A Diabetes Mellitus Gestacional (DMG) pode ser definida como intolerância a carboidrato durante a gravidez e estima-se que pode afetar 10-22% de todas as pacientes grávidas. Durante a gravidez podem surgir diversas complicações para o feto como risco elevado de aborto espontâneo, anormalidades congênitas e morbidade e mortalidade neonatal. Entretanto, podem surgir também alterações morfofuncionais em diversos órgãos da mãe diabética, porém isso não é bem estabelecido. Investigar se haverá ou não alterações bioquímicas e histopatológicas em diversos órgãos, como hipófise, útero, placenta e pâncreas de ratas grávidas com diabetes mellitus durante e no final da gravidez e compará-las . Além disso, investigar se há alteração na matriz extracelular (MEC) da hipófise desses animais. No 5 dia de vida, ratas Wistar foram divididas em dois grupos: um tratado com estreptozotocina (Grupo Diabético / DIAB), na dose de 90 mg/kg, subcutâneo e outro grupo, que foi tratado com veículo (tampão citrato/CTR). Aos 90 dias de vidas, foram submetidas ao cruzamento. Após isso, foram sacrificadas no 11 e 21 dia de gravidez. Foram avaliados glicemia e bioquímica maternal e número de implantes .O pâncreas, útero, placenta e hipófises foram coradas com Hematoxilina e Eosina e somente as hipófises foram coradas com Massom e Picrosirius, para avaliação da MEC.Os animais diabéticos tanto do 11 quanto do 21 dia apresentaram uma redução no número de implantes, menor peso e maior glicemia e colesterol total, em relação aos animais controle independente do dia da gravidez. Não foi verificada diferença dos níveis de triglicerídeos entre os grupos não diabéticos e diabéticos, independente dos dias. Entretanto, os animais diabéticos que finalizaram o período de gestação apresentaram uma maior glicemia maternal em relação ao grupo diabético do 11 dia. Pâncreas de ratas diabéticas do 21 dia apresentaram vacuolização intracitoplasmática das ilhotas, insulite,migração de células inflamatórias, espessamento da parede do vaso e fibrose periductal e vascular. Essas alterações foram verificadas com bem menor intensidade nos animais diabéticos do 11 dia. Foi verificado que a placenta de animais diabéticos apresenta congestão na interface materno-fetal, migração celular, maior concentração de vasos maternos e fetais, mas em forma irregular , necrose e vacuolização. A hipófise de animais diabéticos mostraram células cromófobas agregadas, aumento da espessura de fibras de colágeno vermelhas da MEC, em contraste com o controle, que foi visualizado fibras em verde e em formato de feixe. A diabetes desempenhou um total remodelamento da hipófise. Gravidez de animais diabeticos mostraram maior dano ao pâncreas e placenta, especialmente no final da gravidez. Em consequência dessa alterações, esses animais diabéticos apresentaram hiperglicemia, maior colesterol total, porém menor peso materno, número de implantes e sem alterações nos triglicerídeos. Esse é o primeiro estudo a demonstrar remodelamento tecidual em alguns elementos da MEC na hipófise, como espessamento da camada da MEC e fibras de colágeno em verde. Alterações da MEC da hipófise são provavelmente devido ao processo de diabetes na gestação. / Gestational Diabetes Mellitus (GDM) can be defined as carbohidrat intolerance during pregnancy and it may affect 10-22% off all pregnant pacients. During pregnancy can surge lots of complications to the fetus such as high risk of spontaneous abortion, congenital abnormalities and neonatal morbity and mortality. However, it can also surge morphofunctional alterations in several organs of the diabetic mother, but it has not been well established .To investigate if there is going to be biochemical and histopathological alterations in several organs, such as pituitary, uterus, placenta and pancreas of pregnant diabetics rats during and in the end of pregnancy and compared them. Furthermore, to investigate if there is pituitary alteration of the extracellular matrix (ECM) in these animals. On the 5th day of life, Wistar rats were divided in two groups: one treated with streptozotocin (Diabetic Group/DIAB) , with the dose of 90 mg/kg, subcutaneous and another group , treated with vehicle (citrate buffer/CTR). At 90 days of life, they were mated . After, they were sacrified at 11o e 21o days of pregnancy. Were evaluated maternal glicemia and biochemistry and implant numbers. The pancreas, uterus,placenta e pituitary were stained with Hematoxilin and Eosin and only the pituitary were stained with Masson and Picrosirius, for ECM evaluation. Diabetic animals of 11o day as well as 21o days during pregnancy showed a reduced implant numbers, reduced weight and higher glicemia and total cholesterol , compared with control animals independent of pregnancy day. It was not verified difference in triglycerides levels between non diabetic and diabetic animals, independent of the day. However, diabetic animals that concluded the gestational period showed a higher maternal glicemia compared with 11o day diabetic group. Pancreas of 21o days diabetic animals showed islets intracitoplasmatic vacuolization, insulitis, inflammatory cell migration, thickness of wall vessel and periductal and vascular fibrosis. These alterations were verified in low intensity in 11o day diabetic animals. It was verified at the placenta of diabetic animal congestion in the interface maternal-fetal ,cell migration , higher concentration of maternal and fetal vessels , but in irregular shape , necrosis and vacuolization.The pituitary of diabetic animals showed chromophobs cells aggregation, stiffness of red collagen fibers of ECM , in contrast of control, that was visualized green ones and in bundle shape . Diabetes performed a total tissue remodeling in pituitary . Pancreas of diabetic pregnant animals showed a more damage pancreas and placenta, especially in the end of pregnancy.In consequence of these alterations,these diabetic animals presented hyperglycemia, higher total cholesterol , but low maternal weight , implant numbers and no changes in triglycerides. This study is the first to demonstrate that during experimental gestational diabetes occurs a tissue remodeling of some elements of ECM in pituitary, such as stiffness of ECM and presence of red collagen fibers. Control animals presented a thin ECM layer and green collagen fibers.Pituitary alterations in ECM probably are due diabetes process during pregnancy.

