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Bone Enhancement with BMP-2 for Safe Clinical Translation

Kisiel, Marta January 2013 (has links)
Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) is considered a promising adjuvant for the treatment of bone regeneration. However, BMP-2 delivery in a conventional collagen scaffold needs a high dose to achieve an effective outcome. Moreover, such dosage may lead to serious side effects. The aim of the following thesis was to find clinically acceptable strategies reducing the required dose of BMP-2 by improving the delivery and optimizing the preclinical testing of the new approaches. In all the studies hyaluronic acid (HA) hydrogels was used as a carrier for BMP-2. The HA hydrogel/BMP-2 construct was modified with bioactive matrix components in order to obtain an effective release of BMP-2 and an enhanced bone formation. The most promising were two strategies. In the first one, BMP-2, precomplexed with the glycosaminoglycans dermatan sulfate or heparin prior to loading it into HA hydrogel, protected and prolonged the delivery of the protein, resulting in twofold larger bone formation in comparison to non-complexed BMP-2. In the second strategy, the fibronectin fragment integrin-binding domain (FN) was covalently incorporated into HA hydrogel. The FN remarkably improved the capacity of the material to support the cells attachment and spreading, providing the formation of twice as much bone in comparison to non-functionalized HA hydrogel/BMP-2. Furthermore, the importance of a proper design of the preclinical study for BMP-2 delivery systems was highlighted. Firstly, proper physicochemical handling of BMP-2 showed the improvement in further in vivo activity.  The use of glass storage vials and an acidic formulation buffer was superior to plastic surfaces and physiological pH. Secondly, while regenerative medicine strategy testing required the use of animal models that matched the research questions related to clinical translation, two new animal models were developed. The subperiosteal mandibular and calvarial models in rats were found to be minimally invasive, convenient and rapid solution for the evaluation of a broad range of approaches including bone augmentation, replacement and regeneration. Both models are primarily relevant for the initial testing of the injectable bone engineering constructs.  Those clinically translatable approaches presented here could prove to be a powerful platform for a wider use of BMP-2 in orthopedic, plastic surgery and regenerative medicine research.
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Modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a modulação celular na regeneração da fratura óssea padronizada em tíbia de ratos / Modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a modulação celular na regeneração da fratura óssea padronizada em tíbia de ratos / Modulation of expression extracellular matrix components and the cell modulation in regeneration of fracture bone standardized in the tibia of rats / Modulation of expression extracellular matrix components and the cell modulation in regeneration of fracture bone standardized in the tibia of rats

Moyses Messias Souza de Sant'Anna 29 August 2012 (has links)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O propósito do presente trabalho foi investigar a participação da proliferação celular e da expressão dos componentes da matriz extracelular na cascata de eventos do processo de reparo da fratura óssea, empregando as técnicas histológica, imunohistoquímica e morfométrica, em um modelo experimental padronizado para a indução da lesão na tíbia de ratos a partir do método empregado por Yuehuei e Friedman7. É importante padronizar um modelo de indução da fratura, para posterior investigação da participação das células e dos componentes da matriz extracelular no processo de reparo da fratura, considerando que o tempo de consolidação depende significantemente da natureza e do tipo da lesão produzida. Quarenta (n = 40) ratos Wistar foram submetidos a fratura . Os animais foram avaliados em oito (n = 8) grupos de cinco (n = 5) animais, cada grupo emperimental com 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 e 240 horas após a fratura (12h até 10 dias). As fraturas foram classificadas de acordo com o sistema de classificação internacional de fratura de Muller100, AO (Associação para Osteosíntese). Foram encontradas fraturas simples em 86% do total, sendo 68% de fraturas transversas e 18% de fraturas obliquas, 14% do total de fraturas foram complexas, sendo 8% de fraturas irregulares e 6% de fraturas segmentares. Esses resultados demonstram que o aparelho permite padronizar radiológicamente o tipo de fratura, caracterizado pela linha que separa os