Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / In this work morphological, physiological, biochemical and nutritional responses, to elucidate the possible adaptive strategies of young coconut plants, cultivating "Green Dwarf", involved with tolerance to the effects of stress isolated and combined soil salinity and water stress. In the experiment, conducted in a greenhouse, the greenhouse type, in Fortaleza, CearÃ, were evaluated under statistical design of randomized blocks in a split plot arrangement, the effects of different levels of water stress by imposing different percentages resets the potential evapotranspiration - ETpc (20; 40; 60; 80 and 100%), related to increasing levels of soil salinity (1.72, 6.25, 25.80 and 40.70 dS m-1) provided by soils derived from the Irrigated Perimeter Morada Nova - PIMN. The effects of treatments on plants were evaluated using the variables: plant height, leaf number, stem diameter, leaf area, biomass production (root, shoot and total), compared root dry biomass of aerial-1, to salinity tolerance indices, leaf gas exchange (stomatal conductance, transpiration, photosynthesis, instant and intrinsic efficiency of water use), quantum yield of chlorophyll fluorescence (Fv Fm-1) level for total chlorophyll (Spad index) , total content of chlorophyll (a + b) and carotenoids, leaf water potential, leaf and root levels of inorganic solutes (potassium ions, sodium and chloride) and organic (total soluble carbohydrates, N - aminossolÃveis and free proline) and nutritional state (foliar nutrients of nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sulfur, iron, copper, manganese and zinc). The growth and biomass production of the plants are sharply reduced by the conditions of water stress and high soil salinity, apparently being more critical to fluid restriction culture. The degree of water stress can enhance the susceptibility to salinity. The physiological mechanisms are effectively limited when water stress and salinity act separately and / or together. The effects of water stress are more effective in the reduction of physiological parameters, to the detriment soil salinity. The magnitudes of physiological responses of plants to water supply and salinity depend on the intensity of stress. Adaptive physiological responses of plants are related mainly to stomatal regulation. In conditions of drought and soil salinity, the plants have linear reductions in the total levels of chlorophyll. Carotenoid levels respond to the combined effects of water availability and soil salinity and reflect the antagonism between them. The coconut has a number of physiological adjustments mechanisms that give the species a partial tolerance to drought stress and / or saline. Saline ions K+, Na+ and Cl- accumulate significantly in young coconut plants, to the detriment of organic solutes, both in the leaves and in the roots, evidencing an apparent root retention ions. Salinity did not change the concentration of organic solutes, however, show up increments in leaf and root levels of free proline in response to water stress. Water stress and soil salinity interact, affecting the nutritional status of plants, except for the nutrient P. Leaf contents of nutrients N, Ca, S, Fe, Mn and Zn grow positively with the increase of water availability and are reduced substantially with increasing salinity. The interaction of smaller water deficit levels with the highest saline levels maximizes the leaf contents of Mg and Cu and minimizes K. During the establishment of coconut seedlings, the need for macronutrients follows the descending order: N, K Ca, Mg, S and P and micronutrients: Fe, Mn, Zn and Cu. The plant nutrition proved to be adequate, except for the imbalances observed in nutrients K, Mg, S and Mn. The coconut seedlings show full capacity of the establishment in saline soils PIMN, corresponding to the level of electrical conductivity to 6.50 dS m-1, but only when the water supply remains adequate. For the higher salinity levels the plants survive, yet the size of the same is reduced by around 50%, even when fully irrigated. / Neste trabalho foram estudadas repostas morfolÃgicas, fisiolÃgicas, bioquÃmicas e nutricionais, visando elucidar as possÃveis estratÃgias adaptativas de plantas jovens de coqueiro, cultivar âAnÃo Verdeâ, envolvidas com sua tolerÃncia aos efeitos dos estresses isolados e/ou combinados, salinidade do solo e deficiÃncia hÃdrica. No experimento, conduzido em casa de vegetaÃÃo, do tipo telado, em Fortaleza, CearÃ, avaliaram-se, sob delineamento estatÃstico de blocos casualizados, no arranjo de parcelas subdivididas, os efeitos de diferentes nÃveis de deficiÃncia hÃdrica, mediante a imposiÃÃo de distintos percentuais de reposiÃÃes da evapotranspiraÃÃo potencial da cultura - ETpc (20; 40; 60; 80 e 100%), associados à crescentes nÃveis de salinidade do solo (1,72; 6,25; 25,80 e 40,70 dS m-1), proporcionados pelos solos oriundos do PerÃmetro Irrigado Morada Nova - PIMN. Os efeitos dos tratamentos sobre as plantas foram avaliados por meio das variÃveis: altura de plantas, nÃmero de folhas, diÃmetro do caule, Ãrea foliar, produÃÃo de biomassa (radicular, parte aÃrea e total), relaÃÃo biomassa seca raiz parte aÃrea-1, Ãndices de tolerÃncia à salinidade, trocas gasosas foliares (condutÃncia estomÃtica, transpiraÃÃo, fotossÃntese, eficiÃncia instantÃnea e intrÃnseca de uso da Ãgua), rendimento quÃntico da fluorescÃncia da clorofila a (Fv Fm-1), teores relativos de clorofila total (Ãndice Spad), teores totais de clorofilas (a+b) e de carotenÃides, potencial hÃdrico foliar, teores foliares e radiculares dos solutos inorgÃnicos (Ãons potÃssio, sÃdio e cloreto) e orgÃnicos (carboidratos solÃveis totais, N - aminossolÃveis e prolina livre) e estado nutricional (teores foliares dos nutrientes nitrogÃnio, fÃsforo, potÃssio, cÃlcio, magnÃsio, enxofre, ferro, cobre, manganÃs e zinco). O crescimento e a produÃÃo de biomassa das plantas sÃo acentuadamente reduzidos pelas condiÃÃes de restriÃÃo hÃdrica e de elevada salinidade do solo, sendo aparentemente mais crÃtica à cultura a restriÃÃo hÃdrica. O grau de estresse hÃdrico à capaz de acentuar a suscetibilidade à salinidade. Os mecanismos fisiolÃgicos sÃo efetivamente limitados quando a deficiÃncia hÃdrica e a salinidade atuam isoladamente e/ou em conjunto. Os efeitos do estresse hÃdrico se mostram mais efetivos nas reduÃÃes dos