi desenvolvido em parceria entre a Disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo (FOUSP) e a Disciplina de Nutrologia do Departamento de Pediatria da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP EPM). É parte integrante do Projeto Crecheficiente - Ações de Segurança e Educação Alimentar em Creches Públicas e Filantrópicas do Município de São Paulo. A população deste estudo foi constituída de 150 e 144 crianças, que participaram da avaliação odontológica e microbiológica respectivamente, entre 12 e 24 meses, de ambos os gêneros, regularmente matriculadas em cinco creches, sendo duas públicas e três filantrópicas. A coleta dos dados foi obtida por meio de entrevistas com as mães ou responsáveis, antropometria, coleta de sangue para dosagem de hemoglobina, avaliação odontológica (índices ceo-d e ceo-d modificado) e coleta salivar das mães e das crianças para teste de estreptococos mutans. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando análise de regressão logística univariada, considerando o nível de significância a 5%. Foram utilizadas as mesmas variáveis de risco e seus respectivos pontos de corte nas análises univariadas da avaliação odontológica e microbiológica. Das crianças examinadas 7,3% apresentaram experiência de cárie, sendo encontrada uma média do índice ceo-d igual a 0,09 e ceo-d mod de 3,37, sem diferença entre gêneros e tipo de creche. Em relação à presença de cárie, a análise de regressão univariada indicou significância dos seguintes fatores: o tempo de matrícula na creche, aleitamento materno exclusivo menor de 60 dias, idade do primeiro contato com açúcar, e níveis altos de SM que favoreceram a ocorrência da doença, o número maior de irmãos e a presença de biofilme visível foram significantes e associados com proteção. Dentre os alimentos citados encontrados na dieta dos lactentes, observa-se que o consumo de mel e o consumo de refrigerantes favoreceram a ocorrência da cárie dentária. Em relação à presença de SM, 72,9% das crianças tinham este microrganismo presente na cavidade bucal sendo que 9,5% apresentavam altos níveis de SM. As variáveis que influenciaram significantemente os altos níveis de SM foram: idade da mãe, idade de introdução do açúcar e presença de cárie dentária na criança. Em relação aos hábitos alimentares apenas o consumo de petit suisse favoreceu a quantidade elevada de SM. A contagem dos níveis salivares de SM da mãe não foi significante. / The aim of this study was to assess in children of public and philanthropic day care centers of São Paulo, the prevalence of dental carie and the risk factors associated to dental carie and high levels of mutans streptococci (MS). Were included variables denominated socio-demographic, pregnancy and birth conditions, physiological variables of nutrition status, breast feeding and complementary diet, dietary habits, behavior and dental variables. This study was the result of a partnership between the Pediatrics Department of the University of São Paulo and the Nutrology Department of Federal University of São Paulo, UNIFESP EPM. It is part of a larger study called Crecheficiente Project Security and Dietary Education actions of public and philanthropic day care centers of São Paulo city. The population of this study were consisted of 150 and 144 children that participated of the dental and microbiological evaluation respectively, between 12 and 24 years old, both gender, regularly registered in five day care centers, two publics and three philanthropic. The data collection were done by interviews with mothers or childrens responsible, anthropometry, bloody collection for hemoglobin, dental test (Knutson, dmf and modified dmf) and salivary collection from mothers and children for estreptococos mutans test analysis. Data analysis involved univariate logistic regression, The level of significance was set at 5%. The same variables presented at univariate analysis of the dental test and break point, were described into microbiological test. 7,3% of the children had dental carie. A mean of dmft index were 0,09 and modified dmft 3,37. No difference was found between gender and type of day care center. The univariate analyses indicated significance for caries experience: time of day care center admission, exclusive breast feeding least than 60 days, age of the first sugar contact, high levels of MS benefit caries, the major number of brothers and sisters, presence of dental plaque were associated to protection. The foods found in the dietary habits of the infants, honey and soft drinks exposed the occurrence of dental caries. For the streptococci mutans experience, 72,9% of the children had the microorganism present and 9,5% were high levels of MS. The variables that influence significantly this group were: mothers age, age of the first sugar contact and childrens carie experience. In the dietary habits, only the pettit suisses consume exposed to high levels of SM. The mothers mutans streptococci levels were not significant.