A cirrose hepática é um processo irreversível caracterizado pelo desequilíbrio entre a deposição e a degradação de componentes da matriz extracelular (MEC), acarretando disfunção hepatocelular e aumento da resistência ao fluxo sanguíneo, resultando em insuficiência hepática e na hipertensão portal. A cirrose em cães, muitas vezes é identificada nos estágios finais, já que o estágio inicial é assintomático. Em humanos, no estágio final da cirrose, o transplante é o único tratamento. Desta forma, a busca por tratamentos alternativos torna-se imprescindível. A administração de fatores hepatotróficos (FH) tem sido estudada como uma alternativa de tratamento. Este estudo objetivou avaliar os efeitos dos FHs na cirrose hepática murina induzida pela tioacetamida (TAA), imediatamente após o tratamento, e 60 dias pós o seu término. 75 ratas Wistar foram subdivididas em quatro grupos; FH (n=15) e o seu grupo controle (CT, n=30), e FH+60d (n=15) e seu controle (CT, n=15); todos os animais foram induzidos à cirrose hepática pela administração TAA (200mg/Kg), ip, 3 vezes/semana, por 14 semanas. Após a indução, dois grupos receberam a solução de FHs por 12 dias. Um foi eutanasiado imediatamente após o tratamento e o outro, 60 dias após o seu término. Foram realizadas análises bioquímica sérica e histopatológica; a quantificação do colágeno; avaliação da proliferação celular e da ativação das células estreladas. Ainda, foram avaliadas a expressão gênica de proteínas envolvidas na fibrogênese, como, colágeno tipo 1, TGF-1, TIMP-1, MMP-2, MMP-13 e PLAU. Os resultados obtidos imediatamente após o tratamento mostraram que os FHs melhoraram as funções hepáticas, reduziram a deposição de colágeno e a ativação das células estreladas; alterando os mecanismos moleculares envolvidos na fibrogênese pela redução da expressão do colágeno tipo 1, aumento de TIMP-1, MMP-13 e PLAU. A maioria destes efeitos se manteve após o término do tratamento. Os resultados indicam que os FHs auxiliam no restabelecimento das funções e arquitetura hepáticas, atuando sobre os mecanismos de deposição e degradação da MEC, e que o tratamento com os FHs têm ação prolongada, não desaparecendo imediatamente após o tratamento. / Hepatic cirrhosis is an irreversible process characterized by an imbalance between deposition and degradation of extracellular matrix components (ECM). This disease leads to hepatocellular dysfunction and increased resistance to blood flow resulting in liver failure and portal hypertension. The cirrhosis, in dogs, is often identified in the final stages whereas the early stage is asymptomatic. In humans, in the final stage of the cirrhosis, transplantation is the only treatment. Thus, the search for alternative treatments becomes essential. The administration of hepatotrophic factors (HF) has been studied as a treatment alternative. This study evaluated the effects of HFs in murine liver cirrhosis induced by thioacetamide (TAA) immediately after treatment, and 60 days after it ends. 75 female Wistar rats were distributed into four groups: HF (n=15) and control group (n=30), and HF+60d (n=15) and control group (n=15). Hepatic cirrhosis was induced in all animals by TAA administration (200 mg/kg), ip, 3 times a week for 14 weeks. After induction, two groups received the HFs solution for 12 days. One group was euthanized immediately after treatment and another group was euthanized 60 days after treatment. The following analyzes were performed: serum biochemistry, histopathologic, collagen quantification, cell proliferation, and stellate cells activation. In addition, the gene expression of proteins involved in fibrogenesis such as type 1 collagen, TGF-1, TIMP-1, MMP-2, MMP-13, and PLAU was evaluated. The results found immediately after treatment showed that HFs improved liver function, and reduced collagen deposition and stellate cells activation. Alterations of the molecular mechanisms involved in fibrogenesis were observed by reducing the expression of collagen type 1 and increased expression of TIMP-1, MMP-13 and PLAU. Most of these effects remained after the treatment. The results indicate that the HFs assist in restoration of liver function and architecture, acting on the mechanisms of deposition and degradation of ECM. Furthermore, the treatment with HFs showed prolonged action, remaining during the post-treatment.