parÃmetros fisiolÃgicos, em detrimento à salinidade do solo. As magnitudes das respostas fisiolÃgicas das plantas ao suprimento hÃdrico e à salinidade dependem das intensidades do estresses. As respostas fisiolÃgicas adaptativas das plantas estÃo relacionadas, principalmente, à regulaÃÃo estomÃtica. Em condiÃÃes de dÃficit hÃdrico e de salinidade do solo, as plantas apresentam reduÃÃes lineares nos teores totais de clorofilas. Os teores de carotenÃides respondem aos efeitos combinados da disponibilidade hÃdrica e da salinidade do solo e refletem o antagonismo entre estes. O coqueiro apresenta uma sÃrie de mecanismos de ajustes fisiolÃgicos que conferem à espÃcie uma parcial tolerÃncia ao estresse hÃdrico e/ou salino. Os Ãons salinos K+, Na+ e Cl- acumulam-se significativamente em plantas jovens de coqueiro, em detrimento aos solutos orgÃnicos, tanto nas folhas quanto nas raÃzes, sendo evidenciada uma aparente retenÃÃo radicular de Ãons. A salinidade nÃo altera os teores dos solutos orgÃnicos, todavia, denotam-se incrementos nos teores foliares e radiculares de prolina livre em resposta à deficiÃncia hÃdrica. A deficiÃncia hÃdrica e a salinidade do solo interagem, afetando o estado nutricional das plantas, excetuando o nutriente P. Os teores foliares dos nutrientes N, Ca, S, Fe, Mn e Zn crescem positivamente com a ampliaÃÃo da disponibilidade hÃdrica e reduzem-se substancialmente com o aumento da salinidade. A interaÃÃo dos menores nÃveis de deficiÃncia hÃdrica com os maiores nÃveis salinos maximiza os teores foliares de Mg e Cu e minimiza os de K. Durante o estabelecimento das plantas jovens de coqueiro, a necessidade de macronutrientes obedece à ordem decrescente: N, K Ca, Mg, S e P e à de micronutrientes: Fe, Mn, Zn e Cu. A nutriÃÃo das plantas mostra-se adequada, excetuando-se, os desequilÃbrios observados nos nutrientes K, Mg, S e Mn. As plantas jovens de coqueiro mostram plena capacidade de estabelecimento nos solos salinizados do PIMN, atà o nÃvel de condutividade elÃtrica correspondente a 6,50 dS m-1, porÃm apenas quando o suprimento hÃdrico se mantÃm adequado. Para os nÃveis de salinidade mais elevados as plantas sobrevivem, contudo o porte das mesmas reduz-se em torno de 50%, mesmo quando plenamente irrigadas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As proteÃnas desacopladoras de planta (pUCP) estÃo localizadas na membrana mitocondrial interna e facilitam o transporte de prÃtons do espaÃo intermembranar para a matriz mitocondrial, desviando a passagem de H+ atravÃs da F1-ATPase, afetando assim a eficiÃncia da fosforilaÃÃo oxidativa, isto Ã, diminuindo a sÃntese de ATP acoplada ao funcionamento da cadeia transportadora de elÃtrons. Portanto, essas proteÃnas sÃo responsÃveis pela dissipaÃÃo do gradiente eletroquÃmico de H+, gerado pela respiraÃÃo, liberando calor para o ambiente. Tais proteÃnas pertencem a FamÃlia de Carreadores de Ãnions Mitocondriais (FCAM) e sÃo codificadas por famÃlias multigÃnicas. Sua funÃÃo ainda nÃo està completamente elucidada, mas a literatura sugere participaÃÃo na adaptaÃÃo a situaÃÃes de estresses biÃticos e abiÃticos e na proteÃÃo da cÃlula evitando a produÃÃo de espÃcies reativas do oxigÃnio (EROs). Sua participaÃÃo na termogÃnese adaptativa à questionÃvel. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a famÃlia multigÃnica da pUCP em Vigna unguiculata (L.) Walp bem como sua regulaÃÃo atravÃs da expressÃo gÃnica em resposta a diferentes estresses abiÃticos. Sementes de Vigna unguiculata foram germinadas em papel umedecido com Ãgua, no escuro e apÃs 3 dias as plÃntulas foram transferidas para soluÃÃo de Hoagland durante 3 dias antes da aplicaÃÃo dos estresses. As raizes e as folhas foram coletadas com 0, 6, 12 e 24 horas, apÃs respectivas adiÃÃes de NaCl 100 mM, PEG 200,67 g/L, H2O2 10 mM e Ãcido salicÃlico 5 mM, para caracterizar a famÃlia multigÃnica e o perfil de expressÃo dos genes da pUCP por RT- PCR semiquantitativa e por PCR em tempo real (qPCR). Primers especÃficos foram desenhados com base nas sequÃncias de cDNAs/genes de pUCPs identificadas em Vigna unguiculata usando a ferramenta PerlPrimer. A amplificaÃÃo do cDNA da actina foi usada para a normalizaÃÃo dos dados de RT-PCR semi-quantitativa e trÃs genes constitutivos foram usados na normalizaÃÃo dos dados da qPCR: 2 genes para actina (actinas 4 e 5) e 1 gene para o fator de alogamento 1-α (EF1α). AnÃlise in silico revelou que a pUCP na ordem Fabales à codificada por pelo menos seis genes com duplicaÃÃo do gene pUCP do tipo 1 (1a e 1b) e deleÃÃo do gene pUCP6. A famÃlia multigÃnica da pUCP, constituÃda de 6 genes, entÃo foi identificada em Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 e VuUCP5 ). O alinhamento de sequÃncias nucleotÃdicas e de aminoÃcidos das xiii. espÃcies da ordem Fabales incluindo as de Vigna unguiculata, revelou 3 sequÃncias conservadas denominadas Sinal ProtÃico de TransferÃncia de Energia (SPTE), alÃm de 4 domÃnios especÃficos que caracterizam existÃncia de pUCPs verdadeiras em Vigna unguiculata. O gene VuUCP1a foi expresso constitutivamente em folhas e raÃzes, contrastando com VuUCP1b, cuja expressÃo foi modulada em funÃÃo dos estresses e de tecidos. Em raÃzes a expressÃo do VuUCP1b aumentou em resposta a todos os tratamentos (PEG, NaCl, H2O2 e Ãcido salicÃlico) enquanto que em folhas a expressÃo nÃo aumentou em reposta ao NaCl. VuUCP2 teve a expressÃo inibida em resposta ao PEG em folhas. VuUCP4 apresentou expressÃo constitutiva em resposta aos estresses em ambos os tecidos, enquanto que VuUCP3 e VuUCP5 apresentaram induÃÃo de expressÃo por vÃrios estresses dependente do tecido. A identificaÃÃo da famÃlia multigÃnica das pUCPs em Vigna unguiculata e seu perfil de expressÃo gÃnica diferencial, em funÃÃo do estresse aplicado e do tecido estudado, pÃe em evidÃncia um possÃvel papel dessa proteÃna nos mecanismos de ajustamento das plantas aos estresses ambientais. / The plant uncoupling proteins (pUCP) are located in the inner mitochondrial membrane and facilitate the proton translocation across the intermembrane space into the mitochondrial matrix, deflecting the passage of H + by F1-ATPase activity, thus affecting the efficiency of oxidative phosphorylation, i.e decreasing the synthesis of ATP coupled to the operation of the electron transport chain. Therefore, these proteins are responsible for dissipating the electrochemical gradient of H+, generated by