fragmentos ósseos. Os resultados qualitativos dos componentes da matriz extracelular para TGF-β, VEGF, colágeno I e II, osteopontina, proteoglicanos, fibras do sistema elástico com a coloração de resorcina funcsina de Weigert, e para proliferação celular pelo PCNA, assim como os resultados morfométricos, sugerem que a modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a proliferação celular durante o processo de reparo da fratura não é homogênea para todos os componentes teciduais, dependendo significantemente das tensões locais geradas pelo tipo da linha de fratura que pode ser determinante no tempo de regeneração do osso e na qualidade da restauração das propriedades biomecânica. Nossos achados podem contribuir para melhor compreensão da reparo de fratura óssea e para novas abordagens terapêuticas que considerem as propriedades biomecânicas do tecido ósseo em reparo nas suas diferentes etapas / The purpose of this study was to investigate the role of cells proliferation and extracellular matrix components expression in the process of bone fracture repair. To do so it used histological techniques, immunohistochemistry and morphometric analysis as well as a standardized experimental model for the induction of injury to the tibia of rats as proposed by Yuehuei and Friedman7. It is important to standardize a model of fracture induction for further investigation of the involvement of cells and extracellular matrix components in the fracture repair process, whereas the healing time depends significantly on the nature and type of lesion produced. Forty (n = 40) Wistar rats were subjected to fracture. The animals were divided into eight (n = 8) groups of five (n = 5). Each subgroup was observed after 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 and 240 hours of fracture (12 to 10 days). Immediately afterwards, the fractures were classified according to the system of international classification of fracture by Muller100, AO (Association for Osteosynthesis). Simple fractures were found in 86% of the total, among them, 68% were transverse and 18% were oblique. Complex fractures were found in 14% of the cases, among them 8% were irregular and 6% were segmental. These results demonstrated that the device enables researchers to standardize the type of fracture by X-ray, marked by the line separating the bone fragments. The qualitative results of the cells and extracellular matrix components of TGF-β, VEGF, PCNA, collagen I and II, osteopontin, proteoglycans, elastic fibers system with resorcin funcsin of Weigert, as well as the morphometric results suggest that the repair process of the fracture is not homogeneous for all components. Expression of the extracellular matrix components and cell proliferation modulation significantly depends on the local stresses generated by the type of the fracture. Such type can be decisive in determining time duration for bone regeneration and quality of the biomechanical properties restoration. Our findings may contribute to better understanding of bone fracture repair and for new therapeutic approaches that consider the biomechanical properties of bone tissue in repair in its different stages
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Análise morfológica do músculo reto abdominal de ratas prenhas diabéticas /

Vesentini, Giovana. January 2015 (has links)
Orientador: Marilza Vieira Cunha Rudge / Coorientador: Angélica Mércia Pascon Barbosa / Coorientador: Débora Cristina Damasceno / Banca: Maeli Dal Pai / Banca: José Tadeu Nunes Tamanini / Resumo: Não disponível / Abstract: Not available / Mestre
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Influência da matriz extracelular na expressão gênica de Streptococcus mutans em biofilme cariogênico /

Salamanca, Elkin Jahir Florez January 2017 (has links)
Orientador: Marlise Inês Klein / Resumo: A cárie representa a doença humana mais prevalente no mundo, sua etiologia é dependente de biofilme e da dieta. Os biofilmes são comunidades altamente dinâmicas e estruturadas de células microbianas que se encontram embebidas em uma matriz extracelular tridimensional (MEC). Esta estrutura age como uma barreira que limita a difusão e fornece estabilidade e proteção aos microrganismos. Streptococcus mutans tem um potencial acidogênico e acidúrico, orquestra a construção do biofilme e modula sua virulência, produzindo ácidos lipoteicóicos (LTA), DNA extracelular (eDNA) e exopolissacarídeos (EPS), promovendo assim a adesão e coesão microbiana. Ao mesmo tempo a MEC produzida dificulta a difusão de metabólitos no biofilme. O objetivo do estudo foi determinar por meio de RT-qPCR a dinâmica da expressão de genes de S. mutans associados ao metabolismo de LTA (dltABCD, SMU_775c), eDNA (lytST, lrgAB, ccpA) e exopolissacarídeos (gtfBCD, gbpB, dexA), durante o desenvolvimento da MEC de biofilmes mistos em um estudo longitudinal. Biofilmes mistos de S. mutans UA159 (cepa parental) ou ΔgtfB (mutante com deleção do gene gtfB), Actinomyces naeslundii ATCC 12104 e Streptococcus gordonii DL-1 foram formados em discos de hidroxiapatita revestidos de película salivar, e cultivados a 37° C e 5% de CO2 em caldo triptona e extrato de levedura contendo 25% de saliva e alternando 0,1% de sacarose (escassez) e 0,5% de sacarose + 1% de amido (abundância). O pH do meio de cultura manteve-se ácido durante... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dental caries represents the most prevalent human disease worldwide, its etiology is biofilm-diet dependent. Biofilms are highly dynamic and structured communities of microbial cells that are enmeshed in a three-dimensional extracellular matrix (ECM). This structure acts as a diffusion-limiting barrier providing stability and protection to the microorganisms. Streptococcus mutans is acidogenic, aciduric, and orchestrates the biofilm build-up process. It modulates the biofilm’s virulence by producing lipoteichoic acids (LTA), extracellular DNA (eDNA) and exopolysaccharides (EPS), thereby promoting microbial adhesion and cohesion. The resulting ECM hinders diffusion in the biofilm. The aim of the study was to determine via RT-qPCR the dynamics of expression of S. mutans genes associated with LTA (dltABCD, SMU_775c), eDNA (lytST, lrgAB, ccpA) and exopolysaccharides (gtfBCD, gbpB, dexA) metabolism, during ECM development in mixed-species biofilm by time-lapse studies. Mixed-species biofilms of S. mutans UA159 (parental strain) or ΔgtfB (mutant with deletion of the gene gtfB), Actinomyces naeslundii ATCC 12104 and Streptocsoccus gordonii DL-1 were formed onto saliva-coated hydroxyapatite discs. These biofilms were cultivated at 37°C and 5% CO2 in triptone with yeast extract containing saliva 25% and alternating 0.1% sucrose (scarcity) and 0.5% sucrose + 1% starch (abundance). The pH of the spent media remained acid during the experimental periods, and was lower after prolonged inc... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Influência de alterações genéticas, do fluconazol e de enzimas hidrolíticas na matriz extracelular de biofilmes de candida susceptível e resistente a fluconazol /

Panariello, Beatriz Helena Dias. January 2017 (has links)
Orientador: Ana Cláudia Pavarina / Abstract: Biofilmes formados por Candida estão relacionados a infecções bucais, como a candidíase. Embora a resistência do biofilme seja multifatorial, a proteção exercida por sua matriz extracelular (MEC) é importante para os altos níveis de resistência a drogas antifúngicas. O conhecimento dos princípios estruturais da MEC possibilita maior compreensão de como atuar para desorganizá-la e melhorar a difusão de agentes antifúngicos para que atinjam mais eficientemente o biofilme, além de, futuramente, possibilitar o desenvolvimento de terapias mais eficazes para o controle da formação de biofilmes. Sendo assim, os objetivos principais deste estudo foram: (1) verificar a influência da inativação de genes envolvidos na filamentação (EFG1 e TEC1) em características estruturais dos biofilmes e na produção de componentes da MEC; (2) verificar a influência do fluconazol (FLZ) na MEC de biofilmes de Candida albicans ATCC 90028 (susceptível a fluconazol- CaS), C. albicans ATCC 96901 (resistente a fluconazol- CaR), Candida glabrata ATCC 2001 (susceptível a fluconazol- CgS) e C. glabrata ATCC 200918 (resistente a fluconazol- CgR) e (3) estudar a ação de enzimas hidrolíticas (DNase, Dextranase e β-glucanase individualmente ou em diferentes combinações) sobre a MEC de biofilmes de CaS e CaR. Biofilmes maduros (48 horas) foram analisados através de contagem de unidades formadoras de colônia (ufc/mL), peso seco total, peso seco insolúvel e proteínas insolúveis. Os componentes da MEC- polissacarídeos... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Biofilms formed by Candida are related to bucal infections, such as candidiasis. Although the biofilm resistance is multifactorial, the protection exerted by its extracellular matrix (ECM) is essential for its high levels of resistance to antifungals. The knowledge of the structural principles of the ECM permits a better understanding of how to disorganize the ECM and improve the diffusion of antifungal drugs to reach the biofilm. Moreover, the study of the ECM may enable the development of more effective therapies to control biofilm formation. Thus, the main objectives of this study were: (1) to verify the influence of the inactivation of genes involved in filamentation and structural characteristics of the biofilms (EFG1 and TEC1) on the production of ECM components; (2) to verify the influence of