Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ana Maria Iba Kanashiro / Banca: José Moacir Marin / Resumo: A glicoproteína de superfície (8) do vírus da bronquite infecciosa (VBI) em aves; é um alvo antigênico importante para a indução de imunidade e como antígeno utilizado no imunodiagnóstico da infecção causada por este vírus. Nesse estudo, a forma recombinante da subunidade 81 da glicoproteína 8 da estirpe M41 do VBI foi clonada e expressa como proteína de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o epítopo V-5 em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador dessa proteína foi amplificado a partir do RNA genômico da estirpe M41 do VBI, por meio das técnicas da reação de transcrição reversa (RT) e da reação da polimerase em cadeia (PCR). Foi amplificada toda a seqüência codificadora de interesse e fossem geradas extremidades compatíveis com a inserção no vetor pYE82.1N5-His-TOPO. Este vetor foi usado na transformação de leveduras, tendo sido obtidos os clones transformantes específicos portadores do inserto gênico. A expressão da proteína de fusão foi então induzida, em células de S. cerevisiae, sendo produzida a proteína recombinante 81 de fusão com peso molecular 95 kDa. Essa proteína apresentou com uma elevada reatividade cruzada para a proteína 8 do próprio vírus, tal como demonstraram os resultados das análises pelo Western blotting e ELl8A. Essa proteína de fusão foi, devido à presença da cauda de poli¬histidina, prontamente purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel ¬agarose e, posteriormente utilizada com sucesso no desenvolvimento de um método indireto de ELl8A para a detecção de anticorpos específicos de galinhas infectadas com o VBI. / Abstract: The surface glycoprotein of infectious bronchitis virus (IBV) is a important antigenic target for the induction of immunity and as antigen in the immunodiagnosis of infection caused by this virus. In this study, the gene of 51 glycoprotein of M41 strain of the IBV was cloned and expressed as a fusion protein containing a poly-histidine and epitope V-5 tags in the yeast cells of Saccharomyces cerevisiae. The 51 gene was amplified from genomic RNA of the M41 strain of VBI, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR). The entire coding sequence of 51 gene was amplified and inserted in the vector pYE52.1N5-His-TOPO. This construct was used for transforming yeast cells, and to obtain specific clones carrying the inserted gene. The expression of the fusion protein was induced in transformed cells of S. cerevisiae, and a recombinant 51 protein was produced with a molecular weight of 95 kDa. A high cross¬reactivity with the original 51 protein from the virus was detected by Western blotting and ELl5A. The presence of the poly-histidine tail in the fusion recombinant protein favored their prompt purification by affinity chromatography in a column of nickel¬sepharose. This recombinant 51 protein was successfully used in the development of an indirect method of ELl5A for the detection of specific anti-IBV antibodies in chickens experimentally infected or vaccinated with this virus. / Mestre

Orientador: Raquel Mantuaneli Scarel-Caminaga / Banca: Andrea Marcia Marcaccini / Banca: Ricardo Della Coletta / Banca: Carlos Rossa Junior / Banca: Joni Augusto Cirelli / Resumo: A Doença Periodontal (DP) tem caráter multifatorial, com influência de fatores como a presença de microrganismos periodontopatogênicos, reação do sistema imune, suscetibilidade genética do hospedeiro, hábito de fumar, stress e presença de doenças sistêmicas. O tecido periodontal inflamado produz várias citocinas, dentre elas a interleucina 4 (IL-4). Estudos realizados por este grupo identificaram que indivíduos carregando os polimorfismos -590(T/C), +33(T/C) e VNTR(I/D) no gene IL4 formando o haplótipo TCI/CCI são 5 vezes mais suscetíveis à DP (Odds Ratio ajustado= 5,3; 95% Intervalo Confiança = 2,2 -12,9), enquanto o haplótipo TTD/CTI conferiu proteção contra o desenvolvimento da DP, Odds Ratio ajustado= 0,18 (95% Intervalo Confiança = 0,04 - 0,88). Assim, para verificar a funcionalidade dos haplótipos no gene IL4, o objetivo deste estudo foi investigar possíveis diferenças na resposta imune