O câncer de ovário é uma neoplasia ginecológica e alternâncias hormonais poderiam ter um papel na manifestação da doença. As ADAMTS´s são proteases secretadas dependentes de Zn2+/Ca2+. Nosso objetivo foi avaliar se há Influência de hormônios sexuais nos níveis de expressão de mRNA, proteínas e distribuição de ADAMTS 1 e 4 e alteração na migração e invasão em células tumorais humanas de ovário. As linhagens foram tratadas com progesterona, estrógeno ou testosterona e o controle não recebeu tratamento. O estrógeno e a testosterona induziram uma menor e a progesterona uma maior expressão gênica de ADAMTS 1 e 4 em relação ao controle para a linhagem ES-2. A progesterona foi capaz de induzir aumento nos níveis proteicos de ADAMTS 1 e 4 no lisado de ambas as linhagens. A progesterona diminuiu a capacidade migratória e de invasão das linhagens. Observamos na imunofluorescência ADAMTS 1 no núcleo das células. Concluímos que a progesterona regula a expressão das ADAMTS 1 e 4, e reduz a invasão e migração de células derivadas de câncer de ovário. / Ovarian carcinoma is the leading cause of gynecological neoplastic death, being associated primarily with deregulation of sex hormones. ADAMTS are secreted proteases. Our aim is to assess whether sex hormones would affect ADAMTS1 and 4 expressions in ovarian cancer cells. Estrogen and testosterone induced a decrease on gene expression of ADAMTS 1 and 4 compared to the control for the ES-2 cell line, while progesterone led to an increase in the mRNA levels of these same proteases. Progesterone increases ADAMTS\'s protein levels in the lysate and in conditioned medium from NIH-OVCAR-3 and in the lysate from ES-2 cells. Immunofluorescence showed ADAMTS 1 located at the cell nucleus. NIH-OVCAR-3 cells treated with progesterone exhibited decrease migratory activity compared to control and ES-2 exhibited decrease invasion activity. We conclude that progesterone modulates ADAMTS1 and 4 levels in ovarian cancer cell lines and decrease migratory and invasion behavior in ovarian cancer cells.

Trinta novos membros de Tc85 (superfamília das gp85/trans-sialidases) foram clonados e seqüenciados (30-90% identidade), mostrando um intenso polimorfismo entre os genes e levantando a hipótese de que a família possui propriedades multi-adesivas, que garantem ao Trypanosoma cruzi sucesso na invasão. Para verificar os distintos padrões de interação de diferentes membros de Tc85, duas proteínas recombinantes, Tc85-12r e Tc85-45r, foram testadas frente à matriz extracelular (MEC) e células LLC-MK2. As duas proteínas ligam-se dose-dependentemente à MEC imobilizada e apresentam ligação em laminina e fibronectina. Também foi observado um ligante de 60kDa, não identificado, de ambas Tc85 na MEC. Ensaios de ligação destas proteínas à células LLC-MK2 mostram que Tc85-45r têm ligação maior que Tc85-12r. Se a ligação é inibida com o tripeptídeo RGD, (presente somente na seqüência de Tc85-45r) observamos uma redução de 98% na adesão de Tc85-45r em LLC-MK2 contra 60% em Tc85-12r. No ensaio de invasão de tripomastigotas em LLC-MK2, RGD exógeno e Tc85-45r foram as que mais contribuiram para a inibição da invasão, mostrando a importância de RGD. Os resultados ressaltam as diferenças em motivos de adesão putativos e a capacidade de ligação de proteínas recombinantes tanto em célula hospedeira quanto em MEC, que podem ser importantes para o parasita durante a colonização do hospedeiro. / Thirty new members of Tc85 (gp85/transialidases supergene family) were cloned and sequenced (30-90% of identity), showing an intense polimorfism between the genes and raising the hypothesis that the family has multi-adhesive properties that assures the success of the invasion process of Trypanosoma cruzi. Two recombinants proteins, Tc85-12r and Tc85-45r, were assayed in order to verify the distinctive patterns of interaction between different members of Tc85 and extra cellular matrix (ECM) or LLC-MK2 cells. Both proteins exhibit a dose-dependent binding to immobilized ECM, laminin and fibronectin. We also noticed an unidentified 60 kDa ligand in the ECM that can bind to both Tc85. Binding assays of both proteins to LLC-MK2 cells show that Tc85-45r exhibit a higher number of bound cells at the saturation point than Tc85-12r. If the binding is inhibited with the RGD tripeptide (present just in Tc85-45r sequence), there is a 98% reduction of LLC-MK2 cells adhesion to Tc85-45r against a 60% reduction of adhesion to Tc85-12r. The tripomastigotes invasion to LLC-MK2 assay showed that both exogenous RGD and Tc85-45r were the most efficient inhibitors in the process thus confirming the importance of RGD. The results point out the difference between putative adhesion motifs and the recombinants proteins binding capacity to host cells and ECM, two characteristics that might be important to the parasite during the host colonization.