fluconazole (FLZ) on the biofilms' ECM of Candida albicans ATCC 90028 (fluconazole-susceptible: CaS), C. albicans ATCC 96901 (fluconazole-resistant: CaR), Candida glabrata ATCC 2001 (fluconazolesusceptible: CgS) and C. glabrata ATCC 200918 (fluconazole-resistant: CgR) and (3) to study the action of hydrolytic enzymes (DNase, Dextranase and β-glucanase individually or in different combinations) on the ECM of CaS and CaR biofilms. Mature biofilms (48 hours) were analyzed by colony counting forming units (cfu/mL), total dry weight, insoluble dry-weight and total proteins. ECM components- alkali-soluble polysaccharides (ASPs), water-soluble polysaccharides (WSPs), extracellular DNA (e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor
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Astrócitos e harmônio da tireóide (T3)

Aguiar, Cláudia Beatriz Nedel Mendes de January 2008 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-24T05:23:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 251623.pdf: 3842753 bytes, checksum: 675419ecff620ee00a69fd1fb9444d11 (MD5) / O hormônio da tireóide (T3) exerce uma importante influência no desenvolvimento e maturação do SNC de mamíferos. Os efeitos do T3 no desenvolvimento neuronal são mediados pelos astrócitos, que secretam fatores solúveis e outras moléculas, como proteínas de MEC, modulando o crescimento de neuritos, proliferação e migração neuronal. Os astrócitos também participam ativamente do metabolismo neuronal. Por exemplo, os transportadores de glutamato astrocitários, GLAST e GLT-1, têm papel essencial na retirada de glutamato do espaço extracellular e na manutenção deste neurotransmissor em níveis fisiológicos no cérebro. No presente estudo, demonstramos que o T3 aumentou significativamente a captação de glutamato por astrócitos cerebelares, quando comparados às culturas sem o tratamento. A adição de LPDC e DL-TBOA, inibidores da captação de glutamato, aboliu a captação de glutamato tanto nos astrócitos tratados com T3 como nos controles. Além disto, os níveis de RNA mensageiro e de proteína para GLAST e GLT-1 em astrócitos foram aumentados após o tratamento com T3, embora não tenhamos observado diferenças significativas na distribuição destes transportadores. O efeito gliotóxico do glutamato nas culturas de astrócitos cerebelares foi abolido pelo tratamento com T3. Além disto, neurônios cerebelares cultivados sobre monocamadas de astrócitos tratados com T3 permaneceram viáveis em uma maior proporção após a adição de glutamato do que os cultivados sobre monocamadas astrocitárias controle, demonstrando um efeito neuroprotetor do T3. A expressão de sindecanas (1-4) em culturas de astrócitos de cerebelo, córtex cerebral e hipocampo de ratos neonatos foi analisada por RT-PCR. Nossos resultados demonstraram que as sindecanas 1-4 são expressas em astrócitos de cerebelo e córtex cerebral, enquanto que astrócitos de hipocampo expressam apenas as sindecanas 2 e 4. A análise por RT-PCR semiquantitativa demonstrou que a expressão das sindecanas 1, 2 e 4 foi reduzida e a expressão da sindecana 3 foi aumentada em cerebelos de ratos hipotireoideos, comparados aos tecidos normais. Observamos também redução na expressão das sindecanas 2 e 3 em astrócitos cerebelares tratados com T3, quando comparados às culturas não tratadas. Este balanço de PGs pode estar envolvido na ação do T3, mediada pela sinalização por FGF2. Demonstramos também, neste trabalho, que astrócitos hipotireoideos apresentam alterações na expressão e organização de fibronectina e laminina. Monocamadas de astrócitos hipotireoideos corresponderam a um microambiente pobre para o desenvolvimento neuronal do que astrócitos normais. O tratamento de astrócitos hipotireoideos com T3, recuperou o microambiente hipotireoideo, aumentando a área de cobertura por fibronectina e laminina. Em co-culturas de neurônios hipotireoideos sobre astrócitos hipotireoideos tratados com T3 foi observado maior número de neurônios e estes apresentando maior neuritogênese do que quando cultivados sobre astrócitos hipotireoideos não tratados. O meio condicionado de astrócitos hipotireoideos tratados com T3 também promoveu sobrevivência e neuritogênese em neurônios hipotireoideos. Nossos resultados demonstram que os efeitos do T3 na morfogênese astrocitária podem modular o desenvolvimento neuronal por diferentes mecanismos, como regulação dos níveis extracelulares de glutamato, e modulando contatos diretos célula-célula e célula-MEC. Thyroid hormone (T3) has a significant influence on the development and maturation of the mammalian SNC. T3 modulates neuronal development in an astrocyte-mediated manner, secreting soluble factors and other molecules, as ECM proteins, and regulating neurite outgrowth, neuron proliferation and migration. Astrocytes