Doctorado en Ciencias mención Microbiología. / Acidithiobacillus thiooxidans es una bacteria que obtiene energía metabólica y poder reductor a partir de la oxidación de compuestos reducidos de azufre. En estado natural, esta bacteria se encuentra junto con otros microorganismos participantes del consorcio de biolixiviación de sulfuros metálicos formando estructuras multicelulares llamadas biopelículas sobre la superficie de sulfuros minerales. Las células están embebidas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) las cuales se componen principalmente de exopolisacáridos, proteínas y lípidos. Se ha descrito que la solubilización de los minerales sulfurados metálicos está mediada por estos EPS. Sin embargo, la composición de los EPS y su rol exacto en la solubilización de sulfuros metálicos ha sido caracterizado solamente en la bacteria oxidadora de hierro y azufre Acidithiobacillus ferrooxidans, aunque las demás especies de Acidithiobacillus que son capaces de oxidar solamente compuestos reducidos del azufre son fundamentales en estos procesos de lixiviación. En base a estos antecedentes, nos propusimos caracterizar alguno de los EPS y los mecanismos moleculares involucrados en la formación de biopelículas en la especie modelo At. thiooxidans. En un trabajo previo, se identificó un gen putativo que codifica para una proteína de unión a c-di-GMP PelD, la cual está caracterizada en Pseudomonas aeruginosa formando parte de un complejo multiproteico de membrana involucrado en vii la biosíntesis del exopolisacárido Pel. Al analizar el contexto genético del gen pelD, se identificó un putativo operón con una estructura similar al operón canónico identificado en P. aeruginosa. El análisis comparativo entre los genomas disponibles de las bacterias acidófilas que están presentes en los entornos minerales ácidos reveló que este operón sólo está presente en los genomas de At. thiooxidans y At. caldus. Ante este resultado, este trabajo se enfocó en comprender cuál sería la importancia de este exopolisacárido en la formación de biopelículas de At. thiooxidans sobre la superficie de azufre elemental. La medición de los niveles de transcrito mediante qPCR mostró que los genes pelA, pelD y wcaG del putativo operón presentan un mayor de expresión en células adheridas que en células planctónicas. El análisis de azúcares de superficie mediante el uso de lectinas identificó la presencia de N-acetil-galactosamina y N-acetil-glucosamina. Tratando de dilucidar algunas de las señales que regulan la producción de Pel, se descubrió que la adición exógena de la molécula de Quorum Sensing (QS) 3-oxo-C8 AHL incrementa la transcripción de los genes pelA y pelD. Finalmente, se procedió a obtener una cepa mutante nula en el gen pelD mediante recombinación homóloga. Luego de analizar el DNA de esta cepa, se realizaron análisis de adherencia y formación de biopelículas sobre la superficie de azufre elemental mediante microscopía electrónica y de epifluorescencia. La mutación ΔpelD afectó la estructura de la biopelícula al reducir la presencia de N-acetil-galactosamina y N-acetilglucosamina en la superficie, pero adicionalmente provocó un incremento en la viii producción de estructuras filamentosas que rodean a las células. Para resolver la incógnita sobre la naturaleza de estas fibras, se realizaron análisis comparativos preliminares de la expresión de proteínas extracelulares. El análisis del sobrenadante de los cultivos y de las proteínas del EPS reveló un cambio en producción de proteínas secretadas al medio. En base a estos resultados es posible concluir que el exopolisacárido Pel producido por la bacteria biominera At. thiooxidans juega un rol estructural en la formación de biopelículas sobre la superficie de azufre elemental y que la regulación de su síntesis involucra a las vías del QS y del c-di-GMP. / Acidithiobacillus thiooxidans is a bacterium that obtains metabolic energy and reducing power from the oxidation of reduced sulfur compounds. In the natural state, this bacterium is found along with other microorganisms that are members of the metal sulfides bioleaching consortium forming multicellular structures called biofilms on the surface of mineral sulfides. The cells are embedded in a matrix of extracellular polymeric substances (EPS) which are composed mainly of exopolysaccharides, proteins and lipids. It has been described that the solubilization of the metal sulfide minerals is mediated by these EPS. However, the composition of the EPS and their exact role in the solubilization of metal sulfides has been characterized only in the iron and sulfur oxidizer bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans, although the other Acidithiobacillus species that are only capable of oxidizing reduced sulfur compounds are important in these leaching processes. Based on this background, we set out to characterize some of the EPS and the molecular mechanisms involved in biofilm formation in the model species At. thiooxidans. In a previous work it was identified a putative gene encoding a c-di-GMP binding PelD protein, which is characterized as part of a multiprotein membrane complex involved in Pel exopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. x When we were analyzing the genetic context of the pelD gene, a putative operon with a structure similar to the canonical operon identified in P. aeruginosa was identified. Comparative analysis between available genomes of acidophilic bacteria that are present in acidic mineral environments revealed that this operon is only present in the genomes of At. thiooxidans and At. caldus. Given this result, this work focused on understanding the