respiration, releasing heat to the environment. These proteins belong to family of carriers Mitochondrial Anion (FCAM) and are encoded by multigene families. Their function is not yet fully elucidated, but the literature suggests involvement in adapting to biotic and abiotic stresses and cell protection by avoiding the production of reactive oxygen species (ROS). Their participation in adaptive thermogenesis is unclear. The aim of this work was to characterize the multigene family of pUCP in Vigna unguiculata (L.) Walp and your regulation through gene expression in response to different abiotic stresses. Vigna unguiculata seeds were germinated on paper imbibed water in the dark. Three days after germination the seedlings were transferred to Hoagland solution for 3 days before application of stress. Roots and leaves were collected at 0, 6, 12 and 24 hours after addition of the respective 100 mM NaCl, 200.67 g / L PEG, 10 mM H2O2 and 5 mM salicylic acid to characterize the profile of multigene family expression of genes for pUCP by semiquantitative RT-PCR and real-time PCR (qPCR). Specific primers were designed based on the sequences of cDNA / gene identified in pUCPs Vigna unguiculata using the PerlPrimer tool. Amplification of cDNA of actin was used to normalize the data for RT-PCR semi-quantitative and three constitutive genes were used to normalize the data of qPCR: 2 to actin gene (actin 4 and 5) and a gene for factor alogament 1-α (EF1α). In silico analysis revealed that in Fabales order pUCP is encoded by at least six pUCPs genes presenting a duplication of the gene type 1 (1a, 1b) and a pUCP6 gene deletion. The multigene family of pUCP, consisting of six genes was then identified in Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 and VuUCP5). The alignment of amino acid and nucleotide sequences of the species of Fabales order including Vigna unguiculata, revealed three xv. conserved sequences called signal Energy Transfer Protein (SPTE), and four domains (or regions or sites) existence of specific true pUCPs in Vigna unguiculata. VuUCP1a gene was constitutively expressed in leaves and roots, contrasting with VuUCP1b, whose expression was modulated in a stress and tissue-dependent manner. The VuUCP1b expression increased in response to all treatments (PEG, NaCl, H2O2 and salicylic acid) in roots, whereas the expression in leaves did not increase in response to NaCl. VuUCP2 expression was inhibited in response to PEG in leaves. VuUCP4 showed constitutive expression in response to stresses in both tissues, while VuUCP3 and VuUCP5 showed induction of expression by various stresses depending on the tissue type. The identification of the multigene family of pUCPs in Vigna unguiculata and its gene expression profile in different tissues and stress conditions highlights a possible role of this protein in the adjustment of plants to environmental stresses.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:25:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_camila_pegoraro.pdf: 3121320 bytes, checksum: 5a704b24078eca8a2b35513ec2a606f6 (MD5) Previous issue date: 2012-09-17 / Abiotic stresses represent large threats to agriculture and food security, since they limit the productivity of the majority of cultivated plants. In order to identify the responses of plants to abiotic stresses and their associations with tolerance under different environmental conditions, concepts and techniques in molecular biology, cell biology and genetics have been used. The identification of genes responsive to stresses can be used to obtain plants tolerant to adverse environmental conditions by genetic transformation or directed crosses. Thus, this study had the objective the establishing of expression profiles of gene belonging to the ERF, HSP, HSF, TIM/TOM and TIC/TOC families in rice and tomato under low O2 stress. Also, the transcriptional profile of peaches under cold stress as obtained. The results indicate that in rice, some members of the ERF family present specific expression according to the stressing agent, while others have overlapping expression among different stresses. Besides, within the ERF family, some genes do present a complex regulation and others a simple regulation. In rice, some genes encode proteins belonging to the TIM/TOM and TIC/TOC complexes present high expression levels 24 hours after anoxia stress. However, after 72 hours under anoxia, the majority of genes were inhibited, suggesting an interruption on the transport of proteins to the mitochondria and chloroplast during the stress period. When the HSP expression profiles of flooding tolerant and sensitive rice cultivars were compared, transcript accumulation occurred for both cultivar types. However, the majority of genes evaluated were more responsive in the sensitive cultivar than in the tolerant, indicating that HSPs have an important association in the response to anoxia stress but are not directly involved in the tolerance. In tomato fruits stored under hypoxia, two sHSPs genes were highly induced by low oxygen levels, indicating a primary action of these genes on keeping cell homeostasis after the stress. In peaches, the application of gibberellic acid acts on preventing the damaged caused by cold by the induction of genes associated to lipid metabolism, cell wall degradation and trehalose synthesis. / Estresses ambientais representam grandes ameaças à agricultura e, por consequência, à segurança alimentar, uma vez que limitam a produtividade da maioria das plantas cultivadas. Buscando identificar as respostas das plantas frente a estresses abióticos e suas relações com a tolerância sob diferentes condições ambientais, conceitos e técnicas de biologia molecular, biologia celular e genética vêm sendo continuamente utilizadas. A identificação de genes responsivos a estresses pode ser utilizada na obtenção de plantas tolerantes a condições ambientais adversas através de manipulação genética ou cruzamentos direcionados entre diferentes genótipos. Desta forma, este estudo teve como objetivo estabelecer o perfil de expressão de genes pertencentes às famílias ERF, HSP, HSF, TIM/TOM e TIC/TOC, em arroz e tomate sob condições de estresse por deficiência de O2. Além disso, buscou-se estabelecer o perfil transcricional de pêssegos sob condição de estresse por frio. Os resultados obtidos demonstram que em arroz, alguns membros da família ERF