Orientadore: Laura Maria Mariscal Ottoboni, Fernanda de Castro Reis / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Madureira_DanielleJannuzzi_M.pdf: 2040876 bytes, checksum: f7135c29454428e52c585317e3d024c4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Acidithiobacillus ferrooxidans e Acidithiobacillus thiooxidans são espécies bacterianas acidofilicas, quimiolitotróficas e mesofilicas, encontradas em ambientes de biolixiviação. A. ferrooxidans utiliza íons ferrosos e compostos que contém enxofte como doadores de elétrons enquanto que A. thiooxidans utiliza apenas enxofte e compostos contendo enxofte. Ambas as espécies utilizam principalmente o oxigênio como receptor final de elétrons, contudo, podem também crescer em ambientes de anaerobiose. A. thiooxidans possui maior resistência ao pH podendo ser encontrada em ambientes com pH variando de 0,5 a 5,0, enquanto que A.ferrooxidans é encontrada em pHs que variam de 1,0 a 2,5. Devido a essas características e devido a capacidade dessas bactérias de solubilizar metais, A. ferrooxidans e A. thiooxidans vem sendo utilizadas em experimentos de biolixiviação. Este processo é utilizado na indústria para recuperação de cobre devido às vantagens oferecidas. Entretanto, pouco se sabe sobre a resposta gênica destas bactériaS a presença de sulfetos metálicos e dos metais pesados em solução proveniente do processo de oxidação. Na primeira parte deste trabalho foi analisada a resposta gênica da estirpe de A. ferrooxidans LR na presença e na ausência de covelita (CuS) por 24 horas através da técnica de RAP-PCR (Random Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction). Foram obtidos 19 cDNAs com expressão diferencial, dos quais 12 foram confirmados como sendo diferencialmente expressos. Dentre estes, foram isolados sete genes que codificam: proteínas de transporte (AFE 0123, AFE ,0989, AFE 0990, AFE 0580, AFE 0671, AFE 2248 e AFE 1149), a proteína diguanilato ciclase, uma proteína de membrana, uma metiltnmsferase e uma ATPase, todas induzidas na presença da covelita. Apenas o gene infC, que codifica um fator de iniciação de tradução tipo 3, teve sua expressão reprimida na presença de covelita. Como sete dos genes diferencialmente expressos pertenciam à classe de transportadores, foram investigadas às modificações químicas presentes no meio de cultura após 24 horas. Análises de absorção atômica mostraram que a quantidade de' co1?rê em solução inicialmente zero passava para aproximadamente 1,13 g/L e medidas de pH mostraram que após este período de tempo houve mudanças de 1,8 para 4,0. Pode-se sugerir que essas alterações químicas sejam responsáveis, pelo menos em parte, pela indução dos genes que codificam proteínas de transporte. Uma análise in silico da interação entre proteínas (PPI) relacionadas com transporte, cujos genes foram diferencialmente expressos na presença de covelita e de proteínas pertencentes à mesma categoria funcional, codificadas por genes que estavam fisicamente localizados nas proximidades dos genes diferencialmente expressos, mostraram que os genes de transporte podem estar envolvidos em diferentes etapas da resposta bacteriana à presença de covelita. A segunda parte deste trabalho teve como objetivo estudar a expressão diferencial, por PCR em tempo real, de duas proteínas do tipo ABC (AFE 0123 e AFE 0125) e uma proteína do tipo RND (AFE 0993) na estirpe de A. thiooxidans FGOl na presença de calcopirita (CuFeS2), covelita e pirita (FeS2) por 24 horas. Para tal, a estirpe foi crescida na presença de enxofte e depois mantida na presença dos sulfetos metálicos por 24 horas. A expressão dos três genes foi induzida na presença de covelita e inalterada na presença de calcopirita. Na presença de pirita, a expressão de dois genes foi reprimida e do gene AFE 0993, permaneceu inalterada. Estes resultados podem ser explicados, pelo menos em parte, pelas quantidades de cobre encontradas em solução na presença de covelita (l g/L) e na presença de calcopirita (0,07 g/L). Na presença de covelita e calcopirita a medida de pH também softeu aumento de 1,8 para 4,0 e 2,5, respectivamente. Para investigar se a alteração de pH ou a presença de íons de cobre eram os responsáveis pela indução da expressão desses genes, a bactéria foi mantida na presença de sulfato de cobre (16 mM) e pH 4,0 por 24 horas. Os resultados mostraram que a presença de cobre em solução induz a expressão destes genes, enquanto que a alteração do pH não / Abstract: Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans are acidophilic, chemolitotrophic and mesophilic bacteria found in bioleaching environments. A. ferrooxidans uses ferrous iron and sulphur compounds as an e1ectron donor and A. thiooxidans uses on1y sulphur and sulphur compounds. Both species are aerobic using oxygen as final e1ectron acceptor. However, these bacteria are also able to grow in anaerobic environments. A. thiooxidans is able to survive in pHs ranging from 0.5 to 5.0 while A. ferrooxidans grows in pHs from 1.0 to 2.5. Due to these characteristics and the ability of these bacteria to solubilize metal sulphides, A. ferrooxidans and A. thiooxidans are used in bioleaching. This process has several advantages over the traditional methods and has been used with success in industrial operations to recover main1y copper. However, little is known about the genetic response of these bacteria to the presence of metal sulphides and heavy metal in solution. Therefore, in the first part of this study the A. ferrooxidans LR 'response to covellite was investigated. This bacterium was maintained in contact with covellite for 24 hours and the differentially expressed cDNAs were identified by RAP-PCR (Random Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction) technique. Nineteen cDNAs showed a differential expression and twe1ve had their differential expression confirmed by real time PCR. Among these cDNAs, seven codified for transporter proteins (AFE 0123, AFE 0989, AFE 0990, AFE 0580, AFE 0671, AFE 2248 and AFE 1149), one codified for a putative diguanylate cyc1ase, one for a membrane. protein, one for a methyltransferase and one for an A TPase. With the exception of infC whose expression was down regulated, all the oDNAs had their expression up regulated in the presence of covellite. Since most of the differentially expressed genes are involved in transport, chemical modifications on the culture medium after 24 hours were investigated. The atomic absorption analysis showed that the copper amount in