Objetivos: Determinar a taxa de prevalência de colonização materna por Estreptococo do grupo B na população de gestantes com idade gestacional de 35 semanas ou mais frequentadoras do pré-natal em dois hospitais (Hospital Universitário Júlio Muller - HUJM e Hospital Beneficente Santa Helena) na cidade de Cuiabá, Mato Grosso. Materiais e Métodos: Entre outubro de 2011 e 2013 foram avaliadas 258 gestantes no HUJM e do Hospital Santa Helena. Após concordarem e assinarem o TCLE, as gestantes de 35 semanas ou mais que não tinham sido submetidas ao exame ginecológico e não estavam em uso de antibióticos e atendiam aos critérios de inclusão, foram submetidas a coleta de swab vaginal e retal conforme protocolo estabelecido. Acondicionado em meio de transporte Stuart e no laboratório cultivado em caldo Granada bifásico IGBL. Após 24 horas, amostras com coloração laranja ou avermelhada foram consideradas positivas, caso contrário, nova leitura com 48 horas de cultivo. Os dados foram submetidos a análise estatística utilizando o EPI-Info da OMS. Resultados: Das 258 amostras 13,95% foram positivas para o EGB com IC (95%) de 9.70% a 18.21%. A avaliação estratificada pela idade gestacional predominou nas gestantes de 36 semanas com 35% de positividade, 10.87% para 37 semanas. E 5.88% para 35 semanas. No trabalho de parto prematuro 33.33% e na amniorrexe prematura 28,57% dos casos eram positivos para o EGB. Os demais parâmetros analisados não mostraram significância estatística. Conclusões: A taxa de prevalência da colonização pelo EGB de uma forma global foi estimada em 13.95%, sendo mais elevada na idade gestacional de 36 semanas com taxa de 35%. Este trabalho deve mudar as políticas públicas de saúde na cidade de Cuiabá / Purpose: To determine the prevalence rate of maternal colonization by Group B Streptococcus in the population of pregnant women in the gestational age of 35 or more weeks, attending prenatal care in two hospitals (HUJM - Hospital Universitário Júlio Muller and Hospital Santa Helena), in the city of Cuiabá, Mato Grosso. Materials and methods: Between October 2011 and October 2013, 258 pregnant women were assessed in HUJM and Hospital Santa Helena. After agreeing and signing the FCCT (Free and clarified Consent Term), those pregnant women of 35 weeks or more, who had not undergone gynecological examination, who were not on antibiotics and who also met the inclusion criteria, were subjected to vaginal and rectal swab collection, according to the established protocol. Stowed in Stuart transport medium and cultivated in IGBL biphasic Granada Broth in the laboratory. After 24 hours, samples with orange or reddish colors were considered positive, otherwise, new evaluation with a 48-hour culture was done. Data were submitted to statistical analysis, using OMS\' EPI-Info. The results: From the 258 given samples, 13.21% were positive for EGB, CI (95%) from 9.70% to 18.21%. Evaluation stratified by gestational age was predominant in pregnant women of 36 weeks with 35% positivity rate, 10.87% of pregnant women of 37 weeks and 5.88% of women of 35 weeks. During preterm labor 33.33% and in premature rupture of membranes, 28.57% cases were positive for GBS. Other analyzed parameters showed no significant statistically. Conclusion: The overall prevalence rate of GBS colonization was estimated at 13.95%, being higher in the gestational age of 36 weeks, with a rate of 35%. The present work should change public health policies in the city of Cuiabá

O objetivo do presente estudo foi avaliar, em aparelhos disjuntores de Haas, a contaminação in situ por estreptococos do grupo mutans, sob a forma de colônias/biofilmes, nas diferentes superfícies (acrílico, fios, bandas e parafusos), com e sem o uso de bochechos com gluconato de clorexidina a 0,12%, por meio de Cultura Microbiana e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Adicionalmente, a corrosão na área da união entre o fio, a solda de prata e a banda dos aparelhos foi avaliada por meio de Estereomicroscopia Ótica, MEV e análise em Espectrometria de Energia Dispersiva (EDS). Foram selecionados 34 pacientes de 7 a 12 anos de idade, que compareceram à clínica de Ortodontia Preventiva da FORP/USP, com necessidade de correção com aparelho disjuntor de Haas por problemas transversais da maxila (mordida cruzada posterior). Em seguida, utilizando uma tabela de números randômicos, os pacientes foram aleatoriamente divididos em dois grupos de 17 indivíduos cada (Grupos I e II). Durante todo o período de permanência dos aparelhos na cavidade bucal, no Grupo I (controle; n=17) os pacientes foram orientados a utilizar dentifrício fluoretado para escovação diária e não empregar bochechos com soluções antimicrobianas. Por outro lado, no Grupo II (experimental; n=17) os pacientes foram orientados a realizar, além da escovação diária com o uso de dentifrício fluoretado, 2 bochechos por semana com solução de gluconato de Clorexidina a 0,12% (Periogard®). Decorridos cerca de 4 meses da permanência na cavidade bucal, os aparelhos foram removidos. Sendo seccionadas, aleatoriamente, partes dos aparelhos constituídas de uma banda com fio soldado, para análise em estereomicroscopia ótica, MEV e EDS. Os resultados em estereomicroscopia foram submetidos à análise estatística por meio do teste de Fisher, com nível de significância de 5%. Em seguida, os aparelhos foram submetidos ao processamento microbiológico, em meio de cultura CaSa B, para contagem das colônias/biofilmes de estreptococos do grupo mutans. O teste estatístico não-paramétrico de Mann-Whitney foi aplicado para verificação de possíveis diferenças entre os grupos, com relação à formação de colônias/biofilmes sobre a superfície das diferentes áreas (parafuso, resina acrílica, bandas, fio vestibular e fio palatino), como também para verificar se havia diferença entre a formação de colônias/biofilmes sobre as superfícies livres (voltadas para a cavidade bucal) e as superfícies não-livres (em contato direto com a mucosa palatina e sulco gengival). O nível de significância adotado foi de 5%. Após cultura microbiana, partes dos aparelhos representativas de cada grupo foram submetidas ao processamento e análise em MEV. Os resultados obtidos evidenciaram que, com relação às colônias/biofilmes das superfícies nãolivres dos Grupos I e II, não houve diferença entre os grupos (p=0,009). No entanto, quando as superfícies livres dos Grupos I e II foram comparadas, evidenciou-se diferença significante entre os 2 grupos, em todas as áreas analisadas (parafuso, resina acrílica e bandas) (p<0,001). Os resultados da cultura microbiana foram confirmados em MEV. A análise em estereomicroscopia ótica evidenciou a presença de áreas de alteração de coloração sugestivas de corrosão na região de solda em contato com a banda e com o fio, em ambos os grupos (p=1). Os picos dos elementos químicos observados em EDS também foram semelhantes em ambos os grupos. Pôde-se concluir que o uso do gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®), sob a forma de bochecho, apresentou eficácia na redução da formação de colônias/biofilmes nas superfícies livres dos aparelhos disjuntores de Haas, in situ, sem elevação nos níveis de corrosão. / The purpose of this study was to evaluate, in situ, in Haas expanders, the contamination of different surfaces (acrylic resin, wires, bands and screws) by mutans group streptococci colonies/biofilms with and without prescription of 0.12% chlorhexidine gluconate mouthwashes, by means of microbial culture and scanning electron microscopy (SEM). Additionally, the corrosion in the area of union between the appliances wire, silver soldering and band was assessed by optical stereomicroscopy, SEM and energy dispersive spectroscopy (EDS). Thirty-four children aged 7 to 12 years were selected among the patients attending the Preventive Orthodontic Clinic at FORP/USP with need of corrective orthodontics with Haas expander due to transversal problems of the maxilla (posterior crossbite). Thereafter, using a table of random numbers, the patients were randomly assigned to two groups of 17 individuals each (Groups I and II). Throughout the time that the appliances remained in the oral cavity, the patients in Group I (control; n=17) were instructed to use a fluoridated dentifrice for daily toothbrushing and not to use antimicrobial mouthwash solutions. On the other hand, in Group II (experimental; n=17), in addition to daily toothbrushing with a fluoridated dentifrice, mouthwashes with an antimicrobial agent (0.12% chlorhexidine gluconate - Periogard®) were prescribed to the patients. After approximately 4 months of maintenance in the patients mouth, the appliances were retrieved. Thereafter, components of the appliances (consisting of a band with soldered wire) were sectioned at random for analysis under optical stereomicroscopy, SEM and EDS. The results of the optical stereomicroscopy were submitted to statistical analysis using Fisher\'s test at 5% significance level. The appliances were sent to microbiology processing, in CaSa B culture medium, for counting of the number of mutans streptococci colonies/biofilms. Mann-Whitney non-parametric statistical test was applied to verify possible differences between the groups with respect to the formation of colonies/biofilms on the surface of different areas (screw, acrylic resin, bands, buccal wire and palatal wire), as well as to determine whether there were differences between the formation of colonies/biofilms on free surfaces (facing the oral cavity) and non-free surfaces (in direct contact with the palatal mucosa and gingival sulcus). The level of significance was set at 5%. After microbial culture, components of the appliances that were representative of each group were submitted technical processing and SEM analysis. The obtained results showed that there was no statistically significant difference between Groups I and II (p=0.009) regarding the formation of colonies/biofilms on the non-free surfaces. However, when the free surfaces of Groups I and II were compared, statistically significant difference was observed between these groups in all analyzed areas (screw, acrylic resin and bands) (p<0.001). The results of the microbial culture were confirmed by the SEM analysis. The optical stereomicroscopic analysis showed the existence of color alteration suggestive of corrosion in the solder region in contact with the band and with the wire in both groups (p=1). The peaks of chemical elements observed in EDS were also similar in both groups. It may concluded that the use of 0.12% chlorhexidine gluconate mouthwashes (Periogard®) showed efficacy in reducing the formation of colonies/biofilms on the free surfaces of Haas expanders, in situ, without increasing the corrosion levels.

O objetivo deste estudo foi avaliar, em crianças de creches públicas e filantrópicas do município de São Paulo, a prevalência de cárie dental e os fatores de risco relacionados à presença de cárie e presença de altos níveis de estreptococos mutans (SM). Foram incluídas variáveis denominadas sociodemográficas, condições de gestação e nascimento, variáveis fisiológicas do estado nutricional, aleitamento materno e alimentação complementar, hábitos alimentares, variáveis comportamentais e odontológicas. O estudo foi desenvolvido em parceria entre a Disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo (FOUSP) e a Disciplina de Nutrologia do Departamento de Pediatria da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP EPM). É parte integrante do Projeto Crecheficiente - Ações de Segurança e Educação Alimentar em Creches Públicas e Filantrópicas do Município de São Paulo. A população deste estudo foi constituída de 150 e 144 crianças, que participaram da avaliação odontológica e microbiológica respectivamente, entre 12 e 24 meses, de ambos os gêneros, regularmente matriculadas em cinco creches, sendo duas públicas e três filantrópicas. A coleta dos dados foi obtida por meio de entrevistas com as mães ou responsáveis, antropometria, coleta de sangue para dosagem de hemoglobina, avaliação odontológica (índices ceo-d e ceo-d modificado) e coleta salivar das mães e das crianças para teste de estreptococos mutans. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando análise de regressão logística univariada, considerando o nível de significância a 5%. Foram utilizadas as mesmas variáveis de risco e seus respectivos pontos de corte nas análises univariadas da avaliação odontológica e microbiológica. Das crianças examinadas 7,3% apresentaram experiência de cárie, sendo encontrada uma média do índice ceo-d igual a 0,09 e ceo-d mod de 3,37, sem diferença entre gêneros e tipo de creche. Em relação à presença de cárie, a análise de regressão univariada indicou significância dos seguintes fatores: o tempo de matrícula na creche, aleitamento materno exclusivo menor de 60 dias, idade do primeiro contato com açúcar, e níveis altos de SM que favoreceram a ocorrência da doença, o número maior de irmãos e a presença de biofilme visível foram significantes e associados com proteção. Dentre os alimentos citados encontrados na dieta dos lactentes, observa-se que o consumo de mel e o consumo de refrigerantes favoreceram a ocorrência da cárie dentária. Em relação à presença de SM, 72,9% das crianças tinham este microrganismo presente na cavidade bucal sendo que 9,5% apresentavam altos níveis de SM. As variáveis que influenciaram significantemente os altos níveis de SM foram: idade da mãe, idade de introdução do açúcar e presença de cárie dentária na criança. Em relação aos hábitos alimentares apenas o consumo de petit suisse favoreceu a quantidade elevada de SM. A contagem dos níveis salivares de SM da mãe não foi significante. / The aim of this study was to assess in children of public and philanthropic day care centers of São Paulo, the prevalence of dental carie and the risk factors associated to dental carie and high levels of mutans streptococci (MS). Were included variables denominated socio-demographic, pregnancy and birth conditions, physiological variables of nutrition status, breast feeding and complementary diet, dietary habits, behavior and dental variables. This study was the result of a partnership between the Pediatrics Department of the University of São Paulo and the Nutrology Department of Federal University of São Paulo, UNIFESP EPM. It is part of a larger study called Crecheficiente Project Security and Dietary Education actions of public and philanthropic day care centers of São Paulo city. The population of this study were consisted of 150 and 144 children that participated of the dental and microbiological evaluation respectively, between 12 and 24 years old, both gender, regularly registered in five day care centers, two publics and three philanthropic. The data collection were done by interviews with mothers or childrens responsible, anthropometry, bloody collection for hemoglobin, dental test (Knutson, dmf and modified dmf) and salivary collection from mothers and children for estreptococos mutans test analysis. Data analysis involved univariate logistic regression, The level of significance was set at 5%. The same variables presented at univariate analysis of the dental test and break point, were described into microbiological test. 7,3% of the children had dental carie. A mean of dmft index were 0,09 and modified dmft 3,37. No difference was found between gender and type of day care center. The univariate analyses indicated significance for caries experience: time of day care center admission, exclusive breast feeding least than 60 days, age of the first sugar contact, high levels of MS benefit caries, the major number of brothers and sisters, presence of dental plaque were associated to protection. The foods found in the dietary habits of the infants, honey and soft drinks exposed the occurrence of dental caries. For the streptococci mutans experience, 72,9% of the children had the microorganism present and 9,5% were high levels of MS. The variables that influence significantly this group were: mothers age, age of the first sugar contact and childrens carie experience. In the dietary habits, only the pettit suisses consume exposed to high levels of SM. The mothers mutans streptococci levels were not significant.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Estreptococos do grupo B (EGB) é a principal causa de sepse e meningite neonatal e tem sido recentemente reconhecido como patógeno responsável por infecções invasivas em adultos imunocomprometidos (idosos ou portadores de doenças crônicas). Os EGB produzem inúmeras enzimas extracelulares, várias das quais interagem com o sistema imune do hospedeiro e são importantes durante a interação EGB-hospedeiro, bem como para o desenvolvimento da doença. Estudos anteriores mostraram que metaloproteases estão envolvidas em várias vias metabólicas em diferentes tipos celulares. Por esta razão, nós decidimos investigar o possível envolvimento de metaloproteases de EGB durante a interação celular e apoptose/necrose induzida pelo micro-organismo em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e da linhagem de epitélio respiratório (A549). Tratamento de EGB com inibidores de metaloproteases (EDTA, EGTA e FEN) não induziu alterações no crescimento bacteriano, mas promoveu alterações na expressão de proteínas de superfície, capacidade adesiva e perfil de sobrevivência intracelular do patógeno. O EGB e o sobrenadante do crescimento bacteriano (meio condicionado; MC) promoveram a morte das células HUVEC e A549. Contudo, o tratamento com inibidores de metaloproteases restauraram a viabilidade celular induzida pelos EGB e o MC, sugerindo que metaloproteases bacteriana estão envolvidas no rompimento da barreira celular, promovendo a disseminação bacteriana. Este trabalho descreve pela primeira vez apoptose e necrose induzidas pelo EGB e MC em HUVEC e células A549 após 24h de incubação, respectivamente. Nós também observamos redução da pró-caspase-3 após infecção das HUVEC com EGB e MC, sugerindo ativação da