A doença de Chagas foi incialmente descrita em 1090 e após mais de 100 anos de investigações sobre essa doença, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos ativados no parasita durante sua adesão e invasão à célula hospedeira. Glicoproteínas de massa molecular de 85kDa localizadas na membrana do parasita foram identificadas como principais elementos responsáveis pela interação com o hospedeiro. Essas proteínas também são capazes de se ligar a elementos da matriz extracelular (ECM) da célula hospedeira e esse evento parece ser crucial para modulação da adesão e invasão do parasita e consequente avanço da infecção. Embora diferentes elementos tenham sido identificados no hospedeiro como componentes da via de resposta a adesão ao parasita, as modificações induzidas pela sua ligação ao hospedeiro é ainda pouco conhecida. Modificações pós-traducionais de proteínas, incluindo a fosforilação, têm sido utilizadas por diferentes organismos na transdução de sinais extracelulares. Dessa forma, a identificação de proteínas diferencialmente fosforiladas durante a adesão de tripomastigotas de T. cruzi a ECM, fibronectina e laminina foi o objetivo dessa tese. Tripomastigotas foram incubados com ECM, fibronectina-, laminina- ou BSA- previamente aderidos em placas de cultura de células. Em seguida, os parasitas foram coletados e suas proteínas extraídas e separadas por 2D-PAGE. Os géis de eletroforese foram corados com Pro-Q Diamond (para identifiicação de proteínas fosforiladas) e posteriormente com coomassie colloidal (identificação de proteínas totais). Os spots com diferença significativa na coloração com Pro-Q Diamond (p< 0,05) foram identificados por LC-MS/MS. 54 spots foram diferencialmente fosforilados durante a adesão dos parasitas a ECM, dos quais 39 sofreram um aumento da intensidade de fosforilação e 15 uma redução. Já dos 43 spots diferencialmente fosforilados durante incubação com laminina, 16 aumentaram a fosforilação enquanto 27 sofreram redução da intensidade de fosforilação. Por fim, após incubação com fibronectina, dos 50 spots selecionados, 15 spots sofreram aumento da intensidade de fosforilação e 35 sofreram redução. Após identificação dos spots, as modificações por fosforilação/desfosforilação de proteínas de função desconhecida (hypothetical proteins), proteínas do citoesqueleto, proteínas do choque térmico (HSPs) e proteínas componentes do proteassomo do parasita foram as mais evidentes. A validação por immonoblotting de algumas proteínas identificadas indicou que a desfosforilação de proteínas do citoesqueleto junto com a fosforilação de proteínas do choque térmico são os principais eventos durante a resposta do parasita a adesão a ECM e a seus elementos. Além disso, a desfosforilação de ERK 1/2 observada indicou uma inativação dessa proteína em parasitas aderidos a fibronectina e laminina. Os resultados obtidos nessa tese sugerem uma provável relação entre modificações de proteínas do citoesqueleto e HSPs com a capacidade de internalização dos parasitas na célula hospedeira. / The Chagas disease was firstly described in 1909. After more than 100 years of investigation about this sickness much less is known about the mechanism triggered in the parasite during the adhesion and invasion to the host cell. 85kDa glycoproteins were identified as the major element responsible for the attachment to the host. In addition, these proteins are able to binding to extracellular matrix elements and host cytoskeletal proteins and it event appears to be an essential step in host cell invasion by T. cruzi. Although downstream signal modifications have been studied in host cells upon parasite binding, the molecular changes induced on the parasite by ligand binding are largely unknown. Since post-translational modification of proteins by phosphorylation is one of the most important mechanisms employed by organisms to transduce external signals, identification of proteins modified upon adhesion of T. cruzi trypomastigotes to ECM, laminin and fibronectin of the host cell was pursued. Trypomastigotes (Y strain) were incubated with ECM, laminin-, fibronectin- or BSA-coated surfaces, followed by 2D-PAGE stained with Pro-Q Diamond (phosphorylated protein detection) followed by colloidal coomassie stain (total protein identification). Proteins with significant differences in Pro-Q Diamond stain (p<0.05) were identified by LC-MS/MS. 54 spots were differentially phosphorylated during parasite adhesion to ECM, in which 39 spots have increased their phosphorylation level and 15 have decreased their phosphorylation. From the 43 spots presenting modification to the phosphorylation on incubation with laminin, 16 corresponded to cases of increase of phosphorylation and 27 to cases of dephosphorylation. After incubation with fibronectin: from the 50 spots selected, 15 corresponded to increase of phosphorylation and 35 to dephosphorylation. The results show phosphorylation/dephosphorylation modifications of unknown proteins, parasite cytoskeletal proteins (alpha and beta tubulin and paraflagellar-rod proteins), heat shock proteins and proteasome proteins. The validation by immunoblotting of proteins and their phosphorylation intensities indicates that cytoskeletal protein dephosphorylation in addition to heat shock proteins phosphorylation are the most important event during the trypomastigotes adhesion to the ECM. Looking for downstream signaling, dephosphorylation of ERK1/2 was also shown in trypomastigotes adhered to fibronectin or laminin, suggesting its inactivation. Thereby, those results suggest a possible correlation between cytoskeletal proteins and HSPs modification and the ability of parasite to internalize into host cells