also participate actively in the neuronal metabolism. For example, astrocytic glutamate transporters, GLAST and GLT-1, play an essential role in the clearance of the neuronal-released glutamate from the extracellular space and are essential for maintaining physiological extracellular glutamate levels in the brain. In the present study, we showed that T3 significantly increased glutamate uptake by cerebellar astrocytes when compared to control cultures. Inhibitors of glutamate uptake, such as L-PDC and DL-TBOA, abolished glutamate uptake on control or T3-treated astrocytes. T3-treatment of astrocytes increased both mRNA levels and protein expression of GLAST and GLT-1, although no significant changes on the distribution of these transporters were observed. The gliotoxic effect of glutamate on cultured cerebellar astrocytes was abolished by T3-treatment of astrocytes. In addition, the neuronal viability against glutamate challenge was enhanced on T3- treated astrocytes, showing a putative neuroprotective effect of T3. We also analyzed the modulation of sindecans expression by thyroid hormone via RT-PCR in astrocytes cultures from cerebellum, cortex and hippocampus of newborn rats. Our results showed that syndecans (1-4) are expressed in astrocytes of cerebellum and cortex, whereas in hippocampus only syndecans 2 and 4 were detected. Semi-quantitative RT-PCR analysis revealed reduced expression of syndecans 1, 2 and 4, and increased expression of syndecan 3 in hypothyroid cerebellum, when compared to the euthyroid tissue. Furthermore, we observed a reduced expression of syndecans 2 and 3 in T3-treated cerebellar astrocytes, when compared to non-treated culture. This balance of PGs may be involved in T3 action mediated by FGF2 signaling. Moreover, we demonstrated that hypothyroid astrocytes showed an altered expression and organization of fibronectin and laminin. As expected, astrocytes hypothyroid represented a poor microenvironment to neuronal development than the normal ones. The T3-treatment recovered the microenvironment hypothyroid, increasing the covered area by fibronectin and laminin. In addition, hypothyroid neurons cultivated on T3-treated hypothyroid astrocytes had an increase in the number of cells and presented longer neurites than the cells cultured on astrocytes monolayers without T3. The conditioned medium of T3-treated hypothyroid astrocytes also promoted survival and neuritogenesis in hypothyroid neurons. Taken together our results demonstrate that the T3 effects on astrocytic morphogenesis may influence neuronal development by different mechanisms as regulating the glutamate extracellular levels and secreting ECM proteins modulating direct cell to cell or cell to ECM contacts.
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Estudo da expressão de ligantes e receptores de matriz extracelular nas células endoteliais tímicas e sua participação na migração. / Study of expression of ligands and receptors of extracellular matrix in endothelial cells and its involvement in thymic migration.

Francelino, Andrea Aragao 25 March 2008 (has links)
The traffic of T cells, that occur when bone marrow-derived T cell precursors penetrate the thymus, with a phenotype of immature cells, and its subsequent output, as mature cells, depends of the thymic blood vessels that consists mainly of thymic endothelial cells. The expression of ligands and receptors of ECM in thymic endothelial cells, as well as its role in the processes of migration and emigration of the T cells from the thymus remains unclear. Our goal was to evaluated the expression of some of ECM ligands and their respective receptors in the strain of thymic endothelial cells tEnd.1. In addition, we aimed to study the role of the components of the ECM in the tEnd.1 cells and thymocytes interaction. First, it was detected by confocal immunofluorescence the presence of ECM proteins fibronectin and laminin, which were also observed through flow cytometry. The presence of their respective receptors, VLA5 and VLA6, were highlighted by immunoperioxidase and flow cytometry. Assays of adhesion showed that the use of antibodies anti-VLA5 and anti-VLA6 seems to block at least partially, the adhesion of thymocytes to endothelial cells. In addition, the transendothelial migration assay showed less migration in absolute cell number of the thymocytes pre-treated with antibodies anti-receptors of ECM, although this migration was not statistically significant. Finally, when the phenotype of the transmigrated thymocytes was observed, there was not difference in the migration pattern among them. This investigation shows that the thymic endothelial cells are able to express fibronectin and laminin proteins, as well as, their respective receptors VLA5 and VLA6, and