La patogénesis de la fasciolosis depende de la carga parasitaria y del tamaño de los trematodos adultos. En zonas de hiperendemia, las intensidades individuales de parasitación humana pueden alcanzar niveles muy altos, estando la mayoría de los individuos parasitados en la fase de cronicidad avanzada. En este estudio se ha utilizado el modelo experimental de fasciolosis en rata Wistar por ser un modelo animal útil que mimetiza la fasciolosis crónica avanzada en humanos. Se ha infectado un total de 169 ratas con 20 metacercarias/rata vía oral, llevándose a cabo los siguientes análisis: A) Estudio la influencia de la intensidad individual de infección por rata (entendiendo la intensidad de infección como el número de trematodos por hospedador en el canal biliar principal) sobre: a) el desarrollo del adulto; b) el tiempo comprendido entre la ingestión de metacercarias y la presencia de huevos en heces (el periodo prepatente, pp) y c) el número de huevos por gramo de heces y por adulto (hgh/adulto). B) Estudio la influencia de la presencia de litiasis sobre el desarrollo del adulto. C) Estudio la influencia del género del hospedador definitivo experimental sobre la producción de huevos (hgh). Se ha calculado las trayectorias ontogenéticas de las siguientes medidas biométricas: área corporal (AC), perímetro corporal (P), anchura corporal (AnC) y longitud corporal (LoC). En los grupos analizados las trayectorias ontogenéticas de las medidas siguen un modelo logístico [y = ym / {1 + z0 exp (-kt)}, donde ym es el valor máximo al cual tiende la variable biométrica y; z0 y k = parámetros de las trayectorias; t= tiempo]. Los resultados obtenidos muestran que cuando el número de adultos aumenta, el valor de ym de estas medidas (AC, P, LoC y AnC) disminuye. El “crowding effect” se manifiesta cuando las medidas corporales del Trematodo adulto se aproximan a los valores máximos alcanzados en la fase de cronicidad avanzada. En las últimas fases de desarrollo, las tasas de crecimiento de las medidas corporales son más altas cuando menor es la carga parasitaria. El pp y los hgh/adulto se muestran dependientes del nivel de infección, disminuyendo cuando la carga parasitaria aumenta. Esto significa que el número de huevos por gramo de heces tiende a desestimar la carga parasitaria. En todas las medidas biométricas analizadas, los valores del tiempo en el punto de inflexión en el modelo logístico son similares a los datos empíricos sobre el pp, es decir, el momento donde empieza la emisión de huevos. Los resultados muestran que los adultos de F. hepatica alcanzan un menor desarrollo corporal cuando existe la presencia de litiasis concomitante en los conductos hepáticos. El estudio de la influencia del género del hospedador definitivo experimental revela que, en la fasciolosis crónica avanzada, en hembras Wistar (con una intensidad individual de infección de Trematodos adultos por rata similar a los machos) existe una mayor producción de hgh que en machos. Los resultados obtenidos muestran que la intensidad de infección, la litiasis y el género del hospedador definitivo son factores a tener en consideración cuando estudiamos el desarrollo de los adultos de F. hepatica en el modelo Wistar en la fase crónica avanzada. La consideración de estos factores es de interés tanto en estudios epidemiológicos, como en estudios experimentales in vivo sobre la acción de fármacos antihelmínticos y vacunas, patología, inmunología y resistencia. / Fascioliasis pathogenesis depends on fluke burden and size. In human hyperendemic zones, individual infection intensities can reach very high levels being the majority of infected subjects in the advanced chronic phase. Wistar rat model has been used due to the fact it offers a useful approach for pathological research in the advanced chronic period in humans. 169 rats have been orally infected with 20 metacercariae/rat, developing the following tests: (i) influence of infection intensity per rat on fluke development (adult’s development, time between metacarcariae intake and presence of eggs in faeces, and number of eggs per gramme of faeces and adult); (ii) influence of lytiasis on the adult’s development; and (iii) influence of the experimental definitive host genus on egg production. Ontogenetic trajectories of fluke body measurements (AC, P, AnC and LoC), followed a logistic model. Results showed that (i) when burden increases, maximum values of fluke body measurements decrease; (ii) crowding effect is apparent when fluke measurements approximate their maximums in the advanced chronic stage; (iii) pre-patent period (pp) and egg production (hgh) decrease when fluke burden increases, meaning that measurements of eggs per gramme of faeces tend to underestimate the fluke burden; (iv) adults of F. hepatica reach a lower body development when concomitant lytiasis is observed in liver ducts; (v) when fasciolasis chronic stage, egg production is higher in Wistar rat females. Thus, intensity of infection, lytiasis and definitive host genus are factors to take into consideraction when studying the development of the adults of F. hepatica in Wistar model on an advanced fasciolasis chronic stage. This quantification may be of great interest in both, epidemiological studies and experimental research on the in vivo actions of different anthelminthic drugs and vaccines, pathology, immunology and resistance studies.