caspase-3. Além disso, o aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e diminuição dos níveis da proteína anti-apoptótica Bcl-2 em HUVEC, demonstram o envolvimento do mecanismo apoptótico mitocondrial (via intrínseca). A melhor compreensão das bases moleculares da patogênese do EGB contribui para identificar novas moléculas bacterianas e hospedeiras que podem representar novos alvos terapêuticos ou imunoprofiláticos contra a doença causada por esse patógeno neonatal. / Group B streptococcus (GBS) is the leading cause of neonatal sepsis and meningitis and has recently been recognized as an increasingly common cause of invasive disease in immunocompromised adults (elderly or chronic diseases). GBS produces a number of extracellular enzymes, several of which interact with the host immune system and are important for the GBS- host interaction and for the development of disease. Previous studies showed that metalloproteases are involved in several metabolic pathways in different cellular types. For this reason, we decided to investigate the possible involvement of GBS metalloproteases during cell interaction and apoptosis/necrosis induced by microorganism in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and epithelial respiratory cells line (A549). Treatment of GBS with metalloproteases inhibitors (EDTA, EGTA and PHEN) did not induce alteration on bacterial growth, but promoted changes in the expression of surface proteins, adhesive capacity and profile of intracellular survival of the pathogen. The GBS and supernatant of bacterial growth medium (conditioned medium; MC) promoted the death of HUVEC and A549 cells. However, the metalloproteases inhibitors treatment restored the cellular viability induced by GBS and MC, suggesting that GBS metalloproteases are involved in the disruption of cell barrier, promoting bacterial dissemination. This study describes for the first time apoptosis and necrosis induced by GBS and MC in HUVEC and A549 cells after 24h incubation, respectively. We also observe reduction of pro-caspase-3 after infection of HUVEC with GBS and MC, suggesting activation of caspase-3. Moreover, the over-expression of pro -apoptotic protein Bax and decrease of anti-apoptotic protein Bcl-2 levels in HUVEC show the involvement of mitochondrial apoptotic mechanism (intrinsic via). Enhanced understanding of the molecular basis of GBS pathogenesis may pinpoint novel bacterial and host molecules that can represent novel therapeutic or immunoprophylactic targets against disease caused by this foremost of neonatal pathogens.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Estreptococos do grupo B (EGB) é a principal causa de sepse e meningite neonatal e tem sido recentemente reconhecido como patógeno responsável por infecções invasivas em adultos imunocomprometidos (idosos ou portadores de doenças crônicas). Os EGB produzem inúmeras enzimas extracelulares, várias das quais interagem com o sistema imune do hospedeiro e são importantes durante a interação EGB-hospedeiro, bem como para o desenvolvimento da doença. Estudos anteriores mostraram que metaloproteases estão envolvidas em várias vias metabólicas em diferentes tipos celulares. Por esta razão, nós decidimos investigar o possível envolvimento de metaloproteases de EGB durante a interação celular e apoptose/necrose induzida pelo micro-organismo em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e da linhagem de epitélio respiratório (A549). Tratamento de EGB com inibidores de metaloproteases (EDTA, EGTA e FEN) não induziu alterações no crescimento bacteriano, mas promoveu alterações na expressão de proteínas de superfície, capacidade adesiva e perfil de sobrevivência intracelular do patógeno. O EGB e o sobrenadante do crescimento bacteriano (meio condicionado; MC) promoveram a morte das células HUVEC e A549. Contudo, o tratamento com inibidores de metaloproteases restauraram a viabilidade celular induzida pelos EGB e o MC, sugerindo que metaloproteases bacteriana estão envolvidas no rompimento da barreira celular, promovendo a disseminação bacteriana. Este trabalho descreve pela primeira vez apoptose e necrose induzidas pelo EGB e MC em HUVEC e células A549 após 24h de incubação, respectivamente. Nós também observamos redução da pró-caspase-3 após infecção das HUVEC com EGB e MC, sugerindo ativação da caspase-3. Além disso, o aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e diminuição dos níveis da proteína anti-apoptótica Bcl-2 em HUVEC, demonstram o envolvimento do mecanismo apoptótico mitocondrial (via intrínseca). A melhor compreensão das bases moleculares da patogênese do EGB contribui para identificar novas moléculas bacterianas e hospedeiras que podem representar novos alvos terapêuticos ou imunoprofiláticos contra a doença causada por esse patógeno neonatal. / Group B streptococcus (GBS) is the leading cause of neonatal sepsis and meningitis and has recently been recognized as an increasingly common cause of invasive disease in immunocompromised adults (elderly or chronic diseases). GBS produces a number of extracellular enzymes, several of which interact with the host immune system and are important for the GBS- host interaction and for the development of disease. Previous studies showed that metalloproteases are involved in several metabolic pathways in different cellular types. For this reason, we decided to investigate the possible involvement of GBS metalloproteases during cell interaction and apoptosis/necrosis induced by microorganism in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and epithelial respiratory cells line (A549). Treatment of GBS with metalloproteases inhibitors (EDTA, EGTA and PHEN) did not induce alteration on bacterial growth, but promoted changes in the