solution was 1.13 g/L and pH changed from 1.8 to 4.0 suggesting that these changes are responsible, at least in part, for the induction,"?f1he expression of transport gene. An in si/ico ana1ysis of protein-protein interaction (PPI) between the transport proteins codified by the genes differentially expressed in the presence of covellite and those codified by genes that were physically located around the differentially expressed ones showed that these transport proteins could be involved in different steps of the bacterial response to covellite. The goal of the second part of this study was to analyse the differential expression, by real time PCR, of two ABC proteins (AFE 0123 andAFE 0125) and one RND protein (AFE 0993) inA. thiooxidans FGOl in the presence of chalcopyrite, covellite and pyrite for 24 hours. This strain was maintained in contact with the metal sulphides for 24 hours. The expression ofthe three genes was up regulated in the presence of covellite and unchanged in the presence of chalcopyrite. In the presence of pyrite two genes hOO their expression down regulated and in one (AFE 0993) the expression was unchanged. These results can be explained, at least in part, by the quantities of copper found in solution in covellite (1 g/L) and in chalcopyrite (0.07 g/L). In the presence of covellite and chalcopyrite the pH changed from l'.8 to 4.0 and 2.5, respectively. To investigate if the changes in pH or the presence of copper ions in solution were responsible for the induction of the gene expressions, the bacteria were maintained in the presence of copper sulphate (16 mM) and pH 4.0 for 24 hours. The results showed that the presence of copper in solution was the responsible for the up regulation ofthese genes / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-07-31T15:51:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-01T13:14:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-01T13:14:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-01T13:14:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The interest in genetic manipulation tools increase production of heterologous proteins for biotechnological purposes, especially therapeutic proteins, industrial enzymes and significantly increased worldwide. For the production of heterologous proteins choice of expression vector & host system is essential. For the construction of a library of adjustable and promoters functional in E. coli, two-deoxy oligonucleotides degenerate regions were produced by random chemical synthesis of DNA. To obtain the double-stranded promoters, Lac operator sequences were looped and submitted by treatment with Klenow enzyme. For cloning and analysis of the functionality of the novel promoters, the edges of the double-stranded deoxy-oligonucleotide and vector were digested with Bam HI and Hind III and following were purified. Synthetic promoters were then linked to the promoter vector pKK232-8 hunting so stay in proper position for expressing the CAT reporter gene. The recombinant plasmids were then introduced into E. coli DH5α F'Iq and transformants cells were obtained and classified according to the size of the colony on Petri plates containing different concentrations of chloramphenicol in the presence and absence of the inducer IPTG. After analysis of the colonies were chosen 42 recombinant clones, their DNA extracted plamidiais and the sequences of the promoters completely certain. 6 The following recombinant plasmids were reintroduced into E. coli DH5α F'Iq and clones selected on chloramphenicol, with or without IPTG. Of these six clones, 4 were selected to examine the growth in liquid medium with chloramphenicol in the presence and absence of the inducer IPTG. All recombinant clones in E. coli demonstrated ability to grow in liquid medium, 3 of them grew better with IPTG, indicating that their promoters are regulated. The other clone did not have their growth affected by the inductor, confirmed by deficiency following the Lac operator. The results show that the methodology used to generate and clone novel promoters running and new promoters have the potential of being used for the development of new, powerful and regulated expression vectors. / O interesse por ferramentas de manipulação genética que aumentem a produção de proteínas heterólogas para fins biotecnológicos, especialmente proteínas terapêuticas e enzimas industriais, aumentou significativamente em nível mundial. Para a produção de proteínas heterólogas a escolha do sistema hospedeiro & vetor de expressão é fundamental. Para a construção de uma biblioteca de promotores reguláveis e funcionais em E. coli, dois desoxi-oligonucleotídeos com regiões degeneradas foram produzidos por meio de síntese química randômica de DNA. Para a obtenção dos promotores dupla-fita, as sequências do operador Lac foram aneladas e submetidas por tratamento com a enzima Klenow. Para a clonagem e análise da funcionalidade dos novos promotores, as bordas dos desoxi-oligonucleotídeos dupla-fita e do vetor foram digeridas com BamHI e HindIII e após foram purificados. Os promotores sintéticos foram a seguir ligados ao vetor caça-promotores pKK232-8 de forma que ficassem em posição adequada para expressar o gene repórter CAT. Os plasmídeos recombinantes foram então introduzidos em E. coli DH5α F’Iq e as células transformantes foram obtidas e classificadas de acordo com o tamanho da colônia em placas de Petri contendo diferentes concentrações de cloranfenicol na presença e ausência do indutor IPTG. Após as análises das colônias foram escolhidos 42 clones recombinantes, seus DNAs plamidiais extraídos e as sequências dos seus promotores determinadas completamente. A seguir 6 plasmídeos recombinantes foram reintroduzidos em E. coli DH5α F’Iq e os clones selecionados em cloranfenicol, com ou sem IPTG. Destes 6 clones, 4 foram escolhidos para analisar o crescimento em meio líquido com cloranfenicol na presença e ausência do indutor IPTG. Todos os clones recombinantes em E. coli demonstraram capacidade de crescer em meio líquido, sendo que 3 deles cresceram melhor com IPTG indicando que seus promotores estão sendo regulados. O outro clone não teve seu crescimento afetado pelo indutor, confirmado pela deficiência da sequência do operador Lac. Os resultados mostram que a metodologia utilizada para gerar e clonar novos promotores funciona e que os novos promotores têm potencialidade de serem utilizados para o desenvolvimento de novos, potentes e regulados vetores de expressão.