En la presente Tesis Doctoral se investiga, desde un punto de vista teórico, procesos de transferencia de carga y/o energía inducida por la luz en distintos sistemas biológicos. En concreto se estudian tres procesos paradigmáticos: la transferencia de carga en la fotosíntesis, la fotofísica y fotorreactividad de las bases nitrogenadas del DNA y el proceso de fotoisomerización del cromóforo de la Rodopsina, desencadenante de la visión. La metodología empleada para la realización de estos estudios es principalmente la CASPT2//CASSCF, una herramienta químico-cuántica especialmente adecuada para el tratamiento de los estados moleculares excitados, debido a su carácter multiconfiguracional. / This Doctoral Thesis investigates, from a theoretical point of view, charge and energy transfer processes in biological systems that are induced by light. In particular, three paradigmatic processes are studied: the charge transfer in photosynthesis, photophysics and photoreactivity of DNA nucleobases and the photoisomerization of the chromophore of Rhodopsin, which is the first step in the vision process. These studies has been carried out by using CASPT2//CASSCF methodology, a quantum chemistry tool very useful for the study of excited molecular states due to their multiconfigurational character.

Los primeros receptores de hormona de crecimiento (GHR) descritos en peces se agruparon en dos grupos, las secuencias descritas en peces salmónidos y las descritas en peces no salmónidos. Las de peces no salmónidos presentaron una gran conservación estructural con las secuencias de mamíferos, pero las secuencias de peces salmónidos muestraron un bajo nivel de identidad aminoacídica con ausencia de un par de cisteínas extracelulares y un diferente patrón de tirosinas intracelulares. Llegados a este punto, se planteó la hipótesis de la existencia de dos formas alternativas para el gen GHR en el genoma de los peces: la forma de los peces no salmónidos (GHR-I) y la de los peces salmónidos (GHR-II). A la luz de esta hipótesis se plantearon los siguientes objetivos: 1) Abordar la caracterización molecular y organización genómica de los receptores de la hormona del crecimiento en peces teleósteos, 2) analizar la divergencia evolutiva de los receptores de la hormona del crecimiento en los peces teleósteos, 3) analizar en dorada el patrón de regulación transcripcional de los receptores de la hormona del crecimiento y 4) definir en dorada el uso de los receptores de la hormona del crecimiento como biomarcadores de crecimiento y estrés por confinamiento y exposición a patógeno. Para analizar la divergencia evolutiva, se diseñaron cebadores degenerados en base a las secuencias de los GHR descritos previamente en los peces salmónidos. Utilizando estos cebadores en una estrategia de RT-PCR, se determinó la existencia del GHR-II en dorada, trucha y lubina. Las nuevas secuencias de GHR-II presentaron las mismas características estructurales que las secuencias de salmónidos y se agruparon con ellas al realizar un análisis filogenético. De esta manera se definió lo que sería en grupo de secuencias de GHR-II de peces mientras que el resto de secuencias de peces corresponderían al GHR-I. La caracterización molecular de ambos GHR en dorada mostró la misma organización genómica que el GHR de mamíferos, con la salvedad de la falta de un exón homólogo al 3 de mamíferos y la presencia de un intrón adicional en el exón 10 del GHR-I. Además se determinó que ambos receptores presentaron un único sitio de inicio de la transcripción en contraposición a la situación de mamíferos: un único receptor con diferentes inicios de la transcripción. Esta diferente organización sugirió que el gen del GHR se ajusta al modelo de evolución por subfuncionalización. Para analizar su regulación transcripcional, se midió la expresión de ambos GHR junto con la de IGF-I e IGF-II bajo diferentes modelos experimentales en dorada. Los modelos estudiados fueron ayuno, estación, edad, infección por patógeno (Enteromyxum leei) y estrés por confinamiento. De estas experiencias se dedujo que la mayor de expresión de ambos GHR se dio en hígado y que los cambios en la concentración de IGF-I circulante reflejaron su expresión a nivel hepático. La expresión del GHR-I estuvo altamente correlacionada con la expresión de IGF-I e IGF-II en las experiencias de estación, edad e infección por patógeno tanto a nivel hepático como extrahepático. Sin embargo, en el modelo de estrés por confinamiento, la disminución de la expresión hepática de la IGF-I e IGF-II reflejó los cambios en la expresión del GHR-II. Esto estuvo en consonancia con los sitios de unión de factores de transcripción presentes en su región flanqueante. El modelo propuesto mostró una regulación diferencial de los GHR de dorada, aunque no se pudo excluir un cierto solapamiento funcional con independencia de que fueran promiscuos o específicos de la GH. / The first fish growth hormone receptor (GHR) sequences were grouped in two major groups: salmonid fish and non-salmonid