apresentam expressão específica de acordo com o agente estressor, enquanto que outros apresentam sobreposição de expressão entre os estresses, além disso, dentro da família ERF alguns genes apresentam regulação complexa e outros regulação simples. Em arroz, alguns genes codificadores de proteínas pertencentes aos complexos TIM/TOM e TIC/TOC apresentaram altos níveis de expressão 24 horas após estresse por anoxia. Entretanto, após 72 horas sob condições de anoxia, ocorreu a inibição da expressão da maioria dos genes pertencentes a estes complexos, sugerindo que possa haver uma interrupção no transporte de proteínas para a mitocôndria e cloroplasto durante este período de estresse. Ao comparar cultivares de arroz tolerante e sensível ao alagamento, verificou-se que houve um acúmulo de transcritos dos genes codificadores de HSPs em ambas as cultivares. Entretanto, a maioria dos genes avaliados foi mais responsiva ao estresse por anoxia na cultivar sensível, do que na cultivar tolerante, sugerindo que genes HSPs têm relação importante na resposta ao estresse por anoxia, mas não estão diretamente envolvidos na tolerância. Em frutos de tomate armazenados sob hipoxia dois genes codificadores de sHSPs foram altamente induzidos por baixos níveis de oxigênio, indicando uma ação primária destes genes na manutenção da homeostase celular após este estresse. Em pêssegos, a aplicação de ácido giberélico atua na prevenção de danos ocasionados pelo frio através da indução de genes associados ao metabolismo de lipídios, à degradação da parede celular e à síntese de trealose.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / As proteÃnas desacopladoras de planta (pUCPs) sÃo proteÃnas integrais de membrana, localizadas na membrana mitocondrial interna, pertencentes a FamÃlia de Carreadores de Ãnions Mitocondriais (FCAM), responsÃveis pela dissipaÃÃo do gradiente eletroquÃmico de prÃtons, gerado pela respiraÃÃo, como calor. Na presenÃa de Ãcidos graxos livres (AGL), as pUCPs facilitam a reentrada de prÃtons do espaÃo intermembranar para a matriz, desviando-os da ATP Sintase, inibindo assim a fosforilaÃÃo oxidativa. A funÃÃo dessas enzimas ainda nÃo està completamente elucidada, mas a literatura sugere a sua participaÃÃo em processos de amadurecimento de frutos, adaptaÃÃo a situaÃÃes de estresses biÃticos e abiÃticos e proteÃÃo da cÃlula evitando a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio (EROS). Sua participaÃÃo na termogÃnese adaptativa à questionÃvel. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a atividade enzimÃtica da pUCP de mitocÃndrias de hipocÃtilos de Vigna unguiculata (L.) Walp atravÃs de ensaios polarogrÃficos, identificar o(s) gene(s) das pUCPs, estudando a sua expressÃo em diferentes situaÃÃes de estresses abiÃticos. A atividade da pUCP foi avaliada em presenÃa de Ãcidos graxos (palmÃtico, linolÃico, mirÃstico e lÃurico) e BSA tendo succinato e malato como substratos e distintos pHs (6,5, 7,2 e 7,8). As maiores atividades foram obtidas com Ãcido linoleico na presenÃa de succinato em pHs mais alcalinos (7,2 e 7,8). Primers degenerados a partir de dez diferentes pUCPs, denominados pump1 e pump2, foram desenhados para a amplificaÃÃo dos fragmentos gÃnicos por RT-PCR e PCR. Isolou-se o RNA total de folhas de plÃntulas de V. unguiculata submetidas a diferentes condiÃÃes de estresses (NaCl 100mM, H2O2 1mM e PEG 200,67g/L) que foram amplificados por RT-PCR, purificados e clonados no plasmÃdio pCR4-TOPO. Sete fragmentos gÃnicos de aproximadamente 760 pb foram seqÃenciados, apresentando 100% de identidade entre si. A comparaÃÃo da seqÃÃncia deduzida de aminoÃcidos desse fragmento de cDNA com a soja revelou 94% de homologia com GmUCP1a e 90% de homologia com GmUCP1b. Os resultados sugerem que o gene do feijÃo identificado em V. unguiculata (VuUCP1a) à ortÃlogo ao gene GmUCP1a de soja (Glycine max). A expressÃo de VuUCP1a em feijÃo em condiÃÃes de estresses abiÃticos (salino, oxidativo e osmÃtico) atravÃs de anÃlise por xv. RT-PCR revelou um perfil diferencial, sugerindo induÃÃo de expressÃo de VuUCP1a apenas em resposta ao estresse salino. Isolou-se o DNA genÃmico de V. unguiculata e dois fragmentos gÃnicos (1700 e 1900pb) foram amplificados por PCR. A amplificaÃÃo de dois fragmentos distintos a partir do DNA genÃmico sugere a existÃncia de pelo menos dois genes codificando pUCPs em feijÃo, sendo assim, a pUCP à codificada por uma famÃlia multigÃnica. / The uncoupling proteins of plants (pUCPs) are integral proteins of membrane, located in the mitochondrial inner membrane, belong the Mitochondrial Anion Carrier Family (MACF). They are responsible for the dissipation as heat of the electrochemical gradient of protons, generated during respiration. In the presence of free fatty acid acids (FFA), the UCPs facilitate the re-entry of protons from intermembrane space for the matrix and these protons are deviated from the influence of the ATP sintase what leads to the inhibition the oxidative phosphorilation. The function of these enzymes completely is still not elucidated, but literature suggests its participation in processes of fruit maturation, in the adaptation to stress conditions and in cell protection by avoiding the production of reactive species of oxygen (EROS). The involvement of this enzyme in adaptive thermogenesis is questionable. The objective of the present work was to characterize the enzymatic activity of pUCP of mitochondria from hypocotyls of Vigna unguiculata (L.) Walp through polarographic assays and to identify the(s) gene(s) of pUCPs, through its expression in different conditions of abiotic stress. The activity of pUCP was evaluated in the presence of fatty acids (palmitic, linoleic, myristic and lauric) and BSA, having succinate and malate as oxidizable substrates at different pHs (6,5, 7,2 and 7,8). The higuest activities were obtained in the presence of linoleic acid, succinate as substrate and with more alkaline pHs (7,2 and 7,8). Degenerate primers, obtained from ten different pUCPs, called pump1 and pump2, has been designed for amplification of the gene fragments through RT-PCR and PCR. The total RNA was isolated from plants leaves of V. unguiculata submitted to different stress conditions (100 mM NaCl, 1 mM H2O2 and 200,67 g/L PEG) and cDNAs fragments amplified by RT-PCR had been purified and cloned in the plasmid PCR4-TOPO. Seven cDNA fragments of approximately 760 pb had been sequenced and presented 100% of identity among themselves. The comparison of the deduced amino acid sequence of this cDNA fragment with those of soybean disclosed 94% of identity with the gene GmUCP1a and 90% of identity GmUCP1b soybean gene. These results suggest that the pUCP gene identified in V. unguiculata (VuUCP1a) is ortologous to the GmUCP1a gene from soybean (Glycine max). The expression of genes of pUCP in beans, under abiotic stress xvii. conditions (salinity, oxidative and osmotic conditions) analyzed through RT-PCR disclosed a differential profile what suggests induction of expression of VuUCP1a only in response to salt stress. The genomic DNA of V. unguiculata was isolated and two gene fragments (1700 and 1900 pb) had been amplified by PCR. The amplification of two fragments from the genomic DNA suggests the existence of at least two pUCPs genes in beans what leads to the conclusion of a pUCP multigenic family.