importance of this exopolisaccharide in biofilm formation of At. thiooxidans on the surface of elemental sulfur. Measurement of transcript levels by qPCR showed that pelA, pelD and wcaG genes of the putative operon exhibit a greater expression in attached cells than in planktonic cells. The analysis of surface sugars by the use of lectins identified the presence of N-acetyl-galactosamine and N-acetyl-glucosamine. Trying to elucidate some of the signals that regulates the production of Pel, it was discovered that the exogenous addition of Quorum Sensing (QS) molecule of 3-oxo-C8 AHL increases the transcription of pelA and pelD genes. Finally, a pelD gene null mutant strain was obtained by homologous recombination. After analyzing the DNA of this strain, adherence and biofilm formation analysis were performed on the elemental sulfur surface by electronic and epifluorescence microscopy. The ΔpelD mutation affected the structure of the biofilm by reducing the presence of N-acetyl-galactosamine and N-acetyl glucosamine on the surface, but additionally caused an increase in the production of fibrillar structures xi surrounding the cells. To solve the unknown about the nature of these fibers, preliminary comparative analysis of extracelluar protein expression were performed. Analysis of the culture supernatant and proteins from EPS revealed a change in production of secreted proteins to the medium. Based on these results it is possible to conclude that the Pel exopolisaccharide produced by the biomining bacterium At. thiooxidans plays a structural role at biofilm formation on the surface of elemental sulfur and that the regulation of its synthesis involves QS and c-di-GMP pathways. / Proyectos regulares Fondecyt 1120295 y 1160702 y beca Conicyt 21120064 por aportar el financiamiento durante el desarrollo de la tesis.

This document refers to research whose main objective was to investigate the relationship among hydraulic, chemical and electrical signals in poor tomato plants ABA production. The document is organized into three chapters: The first chapter presents a detailed extracellular measurement protocol of electrical signals in plants and how to associate these measurements to determine gas exchange using the Infrared gas analyzer (IRGA) and turgor pressure using the patch clamp pressure probe (ZIM-probe). The second chapter refers to recording of the action potential generated spontaneously and evoked by electrical stimulation in ABA-deficient tomato, mutant sitiens. The final chapter presents the results for turgor pressure, gas exchange and electrical signals measurements in mutants notabilis and sitiens in the re-irrigated after a period of drought. The possible role of electrical signals in the plant signalling under stress conditions is discussed. The main conclusions related to chapters 1, 2 and 3 were: Measurement of extracellular electrical signals can be performed with gas exchange and turgor pressure measurements using IRGA ZIM-probe equipment; Electrical signals generated spontaneously in sitiens mutants propagate with amplitude and speed higher than in wild plants. Mutant is less responsive to electrical stimulation showing higher excitation threshold and longer refractory period than wild plants; The mutant plants are more responsive electrically to re-irrigation after drought than wild plants. The electrical signals precede changes in gas exchange in all genotypes, post irrigation. The ZIM-probe was not efficient to evaluate the turgor pressure in mutant plants under stress conditions, but is a promising tool for studies involving hydraulic and electrical signalling in wild plants. / O presente documento refere-se a pesquisa cujo principal objetivo foi investigar a relação entre sinais hidráulicos, químicos e elétricos em plantas de tomate deficientes da produção de ABA. O documento foi organizado em três capítulos: O primeiro capítulo apresenta um detalhado protocolo de medição extracelular de sinais elétricos em plantas e como associar estas medições a determinação de trocas gasosas usando o Analisador de gás por infravermelho (IRGA) e pressão de turgor usando a sonda de pressão (ZIM-probe). O segundo capítulo refere-se ao registro de potenciais de ação gerados espontaneamente e evocados por estímulo elétrico em tomateiro deficiente na produção de ABA, mutante sitiens. O último capítulo apresenta os resultados referentes a medições de pressão de turgor, trocas gasosas e sinais elétricos nos mutantes notabilis e sitiens, deficientes na produção de ABA reirrigadas após um período de déficit hídrico. O possível papel dos sinais elétricos na sinalização em plantas em condições de estresse é discutido. As principais conclusões referentes aos capítulos 1, 2 e 3 foram, respectivamente: As plantas mutantes são mais responsivas eletricamente a re-irrigação, após déficit hídrico com que as plantas selvagens. Medições extracelulares de sinais elétricos podem ser realizadas com medidas de trocas gasosas e pressão de turgor utilizando os equipamentos IRGA e ZIM-probe; Sinais elétricos gerados espontaneamente nos mutantes sitiens se propagam com amplitude e velocidade maiores do que nas plantas selvagens. sitiens é menos responsivo a estímulo elétrico do que plantas selvagens apresentando maior limiar de excitação e período refratário; Os sinais elétricos precedem as alterações nas trocas gasosas pós irrigação em todos os genótipos estudados. A sonda ZIM-probe não se mostrou eficiente para avaliar a pressão de turgor em plantas mutantes sob condições de estresse, mas para as plantas selvagens é uma ferramenta promissora para estudos envolvendo sinalização hidráulica e elétrica.