fish. Sequences of non-salmonid fish showed a high structural conservation with those of mammals. On the other hand, sequences of salmonid fish showed a low level of aminoacid identity with the lack of two extracellular cysteines and a different intracellular tyrosine pattern. At that moment, the existence of two alternative copies of the GHR gene in fish genomes, GHR-I (non-salmonid form) and GHR-II (salmonid form), was hypothesised. Following that hypothesis, we formulated the following objectives: 1) Address the molecular characterization and genomic organization of GHRs in teleost fish, 2) analyse their evolutional divergence, 3) analyse their transcriptional regulation in gilthead sea bream and 4) define their use in gilthead sea bream as biomarkers of growth and stress. The presence of GHR-II was demonstrated for the first time in gilthead sea bream, European sea bass and rainbow trout. In addition, the genomic organization of both GHR was elucidated in gilthead sea bream. Fish GHR showed the same genomic organization than human GHR except for the lack of the exon 3 and the presence of a short intron within GHR-I exon 10. Moreover, fish GHRs only contained a transcription start site whereas tetrapods’ GHR has several sites. The transcriptional regulation of gilthead sea bream GHR-I, GHR-II, IGF-I and IGF-II was assessed in basis to fasting, season, age, stress and parasite challenge (Enteromixum leei). In basis to our results, the expression of GHR-I was higher in hepatic tissue. Moreover, changes in circulating IGF-I levels reflected the IGF-I hepatic expression. GHR-I expression was highly correlated with IGF expression in season, age and parasite challenge at hepatic and extrahepatic level. However, changes in IGF expression under stress were correlated to hepatic GHR-II expression. This fact agreed with the transcription factor binding sites found in the 5’flanquing region of GHR-II. In summary, coexpression analyses suggest a key role of GHR-I in the tissue-specific regulation of IGFs in gilthead sea bream. Some functional redundancy of GHR-I and GHR-II cannot be excluded, emerging GHR-II as a stress and redox-sensitive gene.

En los últimos años, la industria alimentaria ha incrementado su interés en el desarrollo de alimentos funcionales, siendo el enriquecimiento de bebidas a base de zumo de frutas con vitaminas y minerales uno de los métodos empleados. Esta estrategia persigue mejorar el estado nutricional de la población, o de grupos específicos de población y/o corregir posibles deficiencias en la ingesta diaria de vitaminas o minerales, debidas a cambios en los hábitos alimentarios. No obstante, se precisa un mayor conocimiento sobre las interacciones que puedan producirse entre los compuestos bioactivos de las bebidas a base de zumo de frutas y los minerales adicionados, o viceversa. Para ello, se estudia la influencia del almacenamiento en refrigeración (2-4 ºC) y digestión gastrointestinal simulada en las muestras objeto de estudio (bebidas a base de zumo de frutas (uva-naranja-melocotón) con o sin leche y/o minerales (Fe y Zn)) sobre la capacidad antioxidante total (métodos ORAC y TEAC), polifenoles solubles totales y contenido de ácido ascórbico. Se observa que las propiedades antioxidantes de las bebidas no disminuyen durante su período de vida útil (135 días) tras el almacenamiento en refrigeración así como después de un proceso de digestión gastrointestinal in vitro. Destacar que la presencia de hierro y/o cinc y/o leche, disminuye el contenido de polifenoles solubles totales, observando, sin embargo, un efecto positivo del cinc sobre los flavan-3-oles tras la digestión gastrointestinal. Asimismo, se evalúan los efectos biológicos, en cultivos celulares, de las fracciones bioaccesibles de las bebidas objeto de estudio a través de la actividad citoprotectora frente a estrés oxidativo inducido y mediante la actividad antiproliferativa en células tumorales de cáncer de colon (Caco-2 y HT-29). Las bebidas a base de zumo de frutas que contienen cinc y cinc-leche son aquellas con mayores efectos beneficiosos, ya que ejercen un efecto citoprotector manteniendo la integridad mitocondrial y metabólica de las células, inducen la enzima GSH-Rd, ejercen una respuesta adaptativa del ciclo celular y previenen de la apoptosis caspasa-dependiente. Además, inhiben la proliferación de las células de cáncer de colon a través de un efecto citostático, debido al bloqueo en la progresión del ciclo celular en la fase S, acompañado de un descenso en la expresión de las ciclinas B1 y D1. Por otra parte, se determina la influencia del consumo de las bebidas objeto de estudio sobre el estatus antioxidante de mujeres sanas en edad fértil. Tras el estudio de intervención, no se mejora de la capacidad antioxidante total sérica por el bajo estrés oxidativo endógeno y la ausencia de cambios drásticos en los hábitos alimentarios de la población de estudio, aunque se induce la actividad de la enzima superóxido dismutasa , la cual podría ejercer un efecto protector en