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Desta forma, este estudo teve como objetivo estabelecer o perfil de expressão de genes pertencentes às famílias ERF, HSP, HSF, TIM/TOM e TIC/TOC, em arroz e tomate sob condições de estresse por deficiência de O2. Além disso, buscou-se estabelecer o perfil transcricional de pêssegos sob condição de estresse por frio. Os resultados obtidos demonstram que em arroz, alguns membros da família ERF apresentam expressão específica de acordo com o agente estressor, enquanto que outros apresentam sobreposição de expressão entre os estresses, além disso, dentro da família ERF alguns genes apresentam regulação complexa e outros regulação simples. Em arroz, alguns genes codificadores de proteínas pertencentes aos complexos TIM/TOM e TIC/TOC apresentaram altos níveis de expressão 24 horas após estresse por anoxia. Entretanto, após 72 horas sob condições de anoxia, ocorreu a inibição da expressão da maioria dos genes pertencentes a estes complexos, sugerindo que possa haver uma interrupção no transporte de proteínas para a mitocôndria e cloroplasto durante este período de estresse. Ao comparar cultivares de arroz tolerante e sensível ao alagamento, verificou-se que houve um acúmulo de transcritos dos genes codificadores de HSPs em ambas as cultivares. Entretanto, a maioria dos genes avaliados foi mais responsiva ao estresse por anoxia na cultivar sensível, do que na cultivar tolerante, sugerindo que genes HSPs têm relação importante na resposta ao estresse por anoxia, mas não estão diretamente envolvidos na tolerância. Em frutos de tomate armazenados sob hipoxia dois genes codificadores de sHSPs foram altamente induzidos por baixos níveis de oxigênio, indicando uma ação primária destes genes na manutenção da homeostase celular após este estresse. Em pêssegos, a aplicação de ácido giberélico atua na prevenção de danos ocasionados pelo frio através da indução de genes associados ao metabolismo de lipídios, à degradação da parede celular e à síntese de trealose. / Abiotic stresses represent large threats to agriculture and food security, since they limit the productivity of the majority of cultivated plants. In order to identify the responses of plants to abiotic stresses and their associations with tolerance under different environmental conditions, concepts and techniques in molecular biology, cell biology and genetics have been used. The identification of genes responsive to stresses can be used to obtain plants tolerant to adverse environmental conditions by genetic transformation or directed crosses. Thus, this study had the objective the establishing of expression profiles of gene belonging to the ERF, HSP, HSF, TIM/TOM and TIC/TOC families in rice and tomato under low O2 stress. Also, the transcriptional profile of peaches under cold stress as obtained. The results indicate that in rice, some members of the ERF family present specific expression according to the stressing agent, while others have overlapping expression among different stresses. Besides, within the ERF family, some genes do present a complex regulation and others a simple regulation. In rice, some genes encode proteins belonging to the TIM/TOM and TIC/TOC complexes present high expression levels 24 hours after anoxia stress. However, after 72 hours under anoxia, the majority of genes were inhibited, suggesting an interruption on the transport of proteins to the mitochondria and chloroplast during the stress period. When the HSP expression profiles of flooding tolerant and sensitive rice cultivars were compared, transcript accumulation occurred for both cultivar types. However, the majority of genes evaluated were more responsive in the sensitive cultivar than in the tolerant, indicating that HSPs have an important association in the response to anoxia stress but are not directly involved in the tolerance. In tomato fruits stored under hypoxia, two sHSPs genes were highly induced by low oxygen levels, indicating a primary action of these genes on keeping cell homeostasis after the stress. In peaches, the application of gibberellic acid acts on preventing the damaged caused by cold by the induction of genes associated to lipid metabolism, cell wall degradation and trehalose synthesis.

Orientador: Louis Bernard Klaczko / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:57:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araripe_LucianaOrdunha_D.pdf: 1442005 bytes, checksum: 69889cecab16cb4c8feae92d4eb04c7e (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A espécie Zaprionus indianus expandiu sua distribuição geográfica recentemente, a partir da invasão do continente sul-americano. O primeiro registro data de apenas seis anos, e acredita-se que a origem seja sul-africana. Hoje, indivíduos dessa espécie são encontrados numa amplitude latitudinal de 35o, do Uruguai a Belém (Brasil). A chegada de Z. indianus no Brasil apresenta uma oportunidade rara de se estudar um evento de invasão desde seu início. O estudo de características fisiológicas, morfológicas e genéticas de populações brasileiras pode ajudar a construir hipóteses para o sucesso de Z. indianus nas etapas de invasão, além de indicar o potencial para evolução e diferenciação fenotípica. Um aspecto fisiológico estudado nesta tese foi a condição reprodutiva em machos que foram submetidos a extremos de temperatura ao longo de seu desenvolvimento. O estresse térmico causa esterilidade nos machos