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-06-29T14:18:35Z No. of bitstreams: 1 Micheline Kezia Cordeiro de Araujo.pdf: 597014 bytes, checksum: cbc04cbe646fd01acabd409d39e9b8a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T14:18:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Micheline Kezia Cordeiro de Araujo.pdf: 597014 bytes, checksum: cbc04cbe646fd01acabd409d39e9b8a1 (MD5) Previous issue date: 2012-02-13 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Evidence of a circadian rhythm in the biosynthesis of microcystins (MC) in Microcystis panniformis Komarek et al. posed a question on how this toxin is released into the environment, since there were no cell lysis to explain the variations of intracellular microcystins. The aims of this study were the investigation of possible variations of intracellular and extracellular microcystins during cycles of 24 hours in M. aeruginosa (Kützing) Kützing, the influence of population density in the concentrations of intracellular and extracellular microcystins and if the release of microcystins in batch-like cultivation happens in an active way. The experiments were performed in triplicate, under controlled laboratory conditions in two independent 24h cycles, light:dark and light:light (12:12h) during the exponential growing phase. It was also analyzed a light:dark cycle during the stationary growing phase under the same conditions. Samples collected in 2 hours intervals were centrifuged and the concentrations of intracellular MC per cell-quota (MCI) and extracellular MC per equivalent cell-quota (MCE), using respectively, pellet and supernatant, were obtained using the ELISA method. The MCI exhibited an endogenous rhythm controlled by time in a period of 24 hours with similar patterns between light:dark and light:light cycles in exponential and stationary growing phases. The MCI in the stationary growing phase were higher than in the exponential growing phase, reaching approximately 4.7 times and 4.9 times higher in the 10 and 14 hours, respectively. The oscillations of MCE were similar in both light:dark cycles of exponential and stationary growing phases. Based on these findings, we came to the conclusion that the release of MCI to the extracellular medium is actively controlled by an endogenous rhythm. The population density is directly related to the MCI increasing, which could be related to a communication similar to “quorum sensing”. / A comprovação de um ritmo circadiano na biossíntese de microcistinas (MC) em Microcystis panniformis Komárek et al. levantou a suspeita quanto à forma de liberação desta toxina no meio circundante, visto que não foram observadas lises celulares que explicassem as variações de microcistinas intracelulares. Os objetivos deste estudo foram investigar as possíveis variações de microcistinas intra e extracelulares durante ciclos de 24 horas em M. aeruginosa, a influência da densidade populacional nas concentrações de microcistinas intra e extracelulares e, se a liberação de microcistinas em cultivos do tipo “batch” ocorre de maneira ativa. Os experimentos foram realizados em tréplicas, sob condições controladas de laboratório, em dois ciclos de 24h independentes: claro:escuro e claro:claro (12:12h) durante a fase exponencial de crescimento. Também foi analisado um ciclo claro:escuro durante a fase estacionária nas mesmas condições. Amostras coletadas a cada 2 horas foram centrifugadas e as concentrações de MC intracelulares por quota celular (MCI) e extracelulares por quota celular equivalente (MCE), utilizando respectivamente, “pellet” e sobrenadante foram obtidas através do método ELISA. As MCI exibiram um ritmo endógeno controlado em função do tempo em um período de 24 horas com padrões similares entre os ciclos claro:escuro e claro:claro nas fases exponencial e estacionária de crescimento. As MCI na fase estacionária foram mais elevadas que na exponencial, chegando cerca de 4,7 e 4,9 vezes maiores nos horários das 10 e 14 horas, respectivamente. As oscilações das MCE foram semelhantes nos ciclos claro:escuro de ambas as fases exponencial e estacionária. Baseado nos resultados encontrados, a liberação das MCI para o meio extracelular ocorre de forma ativa controlada por um ritmo endógeno. A densidade populacional está diretamente relacionada ao aumento das MCI que pode estar relacionada a uma comunicação semelhante a “quorum sensing”.

Orientador: Agrício Nubiato Crespo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:39:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_EduardoGeorgeBaptistade_D.pdf: 1487097 bytes, checksum: 8b21a6026c0fd35ff39cc175609d11d7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A correção de sulcos e cicatrizes de pregas vocais permanece como grande desafio à fonocirurgia. Substâncias que promovam a reestruturação da lâmina própria parecem ser a melhor opção. Esta pesquisa avaliou a influência do fator de crescimento de fibroblastos na integração tecidual de enxerto de fragmento de fáscia superficial na lâmina própria de prega vocal de coelhos associado à injeção de FGF, quanto às alterações histológicas induzidas como reação inflamatória aguda e crônica, fibrose desencadeada pelo procedimento e presença de neovascularização. Doze coelhos adultos foram submetidos ao enxerto de fragmento de 0,1 X 0,1 cm de fáscia cervical superficial na lâmina própria de ambas as pregas vocais. Na prega vocal direita foi injetado fator de crescimento de fibroblastos. Após um e doze meses, os animais foram sacrificados e suas pregas vocais submetidas a estudo histológico. O fator de crescimento de fibroblastos induziu resposta inflamatória em todos os animais após um mês do experimento inicial. Desencadeou fibrose além da causada pelo procedimento cirúrgico na prega vocal direita em todos os animais após 12 meses do experimento inicial. Fato que demonstra que o fator de crescimento de fibroblastos não representa uma boa opção terapêutica na correção das alterações da lâmina própria de pregas vocais quando associado ao enxerto de fáscia. / Abstract: The correction of sulcus and scars of vocal cords remains as a major challenge to fonosurgery. Substances which promote the restructuring the lamina propria seem to be the best option. This study evaluated the influence of fibroblasts growth factor in integration fragment of fascia grafted in the vocal fold lamina propria of rabbits associated with the injection FGF, regarding the histological alterations , acute and chronic inflammatory reaction, fibrosis, presence