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Resultados experimentais demonstraram que a patogênese pode estar relacionada com a capacidade destas bactérias em aderir a proteínas da matriz extracelular, escapar da resposta imune do hospedeiro e de produzir toxinas. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas por Leptospira interrogans sorovar Pomona estirpe Fromm kennewicki (patogênica) e Leptospira biflexa sorovar Patoc estirpe Patoc I (saprófita), através de análise proteômica. As leptospiras foram cultivadas em meio EMJH suplementado com soro de coelho ou albumina bovina. Os sobrenadantes foram filtrados, dialisados e liofilizados para aplicação das tecnologias de análise proteômica utilizando gel bidimensional e análise em solução. A análise dos peptídeos obtidos, nos dois procedimentos, foi realizada utilizando-se LC/MS/MS. Foi possível a identificação de 159 proteínas diferentes nas amostras de L.interrogans, entre as quais 64 foram positivas em pelo menos uma das ferramentas usadas para a predição. Em L. biflexa, 104 proteínas diferentes foram identificadas, entre elas 43 proteínas foram positivas pela análise in silico. Entre as proteínas identificadas, estão aquelas que possuem peptídeo sinal sec ou tat dependentes. Em outras, a predição da localização celular é desconhecida ou podem ter múltiplos sítios de localização, e ainda, proteínas que não possuem peptídeo sinal e que podem ser secretadas por mecanismos não convencionais. Muitos destas são proteínas hipotéticas sem domínios conservados detectados. No que diz respeito à atividade proteolítica, foi identificada a presença de metaloproteases no secretoma de L.interrogans. Não houve detecção da presença significativa de proteases bacterianas em amostras de L. biflexa. A identificação e a caracterização funcional de proteínas secretadas poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos patogênicos e no desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento e prevenção de leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of worldwide distribution caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. The mechanisms by which leptospires invade the host and cause the disease are not yet fully understood. Experimental results have shown that the pathogenesis may be related to the ability of these bacteria to bind to extracellular matrix proteins, to escape hosts immune responses and to produce toxins. This work aimed to identify secreted proteins by Leptospira interrogans serovar Pomona strain Fromm kennewicki (pathogenic) and Leptospira biflexa serovar strain Patoc Patoc I (saprophyte) through proteomic analysis. The leptospires were grown in EMJH supplemented with rabbit serum or BSA. Supernatants were filtered, dialyzed and lyophilized to proteomic technology, two-dimensional gel and non-gel. The analysis of the obtained peptides in two procedures was performed using LC/MS/LC. It was possible to identify 159 different proteins in the samples of L.interrogans; among them, 64 were positive proteins in at least one of the tools used for prediction. In L. biflexa, 104 different proteins were identified; among them, 43 positive proteins were positive by in silico analysis. Among the identified proteins are those that possess sec or tat dependent signal peptide. In others, the prediction of the cellular location is unknown or may have multiple sites of localization, and even proteins which have no signal peptide can be secreted by unconventional mechanisms. Many of these are hypothetical proteins with no detected putative conserved domains. The presence of metalloproteases has been identified in the L.interrogans´ secretome, using proteolytic assay. There was no significant detection of the presence of bacterial proteases in samples of L. biflexa. The identification and functional characterization of secreted proteins may contribute to the elucidation of pathogenic mechanisms and in the developing of new strategies for the treatment and prevention of leptospirosis.