e a investigação dos limites (superior e inferior) da curva de fertilidade relativa à temperatura, complementa os dados de viabilidade na caracterização do potencial de ocupação de áreas novas por espécies cosmopolitas. Quanto à morfologia, um aspecto estudado foi o dimorfismo sexual no número de cerdas abdominais em uma população africana. Dimorfismo sexual para este caráter foi observado em várias espécies em estudos anteriores, embora padrões diferentes tenham sido encontrados. Nesta tese o padrão observado em Z. indianus foi comparado com o de outra espécie cosmopolita, Drosophila melanogaster. Um terceiro ponto abordado nesta tese foi a investigação de 10 populações brasileiras quanto à variação fenotípica (tamanho e forma da asa). Além das diferenças entre populações, uma abordagem interessante é o quanto de variação está presente dentro de cada população. Ainda, é importante saber o quanto dessa variação é herdável para estimarmos qual a capacidade evolutiva da população. O estudo revelou a ocorrência de alta variabilidade fenotípica dentro e entre populações, além de variação genética aditiva suficiente para promover a evolução de caracteres relacionados à forma da asa / Abstract: The species Zaprionus indianus has recently expanded its geographical distribution with the invasion of the South American continent. The first record dates of only six years, and the origin is probably the South Africa. Nowadays, individuals of this species can be found in a latitudinal range of 35o, from Uruguai to Belém (Brazil). The arrival of Z. indianus in Brazil presents a rare opportunity of studying an event of invasion from its beginning. The study of physiological, morphological and genetic traits in Brazilian populations may contribute to generate hypothesis for the success of Z. indianus in the stages of invasion. Also, it may indicate the potential for evolution and phenotypic differentiation. One physiological trait studied in the current thesis was the relationship of fertility and the temperature of development. Extreme temperatures cause sterility in males and the study of the limits (upper and lower) of the fertility curve complements the data on viability for the characterization of the potential of cosmopolitan species to occupy new areas. One morphological character studied was the sexual dimorphism for the number of abdominal bristles in one African population. A significant sexual dimorphism for this trait was observed in several species in previous studies, though different patterns have been found. In the current work the pattern observed in Z. indianus was compared to the pattern for another cosmopolitan species, Drosophila melanogaster. The third approach of this thesis was the study of the phenotypic variation (size and shape of the wing) present in 10 Brazilian populations. Besides the differences among populations, an interesting approach is the amount of variation present within each population. Also, it is important to know the proportion of this variation that is heritable, which allows an estimate of the evolutionary potential of the population. This study revealed the occurrence of high phenotypic variability within and between populations. In addition, enough additive genetic variation exists to promote the evolution of traits related to the shape of the wing / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_cristina_moll_huther.pdf: 1943888 bytes, checksum: 19ce036e997295b4526288308a80fe3c (MD5) Previous issue date: 2011-08-10 / The abiotic stress often cause metabolic disorders which cause a decrease in plant growth. In response to stress, an increase in the synthesis of certain proteins called ―heat shock proteins‖ (HSPs), might occur. The tomato (Lycopersicon esculentum) cv. Micro-Tom is regarded as a model for experimental studies, and that is because it has features that make it appropriate, such as small size, short development time and easy modification. This study aimed to evaluate the stress effects by flooding and by high and low temperatures in both modified and not modified ‗Micro-Tom tomato plants which have different mitochondrial expressions (MT- sHSP22). The first experiment was conducted in growth chambers under controlled conditions. When the plants were 50 days, they were submitted to stress by flooding during 14 days, and after 7 days, half the plants were removed from the flooding. In the second trial, plants were grown as in the first experiment, and when they presented themselves in a complete vegetative stage, they were submitted to thermal stress for a period of 24 hours of 10 ºC or 37 °C, soon after that, the plants were transferred to the initial conditions for 24 hours. After this phase they were again subjected to a new cycle of stress and recovery. On both experiments were evaluated parameters of the kinetic emission of chlorophyll fluorescence and of gas exchange, taking into account that in the first was also evaluated the content of chlorophyll, and, at the end of the test, the leaf area and the dry mass of the upper area and root. The flooding interfered on the the chlorophyll content of all genotypes, and on the genotype with a high expression of MT-sHSP22, a decrease in the leaf area was not identified and neither was in the total dry mass. The kinetics analysis of the transient fluorescence of chlorophyll showed differential effects of stress by flooding in the different parts of the photosynthetic machinery, and showed different responses between genotypes. When plants were submitted to stress by low temperature, a reduction in the liquid CO2 rate was noticed immediately after the stress, but, after recovery, all genotypes returned close to the controls. For plants submitted to high temperatures of the wild genotype and with high expression of MT-sHSP22 increased the liquid assimilation rate in comparison to control. The chlorophyll fluorescence data indicated different effects on absorption and utilization of light energy between the two genotypes for two of the temperature stress. The interpretation of the JIP test parameters helped to identify that three genotypes exhibit different behavior, mainly on high-temperature stress, and the plants of high expression genotypes of HSP22 and not transformed showed an increase in the parameters related to the photosystem I activity. These results suggest that plants with high doses of mitochondrial sHSP22 may present mechanisms of tolerance against the applied stress. / Os estresses abióticos geralmente causam disfunções metabólicas que provocam diminuição no crescimento das plantas. Em respostas a estresses pode ocorrer o aumento na síntese de algumas proteínas chamadas proteínas de choque térmico (heat shock proteins, HSPs). O tomate (Lycopersicon esculentum), cv. Micro-Tom é considerado como um modelo para estudos experimentais, pois ele possui características que o tornam adequado, tais como o tamanho pequeno, tempo de geração curto, e facilidade de transformação. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos dos estresses por alagamento e por altas e baixas temperatura em plantas transformadas e não transformadas de tomate ‗Micro-Tom com diferentes expressões da sHSP22 mitocondrial (MT-sHSP22). O primeiro experimento foi conduzido em câmaras de crescimento, sob condições controladas. Quando as plantas apresentavam 50 dias foram submetidas a estresse por alagamento por um período de 14 dias, sendo que após 7 dias metade das plantas foram retiradas do alagamento. No segundo ensaio, as plantas foram cultivadas como no primeiro experimento, e quando se apresentavam em estádio vegetativo pleno foram submetidas a estresse térmico por período de 24h a 10ºC ou 37ºC, a seguir as plantas foram transferidas para as condições iniciais por 24h, após este período foram novamente submetidas a um novo ciclo de estresse e recuperação. Em ambos os experimentos foram avaliados os parâmetros da cinética de emissão da fluorescência da clorofila e trocas gasosas, sendo que no primeiro avaliou-se também o índice de clorofila, e ao final do ensaio a área foliar e massa seca da parte aérea e raiz. O alagamento interferiu nos teores de clorofila de todos os genótipos, sendo que no genótipo com elevada expressão da MT-sHSP22, não foi observada redução da área foliar e em relação a massa seca total. A análise da cinética da fluorescência transiente da clorofila a mostrou efeitos diferenciais do estresse por alagamento nos diferentes locais da maquinaria fotossintética, e apresentou variação de resposta entre os genótipos. Quando as plantas foram submetidas ao estresse por baixa temperatura, observou-se redução na taxa assimilatória liquida de CO2 imediatamente após o estresse, mas depois da recuperação todos os genótipos retornaram próximos aos controles. Para as plantas submetidas a altas temperaturas do genótipo selvagem e do com elevada expressão da MT-sHSP22 aumentaram a taxa assimilatória líquida em relação ao controle. Os dados de fluorescência das clorofilas indicaram efeitos diferentes na absorção e aproveitamento da energia luminosa entre os genótipos para os dois estresses de temperatura. A interpretação dos parâmetros do Teste JIP possibilitou identificar que os três genótipos apresentam comportamento distinto principalmente sobre estresse de alta temperatura, sendo que as plantas dos genótipos com alta expressão de sHSP22 e não transformado apresentaram elevação nos parâmetros relacionados a atividade do fotossistema I. Estes resultados sugerem que as plantas com elevada expressão das sHSP22 mitocondrial podem apresentar mecanismos de tolerância frente as estresses aplicados.

Orientador: Douglas Silva Domingues / Resumo: O café é uma das commodities agrícolas tropicais mais comercializadas no mundo. Coffea arabica é a principal espécie utilizada para a produção comercial de café. A espécie é originária da Etiópia. Ela é única espécie alotetraploide do gênero (2n = 4x = 44) e se reproduz predominantemente por autofecundação. As cultivares comerciais de C. arabica possuem baixa diversidade genética, o que indica a necessidade de introgressão de alelos de germoplasma para o melhoramento dessas cultivares. Acessos do centro de origem da espécie possuem maior diversidade que as cultivares comerciais e podem ser utilizados para a identificação de novos alelos. O conteúdo de macronutrientes em grãos do cafeeiro tem impacto direto na qualidade do produto. No entanto, a base molecular da composição mineral de grãos de cafeeiro ainda é pouco conhecida. Com isso, o objetivo desse trabalho foi identificar marcadores SNP possivelmente associados com a composição de macronutrientes em grãos de C. arabica. Para alcance deste objetivo, foram comparados três métodos de imputação de genótipos, bem como foi realizado o mapeamento associativo em estudo de associação genômica ampla (GWAS). Foi utilizado um painel de 110 genótipos de C. arabica, composto por genótipos elite do programa de melhoramento do Instituto Agronômico do Paraná (3), cultivares comerciais (11) e acessos selvagens (96). Foram realizadas análises da composição de cinco macronutrientes (N, P, K, Ca e Mg) em grãos de cafeeiro coletados de 70 e 1... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Coffee is one of the most traded tropical commodities in the world. Coffea arabica is the main species used for commercial production. The species is originally from Ethiopia. In the Coffea genus, C. arabica is the only allotetraploid species (2n = 4x = 44) and it reproduces predominantly by self-fertilization. The commercial cultivars of C. arabica have a narrow genetic base that indicates the need for the introgression of new alleles from germplasm into coffee breeding programs. Wild accessions of C. arabica, from Ethiopia, have higher genetic diversity and can be used to identify new alleles. The macronutrient composition of the coffee grains has a direct impact on grain quality. However, the molecular basis for the mineral composition in coffee grains still poorly understood. Thus, the aim of this work was to perform mapping association analyses using the genome-wide association study (GWAS) technique to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with macronutrient content in coffee grains from C. arabica. We also tested three imputation methods (haplotype missing allele imputation - Beagle, K-nearest neighbors, and Random Forest) in the genotypic data, and mapped it to two C. arabica reference genomes from the cultivar Caturra red and the spontaneous dihaploid Et39. We used a panel of 110 C. arabica genotypes, including elite landraces from the IAPAR coffee breeding program (3), commercial cultivars (11) and wild accessions (96). Analysis of the compositi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Em estudos de proteção ao