of neovascularization and the density of collagen. Twelve adult rabbits were submitted to grafting of fragment of 0.1 X 0.1 cm cervical fascia in the vocal fold lamina propria. Fibroblasts growth factor was injected in the right vocal fold. After a month and 12 months, the animals were sacrificed and their vocal folds submitted to histological study. The fibroblasts growth factor induced acute inflammatory response in all animals after one month of initial experiment. It induced fibrosis in addition to the caused by surgical procedure on the right vocal fold in all animals after 12 months of initial experiment. Fact which demonstrate that the fibroblasts growth factor with fascia grafting is not a good therapeutic option in correction of alterations of the vocal fold lamina propria. / Doutorado / Otorrinolaringologia / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling, Albetiza Lôbo de Araújo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T23:01:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barbosa-Souza_Valeria_M.pdf: 7722866 bytes, checksum: 7544e873dc1e9f79280e8045930c4c37 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os acidentes por serpentes venenosas podem causar alterações locais graves e de rápido desenvolvimento. O veneno de Bothrops lanceolatus (VBL) contém, dentre outras toxinas, metaloproteinases hemorrágicas e pouco hemorrágicas (SVMPI e SVMPIII) e atividade pró-trombina que causam inflamação (vias das ciclooxigenases-COX e lipoxigenases), alterações hemostáticas e degenerativas. O veneno de Bothrops lanceolatus (100 ?g/100 ?l) foi injetado no gastrocnêmio de ratos para investigar a patogênese da mionecrose (1,3,6,18 horas 1, 2 dias) e regeneração muscular (3,7,14 e 21 dias) ocasionada pelo envenenamento através de análise histológica quantitativa (medida do menor diâmetro 1 hora e 21 dias pós- VBL) e imunohistoquímica para a osteopontina (OPN), citocina inflamatória, quimiotática, com sítios de ligação para integrinas de matriz e células. A medida da expressão dos macrófagos residentes (CD68+) e dos macrófagos migrantes (CD163+), de myoD e miogenina, membros da família de fatores transcricionais miogênicos foi feita com o objetivo de correlacionar com a expressão da OPN nos diferentes estágios patológicos (n=6/período) ao longo do período experimental. Os grupos controles foram injetados com PBS (100 ?l). O envenenamento produziu hemorragia local, edema, infiltrado neutrofílico e macrofágico e desorganização das bainhas perimisiais de tecido conjuntivo, após 48 horas. As fibras mionecróticas apresentavam-se em número moderado. Aos 3 dias, havia focos de deposição de colágeno (tipo I) no meio dos quais se viam mioblastos. O número de macrófagos CD68+ atingiu o máximo às 24 horas, e manteve-se significativamente maior que nos grupos controles até aos sete dias. A expressão de OPN foi significativamente maior das 6 horas aos 3 dias e dos 7 aos 14 dias, sendo expressa em fibras musculares, macrófagos, mioblastos, miotubos e fibroblastos. Não foi obtida marcação para anti-myoD; a expressão de miogenina, que tipicamente é nuclear, foi observada também no citoplasma de mioblastos e miotubos até o 70 dia (pico), sendo sua expressão somente nuclear aos 14 dias. A retenção de miogenina no citoplasma tem sido interpretada como mecanismo de retardo na diferenciação, já que a presença no núcleo é necessária para o seu papel regulador transcricional. Aos 21 dias as fibras regeneradas, com núcleo central, não haviam atingido o tamanho das fibras maduras intactas (VBL) e dos controles. Considerando que as SVMPs e a enzima com atividade tipo trombina de VBL, podem aumentar a capacidade de ligação de sítios da OPN a integrinas de matriz e de superfícies de células, sugerimos que durante a patogênese da regeneração muscular post- VBL a OPN estaria criticamente envolvida no processo inflamatório agudo, e como tal atuaria primordialmente como citocina ativadora de células satélites quiescentes, seguida por atividade quimiotática e adesiva, favorecendo migração, proliferação de mioblastos e a diferenciação de miotubos. Segundo a literatura a OPN é profibrótica em certas doenças. Sugerimos que a fibrose intersticial observada, mais a presença tardia de macrófagos no local, mais a expressão citoplasmática da miogenina podem ter sido fatores relevantes que levaram ao atraso da regeneração das fibras musculares, como constatado pelo tamanho menor diâmetro das fibras. Sugere-se para a OPN um papel dual, isto é, tanto próregenerativo, como anti-regenerativo na patogênese das alterações causadas pelo veneno de B. lanceolatus / Abstract: Accident caused by venomous snakes can lead to local changes of serious and rapid development. Bothrops lanceolatus venom (BLV) contains, among other toxins, hemorrhagic metalloproteinases and non-hemorrhagic (SVMPI and SVMPIII) and prothrombin activity. As result, the venom causes hemostatic and inflammatory (via lipoxygenase and cyclooxygenase) and degenerative alterations. In this study, Bothrops lanceolatus venom (100 ?g/100?l) was injected into the gastrocnemius of rats to investigate the pathogenesis of myonecrosis (one, three, six, 18 hours and two days) and regeneration (three, seven, 14 and 21 days) by quantitative histological analysis (measurement of the small diameter one hour and 21 days post-BLV injection) and immunohistochemistry for osteopontin (OPN) protein, an inflammatory and chemotactic cytokines, with integrin binding sites to matrix proteins and cells. The number of macrophages CD68+ (resident macrophages), and CD163 (migrants macrophages), the expression of myoD and myogenin, members of the myogenic, both transcription factors family were correlated (n = 6/period). Control groups were injected with PBS (100?l). The envenomation produced local hemorrhage (initially massive), acute interstitial edema and myofibers, neutrophil and macrophage infiltration, and disruption of the perimysium sheath of connective tissue. These changes were observed up to 48 hours. The number of myonecrotic fibers was in moderate number. At 3 days, there were foci of collagen (type