suggests that these molecules could participate in the processes of intrathymic lymphocytes migration. / Os precursores das células T sofrem diferenciação e seleção intratímica através das interações com os componentes do microambiente tímico. Este é constituído em sua grande maioria por células epiteliais tímicas (TEC), macrófagos, células dendríticas, fibroblastos e os produtos de secreção dessas células, tais como hormônios, interleucinas e moléculas de matriz extracelular (ECM). O tráfego de células T, que a princípio penetram no timo provenientes da medula óssea, com fenótipo de células imaturas e, a sua posterior saída, como células maduras, depende terminantemente dos vasos sanguíneos que irrigam o órgão. Tais vasos são constituídos principalmente de células endoteliais tímicas. Tendo em vista que a expressão de ligantes e receptores de ECM em células endoteliais tímicas, assim como sua função nos processos de migração e emigração de células T do timo permanece pouco estudada, neste trabalho foi avaliada a expressão de alguns ligantes de ECM e seus respectivos receptores em uma linhagem de células endoteliais tímicas, tEnd.1. Além disso, estudou-se também o papel destes componentes de ECM na interação entre as células tEnd.1 e os timócitos. A princípio, foi detectado por imunofluorescência confocal a presença das proteínas de ECM fibronectina e laminina, que foram também observadas através de citofluorimetria, enquanto a presença de seus respectivos receptores, VLA5 e VLA6, foram evidenciados por imunoperoxidase e citofluorimetria. Ensaios de adesão sugeriram que o uso de anticorpos anti-receptores de ECM, anti-VLA5 e anti-VLA6, inibem pelo menos parcialmente, a adesão de timócitos às células endoteliais tEnd.1. Por fim, ensaios de migração transendotelial demonstraram claramente uma menor migração em números absolutos dos timócitos pré-tratados com anticorpos anti-receptores de ECM, embora essa diminuição não tenha sido estatisticamente significativa. Tomando em conjunto, os dados neste trabalho demonstraram que as células endoteliais tímicas da linhagem tEnd.1 são capazes de expressar tanto ligantes de ECM, como seus respectivos receptores, sugerindo ainda, a participação destas moléculas nos processos de migração de linfócitos intratímicos.
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Efeitos da expressão de VEFG165 humano injectado no músculo cardíaco de ratos, após indução de infarto agudo do miocárdio, na fase tardia de remodelamento da matriz extracelular / Effects of expression of human VEFG165 injected into heart muscle of rats after induction of acute myocardial infarction, in the late phase of remodeling the extracellular matrix

Mataveli, Fábio D'Aguiar [UNIFESP] January 2009 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / O remodelmento cardíaco é em última instância regulado por compenentes da matriz extracelular (MEC). Investigamos o importante papel que os fatoresde crescimento desempenham na regulação do remodelamento da MEC cardíaca decorrente do infarto agudo do miocárdio. Ratos foram submetidos à ligação da artéria coronaria descendente esquerda e subsequente transferência gênica intramiocárdica do plasmídeo pVEGF165 no grupo tratado. Os animais foram divididos de acordo com o tamanho do infarto em grande (LMI), pequeno (SMI), com ou sem tratamento com a transferência gênica. O plasmídeo contendo o cDNA que codifica para o VEGF165 foi injetado no músculo cardíacoe seus efeitos sobre os componentes da MEC foram analisados. Os ensaios de transfecçnao foram realizados com células endoteliais e musculares lisas, utilizando pcDNA3.1 recombinante contendo cDNA do VEGF165.Os glicosaminoglicanos foram identificados e quantificados por eletroforese em gel de agarose e ELISA como também por imunohistoquímica para investigar aterações da expressão da catepsina B, heparanase e sindecam-4. A quantidadede ácido hialurônico (HA) (p < 0.005), dermatam sulfato (DS), condroitim sulfato (CS) e heparam sulfato (HS) (p < 0.001) foram significativamente maiores no grupo LMI tratado em comparação com os demais grupos, corroborando com a dominuição na expressão da heparanase. Uma diminuição da massa molecular do HA foi observada no tecido cicatricial do grupo tratado. Os dados obtidos fortemente sugerem que alterações da MEC e de seus compenentes são importantes determinantes do remodelamento cardíaco após infarto do miocárdio, podendo ser essenciais na resposta inflamatória e na tentativa de recuperar os danos e prover mecanismos compensatórios para manter a fração de ejeção cardíaca, visto que os componentes da MEC analisados estão diretamente envolvidos na angiogênese, proliferação e diferenciação cellular. Os ensaios in vitro mostraram que a resposta aos fatores de crescimento com relação à síntese