Uma propriedade fundamental dos seres vivos é a condução de sinais elétricos através de seus tecidos. Mas esse fato pouco é lembrado quando se trata de organismos vegetais. Outro item fundamental é a geração de sinais que possam transmitir informações entre os tecidos e órgãos para um ajuste fino do metabolismo. Nas plantas esses sinais podem ser de natureza química, hidráulica e elétrica. Nesse último caso são conhecidos potenciais de ação (PA), de variação (PV), de ferimentos (WP) e sistêmicos (SP), cada um com sua particularidade quanto à amplitude, velocidade e rotas de propagação, bem como seu papel no metabolismo. Os sinais elétricos podem afetar a respiração, fotossíntese, absorção de água, ativação de genes e fechamento de folhas de plantas insetívoras. PAs podem se propagar com velocidade relativamente constante e sem decréscimo. Eles seguem a lei do tudo-ou-nada, ou seja, todo estímulo que desencadeia um PA deve atingir um limiar de excitação para desencadear o sinal. Assim que o limiar é atingido o sinal se autoperpetua ao passo que estímulos supra limiares desencadeiam PAs de amplitude constante. A via de propagação do PA é o vaso do floema. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a sinalização elétrica em resposta à irrigação em plantas de girassol sob déficit hídrico e caracterizar esse sinal quanto à amplitude, duração, velocidade e direção de propagação. Para tanto 37 plantas foram avaliadas por meio de eletrodos extracelulares. Elas foram monitoras eletrofisiologicamente durante um período em que eram irrigadas e em um período sob déficit hídrico. Desse montante, onze responderam à irrigação pela geração de potenciais de ação (PA), ou seja, 30% delas. Oito delas geraram PAs em direção ao ápice (propagação acrópeta) enquanto duas geraram na direção basípeta. Uma delas gerou nos dois sentidos. O PA foi gerado também pós-irrigação mesmo com a planta não tendo passado por déficit hídrico, porém só aconteceu em uma das onze plantas. Os sinais se propagaram no caule, pecíolo e nervura central das folhas. O potencial de ação é gerado após irrigação em plantas de girassol com maior frequência quando elas passam por período de déficit hídrico e se propagam por toda a planta. Isso evidencia o papel do PA na sinalização de longa distância nos vegetais. / A fundamental property in the leaving beings is the conduction of electrical signals through their tissues. However, this fact is not always remembered when it comes to plant organisms. Another key process is the generation of signals that can transmit information among tissues and organs to a fine-tuning of the metabolism. In plants, these signals can be chemical, hydraulic and electrical. Concerning the last one, action potentials (AP), variation potentials (VP), wound potentials (WP) and system potentials (SP) are known; each one with its particularity regarding amplitude, velocity and propagation routes as well as its role in metabolism. The electrical signals may affect respiration, photosynthesis, water uptake, activation of genes and leaf closure in insectivorous plants. APs can spread with relatively constant speed and no decrement. They follow the all-or-nothing law, in another words, every stimulus that triggers an AP must reach a threshold to trigger the signal. Once the threshold is reached, the signal is self-perpetuating while stimuli above threshold trigger APs with constant amplitude. The propagation path of the AP is the phloem vessel. The aim of this work was to evaluate the electrical signaling in response to irrigation in sunflower plants under water deficit and characterize the AP regarding its amplitude, duration, velocity and propagation direction. Thirty seven plants were analyzed using extracellular electrodes. They were electrophysiologically monitored during a period when irrigated and in a period under drought. Eleven plants generated AP after irrigation, i.e. 30%. Eight of them generated AP that propagated acropetally while two generated in basipetal direction. One generated in both directions. The action potential was also generated in a plant that was not under drought stress, however it just happened in one of the eleven plants. The signals propagated in the stem, petiole and midrib of the leaves. The action potential is generated after irrigation in sunflower plants more frequently when they go through a period of water deficit and propagate throughout the plant. This highlights the role of AP in long-distance signaling in plants.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissPICO.pdf: 1390229 bytes, checksum: 6dfd0bd8898ab8895eb69028201e2edf (MD5) Previous issue date: 2005-05-18 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work presents original data about aggregate formation by two diatoms, Aulacoseira granulata and Thalassiosira cf. duostra, isolated from Barra Bonita reservoir (Tietê river/ SP). Experiments were performed using a Couette floculator, a machine that promotes laminar fluid shear rates (G, s-1), in which particles in movement with several velocities will shock. Depending on their stickiness, the particles may or may not form aggregates. It was determined that different fluid shear rates can affect distinctly aggregate formation by the two algal species. At shear rates of 10 s-1, T. cf. duostra formed aggregates more intensively than A. granulata. However, aggregate formation by A. granulata was greater at a lower