Banco do Nordeste do Brasil / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A pro-lectina de sementes de Dioclea grandiflora apresentou-se ativa quando expressa de forma recombinante (r-pro-DGL) no citoplasma do modelo procariÃtico Escherichia coli. Obtida de forma solÃvel a partir do vetor pET32a, a proteÃna recombinante apresentou massa aparente (25 kDa) e sequÃncia (obtida por espectrometria de massas) idÃnticas ao precursor natural, mostrando-se atipicamente funcional em comparaÃÃo a outras lectinas de leguminosas expressas de forma heterÃloga, possuindo uma atividade especÃfica de 134.217.728 (U.H./mg). Diferentemente de sua contraparte silvestre a r-pro-DGL nÃo reconheceu especificamente glicose, sendo apenas fracamente inibida por manose. Em decorrÃncia da alta homologia de sequÃncia entre os precursores de lectinas na subtribo Diocleinae e lectinas ligantes de galactose pertencentes a outras tribos de leguminosas, hà a hipÃtese de que o processamento pÃs-traducional peculiar dessa subtribo poderia influir de forma decisiva sobre a especificidade fina dessas proteÃnas. Entretanto, a r-pro-DGL nÃo apresentou afinidade por galactose ou lactose, demonstrando ser a topologia do sÃtio de ligaÃÃo, bem como a conformaÃÃo das alÃas que os estruturam, os principais fatores determinantes da especificidade a monossacarÃdeos. Assim, pode-se afirmar que precursores de lectinas na subtribo Diocleinae apresentam-se ativos enquanto deglicosilados, sendo ainda capazes de formar oligÃmeros e estabelecer ligaÃÃes cruzadas entre membranas celulares. / The pro-lectin from Dioclea grandiflora presented active when expressed in recombinant (r-pro-DGL) in the cytoplasm of the model prokaryotic Escherichia coli. Obtained in soluble form from the pET32a vector, the recombinant protein presented apparent mass (25 kDa) and sequence (obtained by mass spectrometry) identical to the natural precursor, being unusually functional compared with other lectins of the pulses expressed heterologously having a specific activity of 134 217 728 (HU / mg). Unlike its counterpart wild r-Pro-DGL not specifically recognize glucose, and only weakly inhibited by mannose. Due to the high sequence homology among the forerunners in the subtribe lectins Diocleinae and galactose-binding lectin belonging to other tribes of legumes, there is the hypothesis that post-translational processing of this peculiar subtribe could influence decisively on the fine specificity of these proteins. However, the pro-r-DGL showed no affinity for galactose or lactose, showing that the topology of the binding site and the conformation of the loops that structure, the main specificity determinants of the monosaccharides. Thus, it can be stated that in the subtribe lectins precursors Diocleinae presents deglicosilados active while being still able to form oligomers and to establish cross-links between cell membranes.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-10-03T12:39:39Z No. of bitstreams: 1 Tese - Enedina Nogueira de Assunção.pdf: 3908952 bytes, checksum: 3e60d5d0a0af7d037587c69426e344bb (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-10-03T12:39:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Enedina Nogueira de Assunção.pdf: 3908952 bytes, checksum: 3e60d5d0a0af7d037587c69426e344bb (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-10-03T12:40:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - Enedina Nogueira de Assunção.pdf: 3908952 bytes, checksum: 3e60d5d0a0af7d037587c69426e344bb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T12:40:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - Enedina Nogueira de Assunção.pdf: 3908952 bytes, checksum: 3e60d5d0a0af7d037587c69426e344bb (MD5) Previous issue date: 2015-09-26 / According to the World Health Organization (WHO), diabetes mellitus is expected to reach 333 million by 2025 and around 2030 is going to be the second cause of death in Latin America. Therefore, an insulin production increasing becomes a need to meet future market demands. The heterologous expression system in Pichia pastoris have been increasingly used and has proven to be an attractive alternative for over expressing human genes for biotechnological purposes. Thus, this work has as main objective to produce human proinsulin by P. pastoris using a PGK gene promoter. A1 gene codes for the insulin precursor and was chemically synthesized with optimized codons for P. pastoris. This gene was cloned into expression vector / secretion under control of PGK P. pastoris promoter and integrated into the genome of P. pastoris GS115. Transformant clones were selected for increased zeocin production and from dot-blotting. The production of recombinant proinsulin was performed in YPD liquid in shake flasks at 30 ° C, 180 rpm. The supernatant was clarified by centrifugation, and detection of recombinant proteins by ELISA, electrophoresis in denaturing polyacrylamide gel, Western-blotting and finally chromatography for size exclusion. Best conditions for expression / secretion of proinsulin were established through statistical experimental design detecting the expression level by ELISA. The amount of pre-proinsulin mRNA was determined from two samples of two contrasting conditions of A140 clone with the highest and lowest production of proinsulin using Real-Time PCR (qPCR). As results, the recombinant clones that had higher resistance to Zeocin also showed more intense positive signs in the dot-blotting. Proinsulin coding sequence (A1) was efficiently expressed in P. pastoris and secreted into the cell culture supernatant, with molecular weight of approximately 7.5 kDa. The A140 clone showed significant productivity in production level within 48 to 72 hours after the improvement of the YPD culture medium showed level of 0.83 g/L of insulin expression at 72 hours, for total biomass of about 50g / L. High levels of proinsulin expression with PGK promoter using P. pastoris as host make this heterologous expression attractive for human proinsulin production as well as other industrial proteins. / De acordo com os indicadores da Organização Mundial de Saúde (OMS) o diabetes mellitus deve alcançar 333 milhões de pessoas em 2025 no mundo e em 2030 na América Latina será a segunda causa de morte, por isso o aumento da produção de insulina torna-se uma necessidade para suprir as futuras demandas de mercado. Os sistemas de expressão em leveduras tipo Pichia pastoris tem sido cada vez mais utilizados e tem-se mostrado como atraentes alternativas para a expressão de proteínas para fins industriais. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo principal a produção de proinsulina humana por Pichia pastoris utilizando o promotor do gene PGK. O gene A1 que codifica o precursor da insulina foi sintetizado quimicamente com codóns otimizados para a expressão em P. pastoris. Esse gene foi clonado em vetor de expressão/secreção sob controle do promotor PGK de P. pastoris e integrado no genoma de P. pastoris GS115. A produção de proinsulina recombinante foi realizada em meio líquido YPD em frascos agitados a 30°C, a 180 rpm. A análise da proinsulina expressa em P. pastoris foi realizada por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida e Western-blotting e mostrou massa molecular de aproximadamente 7,5 kDa. O clone recombinante A140 que apresentou maior resistência a zeocina e sinal positivo mais intenso no imunodot-blotting foi utilizado para estabelecer condições melhores de expressão/secreção de proinsulina em planejamento fatorial estatístico experimental. As condições de cultivo que se mostraram melhores para a produção da proinsulina foram: composição do meio de cultivo (dextrose 7,5%, extrato de levedura 1% e peptona 0,15%), temperatura de 25°C e pH do meio igual a 7,0. O clone A140 nas melhores condições de cultivo atingiu biomassa total de 50g/L e nível de expressão de insulina de 0,83g/L em 72 horas de cultivo. A expressão de proinsulina em altos níveis utilizando o promotor PGK em P. pastoris faz esse sistema de expressão atrativo para produção da proinsulina humana e outras proteínas de interesse industrial.

A desinfecção de dentaduras promove o controle do biofilme microbiano e previne doenças, como a estomatite por uso de dentadura, associada à presença de Candida albicans. A expressão dos genes HWP1, ALS1, ALS3 deste fungo está relacionada à adesão das células fúngicas às do hospedeiro. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar a expressão desses genes em células planctônicas e biofilme de Candida albicans, desenvolvidos sobre superfícies de resina acrílica, após tratamento com dois métodos de desinfecção. Corpos de prova de resina acrílica, previamente tratados por hipoclorito de sódio 1%, microondas, e um grupo não tratado, foram inoculados com Candida albicans para desenvolvimento de biofilme. O biofilme e as células planctônicas foram coletados em três tempos distintos, correspondentes às etapas de desenvolvimento do biofilme: inicial (6h), intermediária (12h) e madura (48h) e a expressão gênica foi quantificada pelo ensaio de RT-PCR em tempo real. Os dados obtidos foram submetidos ao teste estatístico ANOVA two-way e pós-teste de Bonferroni; valores de p<0,05, p<0,01 e p<0,001 foram considerados significantes. Os três genes avaliados foram detectados e quantificados por RT-PCR em tempo real, em biofilmes e células planctônicas, independente do grupo de tratamento ou tempo de desenvolvimento do biofilme. A expressão dos genes ALS1 e ALS3 variou de acordo com o tempo de desenvolvimento do biofilme e, e com o tratamento da superfície. Ocorreu diferença significativa (p<0,001) entre a expressão desses genes nas superfícies tratadas por hipoclorito de sódio e microondas, além de diferenças significativas (p<0,001) na expressão gênica entre células planctônicas e biofilme, para os tratamentos avaliados. Concluiu-se que os tratamentos de desinfecção alteram o padrão da expressão dos genes ALS1 e ALS3 em biofilmes desenvolvidos sobre superfície de resina acrílica e em células planctônicas e este padrão foi diferente entre os tratamentos de desinfecção. / Complete dentures disinfection promotes biofilm control and prevents diseases such as denture stomatitis associated with the presence of Candida albicans infection. The expression of the genes HWP1, ALS1, ALS3 in this fungus is related to the adhesion of fungal cells to the host tissues. Therefore, the aim of this study was to detect and quantify the expression of these genes in planktonic cells and biofilms of Candida albicans, developed on acrylic resin surfaces, after treatment with two disinfection methods. Specimens of acrylic resin, previously treated by 1% sodium hypochlorite or microwave, and an untreated group were inoculated with Candida albicans for biofilm development. Biofilm and planktonic cells were collected at three different time points corresponding to biofilm development stages: initial (6 h), intermediate (12h) and mature (48h). The total RNA of these samples was obtained and the gene expression for mRNA of HWP1, ALS1 and ALS3 were quantified by Real-Time RT-PCR assay. The data obtained were assessed throught two-way ANOVA and Bonferroni post-test. Significant levels were determined for p values at <0.05. The three genes were detected and quantified in both biofilms and planktonic cells regardless of treatment condition or time of biofilm development. ALS1 and ALS3 expression varied according to the time point, and surface treatment. Significant differences (p <0.001) were showed between gene expression on surfaces treated with sodium hypochlorite and microwave, and significant differences (p <0.001) were showed in gene expression between planktonic and biofilm cells. It can be concluded that the disinfection procedures affect the ALS1 and ALS3 expression patterns in Candida albicans denture biofilms and planktonic cells. Additionaly, differential gene expression patterns were observed among the disinfection treatments.