expression of surface proteins, adhesive capacity and profile of intracellular survival of the pathogen. The GBS and supernatant of bacterial growth medium (conditioned medium; MC) promoted the death of HUVEC and A549 cells. However, the metalloproteases inhibitors treatment restored the cellular viability induced by GBS and MC, suggesting that GBS metalloproteases are involved in the disruption of cell barrier, promoting bacterial dissemination. This study describes for the first time apoptosis and necrosis induced by GBS and MC in HUVEC and A549 cells after 24h incubation, respectively. We also observe reduction of pro-caspase-3 after infection of HUVEC with GBS and MC, suggesting activation of caspase-3. Moreover, the over-expression of pro -apoptotic protein Bax and decrease of anti-apoptotic protein Bcl-2 levels in HUVEC show the involvement of mitochondrial apoptotic mechanism (intrinsic via). Enhanced understanding of the molecular basis of GBS pathogenesis may pinpoint novel bacterial and host molecules that can represent novel therapeutic or immunoprophylactic targets against disease caused by this foremost of neonatal pathogens.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a desmineralização do esmalte após períodos de 4, 7 e 10 dias de acúmulo de placa bacteriana in situ, além da influência de fatores salivares e microbiológicos no processo. Após a avaliação do fluxo salivar estimulado, capacidade tampão da saliva e níveis salivares de estreptococos do grupo mutans, 13 voluntários utilizaram dispositivos intrabucais palatinos contendo 4 blocos de esmalte bovino (4 X 4 X 2 mm) polidos, cobertos por uma tela plástica, durante 3 períodos cruzados de 4, 7 e 10 dias. Os voluntários utilizaram um dentifrício não fluoretado e gotejaram 10 vezes ao dia uma solução de sacarose a 20% sobre os blocos de esmalte. A microdureza superficial dos blocos foi determinada antes e após a desmineralização in situ, utilizando um penetrador Knoop e carga de 50 g por 5 s. Ao final de cada fase experimental, a placa bacteriana formada sobre os blocos foi coletada e a porcentagem de estreptococos mutans em relação ao número de bactérias totais foi determinada. Houve diferença estatisticamente significante, segundo o teste “t" pareado, entre a microdureza inicial e final nos três períodos estudados (p<0,05). A porcentagem de perda de dureza superficial (%PDS) foi em média de 13,8%, 19,3% e 48,3%, nos períodos de 4, 7 e 10 dias. Não houve diferença estatisticamente significante entre a %PDS com 4 e 7 dias, de acordo com a análise de variância e teste de Tukey (p<0,05). A correlação entre a %PDS e os fatores salivares e microbiológicos avaliados foi determinada por meio dos coeficientes de correlação de Pearson e Spearman, com p<0,05. Não foi encontrada correlação estatisticamente significante entre a %PDS e os fatores salivares avaliados inicialmente. Em aproximadamente metade das análises de placa bacteriana não foram detectados estreptococos mutans, embora tenha ocorrido desmineralização do esmalte. A porcentagem de estreptococos mutans na placa bacteriana não apresentou correlação com os níveis salivares dessas bactérias. Não foi encontrada correlação entre a %PDS e a porcentagem de estreptococos mutans na placa bacteriana formada sobre os blocos de esmalte. A %PDS nos blocos cobertos por placa bacteriana em que foram detectados estreptococos mutans foi estatisticamente maior do que nos blocos em que eles não foram detectados, apenas no período de 4 dias, de acordo com o teste de Mann-Whitney (p<0,05). Os resultados mostraram desmineralização do esmalte in situ após curtos períodos de acúmulo de placa bacteriana, não tendo sido encontrada relação com os fatores salivares avaliados ou com as contagens de estreptococos mutans na saliva e na placa. / The aim of this study was to evaluate the in situ enamel demineralization during 4, 7 and 10 days and some of the factors influencing the process. Before the beginning of the in situ phase, a stimulated whole saliva sample was collected from 13 volunteers for 5 min and the salivary secretion rate, buffering capacity and numbers of mutans streptococci were estimated. A palatal appliance containing 4 polished bovine enamel blocks (4 X 4 X 2 mm) covered by a plastic mesh was worn on 3 separate periods of 4, 7 and 10 days, throughout which time a non-fluoridated dentifrice was used. A 20% sucrose solution was dripped extra-orally onto the enamel blocks 10 times a day. All enamel blocks were evaluated by the analysis of enamel surface microhardness before and after in situ demineralization, using a 50 g, Knoop load for 5 s. At the end of each period, plaque covering the enamel blocks was collected and analyzed for the % of mutans streptococci of the total viable counts. Paired-t test showed that initial and final microhardness were statistically different at the three periods evaluated (p<0.05). Change in surface microhardness (%CSMH) was 13.8%, 19.3% and 48.3% during the 4, 7 and 10-day periods, respectively. There was no statistically significant difference on the %CSMH between 4 and 7 days, according to analysis of variance and Tukey’s test (p<0.05). Correlation between %CSMH and the salivary and bacteriological factors evaluated was determined using Pearson’s and Spearman’s coefficient of correlation (p<0.05). The %CSMH was not significantly correlated to the salivary factors determined initially. In about half of the plaque samples analyzed mutans streptococci were not detected, although the enamel showed some demineralization. The % of mutans streptococci in plaque samples was not correlated to its numbers in saliva. There was no statistically significant correlation between the %CSMH and the % of mutans streptococci in plaque over the enamel blocks. The presence of these bacteria in plaque significantly increased enamel demineralization when compared to the blocks where they were not detected only at 4 days, according to Mann-Whitney test (p<0.05). The results showed in situ enamel demineralization after short periods of plaque accumulation, which was not related to the salivary factors evaluated nor to the numbers of mutans streptococci in saliva or plaque.