shear rate (3 s-1). The role of exopolysaccharides (EPS) produced by these species in aggregate formation by their cells/chains was also studied. The results showed that these compounds enhanced aggregation by both species. The addition of A. granulata EPS in Barra Bonita water, leaded to the formation of aggregates with larger relative surfaces (µm2) when compared to aggregates formed in Barra Bonita water in the absence of these compounds. This effect could be related to the hydrofobic characteristics of A. granulata EPS, which is composed of large amounts of terminal deoxy-sugars (fucose and rhamnose). When A. granulata chains were added to Barra Bonita water, the formed aggregates presented also larger relative surfaces. This increment leads to greater sinking rates and can promote important consequences for the cycling of matter in Barra Bonita reservoir. / Foi realizado o estudo inédito no país sobre a formação de agregados por duas espécies de diatomáceas isoladas do Reservatório de Barra Bonita (Rio Tietê/ SP), Aulacoseira granulata e Thalassiosira cf. duostra. Para tanto, utilizou-se um floculador Couette, aparelho constituído por dois cilindros que, quando em rotação, promovem a formação de um gradiente de cisalhamento em que partículas movendo-se com diferentes velocidades de deslocamento irão chocar-se. Tais partículas poderão permanecer aderidas ou não, dependendo de sua adesividade (stickiness). Foram determinados o coeficiente de decaimento do número de partículas em suspensão (part · mL-1) e o número de partículas agregadas ao final do experimento. Determinou-se que diferentes taxas de cisalhamento (G, s-1) afetam distintamente a formação de agregados em espécies diferentes de algas. T. cf. duostra apresentou maior agregação quando submetida a G= 10 s-1, apresentando coeficiente de decaimento e número de partículas agregadas aproximadamente 1,5 vez maiores que a G= 3 s-1. A. granulata agregou aproximadamente 1,5 vez mais partículas quando submetida a G= 3 s-1 do que a G= 10 s-1. Os exopolissacarídeos (EPS) produzidos por T. cf. duostra aumentaram mais de duas vezes o número de partículas agregadas no final da fase exponencial de crescimento em relação ao mesmo processo na ausência desses compostos. O EPS produzido por A. granulata aumentou em mais de uma vez a agregação no final da fase exponencial e no início da fase estacionária A adição de EPS produzido por A. granulata à água do Reservatório de Barra Bonita aumentou área relativa dos agregados em relação aos agregados formados sem a adição desses compostos, o que pode estar relacionado ao caráter hidrofóbico desse EPS. A adição das células dessa diatomácea à água do Reservatório também aumentou a área dos agregados formados. O aumento da área dos agregados provoca aumento das taxas de afundamento dessas partículas e representa importantes implicações na ciclagem de matéria no Reservatório de Barra Bonita.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Se purifica y caracteriza proteasas extracelulares de una cepa de Pseudomonas sp. aislada de muestras de suelos de los aguajales de Tambopata en Madre de Dios. Las proteasas son purificadas mediante cromatografía de intercambio aniónico en un sistema FPLC, utilizando la columna CaptoTM Q, seguida por precipitación con sulfato de amonio al 70 %. Se purifican tres proteasas extracelulares denominadas EI, EII y EIII; siendo EI la que presenta mayor porcentaje de recuperación y factor de purificación de 80,1 % y 5,7. Los pesos moleculares de EI, EII y EIII son de 35, 40 y 55 kDa respectivamente. Las enzimas EI y EIII son clasificadas como serínmetaloproteasas, en tanto EII como metaloproteasa. El pH óptimo de EI y EII es 8, mientras que de EIII es 11. La temperatura óptima de las tres enzimas fue 60 °C. Las proteasas EI y EII incrementan su actividad en presencia de Mn+2, sin embargo, estas fueron inhibidas por Zn+2. En tanto, la proteasa EIII incrementa su actividad en presencia de Mg+2, Ca+2 y Zn+2. Según las características bioquímicas de las tres proteasas extracelulares purificadas de Pseudomonas sp. se puede indicar que son alcalinas y termoestables, principalmente la enzima EIII, por lo cual presentan gran potencial biotecnológico para su aplicación en diversos bioprocesos. / Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Perú). Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt) / Tesis

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-11-03T03:09:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336035.pdf: 1749129 bytes, checksum: 652600fc4a7cd061b80febeb468258e5 (MD5) Previous issue date: 2015 / A macieira é uma espécie frutícola de clima temperado de maior importância comercial, tanto no contexto internacional, quanto no nacional. No sul do Brasil e Uruguai, a cultura é severamente afetada por doenças típicas de clima tropical, entre elas merece destaque a mancha foliar de Glomerella (MFG) e a podridão amarga (PA), ambas causadas por espécies do gênero Colletotrichum. A MFG e a PA podem ocorrer simultaneamente nos pomares, porém possuem muitas diferenças no que se refere à capacidade de infecção. Dessa forma, o principal objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar isolados de Colletotrichum que afetam as folhas e os frutos de macieira no sul do Brasil e Uruguai e investigar os principais mecanismos bioquímicos envolvidos no processo de infecção em folhas. No estudo de diversidade, o