Xylella fastidiosa (Xf) é o agente etiológico causador de doenças em uma grande variedade de cultivos de grande importância econômica, causando a c1orose variegada dos citros, uma das doenças mais danosas à indústria de citros no Brasil. Os genomas de algumas cepas deste fitopatógeno foram completamente seqüenciados promovendo assim estudos funcionais do genoma em larga escala. Neste trabalho nós nos propusemos a investigar o perfil de transcrição de Xf através da técnica microarranjos (no título da dissertação microarrays, mas a partir de agora usaremos microaarranjos) de DNA usando todo o genoma do fitopatógeno e cultivando-a sob meio definido variando a concentração de glicose. O objetivo inicial deste trabalho era observar se Xf comportava-se da mesma forma que Xac, que tem a expressão de goma aumentada devido ao aumento da concentração de glicose do meio. Nossas análises revelaram que enquanto os transcritos relacionados à goma não se mostraram afetados com a concentração de glicose, genes que codificam para análogos a Colicina-V e precursores de fimbria foram induzidos em alta concentração de glicose. Baseados nestes resultados, nós propusemos um modelo de mecanismo de produção e defesa contra a Colicina em Xf. / Abstract not available.

O conceito mônada no pensamento leibniziano guarda em si um aspecto fundamental que é o de expressão: este remete a pensar o indivíduo não só como dotado de uma lógica interna fenomênica como também pertencente a uma lógica metafísica baseada nos princípios de melhor e de causa final; interligados os princípios se refuta o dualismo cartesiano e se alcança, ao nosso ver, um novo conceito que é o de individualidade sistêmica. Isto abre ao filósofo alemão um universo relacional que leva a consequências importantes em âmbito metafísico, político, jurídico, linguístico, etc., mas, em suma sociológico, e que ficará patente em sua formulação do princípio place dautruy. Deste movimento reflexivo de se colocar no lugar do outro entende-se a reconstrução subjetiva das possibilidades externas no interior do próprio indivíduo, o que condicionará de modo singular a sua expressão. Estas elaborações de Leibniz darão os fundamentos para uma leitura organísmica e uma leitura organicista da sociedade. Contudo, enquanto a segunda leitura passa a sobrevalorizar a interdependência das partes enfatizando a cooperação de seus elementos, a primeira, mais próxima de Leibniz, passa a sobrevalorizar a interdependência enfatizando uma ordem anterior, que chamaremos de comunicativa. A esfera comunicativa, levando em conta o fechamento das mônadas, abrange uma pluralidade de perspectivas e expressões se mantendo harmonicamente descentralizada e, ao mesmo tempo, vinculativa. É nesta linha interpretativa que se concebe uma das raízes do pensamento sistêmico e da pós-ontologia social instaurada por Niklas Luhmann. Para o sociólogo alemão, o modelo leibniziano, sendo sistêmico, é o ponto alto de ruptura com o modelo interpretativo mecanicista de ciência embora não seja radical o bastante para romper com as imprecisões epistemológicas humanistas que impedem o avanço de uma ciência da sociedade. Para tal, é necessário levar em consideração o caráter de unidade dinâmica, relacional e autopoietica dos sistemas biológico, psíquico e social e, quanto a este último, o seu caráter fundamentalmente comunicativo. Para este corte metodológico denominado anti-humanista nos parece que Luhmann requisita certos conceitos do pensamento leibniziano, a saber, o fechamento, o place dautruy (incorporado pela cibernética) e a expressividade, para a elaboração de seu modelo funcional-estruturalista de compreensão da complexidade que permeia a sociedade moderna. / The concept of monad in the leibnizian thought guard itself a fundamental aspect that is expressivity: this refers to think the individual not only endowed by phenomenical logic but belonging to metaphysical logic based on the principles of the best and final cause; these interconnected principles refutes cartesian dualism and achieves, in our view, a new concept that is the sistemic individuality. This opens for the german philosopher a relational universe which leads to important consequences in scope of metaphysics, politics, jurisprudence, linguistics, etc. and this will be clear in his formulation about principle \"place d\'autruy\". From this reflexive movement of put himself in the place of other, we understand the subjective reconstruction of external possibilities within the own individual, which will conditionates singularly his expressions. The two elaborations of Leibniz will give the basis for a organismic interpretation and a organicist interpretation of society. However, while the latter overestimates the interdependence of the parts emphasizing the cooperation, the former one, closer to Leibniz, overestimates the interdependence emphasizing a higher order, that we will call communicative. The communicative sphere, taking into account the closure of the monad, covers a plurality of perspectives and expressions keeping itself harmonically descentralized and, in the same time, vinculative. It\'s on this interpretative line that is conceived one of the roots of sistemic thinking and the social pos-ontology