I) deposition surrounding groups of myoblasts. The number of macrophages (CD68 +) peaked at 24 hours, and remained significantly higher for seven days: there was no expression of CD163 macrophages. The OPN expression showed two steps, a significant increase in, from six hours to three days and seven to 14 days, and it was expressed in muscle fibers, macrophages, myoblasts, myotubes and fibroblasts. There was no MyoD imunolabeling. The myogenin expression, which is known to be typically nuclear, was also observed in the cytoplasm of myoblasts and myotubes until 7 days (peak). At 14 days, the myogenin expression became nuclear. The cytoplasmic retention of myogenin has been interpreted as a mechanism to delay myotube differentiation, since the presence in the nucleus is required for its transcriptional regulatory role. At 21 days, the regenerated fibers with central nucleus had not reached the size of intact fibers (VBL), nor that of controls. Whereas SVMPs and an enzyme with thrombin-like activity are known to increase the capacity of OPN binding to integrin of matrix and cell surfaces, we suggest that, during the pathogenesis of muscle regeneration post-VBL injection, OPN would be critically involved in an acute inflammatory process. OPN would act primarily as a cytokine activator of quiescent satellite cells and later play chemotactic and adhesive activities, promoting migration, proliferation of myoblasts, and formation and differentiation of myotubes. According to the literature, OPN is profibrotic in certain diseases. We suggest that the foci of interstitial fibrosis and the late presence of macrophages at the site of regeneration, as well as the cytoplasmic expression of myogenin may be relevant factors that lead to regeneration delay. It is suggested a pro-regenerative and anti-regenerative roles for OPN in the pathogenesis of alterations caused by B. lanceolatus venom / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

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Here we have evaluated the participation of angiotensina II (ANGII) receptors AT1 and AT2 in the CeA on water and sodium intake induced by sodium depletion. Wistar male rats (250-280g) were submitted to extracellular dehydration by subcutaneous injections of furosemide (10 mg/kg) and captopril (5mg/kg) (FURO+CAP). In rats treated with FURO+CAP, central microinjections (0,1 μl ) of either ANGII (48 pM), Compound 21 (AT2 receptor selective agonist - C21; 0.1 μM) or PD123319 (AT2 receptor antagonist, 40 mM) forty-five minutes after FURO+CAP treatment did not significantly change water intake (ANGII:3.3±1.2 vs. Control:2.5±0.9 ml/120 min; C21:4.7±1.3 vs. Control:4.6±0.9 ml/120 min; PD123319:6.1±1.7 vs. Control:6.2±1.3 ml/120 min). However, losartan (AT1 receptor antagonist, 217 mM) to potentiate water intake (losartan: 4.8±0.6 vs. Control:3.1±1.1 ml/120 min, p<0.05 between treatments). Sodium intake was not different following ANGII (48 pM), losartan (217 mM), C21 (0,1 μM) or PD123319 (40 mM) treatments. We also tested AT2 receptors activation or blockade in the CeA before the establishment of ANGII mechanisms caused by extracellular dehydration. Right after FURO+CAP treatment, we microinjected C21 or PD123319 and saw an impaired in sodium intake caused by selective activation of AT2 receptors (C21:3.5±0.9 vs Control:5.8±2.0 ml/120 min, p<0.05 between treatments) and a reduction on water intake after AT2 receptors blockade (PD123319:3.5±1.0 vs Control:5.6±1.5 ml/120 min, p<0.05 between treatments). Thus, our results suggest that the AT1 and AT2 receptor in CeA could be part of a integrate circuitry to regulate water and sodium intake caused by extracellular dehydration. / O sistema nervoso central (SNC) desempenha um papel importante na manutenção da regulação dos mecanismos homeostáticos que controlam a osmolaridade e o volume dos líquidos corporais. A amígdala é uma estrutura límbica do circuito cerebral envolvida no controle da ingestão de sódio e água. Sua estrutura é composta por diversos subnúcleos: o basal, o medial, o lateral e o central. A importância dos receptores de angiotensina no núcleo central da amígdala (CeA) na regulação da sede e do apetite de sódio é pouco conhecida. Neste trabalho, avaliamos a participação dos receptores de angiotensina II (ANGII) AT1 e AT2 no CeA na ingestão de água e sódio induzida pela depleção de sódio. Ratos Wistar (250-280g) foram submetidos à desidratação extracelular por injeções subcutâneas de furosemida (10 mg / kg) e captopril (5 mg / kg) (FURO + CAP). Em ratos tratados com FURO + CAP, as microinjeções centrais (0,1 μl)? de ANGII (48 pM), Composto 21 (agonista de receptores AT2 - C21; 0,1 μM) ou PD123319 (antagonista dos receptores AT2, 40 mM) quarenta e cinco minutos após o tratamento com FURO + CAP não alteraram significativamente a ingestão de água (ANGII: 3,3 ± 1,2 vs. Controle: 2,5 ± 0,9 ml / 120 min; C21: 4,7 ± 1,3 vs. Controle: 4,6 ± 0,9 ml / 120 min; PD123319: 6,1 ± 1,7 vs. Controle: 6,2 ± 1,3 ml / 120 min). No entanto, o losartan (antagonista de receptores AT1, 217 mM) potencializou a ingestão de água quando comparado com o controle (losartan: 4,8 ± 0,6 vs. Controle: 3,1 ± 1,1 ml / 120 min, p <0,05 entre os tratamentos). A ingestão de NaCl 0,3 M não foi diferente após os tratamentos com ANGII (48 pM), losartan (217 mM), C21 (0,1 μM) ou PD123319 (40 mM). Também testamos a ativação ou o bloqueio dos receptores AT2 no CeA antes que os mecanismos dependentes da ANGII causados pela desidratação estivessem estabelecidos. Logo após o tratamento com FURO + CAP, microinjetamos C21 ou PD123319 e vimos uma diminuição na ingestão de NaCl 0,3 M causada pela ativação seletiva de receptores AT2 (C21: 3,5 ± 0,9 vs Controle: 5,8 ± 2,0 ml / 120 min, p <0,05 entre tratamentos) e uma diminuição na ingestão de água após o bloqueio dos receptores AT2 (PD123319: 3,5 ± 1,0 vs. Controle: 5,6 ± 1,5 ml / 120 min, p <0,05 entre os tratamentos). Assim, nossos resultados sugerem que os receptores AT1 e AT2 no CeA fazem parte de um circuito integrador que regula a ingestão de água e sódio causados por desidratação extracelular.