frente a estímulos inflamatórios e de bactérias periodontopatogênicas em células coletadas do sangue de pacientes que carregam tais diferentes haplótipos. A funcionalidade dos referidos haplótipos no gene IL4 foi também investigada por meio da regulação da expressão do gene repórter presente em plasmídeos recombinantes construídos artificialmente (constructos). Foram coletados sangue periférico de 5 pacientes de cada haplótipo e estimulados com mediadores inflamatórios e bactérias periodontopatogênicas para se avaliar a expressão gênica (mRNA, RT-qPCR), proteínas secretadas (Multiplex) e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Periodontal disease (PD) is multifactorial, with the influence of factors such as the presence of periodontopathogenic micro-reaction of the immune system, genetic susceptibility of the host, smoking, stress and presence of systemic diseases. The inflamed periodontal tissue produces various cytokines, among which interleukin 4 (IL- 4). Studies by this group found that subjects carrying the -590 polymorphism (T/C) +33 (T/C) and VNTR (I/D) in the IL4 gene haplotype forming the TCI/CCI are 5 times more susceptible to PD (ORadjusted= 5.3; 95% CI = 2.2 - 12.9), while the TTD/CTI haplotype conferred protection against the development of PD (ORadjusted= 0.18; 95% CI = 0.04- 0.88). So, to check the functionality of the haplotypes in the IL4 gene, the aim of this study is to investigate possible differences in the immune response against inflammatory and periodontal bacteria stimuli in collected blood cells from patients with different haplotypes. The functionality of these haplotypes in the IL4 gene will also be investigated by means of regulation of expression of the reporter gene present in the recombinant plasmids constructed artificially (constructs). Peripheral blood was collected from 5 patients of each haplotype and stimulated with inflammatory mediators and periodontal bacteria to assess the gene expression (mRNA RT-qPCR), secreted proteins (Multiplex) and intracellular proteins featuring cellular phenotypic profile (flow cytometry). Constructs containing each haplotype were ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Claudia Aparecida Rainho / Banca: Patrícia Pintor dos Reis / Banca: Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro / Resumo: Alterações epigenéticas, incluindo as alterações da metilação do DNA, das modificações de histonas e da atividade de RNAs não codificadores, são eventos frequentes em células tumorais e estão associados às mudanças da estrutura da cromatina e dos níveis de expressão gênica. O gene RASSF1, localizado em 3p21.3, é responsável pela transcrição de sete variantes a partir de regiões promotoras distintas, associadas a duas ilhas CpG. Dentre os transcritos estão RASSF1A e RASSF1C, codificados por regiões promotoras diferentes, e que têm sido descritos na literatura como codificadores de proteínas com funções celulares opostas: RASSF1A é caracterizado como supressor tumoral e é frequentemente silenciado por metilação anormal em vários tipos de câncer, enquanto RASSF1C tem sido associado a atividades oncogênicas, e não há relatos de metilação de ilha CpG associada à sua região promotora. Com a finalidade de investigar uma possível associação entre parâmetros clínicos e histopatológicos em pacientes diagnosticadas com câncer de mama e o padrão de metilação de RASSF1A e RASSF1C, foram analisadas 84 amostras de carcinomas mamários pela técnica de MS-PCR (Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction). Para RASSF1A, foi encontrada uma frequência de metilação de 84,5% das amostras, enquanto que para RASSF1C todas as amostras apresentaram alelos exclusivamente não-metilados, o que sugere uma regulação de expressão diferente da observada para RASSF1A. Devido ao fato de 75 das 84 amostras utilizadas serem diagnosticadas como carcinomas ductais invasivos, as análises estatísticas incluíram apenas esse subtipo histológico. Não foi encontrada diferença estatística significativa para as características clínicas/histopatológicas e presença/ausência de metilação de RASSF1A. Foi também analisado o padrão de metilação das ilhas CpGde RASSF1 em 17 linhagens celulares derivadas