carried out by Niklas Luhmann. For the german sociologist, the leibnizian interpretation which Bertalanffy does is the higher point of disruption with the mecanicist interpretative model of science but is not sufficiently radical to disrupt with the humanist epistemological inaccuracies that impede the advancement of social science. For this, is necessary to take into account the character of dynamical unity, relational and autopoietic of biological, psychic and social systems, and, about the latte, its character fundamentally comunicative. For this methodological cut called anti-humanist seems that Luhmann requests some concepts of the leibnizian thought, like the \"closure\", the \" place d\'autruy\" (incorporated by cybernetics) and expressivity to do an elaboration of his functional-structuralist model of comprehension the complexity which permeates the modern society.

As proteases FtsHs, encontradas em eubactérias e eucariotos, pertencem à família das proteínas AAA (ATPases associadas a diferentes atividades celulares) e são classificadas no grupo das metaloproteases. A proteína FtsH foi primeiro identificada em Escherichia coli em mutantes ftsH (filamentation temperature sensitive) como uma protease que age facilitando a degradação de proteínas intermembrânicas e citosólicas. Ortólogas a FtsH já foram encontradas em leveduras, metazoários e plantas. Nestas últimas, a FtsH pode estar localizada nos plastídeos, como uma proteína integral da membrana dos tilacóides ou na membrana interna das mitocôndrias, como em leveduras. Estudos sobre as isoformas plastidiais são abundantes e indicam a participação dessas proteases na renovação da proteína D1, componente do fotossistema II, na resposta hipersensível e na biogênese das membranas do tilacóide. Os estudos sobre as isoformas mitocôndriais são escassos e resumem-se a informações sobre o direcionamento subcelular dessas proteases e evidências de seu envolvimento no acúmulo da subunidade 9 da ATP-sintase na membrana interna. Com o objetivo de caracterizar a função da FtsH-m1 em plantas, foi realizada a transformação genética de Nicotiana tabacum via Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo em que o cDNA da FtsHm1 de cana-de-açúcar encontra-se sob o controle de um promotor transcricional constitutivo. Esse plasmídeo apresenta o gene seletivo nptII, que confere resistência à canamicina. As plantas regeneradas in vitro, 17 no total, foram aclimatadas e transferidas para a casa de vegetação até a produção de sementes. As plantas regeneradas foram testadas quanto à presença do cDNA da FtsH-m1 de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR. A seleção de plantas da geração T1 que possuíam o transgene de interesse foi conduzida em ensaios in vitro e em casa de vegetação baseados na resistência dessas plantas à canamicina. A presença do transgene foi confirmada por meio da técnica de PCR. A análise da expressão heteróloga foi realizada via RT-PCR e revelou níveis elevados de RNA mensageiro nas plantas transformadas. Ao todo, foram obtidas dez plantas de fumo em que a presença do transgene de interesse foi confirmada. Não foram observadas alterações fenotípicas marcantes nas plantas das gerações T0 e T1 que pudessem ser relacionadas à expressão heteróloga da FtsH-m1 de cana-de-açúcar. Devem ser realizadas análises mais finas, que podem incluir ensaios para a investigação de possíveis alterações na função mitocondrial, no metabolismo respiratório ou na ultraestrutura das mitocôndrias em plantas a partir da geração T2. / FtsH proteases of eubacteria and eucaryotes belong to the AAA protein family (ATPases associated with different celular activities) and are included among the metaloproteases. The FtsH protein was first described in ftsh (filamentation temperature sensitive) mutant of Escherichia coli as a protease involved in the degradation of transmembrane and cytosolic proteins. FtsH-ortologous proteins have been described in yeast, metazoa and plants. In the latter, FtsHs are localized to plastids, as an integral membrane protein of thylakoid or, as in yeast, to the inner mitochondrial membrane. The various studies on the plastid isoforms point to their involvement in the turnover of D1 protein, a member of the photosystem II, in hypersensitive response, and in thylakoid membrane biogenesis. On the other hand, data on the mitochondrial isoforms are scarce and restricted to their subcellular localization, and involvement in the accumulation of ATP-synthase subunit 9 in the inner membrane. With the aim of disclosing the function of FtsH-m1 in plants, Nicotiana tabacum plants were transformed by Agrobacterium tumefaciens carrying a designed plasmid containing the sugar-cane FtsH-m1 cDNA under the control of a constitutive-transcription promoter. This plasmid also contained the selectable kanamycin-resistance gene nptII. The seventeen plants obtained in vitro were acclimatized and kept in a greenhouse until seeding. These plants were then tested by PCR for the presence of the sugar-cane FtsH-m1 cDNA. Selection of T1 plants for the presence of the transgene of interest was carried out both in vitro and in the greenhouse, based on kanamycin resistance. The transgene carrier status of the selected plants was confirmed by PCR. Higher levels of FtsH-m1 messenger RNA were detected by RT-PCR in transformed T1 plants. A total of ten tobacco plants carrying the sugar-cane FtsH-m1 cDNA were obtained. T0 and T1 plants did not show conspicuous phenotype alterations which could be related to the heterologous gene expression. Refined analyses are needed in plants from T2 generation on, including the evaluation of mitochondrial structural abnormalities and disfunction, as well as respiratory alterations.