Exon shuffling foi primeiramente proposto por Walter Gilbert em 1978 como um mecanismo em que exons de diferentes genes podem ser combinados, levando à formação de novos genes. O mecanismo de exon shuffling é favorecido por recombinações intrônicas e está correlacionado com a simetria de exons. Evidências deste mecanismo provém de análises de combinações de fases de introns, correlações entre bordas de exons e de domínios protéicos e da recorrência de domínios em diversas proteínas. Dessa forma, a evolução de proteínas formadas por exon shuffling pode ser inferida considerando a organização exon-intron dos genes, o padrão de combinações de fases de introns e a organização de domínios nas proteínas. Neste sentido, regiões protéicas que possivelmente foram originadas por eventos de exon shuffling foram identificadas através de análises em larga escala em diferentes espécies eucarióticas. A estratégia foi baseada no alinhamento entre todas as proteínas anotadas de uma determinada espécie e a verificação da presença de introns e suas respectivas fases em torno das regiões alinhadas. Nós verificamos que eventos de exon shuffling em eucariotos antigos, de origem anterior aos Metazoa, são predominantemente simétricos 0-0, enquanto nos metazoários a predominância é de unidades simétricas 1-1. Esses dados confirmam idéias anteriores de que a transição para a multicelularidade animal foi marcada pelo embaralhamento extensivo de exons e domínios 1-1. O metazoário basal Trichoplax adhaerens pode ser considerado um representante desta transição, evidenciada pelas freqüências balanceadas de regiões simétricas 0-0 e 1-1. O sinal de flanqueamento por introns em torno das bordas de domínios protéicos confirmou os resultados obtidos através dos alinhamentos, com a prevalência de domínios 0-0 em não metazoários e 1-1 em metazaoários. Um agrupamento hierárquico de domínios flanqueados por introns foi construído, permitindo identificar domínios ou grupos de domínios com evidência de expansões em períodos específicos, como nos vertebrados. Por fim, os genes envolvidos em eventos de exon shuffling foram analisados quanto ao enriquecimento em termos do Gene Ontology. Os resultados indicaram que este mecanismo contribuiu significativamente para a formação de genes relacionados com uma grande diversidade de termos, alguns dos quais envolvidos diretamente com características de metazoários e vertebrados, tais como matriz extracelular, adesão, coagulação sangüínea, processos do sistema imune e sistema nervoso / Exon shuffling was first proposed by Walter Gilbert in 1979 as a mechanism in which exons from different genes could be combined to lead the creation of new genes. The mechanism of exon shuffling is favored by intronic recombinations and it is correlated with symmetry of exons. Evidence of this mechanism come from analyses of intron phase combinations, correlations between the borders of exons and domains and domain recurrence in several proteins. Taking this into account, the evolution of proteins formed by exon shuffling can be inferred regarding the exonintron organization of the genes, the pattern of intron phase combinations and the protein domain organization. In this sense, protein regions that were probably arose by exon shuffling events were identified through a large scale analysis in several eukaryotic species. The strategy was based on alignments between all annotated proteins from a given species. Then, the aligned regions were verified in respect with intron phase combinations surrounding them. We have found that exon shuffling events in early eukaryotes are preferentially symmetric of phase 0, while in metazoans, the preference is for 1-1 symmetric units. These data confirms previous ideas that the transition to animal multicellularity was marked by extensive 1-1 exon shuffling. The basal metazoan Trichoplax adhaerens is a representative of this transition, evidenced by the balanced frequencies of 0-0 and 1-1 symmetric regions. The signal of intron flanking around the borders of protein domains corroborated previous analyses, showing that non metazoans have higher frequencies of 0-0 domains and metazoans have higher frequencies of 1-1 domains. A hierarchical clustering of domains flanked by introns was built, allowing us to identify domains or groups of domains with evidence of expansions during specific periods, such as in vertebrates. Finally, genes involved in exon shuffling events were analyzed regarding the Gene Ontology enriched terms. The results indicated that this mechanism significantly contributed to the creation of genes related with a large diversity of terms, some of them are directly involved with features of metazoans and vertebrates, such as extracellular matrix, cell adhesion, blood coagulation and immune and nervous system processes