de carcinomas ... / Abstract: Alterações epigenéticas, incluindo as alterações da metilação do DNA, das modificações de histonas e da atividade de RNAs não codificadores, são eventos frequentes em células tumorais e estão associados às mudanças da estrutura da cromatina e dos níveis de expressão gênica. O gene RASSF1, localizado em 3p21.3, é responsável pela transcrição de sete variantes a partir de regiões promotoras distintas, associadas a duas ilhas CpG. Dentre os transcritos estão RASSF1A e RASSF1C, codificados por regiões promotoras diferentes, e que têm sido descritos na literatura como codificadores de proteínas com funções celulares opostas: RASSF1A é caracterizado como supressor tumoral e é frequentemente silenciado por metilação anormal em vários tipos de câncer, enquanto RASSF1C tem sido associado a atividades oncogênicas, e não há relatos de metilação de ilha CpG associada à sua região promotora. Com a finalidade de investigar uma possível associação entre parâmetros clínicos e histopatológicos em pacientes diagnosticadas com câncer de mama e o padrão de metilação de RASSF1A e RASSF1C, foram analisadas 84 amostras de carcinomas mamários pela técnica de MS-PCR (Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction). Para RASSF1A, foi encontrada uma frequência de metilação de 84,5% das amostras, enquanto que para RASSF1C todas as amostras apresentaram alelos exclusivamente não-metilados, o que sugere uma regulação de expressão diferente da observada para RASSF1A. Devido ao fato de 75 das 84 amostras utilizadas serem diagnosticadas como carcinomas ductais invasivos, as análises estatísticas incluíram apenas esse subtipo histológico. Não foi encontrada diferença estatística significativa para as características clínicas/histopatológicas e presença/ausência de metilação de RASSF1A. Foi também analisado o padrão de metilação das ilhas CpGde RASSF1 em 17 linhagens celulares derivadas de ... / Mestre

Orientador: Cláudia Aparecida Rainho / Banca: Deilson Elgui de Oliveira / Banca: Vinicius Santana Nunes / Resumo: O gene SFN (stratifin; 14-3-3sigma) atua como um gene supressor tumoral cuja expressão é induzida em resposta a danos ao DNA, promovendo o bloqueio do ciclo celular no checkpoint G2/M. A inativação ou redução da expressão gênica por hipermetilação de sua ilha CpG foi apontada como um mecanismo comum a vários tipos de cânceres humanos e também foi associada com resposta ao tratamento. O objetivo desse estudo foi caracterizar alterações genéticas e epigenéticas do gene SFN em carcinomas mamários primários e investigar a sua relação com parâmetros clínicos e histopatológicos. Em adição, linhagens derivadas de epitélio mamário normal e de carcinomas mamários foram utilizadas para a caracterização do efeito do número de cópias e do padrão de metilação do DNA na expressão gênica e para o estudo do efeito combinado do tratamento com o agente desmetilante 5-Aza-dC (5-Aza-2'-Desoxicitidina) e da exposição à radiação nas taxas de sobrevivência celular. O padrão de metilação do DNA foi determinado por MS-PCR (Methylation Specific-Polimerase Chain Reaction), após modificação do DNA por bissulfito de sódio, em uma série de 84 carcinomas mamários (76 ductais infiltrantes, 5 lobulares infiltrantes, 1 metaplásico, 1 apócrino e 1 papilífero) , bem como em um painel de 20 linhagens celulares (3 normais e 17 derivadas de carcinomas). O número de cópias foi determinado por qPCR (quantitative Polimerase Chain Reaction) em 82 destas amostras. Os níveis de expressão do transcrito foram avaliados por RT-qPCR em 8 linhagens celulares selecionadas com base no número de cópias, padrão de metilação e o status da proteína p53. O efeito da exposição à radiação ionizante, em uma única dose de 4 Gy em intervalos de tempo de 12, 24, 48 e 72h foi estudado através do ensaio de MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) em três linhagens celulares (T47D, MDA-MB-231 e MDA-MB-436) ... / Abstract: The SFN gene (Stratifin; 14-3-3 sigma) plays roles as a tumor suppressor gene and its expression is induced in response to DNA damage by disabling the cell cycle arrest at the G2/M checkpoint. Inactivation or down-regulation of gene expression levels has been generally