sequenciamento de três regiões gênicas (ITS, GAPDH e TUB2) permitiu a identificação de três espécies causadoras de PA e MFG no Brasil, Colletotrichum fructicola, Colletotrichum karstii e Colletotrichum nymphaeae; e três espécies causadoras de PA no Uruguai, Colletotrichum fructicola, Colletotrichum theobromicola e Colletotrichum melonis. Além disso, a análise filogenética e multivariada agrupou os isolados em três diferentes complexos de espécies, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum boninense e Colletotrichum acutatum. No teste de patogenicidade em frutos, todos os isolados brasileiros provenientes de PA causaram podridão em frutos com ferimentos, mas apenas 5 em frutos sem ferimentos. No entanto, todos os isolados uruguaios causaram podridão em frutos com e sem ferimentos. Em folhas, todos os isolados brasileiros de MFG e 11 de PA foram capazes de causar mancha foliar, enquanto que somente um isolado uruguaio de PA possuiu essa capacidade. Na produção de enzimas extracelulares, o isolado de PA apresentou os maiores níveis de laccase e pectina liase em meio líquido comparado ao isolado de MFG. Em folhas de macieira, o isolado de MFG apresentou apressórios predominantemente sésseis, enquanto que os de PA foram pedicelados. O isolado de PA exibiu mais conídios com múltiplos apressórios melanizadosprovavelmente como um sinal das múltiplas tentativas de infecção. O acúmulo de H2O2 foi raramente observado nos sítios de infecção, e o escurecimento em algumas células epidérmicas não foi associado à reação de hipersensibilidade. Folhas inoculadas com o isolado de MFG aumentaram a perda de eletrólitos 48 h após a inoculação (HAI), o reflete a transição do fungo da fase biotrófica para a necrotrófica. Em relação à atividade das enzimas envolvidas com o estresse oxidativo, os dois isolados testados aumentaram a atividade das enzimas guaiacol peroxidase, catalase e glutationa redutase, porém de forma diferenciada ao longo do tempo. A atividade da ascorbato peroxidase apresentou um aumento 6 HAI com o isolado de MFG, enquanto que a atividade da superóxido dismutase não foi afetada. Plantas inoculadas com o isolado de MFG tiveram um menor acúmulo de H2O2 48 HAI, o que pode indicar a eficiência das enzimas antioxidantes na eliminação de espécies reativas de oxigênio e em evitar a morte celular. Os isolados de MFG parecem ter um mecanismo para suprimir as respostas de defesa da planta.<br> / Abstract : Apple is one of the most important fruit of temperate climate in the international and national context. In Southern Brazil and Uruguay, it is severely affected by tropical climate diseases, such as, glomerella leaf spot (GLS) and apple bitter rot (ABR), both caused by Colletotrichum spp. GLS and ABR can occur simultaneously in orchards, but have clear differences in tissue specialization. Thus, the main objective of this work was to identify and characterize Colletotrichum isolates that affects leaves and fruits in Southern Brazil and Uruguay and investigate biochemical mechanisms involved during the leaf infection process. In diversity studies, sequencing of three gene regions (ITS, GAPDH and TUB2) allowed the identification of three species causing ABR and GLS in Brazil, i.e., Colletotrichum fructicola, Colletotrichum karstii, and Colletotrichum nymphaeae; and three species causing ABR in Uruguay, i.e., Colletotrichum fructicola, Colletotrichum theobromicola, and Colletotrichum melonis. Furthermore, phylogenetic and multivariate analysis clustered the isolates into three different species complexes, C. gloeosporioides, C. boninense and C. acutatum. In pathogenicity test, Brazilian isolates caused ABR in wounded fruits, but only five in non-wounded ones. Uruguayan isolates produced symptoms in fruits with or without previous wounding. All Brazilian isolates from GLS and eleven from ABR were able to cause GLS symptoms, while a sole Uruguayan ABR-isolate caused leaf spot symptom. In culture, ABR-isolate exhibited higher levels of laccase and pectin lyase, but not polygalacturonase. On leaves, GLS-isolate formed appressoria mostly sessile, while ABR-isolate pedicellate. ABR-isolate germlings formed multiple melanized appressoria probably as a sign of unsuccessful infection attempts. H2O2 accumulation was rarely visualized at infection sites and was not associated with hypersensitive response. GLS-isolate markedly increased the electrolyte leakage at 48 hours after infection (HAI) reflecting its transition from the biotrophic into the necrotrophic phase. Both isolates influenced differently oxidative stress enzymes,increasing the activities of guaiacol peroxidase, catalase and glutathione reductase at different times, except for superoxide dismutase that remained unaltered. Ascorbate peroxidase activity was only affected with GLS-isolate at 6 HAI. GLS-isolate reduced H2O2 accumulation in leaves at 48 HAI, suggesting that antioxidative enzymes act more efficiently in scavenging reactive oxygen species and avoiding cell death. GLS-isolate seems, therefore, to have a mechanism to suppress plant defence responses.