Proteínas FtsH são metaloproteases pertencentes à família AAA (ATPases Associadas a Diversas Atividades Celulares), e estão presentes em todos os reinos dos seres vivos. Estas proteases utilizam a energia liberada da hidrólise do ATP para desempenhar suas diversas atividades celulares. Em Escherichia coli, as proteases FtsH se organizam em um homohexamero na membrana plasmática, sendo que este complexo atua na degradação de proteínas mal dobradas. Em Arabidopsis, o hetero-complexo FtsH localizado na membrana dos tilacóides é formados por isômeros do tipo A (FtsH1/FtsH5) e do tipo B (FtsH2/FtsH8). Sua atividade proteolítica está relacionada ao controle de qualidade organelar, degradando proteínas mal dobradas e de vida curta. O complexo está envolvido também na degradação da proteína D1 do PSII, danificada por danos foto-oxidativo. Embora as FtsH cloroplastidiais sejam bem caracterizadas em termos genéticos e moleculares, o mecanismo de regulação do complexo ainda não foi esclarecido, o que torna interessante a busca por fatores proteicos adicionais. Em investigações anteriores nosso grupo de pesquisa encontrou um candidato potencial, denominado FIP (FtsH5 Interacting Protein), que pode modular a atividade ATPásica e/ou proteásica do complexo. Fip está presente na membrana dos tilacóides e mostrou interação com FtsH5 in vivo e in vitro. Neste trabalho foram realizados ensaios de duplo híbrido de leveduras, utilizando deleções da proteína FIP, bem como substituições de resíduos de cisteína por alanina. Os resultados revelaram que a interação entre FIP e FtsH5 é mantida somente quando duas regiões ricas em cisteína estão presentes na sequência de FIP. Essa região compreende 46 aminoácidos, com 4 resíduos de cisteína conservados, e ensaios com 7 diferentes substituições desses resíduos por alanina não mostraram interação com FtsH5, o que corrobora a hipótese de que os resíduos de cisteína são necessários para a interação. Experimentos de análise de expressão utilizando PCR em tempo real, sob condições de estresse salino e estresse a frio, revelaram que os genes que codificam FIP e FtsH5 têm sua expressão regulada de modo antagônico, o que sugere que FIP possa atuar como modulador negativo da atividade proteásica do complexo FtsH. / Metalloprotease FtsH proteins are members of the AAA family (ATPases Associated with Diverse Cellular Activities), and are present in all kingdoms of living organisms. These proteases use energy of ATP hydrolysis to perform its various cellular activities. In Escherichia coli, FtsH proteases are organized in a homo-hexamer in the cytoplasmic membrane, and this complex acts in the degradation of misfolded proteins. In Arabidopsis, the FtsH hetero-complex located in the thylakoid membrane is formed by type A (FtsH1/FtsH5) and type B (FtsH2/FtsH8) isomers. Its proteolytic activity is involved in organellar quality control by degrading misfolded and short-lived proteins. The complex is also involved in the degradation of the D1 protein of PSII, damaged by photo-oxidative damage. Although the chloroplast FtsH are well characterized genetically and molecularly, the regulatory mechanism of the complex remains unclear, which makes it interesting to search for additional protein factors. In earlier studies our research group has found a potential candidate called FIP (FtsH5 Interacting Protein), which can modulate the ATPase and/or protease activity of the complex. FIP is present in the membrane of the thylakoids and showed interaction with FtsH5 in vivo and in vitro. In this study yeast two-hybrid assays were performed using FIP protein deletions, and substitutions of cysteine to alanine residues. The results showed that the interaction between FIP and FtsH5 is maintained only when two cysteine rich regions are present in the sequence of FIP. This region contains 46 amino acids with four conserved cysteine residues and 7 different assays with alanine replacements of these residues showed no interaction with FtsH5, which corroborates the hypothesis that the cysteine residues are required for the interaction. Expression experiments analysis using realtime PCR, under conditions of salt stress and cold stress, revealed that the genes encoding FtsH5 and FIP have its expression regulated in an antagonistic way, suggesting that FIP can act as a negative modulator of the activity FtsH protease of the complex.