attributed to the hypermethylation of its CpG island, identified as a common mechanism in a variety of human cancers, also associated to treatment response. The aim of the present study was to characterize epigenetics and genetics alterations of the SFN gene in primary breast cancer and to investigate the relationship with clinical and histopatological variables. In addition, cell lines derived from normal breast and breast cancer tissues, were employed to identify the effect of copy number dosage and DNA methylation pattern in gene expression, besides the study of combined response to 5-Aza-dC (5-Aza-2'-Deoxycytidine) and radiation exposure on cell survival. After sodium bisulfite modification, the DNA methylation pattern was determined by Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction (MS-PCR) in a series of 84 Breast cancer samples (76 infiltrating ductal carcinomas, 5 infiltrating lobular, 1 metaplasic, 1 apocrine and 1 papillary) as well as in a panel of 20 human cell lines (3 derived from normal breast and 17 from breast cancer). SFN copy number was performed using relative quantification, by qPCR (quantitative Polimerase Chain Reaction) in 82 samples. Transcript levels were evaluated by RT-qPCR within a selection of 8 cell lines, based on DNA methylation, SFN copy number dosage and p53 status. Ionizing radiation effect was studied through MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay, by using a single dose of 4 Gy at different time intervals (12, 24, 48 and 72h) in tree cell lines (T47D, MDA-MB-231 e MDA-MB-436) treated or not with 5-Aza-dC. SFN methylation was observed in 79% of primary breast cancer, while copy number alterations ... / Mestre

Orientador: Célia Regina Nogueira / Coorientador: Paula de Oliveira Montandon Hokama / Banca: Vânia dos Santos Nunes / Banca: Glaucia Maria F. da Silva Mazeto / Banca: Patrícia Pinto Saraiva / Banca: Maria Tereza Nunes / Resumo: A incidência de câncer de mama (CM) tem aumentado de maneira alarmante nos últimos anos. Diversas pesquisas conduziram à descoberta de amphiregulin (AREG) como um oncogene, tendo sua expressão relacionada com diversos tipos de cânceres. Nosso grupo evidenciou a ação do T3 sobre diferentes genes em células de câncer de mama, por meio de microarray, porém nesse estudo não foi avaliado o mecanismo de ação pelo qual o T3 regula a expressão desses genes e o envolvimento de ER. A relação entre a expressão de AREG e a presença de HT permanece desconhecida, portanto, o objetivo do presente estudo foi verificar a ação nuclear e extra-nuclear do T3 na expressão gênica do oncogene AREG em linhagens celulares de adenocarcinoma de mama, MCF-7 e MDA-MB-231. As linhagens celulares foram submetidas ao tratamento com 10-8M de T3 nos tempos de 10', 30', 1h e 4h, na presença ou ausência de Fulvestrant (ICI 182,780), inibidor de ER, Actinomicina D (ACTD) - inibidor da expressão gênica, Ciclohexamida (CHX), inibidor da síntese protéica, e LY294002 - inibidor da via PI3K. O mRNA de AREG foi analisado pela técnica de RT-PCR. Para a análise dos dados foi utilizado ANOVA complementado com teste de Tukey e adotado significância mínima de 5%. O T3 elevou os níveis de expressão gênica de AREG, em relação ao grupo controle, nas duas linhagens celulares, independente dos tempos de incubação. Nosso trabalho confirma que a expressão gênica de AREG está aumentada na presença T3, em ambas as linhagens e em todos os tempos estudados. Os dados desse estudo indicam que T3 pode agir por meio de ER, diminuindo a expressão de AREG após 30' de tratamento nas células MCF-7 e não alterando a expressão desse gene nas células MDA-MB-231, as quais não possuem ER. Além disso, podemos sugerir que a ação de T3 sobre a expressão gênica de AREG ocorre de forma indireta. O T3 mantém a expressão de AREG mesmo após... / Abstract: The incidence of breast cancer (BC) has increased alarmingly in recent years. Several studies have been lead to the discovery of amphiregulin (AREG) as an oncogene, with its expression related to various cancer types. Our group showed the action of T3 on different genes in BC cells using microarray, but the mechanism which T3 regulates the expression of these genes and the involvement