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27 / Em vista do crescimento de infecções fúngicas oportunisticas causadas por Fusarium spp. e da resistência do fungo aos antifúngicos frequentemente utilizados, o estudo visa avaliar o perfil de sensibilidade das associações entre terbinafina, itraconazol, cetoconazol e anfotericina B frente a 20 isolados clínicos e ambientais de Fusarium solani, e verificar fatores associados a virulência como pesquisa de melanina na parede celular e a produção das enzimas extracelulares proteinase, fosfolipase, lipase e DNAse. Anfotericina B associada à itraconazol demonstrou efeito sinérgico em 15% dos isolados, sendo 33% de origem ambiental e 65% de origem clínica. Efeitos sinérgicos foram obtidos contra 10% dos isolados na associação entre anfotericina B e cetoconazol e contra 5% na associação entre anfotericina B e terbinafina. Nossos resultados revelaram efeitos aditivos e indiferentes contra as cepas testadas nas associações entre terbinafina e derivados azólicos. Não foi detectada presença de melanina na parede de F. solani. As culturas de F. solani clínicas e ambientais apresentaram atividade enzimática de proteinase positiva após coloração com ácido acético e negro de amido, com formação de halos ao redor da colônia na proporção de 30% e 45% respectivamente. Atividades enzimáticas de lipase, fosfolipase e DNAse não foram detectadas, contudo, não é possível afirmar que F. solani não produza essas enzimas, considerando que as mesmas podem ser mantidas intracelularmente e não liberadas para o meio. / Despite of the increase of opportunistic fungal infections caused by Fusarium spp. and their resistance to antifungal drugs, the aims of this study were to evaluate susceptibility profiles of 20 clinical and environmental isolates of Fusarium solani against the associations among terbinafine, itraconazole, ketoconazole and amphotericin B, and to verify the presence of associated virulence factors as melanin and extracellular enzymes (proteinase, phospholipase, lipase and DNAse). Amphotericin B combined with itraconazole showed synergism against 15% of the isolates, 33% of these was from the environment and 65% from clinical cases. Synergistic effect was observed against 10% of strains tested by association between amphotericin B and ketoconazole and against 5% in association between anphotericin B and terbinafine. The associations between terbinafine and azole derivatives showed additive effect and no difference against the samples. Presence of melanin in the F. solani cell wall was not observed. Both, clinical and environmental isolates expressed enzymatic activity of proteinase in 30% and 45% of cases. Enzymatic activity of lipase, phospholipase and DNAse were not detected; however, it was not possible to state that F. solani do not produce these enzymes, as they could manteined intracellularly and would not released to the environment. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-17T21:38:06Z No. of bitstreams: 1 2018_LeidyJohanaNogueraGaviria.pdf: 1783345 bytes, checksum: 74ef4b3f16d49d4cf2407d7ceac193b3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-27T21:09:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_LeidyJohanaNogueraGaviria.pdf: 1783345 bytes, checksum: 74ef4b3f16d49d4cf2407d7ceac193b3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-27T21:09:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_LeidyJohanaNogueraGaviria.pdf: 1783345 bytes, checksum: 74ef4b3f16d49d4cf2407d7ceac193b3 (MD5) Previous issue date: 2018-08-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / A doença renal crônica (DRC) é considerada um dano renal que induz a perda progressiva da função dos rins, a qual não pode ser revertida. Os pacientes portadores de DRC necessitam da hemodiálise como terapia de substituição renal. A hemodiálise melhora a qualidade de vida do paciente, mas também tem consequências negativas, como o desencadeamento de um estado de inflamação crônica no paciente, que por sua vez se associa com um alto risco cardiovascular. Este trabalho teve como objetivo investigar se a hemodiálise em pacientes com doença renal crônica altera a população e a função de vesículas extracelulares (EVs) (exossomos e microvesículas). Amostras de sangue de 7 (sete) indivíduos portadores de DRC ativos em programa de hemodiálise foram coletadas. As amostras de soro obtidas a partir das amostras de sangue coletados antes e após a realização da hemodiálise foram utilizadas para realização de testes Proteína C Reativa - PCR LÁTEX e técnicas de purificação e caraterização de EVs. As EVs foram avaliadas quanto a quantidade e distribuição do tamanho pelo método de pulso resistivo (do inglês, Tunable Resistive Pulse Sensing). A estrutura das EVs foi avaliada por microscopia eletrônica. A detecção de proteínas marcadoras de exossomos por Western Blot foi utilizada para reforçar a presença de EVs. O potencial inflamatório das EVs foi testado pelo ensaio de ativação celular com células mononucleares de sangue periférico (CMSP) avaliado por citometria de fluxo. Os pacientes estudados apresentam um processo inflamatório avaliado pela PCR. As amostras coletadas após o procedimento de hemodiálise apresentaram aumento na contagem de EVS. Exceção feita a um paciente que interessantemente tinha o maior valor de PCR. Os resultados de proliferação celular induzidos por EVs não permitiu uma conclusão sobre o potencial anti ou pró inflamatório das EVs após a hemodiálise. A observação de que há um aumento na população de EVs após o procedimento de hemodiálise abre o caminho para que se possa investigar com maior detalhamento o papel destas EVs no risco para o desenvolvimento da doença cardio renal. / Chronic kidney disease (CKD) is a progressive and