genoma contendo lesões de C. crescentus, foi feita uma varredura em uma biblioteca clones mutados pelo transposon Tn5 e sensíveis à luz UV-B e MMS. Dos 249 clones selecionados conseguimos identificar mutações em 102 genes, distribuídos em dez categorias funcionais, incluindo metabolismo de DNA. Além de genes já descritos como atuantes na defesa de genoma a lesões, os dados ainda adicionam funções potenciais para outros genes. Investigação mais detalhada indica que vários dos genes identificados podem afetar o estresse e ciclo celular, podendo estar relacionados a respostas do tipo pontos de checagem. Além disso, verificamos que mutantes para genes envolvidos em reparo excisão de nucleotídeos são mais sensíveis à H2O2, indicando que nessa bactéria, este sistema de reparo atua também em lesões oxidativas no DNA. Os dados obtidos são pioneiros no estabelecimento de funções para vários genes de C. crescentus e de outras alfa-proteobactérias. / This work aimed to identify genes related to DNA damage protection in C. crescentus, by means of screening a Tn5 -mutated library for clones sensitive to UV-B light and MMS. Out of 249 selected clones, we were able to identify mutations in 102 genes, classified in ten different functional categories, including DNA metabolism. In addition to genes already described as playing a role in genome defense to lesions, the results provide new potential functions to several other genes. More detailed investigation indicates also that the mutations in some of these genes may also affect cell stress and cell cycle, being potentially involved in check-point responses. Moreover, mutants for nucleotide excision repair genes were also found to be sensitive to H2O2, indicating that this DNA repair system also acts in DNA oxidative damage. These data are the first establishing a role in genome protection for several genes in C. crescentus, as well as other alpha-proteobacteria.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O acÃmulo de Na+ no vacÃolo central representa um importante mecanismo de defesa de plantas contra o estresse salino. A regulaÃÃo dos volumes e conteÃdos dos vacÃolos de cÃlulas vegetais depende da atividade de transportadores e canais localizados no tonoplasto (membrana vacuolar). A membrana vacuolar possui duas distintas bombas de prÃtons (V-ATPase e V-PPase), aquoporinas e vÃrios sistemas de transportes ativos e/ou secundÃrios, como os contra-transportadores Na+/H+ vacuolares. As duas bombas de prÃtons transmembranares funcionam como sistemas de transporte primÃrio nas cÃlulas vegetais e ambas as enzimas geram uma diferenÃa de potencial eletroquÃmico de prÃtons atravÃs da membrana vacuolar. Os contra-transportadores vacuolares Na+/H+ utilizam o gradiente eletroquÃmico de prÃtons gerado pelos transportadores primÃrios para transportar Na+ para dentro do vacÃolo. No presente trabalho inicialmente foram determinados os conteÃdos de Ãons Na+ e K+ em raÃzes, hipocÃtilos e folhas e em seguida a anÃlise da expressÃo dos genes das bombas de prÃtons (VHA-A, VHA-E e HVP) e dos contra-transportadores vacuolares (NHX2 e NHX6) em plÃntulas de Vigna unguiculata (L.) Walp cv. Vita 5 submetidas a estresse salino e osmÃtico. As plÃntulas foram crescidas em meio nutritivo na ausÃncia de NaCl e PEG (controle), na presenÃa de 100 mM de NaCl (estresse salino) ou na presenÃa de 200,67 g/L de PEG (estresse osmÃtico). O conteÃdo de Ãons Na+ aumentou em todos os tecidos da planta quando submetidos ao estresse salino (NaCl 100 mM) enquanto que o conteÃdo de Ãons K+ diminuiu na mesma condiÃÃo. A expressÃo dos genes das bombas de prÃtons e dos contra-transportadores vacuolares de folhas e de raÃzes no estresse salino aumentou em todas as condiÃÃes estudadas, porÃm o aumento foi mais expressivo para os genes da V-PPase, NHX2 e NHX6 sugerindo uma regulaÃÃo paralela entre esses genes. JÃ no estresse osmÃtico, os resultados para as folhas mostraram que a expressÃo dos genes VHA-A e VHA-E aumentaram enquanto que os outros genes nÃo sofreram mudanÃas significativas. Nossos resultados sugerem que o estresse salino e o estresse osmÃtico induziram uma regulaÃÃo diferenciada em todos os genes sendo o contra-transportador Na+/H+ importante na homeostase celular quando as plantas foram submetidas ao estresse salino e osmÃtico. / The acummulation of Na+ in the central vacuole represents an important mechanism for plants to cope with salt stress. The vacuolar content and the regulations of their volumes in vegetable cells depend on the activity of transporters and channels located in the tonoplast (vacuolar membrane). The vacuolar membrane possesses two different proton pumps (V-ATPase and V-PPase), aquoporine, and systems of primary and secondary transporters like the vacuolar Na+/H+ antiporter (NHX). The two transmembrane proton pumps work as systems of primary transport in vegetable cells and both enzymes generate a difference of proton electrochemical potential through the vacuolar membrane which can provide energy to antiport system, H+/substrate. The vacuolar Na+/H+ antiporter, uses the electrochemical gradient generated by the primary transporters to pump Na+ ions inward the vacuole. In the present work were first determined the Na+ and K+ content followed by the gene expression of the vacuolar proton pumps (VHA-A, VHA-E and HVP) and the vacuolar antiporters (NHX2 and NHX6) from seedlings of Vigna unguiculata subjected to salt and osmotic stress. The seedlings were grown on nutritive medium in the absence of NaCl and PEG (control condition), presence of NaCl 100 mM (salt stress) or in the presence of PEG 6000 200,67g.L-1 (osmotic stress). The ion Na+ content essay showed an increase in all plant tissues when submitted to salt stress, while the K+ ions decreased in the same condition. The gene expression of the vacuolar proton pumps and the Na+ antiporter from roots and leaves showed an increase in all studied conditions being more expressive to V-PPase, NHX2 and NHX6 suggesting a coordinated regulation of these genes. The results from leaves showed that VHA-A and VHA-E were increased, while the others genes tend to remain constant in the osmotic stress. These results suggest that salt and osmotic stress induced a differential regulation of all studied genes, being the vacuolar Na+ antiporters an important part on keep the cellular homeostasis when the plants were submitted to salt stress