of ER have not been evaluated yet. The relationship between the expression of AREG and the presence of TH remains unknown, therefore, the aim of this study was to verify the nuclear and extra-nuclear action of T3 on AREG gene expression in breast adenocarcinoma cell lines, MCF-7 and MDA-MB-231. The cell lines were subjected to treatment with 10-8M T3 at the times 10', 30', 1h and 4h in the presence or the absence of Fulvestrant (ICI 182,780) - ER inhibitor, Actinomycin D (ACTD) - inhibitor of gene expression, cycloheximide (CHX) - inhibitor of protein synthesis, and LY294002 - inhibitor of PI3K pathway. The AREG mRNA levels were analyzed by RT-PCR. For data analysis we used ANOVA followed by the post hoc Tukey's test with a significance level of 5%. T3 increased AREG gene expression levels, compared to the control group in both cell lines, regardless of the incubation times. Our study confirms that AREG gene expression is increased in the presence of T3 in both cell lines and at all the times studied. The data from this study indicate that T3 might act through ER, decreasing AREG expression after 30' treatment in MCF-7 cells and did not alter the expression of this gene in MDA-MB-231 cells, which lack ER. Furthermore, we suggest that T3actionon AREG gene expression occurs indirectly. The T3 maintains AREG expression even after the inhibition of transcription. And, the PI3K pathway activation by T3 is required for the modulation of AREG in both cell lines studied / Doutor

Orientador: Luis Artur Loyola Chardulo / Banca: Saulo da luz e Silva / Banca; Henrique Nunes de Oliveira / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Banca: Rogério Abdallah Curi / Resumo: Com o intuito de estudar o potencial de aplicação de genes candidatos na seleção animal para o melhoramento genético da qualidade de carne de bovinos Nelore (Bos indicus), o presente trabalho teve como objetivos principais: (1) Avaliar em bovinos Nelore e cruzamentos Nelore x Bos taurus a ocorrência de associações entre o SNP g.98535683A>G:BTAU7 do gene CAST e as características da carne produzida e (2) quantificar a expressão gênica e proteica da cadeia pesada da miosina em bovinos Nelore com características fenotípicas contrastantes de crescimento e maciez da carne. Para o desenvolvimento do primeiro objetivo, 500 animais foram genotipados para o SNP g.98535683A>G:BTAU7 e fenotipados para força de cisalhamento (FC), índice de fragmentação miofibrilar (MFI), área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e lipídeos totais (LIP). Associação significativa entre o SNP e a maciez da carne foi observada. O genótipo AA apresentou os melhores valores em relação a esta característica. As diferenças encontradas entre os genótipos AA e AG (AA - AG) foram de - 0,19 kg e 5,31 para FC e MFI, respectivamente. O SNP não mostrou associação significativa com AOL, EGS e LIP. Para a execução do segundo objetivo, 90 bovinos Nelore terminados em confinamento foram utilizados. Levando em consideração o peso final ao abate (PF) e a FC dos 90 animais, 24 indivíduos com características contrastantes de peso e maciez da carne foram selecionados e divididos em quatro grupos experim... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In order to study the potential of application of candidate genes in animal selection for breeding meat of Nellore cattle, this work had as main objectives: (1) Assess in Nellore cattle (Bos indicus) and crosses Nellore x Bos taurus the occurrence of associations between the g.98535683A>G:BTAU7 SNP in the CAST gene and traits of the meat produced and (2) quantify the gene and protein expression of myosin heavy chain in Nellore cattle with contrasting phenotypic traits of growth and meat tenderness. For the development of first objective, 500 animals were genotyped for the g.98535683A>G:BTAU7 SNP and phenotyped for shear force (SF), myofibrillar fragmentation index (MFI), ribeye area (RA), backfat thickness (BT) and total lipids (TL). Significant association between the SNP and meat tenderness was observed. The AA genotype showed the best values in relation to this trait. The differences found between genotypes AA and AG (AA - AG) were - 0.19 kg and 5.31 for SF and MFI, respectively. The SNP did not show significant association with RA, BT and TL. For the execution of the second aim, 90 feedlot Nellore cattle were used. Considering the final slaughter weight (FW) and the SF of the 90 animals, 24 individuals with contrasting characteristics of weight and tenderness of meat were selected and divided into four experimental groups (6 animals / group). The groups corresponded to lightweight animals with tender meat (FW = 493.50 kg and SF = 3.76 kg), lightweight animals with tough m... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Flávia Cristina Rodrigues Lisoni / Coorientador: Sonia Maria Oliani / Banca: Edson Guilherme Vieira / Banca: Andréia Machado Leopoldino / Resumo: O carcinoma de colo de útero, também denominado câncer cervical, é o segundo tipo de câncer mundialmente mais frequente em mulheres, sendo a quarta causa de morte em países em desenvolvimento. A carcinogênese de colo de útero está relacionada com alterações genéticas, infecção pelo Papilomavirus Humano (HPV), angiogênese e processos inflamatórios. A idéia de que a inflamação está envolvida na tumorigênese é apoiada pela observação de que surge frequentemente em áreas de inflamação crônica. Por outro lado, a resposta inflamatória é controlada pela ação de mediadores anti-inflamatórios, que atuam para manter a homeostasia da resposta imunológica e prevenir a lesão tecidual. Entre esses mediadores destacamos a anexina-A1 (ANXA1), proteína de 37 kDa, que é expressa pelas células tumorais e atua como moduladora do processo inflamatório. Diante dessas considerações, investigamos, in vitro, a influência dessa proteína nas células SiHa sobre a morfologia, proliferação e expressão gênica e proteica. Para isso foi cultivada a linhagem celular SiHa em meio completo e tratada com o peptídeo ANXA1Ac2-26 para avaliar o efeito dessa proteína nos tempos de 2, 4, 24, 48 e 72 horas na morfologia e proliferação celular. Os resultados mostraram que o peptídeo não alterou a morfologia das células SiHa, no entanto diminuiu a proliferação celular, evidenciando o tempo de 72 horas como o mais significante pelas análises estatísticas, seguido de um novo cultivo para posterior análise imunocitoquímica ultraestrutural, extração de RNA e desenvolvimento da técnica de Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH). A validação dos seis genes diferencialmente expressos foi realizada por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). A expressão da proteina ANXA1 foi observada diminuida nas células SiHa tratadas com o peptídeo pelas análises imunocitoquímicas ultraestruturais. A técnica de RaSH resultou em 82 genes .. / Abstract: Carcinoma of the cervix, also called cervical cancer is the second most common cancer in women worldwide and is the fourth leading cause of death in developing countries. The cervical carcinogenesis is related to genetic alterations, infection with Human Papillomavirus (HPV), angiogenesis and inflammation. The idea that inflammation is involved in tumorigenesis is supported by the observation that often arises in areas of chronic inflammation. Furthermore, the inflammatory response is controlled by the action of anti- inflammatory mediators that act to maintain homeostasis of the immune response and prevent tissue damage. Among these mediators is included annexin A1 (ANXA1), a protein of 37 kDa, which is expressed by tumor cells and acts as a modulator of the inflammatory process. Given these considerations, we investigated in vitro the influence of this protein in SiHa cells on the morphology, proliferation and gene and protein expression. In order to realize this aim, the cell line SiHa was cultured in complete medium and treated with the peptide ANXA1Ac2 -26 to evaluate the effect of this protein on times 2, 4, 24, 48 and 72 hours in morphology and cell proliferation. The results showed that the peptide did not alter the morphology of SiHa cells, but decreased cell proliferation, indicating the time 72 hours as the most significant by statistical analysis, followed by a further cultivation for subsequent ultrastructural immunocytochemical analysis, RNA extraction, and development of technical Rapid Subtractive Hybridization (RaSH). The validation of six differentially expressed genes was performed by quantitative real-time PCR (RT- qPCR). The expression of ANXA1 was decrease in cells treated with the peptide observed by ultrastructural immunocytochemical analysis. The RaSH technique resulted in 82 differentially expressed genes after treatment with ANXA1Ac2 -26. Six of these genes (HIF1A, ID1, LDHA, NCOA3, RAB13, TPT1), because their ... / Mestre