irreversible loss of function from the kidney. The CKD patients require hemodialysis as renal replacement therapy. Hemodialysis is mandatory to improve the quality of life of CKD patients. However, it also has negative consequences, such as the increased risk of cardiovascular disease, what is believed to be triggered by an inflammatory state in the hemodialysis patient. This study aimed to investigate whether CKD patients under hemodialysis show changes in the quantity and function of EVs (exosomes and microvesicles) prior and after the hemodialysis procedure. Seven blood samples from CKD patients under hemodialysis therapy were collected. Serum samples obtained from blood samples collected before and after the completion of hemodialysis were used for CRP (C Reative Protein) testing using the CRP latex technique. Tunable Resistive Pulse Sensing technique was used to evaluate EVs concentration and size distribution. Electron microscopy was used to investigate the EVs structure. Exosome-associated proteins were assayed using Western blotting. Flow cytometry was used to evaluate peripheral blood mononuclear cells (PBMC) proliferation under the presence of EVs purified prior or after the hemodialysis. CRP test showed that all patients are in an inflammatory state both prior and after the hemodialysis. Based on the data of the seven patients the EVs concentration showed to be increased after the hemodialysis procedure. Cell proliferation induced by EVs purified prior and after the hemodialysis did not allow a conclusion about the inflammatory potential of the EVS after hemodialysis. The observation that there is an increase in the population of EVs after the hemodialysis procedure opens the way so that we can investigate in more detail the role of these EVs in CKD patients under hemodialysis.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:28:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMJDO.pdf: 1550379 bytes, checksum: 5ca8c2ddbfc8ee491b380e078a951b9f (MD5) Previous issue date: 2006-03-13 / Universidade Federal de Minas Gerais / (Gelatinous aggregates (lake snow) from an eutrophic Brazilian reservoir and their relationships with abundant phytoplanktonic algae). Lake snow and phytoplankton studies were conduced in Barra Bonita Reservoir, in the Tietê River basin, southeastern Brazil. Monthly sampling from April 2002 to January 2004 and two intensive sampling (dry and wet periods) were performed in six depths (0m, 1m, 3m, 5m, 10m and 17m deep), at a sample station localized 3km upstream the reservoir dam. Among the sampled months the highest numbers of aggregates were registered in August 2002 (167 agg.L-1) and September 2002 (230 agg.L-1). The mean numbers of aggregates registered in the intensive samplings was 38 agg.L-1 in June 2003 and 68 agg.L-1 in December 2003. Seasonal occurrence of algal species aggregated to polysaccharidic matrices followed the dynamic of dominant species in the Reservoir. Aulacoseira granulata and free cells of Microcystis sp. were the most frequent taxa in the aggregates (70%) in the majority of samples. Other species, as Pseudanabaena mucicola, Microcystis aeruginosa, Planktothrix tropicalis, Cyclotella menegheniana, Cryptomonas sp, Actinastrum hantzschii, Quadrigula lacustris and Schroederia indica were registered in less frequency (10% to 15%). The monosaccharide composition of the gelatinous aggregated polysaccharides was the same registered in dissolved carbohydrates samples, reinforcing the importance of phytoplankton as the major source, chiefly of polysaccharides and of the gelatinous aggregates in the transport of these sugars through the water column. However, studies concerning gelatinous aggregates in freshwater are recent and more investigation are needed to confirm the patterns showed in our results. / (Estudo dos agregados gelatinosos (lake snow) no reservatório de Barra Bonita e sua relação com as algas fitoplanctônicas abundantes). O estudo dos agregados foi realizado em coletas mensais (abril de 2002 a janeiro de 2004) e intensivas (períodos seco e chuvoso), em seis profundidades na coluna d água (0m, 1m, 3m, 5m, 10m e 17m), em um ponto fixo do reservatório, localizado 3 km a montante da barragem. Nas coletas mensais, o maior número de agregados foi registrado nos meses de agosto/02 (167 agg.L-1) e setembro/02 (230 agg.L-1). Durante as coletas intensivas o número de agregados foi, em média, de 38 agg.L-1 em junho e de 68 agg.L-1 em dezembro. A ocorrência sazonal das espécies algais agregadas às matrizes polissacarídicas, acompanhou a dinâmica das espécies abundantes no reservatório. Aulacoseira granulata e células livres de Microcystis sp, foram os táxons mais freqüentes nos agregados (70%) na maioria das coletas. Outras espécies, como Pseudanabena mucicola, Microcystis aeruginosa, Planktothrix tropicalis, Cyclotella menegheniana, Cryptomonas sp, Actinastrum hantzschii, Quadrigula lacustris e Schroederia indica, foram registradas com menor freqüência (10% a 15%). A composição monossacarídica dos polissacarídeos dos agregados gelatinosos foi a mesma registrada nas amostras de carboidratos dissolvidos, reforçando a importância do fitoplâncton como principal fonte, principalmente de polissacarídeos e dos agregados gelatinosos no transporte destes açúcares através da coluna d água. Porém, os estudos envolvendo os agregados gelatinosos em água doce, são recentes e necessitam de maiores investigações.