dos glicosaminoglicanos é dependente do tipo celular e dose utilizada. / Cardiac remodeling is ultimately regulated by components of the extracellular matrix (ECM). We investigated the important role that growth factors play in the regulation of ECM remodelling that occurs as a consequence of myocardium damage. Rats were submitted to the ligation of the left anterior coronary artery and pVEGF165 was immediately injected intramyocardially in the treated group. The animals were divided into large (LMI) and small infarct (SMI), with or without gene transfer. The plasmid containing cDNA encoding VEGF165 was injected into the cardiac muscle and its effect was observed on the ECM components. Transfection assays were also performed with endothelial and smooth muscle cells using recombinant pcDNA3.1 containing VEGF165 cDNA. Glycosaminoglycans were identified and quantified by agarose gel based electrophoresis and ELISA as well as immunocytochemistry to examine specific cathepsin B, heparanase and syndecan-4 changes. The amounts of hyaluronic acid (HA), (p<0.005), dermatan sulfate (DS), chondroitin sulfate (CS) and heparan sulfate (HS) (p<0.001) were significantly increased in the LMI treated group in comparison to the other groups, which correlates with the decrease in the expression of heparanase. A decrease in the molecular mass of HA was found in the scar tissue of treated group. The data obtained strong support the idea that changes in the ECM and its components are important determinants of cardiac remodelling after myocardium infarct and may be essential for inflammatory response and attempt to stabilize the damage and provide a compensatory mechanisms to maintain cardiac output since the ECM components analyzed are involved with angiogenesis, cell proliferation and differentiation. In vitro assays showed that growth factors affect glycosaminoglycans synthesis in a cell specific and dose dependent manner. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Interações linfócitos/células nervosas, in vitro, na infecção experimental pelo Trypanosoma cruzi possível participação da matriz extracelular

Mariz, Fernanda Pinto January 2002 (has links)
Made available in DSpace on 2014-12-05T18:40:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fernanda_mariz_ioc_mest_2002.pdf: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 1_fernanda_mariz_ioc_mest_2002.pdf: 397710 bytes, checksum: c5806b803bc46b6c3532cd3281026b69 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, cujo agente etiológico é o Trypanosoma cruzi, é considerada uma parasitose endêmica que acomete mais de 18 milhões de indivíduos na América Latina. Uma parte destes apresenta acometimento do sistema nervoso central e periférico. Vem sendo descrito, durante a fase aguda da doença, um intenso infiltrado inflamatório em regiões do tecido nervoso. Entretanto, os mecanismos envolvidos no aporte de células T e nas interações celulares neste tecido permanecem pouco esclarecidos. Assim, utilizamos neste trabalho um modelo in vitro visando estudar as interações entre células T de camundongos na fase aguda de infecção e células neuronais, exemplificadas por uma linhagem de neuroblastoma murino (N2a), e por neurônios do córtex cerebral oriundos de cultivo primário. Em particular, procuramos avaliar as interações mediadas por elementos de matriz extracelular (ECM), os quais sabidamente são capazes de interferir com os eventos de migração celular Inicialmente, observamos que células N2a e neurônios de cultivo primário expressam constitutivamente proteínas de ECM (laminina, fibronectina e colágeno tipo IV), cuja presença é aumentada na vigência de infecção in vitro pelo T. cruzi. Também pudemos notar aumento na adesão de células T às células N2a quando estas são infectadas in vitro e/ou quando os linfócitos T são oriundos de animais infectados. Este fenômeno é mediado, pelo menos em parte, por elementos de ECM, visto que pôde ser bloqueado por anticorpos antifibronectina, antilaminina e anticolágeno tipo IV. Nossos resultados indicam que ligantes e receptores de ECM encontram-se envolvidos na interação células T/células neuronais, a qual pode ocorrer após a infecção experimental pelo T. cruzi / Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi , is an endemic parasitic disease affecting more than 18 million individuals in Latin America. Part of these patients develop symptoms related to the disorders in the pe ripheral and central nervous system. It has been described, during the acute phase of the d isease, an intense inflammatory infiltrate in the nervous tissue, but the mechanism (s) driving T cells to this tissue remain(s) to be clarified. We used an in vitro model to study the interactions between T cells derived T. cruzi -infected mice and neurons, herein