Orientador: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Carlos Eduardo Calzavara Silva / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: O Vírus da Febre amarela (YFV) causa doença com considerável morbidade e mortalidade nas regiões tropicais. Diversos vírus possuem estratégias para a alteração dos processos celulares. Mecanismos de splicing celulares são essenciais para diversificar a expressão dos genes e podem aumentar seu potencial de gerar proteínas. A replicação de YFV e as interações entre proteínas virais e celulares não são totalmente conhecidas. A proteína celular hSlu7 possui sinal de localização nuclear e tem um papel importante nas reações catalíticas do segundo passo do splicing. Estudos demonstram que sob infecção de YFV hSlu7 transloca para o citoplasma. A translocação de proteínas entre o citoplasma e o núcleo pode representar um mecanismo viral da regulação da expressão gênica. Este estudo teve como objetivo a caracterização da interação entre a proteína hSlu7 e NS5 viral, bem como estudar os efeitos de interações sobre os mecanismos de splicing alternativo após a infecção de YFV. Para identificar interação de NS5 de YFV com hSlu7 foi realizado ensaio de co-imunoprecipitação. Para verificar alteração de splicing celular foram utilizados replicons pEGFP-ADAR, pI12-IL7R, pEFGP-FGFR2, bem como a alteração de isoformas de XBP-1 endógenos. Os resultados indicam que NS5 de YFV interage com proteína hSlu7 e que sua interação pode influenciar no metabolismo RNA celular. YFV demonstrou exercer modulação no splicing celular, a avaliação de replicons sugerem que em splicing dependente de hSlu7, bem como a independente ocorre uma regulação viral atuando sobre sítios de splicing fraco e que a interação hSlu7-NS5 pode alterar direta e indiretamente a regulação trans-acting / Abstract: Yellow fever virus (YFV) causes disease with significant morbidity and mortality in tropical regions. Several viral strategies are avail for recruitment and alteration of the biochemical cellular processes. Cellular splicing mechanisms are essential to diversify the gene expression and increase it's proteomic potential. Replication of YFV and the interactions between viral and cellular proteins are unknown. The cellular protein hSlu7 has an nuclear localization and an important role in the second catalytic reaction step of the alternative splicing. In our study group demonstrated that under YFV infection hSlu7 translocates to the cytoplasm. The translocation of proteins between nucleus and cytoplasm may represent a viral mechanism of cellular gene expression regulation, interference in the protein availability of the alternative splicing and viral replication control. This study aimed to characterize the interaction between the viral protein hSlu7 and NS5, as well as studying the effects of interactions on the mechanisms of alternative splicing after YFV infection. To identify interaction with YFV NS5 hSlu7 was conducted co-immunoprecipitation assay. To verify changes in cellular splicing replicons were used pEGFP-ADAR, PI12-IL7R, pEFGP-FGFR2 as well as the change of isoforms of XBP-1 endogenous.The results indicated that YFV NS5 protein interacts with hSlu7 and that their interaction may influence cellular metabolism RNA. YFV perform modulation on cellular splicing, the evaluation of replicons suggest that in hSlu7 splicing dependent and independent regulation occurs viral acting on weak splice sites and that the interaction hSlu7-NS5 can change directly or indirectly to regulate trans- acting / Mestre