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estreptococos do grupo B (EGB), principalmente sorotipo III são a principal causa de pneumonia neonatal, sepse e meningite. O potencial de virulência das amostras de EGB pode determinar a colonização ou a infecção do hospedeiro. Como o pulmão constitui uns dos primeiros órgãos durante o processo de invasão sistêmica por EGB, nós decidimos investigar os mecanismos de adesão e invasão de amostras do sorotipo III (90356-líquor e 80340-vagina) com linhagem de células epiteliais do pulmão humano (A549). Desta forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de aderência e invasão de duas amostras de EGB sorotipo III com células de epiteliais pulmonares A549, a persistência bacteriana intracelular, a fusão com compartimentos acídicos, potencial citotóxico e indução de apoptose. As amostras mostraram capacidade de aderir e invadir o epitélio pulmonar A549, onde a amostra 90356-líquor isolada de paciente a que apresentou maior propriedade adesiva e invasiva que a amostra 80340-vagina (p<0,05). Ambas as cepas mostraram persistência intracelular sem replicação no interior do epitélio respiratório até 24h de incubação. Além disso, verificamos que os EGB são capazes de promover vacuolização celular permanecendo viáveis dentro de vacúolos acídicos, sugerindo a ocorrência de fusão lisossomo-fagossomo. A amostra 90356-líquor também mostrou maior citotoxidade quando comparada com a amostra 80340-vagina. A análise por citometria de fluxo demonstrou, pela primeira vez, que o EGB induz apoptose em epitélio respiratório, podendo representar um mecanismo importante para o desenvolvimento da lesão celular aguda e a patogênese bacteriana. / Group B streptococci (GBS), mainly serotype III, is a major cause of neonatal pneumonia, sepsis and meningitis. Virulence potential of GBS strains may determine the outcome of host colonization or infection. Because the lung constitutes a first step in GBS systemic invasion processes, we have investigates the adherence and invasion mechanisms of GBS-III isolates to human lung epithelial cell line (A549). Thus, the main objective of this study was to evaluate the ability of adhesion and invasion of GBS strains serotype III (90356-liquor and 80340-vagina) with A549 lung epithelial cells, intracellular bacterial persistence, fusion with acidic compartments, cytotoxic potential, and induction of apoptosis. The strains showed ability to adhere and invade the epithelial A549 cells; GBS 90356-liquor isolated from a patient showed a more efficient adherence and invasion properties than GBS-III 80340 isolated from vagina (P<0,05). Both strains showed persistent intracellular viability without replication into A549 cells up to 24h incubation. In addition, we found that GBS are able to promote cellular vacuolization and persisted viable inside acidic vacuoles, suggesting lysosome-phagosome fusion. The GBS 90356-líquor also showed higher cytotoxicity when compared with 80340-vagina strain. The present work describe for first time by flow cytometry that GBS induces apoptosis in respiratory epithelium and be an important mechanism for the development of acute cellular injury and bacterial pathogenesis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Streptococcus agalactiae, ou Streptococcus do grupo B (GBS), é um importante patógeno oportunista que causa pneumonia, sepse e meningite em recém-nascidos e infecções em adultos imunocomprometidos. O pulmão aparentemente é o portal de entrada para o EGB na corrente sanguínea o que pode evoluir para uma septicemia. Os mecanismos de virulência relevantes envolve a habilidade do EGB em penetrar e sobreviver intracelularmente em células hospedeiras. Neste trabalho, foram analisados os mecanismos moleculares da apoptose epitelial induzida pelo EGB, e a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS) em células epiteliais respiratórias A549 durante a infecção por EGB. Todas as amostras de EGB exibiram a capacidade de aderir e invadir células A549. A sobrevivência intracelular do EGB em células A549 ocorreu durante 24 h de incubação sem replicação do patógeno. No entanto, a amsotra 88641-V isolada de vagina não sobreviveu após 0,5 h de interação. O EGB promoveu a perda de viabilidade do epitélio durante a infecção. As alterações morfológicas em células A549 infectadas com o EGB incluem arredondamento celular, condensação nuclear, encolhimento celular e perda de contato célula-célula e célula-substrato. A dupla marcação AV/IP revelou que amostras de EGB sorotipo III induziram apoptose enquanto amostras do sorotipo V induziram morte celular semelhante a necrose em células A549. Caspase-3 foi ativada durante a apoptose induzida por EGB em células epiteliais. No entanto, a ativação de caspases-8 e -9 foi detectada apenas para a amostra 88641-V e as amostras EGB do sorotipo III, respectivamente. Experimentos comparativos de Immunoblotting revelaram que o EGB induziu um aumento da expressão Bim, uma proteína pró-apoptótica e diminuiu a expressão de Bcl-2 e Bcl-xL, proteínas anti-apoptóticas. As células A549 apresentaram perda de potencial de membrana mitocondrial &#916;&#968;m e co-localização com o Bax. Ensaio de espectrometria de massa identificou a proteína PI-2a, uma proteína estrutural de pili, que exibe atividade carboxipepdidase. Descobrimos