exemplified by t he N2a murine neuroblastoma cell line, as well as by a brain cort ex-derived primary culture of murine neurons. In particular, we looked for extracellular matrix (ECM)- mediated interactions, known to affect T cell migration. We first showed that N2a cells and the primary cult ures of neurons constitutively express the ECM proteins, laminin, fibronectin and collagen type IV and that such an expression is upregulated upon T. cruzi infection in vitro . Moreover, adhesion of peripheral T cells was enhanc ed (as compared to non- infected conditions) when N2a cells were infected in vitro , or when T cells were derived from T. cruzi infected mice. This likely represents an ECM- medi ated event since it could be partially inhibited with anti-ECM antibodies. In conclusion, our results indicate that ECM ligand s and receptors are involved in the T cell/neuronal interactions that may occur following T. cruzi infection
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PAPEL DAS PROTEÍNAS SECRETADAS POR CÉLULAS RESIDENTES CARDÍACAS COMO POTENCIAIS INDUTORAS DA DIFERENCIAÇÃO CARDIOMIOGÊNICA DE CÉLULAS-TRONCO HUMANAS

REUS, THAMILE LUCIANE 01 September 2016 (has links)
Submitted by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:28:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Thamile_versaofinal.pdf: 1994677 bytes, checksum: ae5ee13d8f71c37552b741b9a2c81a37 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciane Willcox (luwillcox@gmail.com) on 2016-09-01T16:46:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Thamile_versaofinal.pdf: 1994677 bytes, checksum: ae5ee13d8f71c37552b741b9a2c81a37 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T16:46:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Thamile_versaofinal.pdf: 1994677 bytes, checksum: ae5ee13d8f71c37552b741b9a2c81a37 (MD5) / As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células indiferenciadas capazes de se autorrenovarem e diferenciarem em diversos tipos celulares; estas células têm sido amplamente avaliadas quanto ao uso em terapias para doenças cardiovasculares, visando recuperar o tecido cardíaco danificado. É sabido que o comportamento biológico das CTMs depende do microambiente onde se encontram, que é composto principalmente por células, matriz extracelular (MEC) e fatores solúveis. Desta forma, isolamos células residentes cardíacas através da cultura de explantes de aurícula e ventrículo cardíaco humano e realizamos a caracterização do fenótipo destas células, bem como de proteínas de MEC e do meio condicionado (fatores solúveis) secretados por elas. Constatamos que ambas as populações celulares são compostas por CTMs, fibroblastos cardíacos e possivelmente pericitos/miofibroblastos. Realizamos o cultivo destas células e isolamos a MEC por meio da descelularização das monocamadas celulares com uma solução de Triton X-100 0,5%. Por outro lado, obtivemos o meio condicionado (MC) de ambas as populações celulares e observamos que estes são compostos por diversas proteínas, muitas das quais sendo relacionadas aos processos de regulação da diferenciação celular, desenvolvimento e reparo tecidual. Devido ao fato destas populações celulares serem populações heterogêneas compostas de células encontradas no coração, procuramos avaliar o papel das proteínas de MEC e do MC secretados por elas em cultivos de CTMs. Primeiramente, observamos através de ensaios de viabilidade celular e morte por apoptose e necrose, que as MEC e os MCs não foram tóxicos para os cultivos de CTMs. Observamos que a MEC derivada de células de aurícula induziu redução da taxa de proliferação das CTMs em 24 horas. Em contrapartida, após 7 dias, o número de CTMs cultivadas na presença de ambos os MCs aumentou significativamente em relação ao controle, sugerindo um papel destas proteínas secretadas como indutoras da proliferação celular. Em relação a adesão, observamos que as MECs não influenciaram o número de CTMs aderidas em comparação com o controle de colágeno tipo I. Da mesma forma, não observamos diferença na taxa de migração e na marcação para GATA-4 e Troponina-I entre os grupos controle e os cultivados na presença das MECs e/ou MCs. Embora não tenhamos observado diferença nestes parâmetros, ao menos nas condições avaliadas neste estudo, conseguimos demonstrar através deste trabalho que as populações celulares derivadas de aurícula e ventrículo são secretoras ativas de diversas proteínas relacionadas a processos de desenvolvimento celular e possivelmente ao reparo do tecido cardíaco. Portanto, estas células podem representar uma importante fonte de fatores tróficos a ser avaliada como indutora de estímulos em células progenitoras com objetivos terapêuticos em lesões cardiovasculares.

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