Entre as modificações sofridas pelo transcrito primário de RNA de eucariontes, o splicing é responsável pela colocação lado a lado das sequências expressas alinhando a região codificadora no RNAm. Este mecanismo, descrito na década de 1970, como o responsável pela remoção dos íntrons e junção dos éxons consecutivos, é efetuado por um complexo ribonucleoprotéico conhecido como spliceossomo. O reconhecimento por este complexo dos segmentos definidos como éxons e íntrons depende de diversas sequências presentes no RNA e reconhecidas por ligantes protéicos. A modulação desta interação resulta na geração de diferentes transcritos maduros a partir de um mesmo gene, evento conhecido como splicing alternativo, comum a maioria dos genes humanos e um dos grandes responsáveis pela geração de variabilidade proteômica dos eucariotos e sua complexidade morfo-fisiológica. O splicing alternativo é um importante gerador de diversidade funcional no sistema nervoso central, onde participa da geração de variantes para mais de 80% dos genes. Entre estes está o gene do Retardo Mental do X Frágil (FMR1), cujo transcrito primário pode sofrer splicing alternativo de quatro éxons, produzindo até vinte isoformas diferentes da FMRP. Os objetivos gerais deste projeto foram (i) a análise da expressão do éxon 12 do Fmr1 em córtex cerebral frontal, hipocampo e cerebelo de ratos em E19 e P2; e (ii) a busca por elementos em cis reguladores do splicing do éxon 12 do Fmr1 de rato. Para averiguar os níveis da expressão do éxon 12 do Fmr1, no final do período embrionário e início do pós-natal de rato, foi realizada RT-PCR em tempo real com os tecidos citados acima, em E19 e P2. Observamos significativa inclusão do éxon 12 nos transcritos do Fmr1 no córtex frontal em P2 quando comparado a E19, o que não se relacionou ao aumento geral da expressão do Fmr1. No hipocampo, houve aumento da expressão do conjunto de mensagens do Fmr1 e tendência à exclusão do éxon 12 em P2, quando comparado a E19. Estes dados revelam o córtex cerebral como fonte de proteínas ativadoras do splicing do éxon 12 do Fmr1 e onde se deve buscar pela relevância funcional das isoformas da FMRP expressando este éxon. A busca por elementos reguladores do splicing do éxon 12 se baseiou na avaliação da expressão por RT-PCR de mini-gene de segmento genômico do gene Fmr1 usado para transfectar células C6 (glioma de rato). Estas células demonstraram inclusão preferencial do éxon 12 em seus transcritos superexpressos. Um segundo clone foi gerado com uma deleção a partir do clone original, na região 5 do íntron 12, na qual observamos in silico, elementos ricos em U e C, candidatos a acentuadores da inclusão do éxon 12. A superexpressão deste clone em C6 revelou exclusão preferencial do éxon 12, um padrão invertido em relação ao anteriormente observado. Estes dados indicam o elemento rico em U e C como um forte candidato a acentuar a inclusão do éxon 12 no RNAm do Fmr1. / Splicing is an important hnRNA processing mechanism in eukaryotes, aligning exons in the mRNA. First described in the 1970s, it is performed by a molecular complex named spliceosome, which recognizes RNA sequences in the boundaries between exons and introns. Interaction modulation in the spliceosome results in mature transcripts with varying sizes, a process known as alternative splicing, common to most human genes and the major mechanism leading to proteomic diversity and morphological and functional complexity in eukaryotes. Alternative splicing is very important in generating functional diversity in the central nervous system (CNS), where it takes part in more than 80% of primary transcript processing. Among these is the Fragile Mental Retardation 1 gene (FMR1), which undergoes alternative splicing of four exons creating the possibility of 20 non-redundant FMRP isoforms. The aims of this project were (i) to analyze the expression of rat Fmr1 exon 12 in frontal cerebral cortex, hippocampus, and cerebellum at E19 and P2 days; and (ii) to search for cis-acting elements regulating exon 12 splicing. We performed real-time RT-PCR to examine Fmr1 exon 12 expression, in the above-mentioned CNS structures, between the end of embryonic period and the second postnatal day. We observed significant inclusion of exon 12 in Fmr1 mRNA in frontal cortex at P2 as compared to E19, which was unrelated to general Fmr1 expression increase. At P2 hippocampus there was a significant increase at the expression levels of Fmr1, and a trend to exclude exon 12 from the primary transcript. This data indicates that cerebral cortex is an important source of proteins activating exon 12 splicing, and also a tissue where the functional relevance of FMRP isoforms expressing exon 12 should be regarded. We adopted the mini-gene approach to search for cis elements regulating Fmr1 exon 12 splicing. RTPCR was performed to evaluate C6 (rat glioma) cells overexpressing a clone containing a genomic Fmr1 segment. Transfected cells revealed preferential inclusion of Fmr1 exon 12. A deletion construct lacking the initial bases of intron 12 was generated. The deleted segment harbor U- and C-rich sequences that had been identified in silico in a search for intronic splicing enhancers. Overexpression of the deletion construct in C6 yielded to preferential exclusion of exon 12, as opposed to the expression pattern previously observed in the original clone. Therefore, the U- and C-rich elements at Fmr1 intron 12 are strong candidates to enhance Fmr1 exon 12 splicing.