que os dois sorotipos (III e V) induziram a produção ROS e NO em células A549. Em conclusão, a apoptose induzida pelo EGB em células A549 é um mecanismo importante de virulência, resultando na destruição de tecidos, escape do sistema imune do hospedeiro com espalhamento bacteriano e, em consequência, a doença invasiva ou uma infecção sistémica. / Streptococcus agalactiae, or group B Streptococcus (GBS), is an important opportunistic pathogen that causes pneumonia, sepsis, and meningitis in neonates and severe diseases in immunocompromised adults. The lung is the apparent portal of entry for GBS into the bloodstream, after which septicemia may ensue. A relevant virulence mechanism involves the ability of GBS to penetrate and to survive intracellularly within these host cells. In this work, we analyzed the molecular mechanisms of GBS-induced epithelial apoptosis, and nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) production by lung epithelial cell line A549 cells during infection with GBS. All GBS exhibited the ability to adhere and to invade A549 cells. The survival of GBS within A549 cells without replication was shown during 24 h incubation. However, the 88641-V strain isolated from vagina did not survive after 0.5 h of interaction. GBS promoted the loss of viability of the epithelium during infection. The morphological changes in A549 cells infected with GBS included cell rounding, nuclear condensation, cellular shrinkage and loss of cell-cell contact and cell-substrate. The double staining AV / IP revealed that GBS serotype III induced apoptosis while GBS serotype V induced like necrosis cell death in A549 cells. Caspase-3 was activated during GBS-induced endothelial apoptosis. However, activation of caspases-8 and -9 was detected only by GBS 88641-V and GBS-III, respectively. Comparative immunoblotting experiments revealed that GBS induced an increasing pro-apoptotic Bim expression and decreasing anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-XL expression. A549 cells exhibited loss of mitochondrial membrane potential &#916;&#968;m with Bax colocalization. Mass spectrometry assay identified protein PI-2a, a structural protein pili, which exhibit carboxipepdidase activity. We found that both serotypes (III and V) induced ROS and NO production in A549 cells. In conclusion, apoptosis of A549 cell induced by GBS is an important virulence mechanism resulting in tissue destruction, escape from the host immune system with bacterial spreading and, in consequence, invasive disease or systemic infection.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estreptococos do grupo B (EGB), principalmente sorotipo III são a principal causa de pneumonia neonatal, sepse e meningite. O potencial de virulência das amostras de EGB pode determinar a colonização ou a infecção do hospedeiro. Como o pulmão constitui uns dos primeiros órgãos durante o processo de invasão sistêmica por EGB, nós decidimos investigar os mecanismos de adesão e invasão de amostras do sorotipo III (90356-líquor e 80340-vagina) com linhagem de células epiteliais do pulmão humano (A549). Desta forma, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de aderência e invasão de duas amostras de EGB sorotipo III com células de epiteliais pulmonares A549, a persistência bacteriana intracelular, a fusão com compartimentos acídicos, potencial citotóxico e indução de apoptose. As amostras mostraram capacidade de aderir e invadir o epitélio pulmonar A549, onde a amostra 90356-líquor isolada de paciente a que apresentou maior propriedade adesiva e invasiva que a amostra 80340-vagina (p<0,05). Ambas as cepas mostraram persistência intracelular sem replicação no interior do epitélio respiratório até 24h de incubação. Além disso, verificamos que os EGB são capazes de promover vacuolização celular permanecendo viáveis dentro de vacúolos acídicos, sugerindo a ocorrência de fusão lisossomo-fagossomo. A amostra 90356-líquor também mostrou maior citotoxidade quando comparada com a amostra 80340-vagina. A análise por citometria de fluxo demonstrou, pela primeira vez, que o EGB induz apoptose em epitélio respiratório, podendo representar um mecanismo importante para o desenvolvimento da lesão celular aguda e a patogênese bacteriana. / Group B streptococci (GBS), mainly serotype III, is a major cause of neonatal pneumonia, sepsis and meningitis. Virulence potential of GBS strains may determine the outcome of host colonization or infection. Because the lung constitutes a first step in GBS systemic invasion processes, we have investigates the adherence and invasion mechanisms of GBS-III isolates to human lung epithelial cell line (A549). Thus, the main objective of this study was to evaluate the ability of adhesion and invasion of GBS strains serotype III (90356-liquor and 80340-vagina) with A549 lung epithelial cells, intracellular bacterial persistence, fusion with acidic compartments, cytotoxic potential, and induction of apoptosis. The strains showed ability to adhere and invade the epithelial A549 cells; GBS 90356-liquor isolated from a patient showed a more efficient adherence and invasion properties than GBS-III 80340 isolated from vagina (P<0,05). Both strains showed persistent intracellular viability without replication into A549 cells up to 24h incubation. In addition, we found that GBS are able to promote cellular vacuolization and persisted viable inside acidic vacuoles, suggesting lysosome-phagosome fusion. The GBS 90356-líquor also showed higher cytotoxicity when compared with 80340-vagina strain. The present work describe for first time by flow cytometry that GBS induces apoptosis in respiratory epithelium and be an important mechanism for the development of acute cellular injury and bacterial pathogenesis.