Orientador: Carlo José Napolitano / Banca: José Carlos Marques / Banca: Ary José Rocco Júnior / Resumo: O direito à liberdade de expressão é garantido pela Constituição brasileira de 1988, e pode ser exercido de diversas formas. Entre junho de 2013 e julho de 2014, esse direito foi exercido por milhões de brasileiros que foram às ruas protestar contra a precariedade da saúde e educação pública, a corrupção, o aumento da tarifa de ônibus e também contra os gastos excessivos para a realização da Copa do Mundo. As manifestações sociais aconteceram na mesma época em que dois megaeventos esportivos eram realizados no país: a Copa das Confederações, em 2013, e a Copa do Mundo, em 2014. O objetivo desta pesquisa é verificar se dois veículos de comunicação impressos, Folha de S. Paulo e O Globo, que noticiaram as manifestações sociais, trataram-nas como um exercício pleno do direito à liberdade de expressão, ou criminalizaram o movimento. Para cumprir os objetivos, será utilizada a metodologia da análise de conteúdo. A hipótese é de que os jornais abordaram o assunto de maneira superficial e negativa. A partir das análises quantitativas e qualitativas realizadas com base na metodologia escolhida, tornou-se possível a confirmação de tal hipótese. / Abstract: The right to freedom of expression is guaranteed by the Brazilian Constitution of 1988, and can be practiced by many different ways. Between june of 2013 and july of 2014, this right was practiced by millions of Brazilians, that went to the street to protest against the precariousness of public health and education, corruption, the increase in the bus pass and also against excessive expenses for the realization of the World Cup. The social manifestations happened in the same time that two sportive mega events were realized in the country: The Confederations Cup, in 2013, and The World Cup, in 2014. The object of this research is to verify if two newspapers, Folha de S. Paulo and O Globo, that noticed the social manifestations, treated them as an exercise of the right to freedom of expression, or criminalized the protest. To meet the goals, it will be used the methodology of content analysis. The hypothesis is that the newspapers dealt with the issue in a superficial and negative way. By the quantitative and qualitative analysis based on the chosen method, it became possible to confirm this. / Mestre

Orientador: Patrícia Pintor dos Reis / Coorientador: Igor Jurisica / Banca: Sandra Drigo Linde / Banca: Jefferson Luiz Gross / Resumo: O câncer de pulmão é a causa mais frequente de óbito por câncer, com 1,6 milhões de óbitos mundialmente, a cada ano. Apesar dos avanços nas estratégias de tratamento, o prognóstico dos pacientes com carcinoma pulmonar ainda é pobre. O desenvolvimento de drogas com alvos moleculares têm levado a um aumento, embora modesto, na sobrevida de pacientes com carcinomas pulmonares de células não pequenas (NSCLC), especialmente do subtipo histológico adenocarcinoma (AD). A identificação de vias moleculares como alvos terapêuticos é uma área promissora de investigação. Considerando que os miRNAs regulam a expressão gênica, os miRNAs têm o potencial de modular vias moleculares associadas à gênese e progressão do câncer. Investigamos alterações na expressão e ou mutações em sequências de miRNAs em AD pulmonar, utilizando plataformas de análise de sequenciamento de alto desempenho (Illumina) (N=17 AD e N=7 tecidos pulmonares histologicamente normais) e ensaios da PCR quantitativa em tempo real (RQ-PCR) (N=22 AD e N=9 N). A análise de miRNA-Seq identificou variações em nucleotídeos únicos (SNVs) bem como alterações na expressão de miRNAs em AD pulmonar. Três miRNAs (miR- 328, miR-574 e miR-99a) foram validados, com expressão aumentada (p<0,05) em AD comparado com N. Adicionalmente, realizamos uma meta-análise de dados da literatura em NSCLC, com o objetivo principal de comparar os dados da literatura com os nossos dados de miRNA-Seq em AD. Os miRNAs identificados na meta-análise foram utilizados em análises de predição de genes-alvo potencialmente regulados por miRNAs. Redes de interação proteica e vias moleculares relevantes em AD pulmonar foram identificadas. mRNAs-alvo identificados nas redes de interação foram validados por RQ-PCR em 57 amostras de 38 pacientes com NSCLC (N=30 NSCLC e N=27 N). Os resultados mostraram que 3 genes-alvo de miRNAs (PIK3R1, NOTCH1, KLF4), estavam frequentemente... / Abstract: Not available / Mestre