forma de "tolerancia" frente a un daño oxidativo posterior. Finalmente, se determina la bioaccesibilidad de hierro y cinc tras el proceso de digestión gastrointestinal simulada, junto a la biodisponibilidad de hierro en células Caco-2 utilizando la síntesis de ferritina como criterio estimador de la misma. La interacción negativa del cinc sobre la bioaccesibilidad del hierro es contrarrestada en presencia de leche, posiblemente debido a los caseinofosfopéptidos formados durante el proceso de digestión, mientras que la síntesis de ferritina es 3 veces superior en las bebidas que contienen leche y hierro, poniendo de manifiesto que la presencia de caseinofosfopéptidos mejora la captación celular de hierro. / In last years food industry has focused its interest in the development of functional foods, being fortification of fruit beverages with vitamins and minerals one of the methods employed. However, more knowledge about interactions between bioactive compounds of fruit beverages and minerals is needed. To do this task, it was evaluated total antioxidant capacity (ORAC and TEAC methods), total soluble phenolic compounds and ascorbic acid content as influenced by cold storage (2-4 ºC) and an in vitro simulated gastrointestinal digestion in fruit beverages supplemented with/without iron and/or zinc and/or milk. Results showed that antioxidant properties did not diminish after cold storage and the digestion process. Likewise, biological effects such as cytoprotection against H2O2-induced oxidative stress and antiproliferative activity were determined using the bioaccesible fraction of fruit beverages upon cell cultures (Caco-2 and HT-29 cells). Fruit beverages with zinc and zinc-milk conferred the biggest effects against oxidative stress maintaining the functionality of cells and showing an antiproliferative activity due to a cytostatic mode of action. On the other hand, it was evaluated the impact of fruit beverage consumption upon antioxidant status in healthy woman of fertile age. After the intervention study, serum total antioxidant capacity was not improved but increase erythrocyte superoxide dismutase activity what could imply a protective effect in the form of “tolerance” to a subsequent larger challenge. Finally, iron and zinc bioaccessibility together with iron bioavailability determined by means ferritin synthesis in Caco-2 cells was assessed. The negative interaction of zinc on iron bioaccessibility was overcome in the presence of milk probably due to caseinophosphopeptides formed during the digestion process, while ferritin synthesis was 3-fold higher in fruit beverages with iron and milk, what implies that possibly caseinophosphopeptides could improve iron cellular uptake.

Tits (Paridae) are one of the most and better passerines known owing to they are broadly distributed, breeding in different habitats from gardens to forests, and they make use of nest boxes for breeding. Hence, such species are ideal for comparative studies on a large geographical scale. Despite the great amount of information concerned to tits, we still do not really understand life-history strategies of birds living under most ecological conditions. The present thesis is focused on achieving a better understanding of how birds are adapted to their environment. In particular, to examine the existence and the consequences of food limitation in Mediterranean evergreen habitats, through an adequate knowledge of the constraints affecting both feeding behaviour and breeding success. To achieve the main objectives proposed, studies were conducted in three Mediterranean ecosystems: pine and Holm Oak Quercux iles forests, and an orange grove. This was carried out mainly over Great Tits Parus major, and in certain cases over Crested Tits Lophophanes cristatus and Coal Tits Periparus ater. The specific aims pursued in this thesis are as follows: / Los Carboneros son aves insectívoras que pertenecen a la Familia Paridae. Las especies que engloba dicha familia están muy estudiadas, conociéndose bastante sobre su biología. Esto se debe a que están ampliamente distribuidas, reproduciéndose en diferentes tipos de hábitat. Por lo tanto, dichas especies son ideales para estudios comparativos a gran escala geográfica. A pesar de la gran cantidad de información existente, todavía se desconoce las estrategias de vida de las aves bajo determinadas condiciones ecológicas. La presente tesis pretende alcanzar un mejor entendimiento de cómo las aves están adaptadas a su ambiente. En concreto, se examinó la existencia y las consecuencias de la limitación de alimento en ambientes Mediterráneos perennifolios, sobre el comportamiento trófico y el éxito reproductor. El estudio se llevó a cabo en tres ecosistemas Mediterráneos: bosque de pino y Carrasca Quercus ilex, y en un naranjal. Se utilizó principalmente como especie modelo, el Carbonero Común Parus major, y en menor medida, el Herrerillo Capuchino Lophophanes cristatus y el Carbonero Garrapinos Periparus ater. En la presente tesis, se ha demostrado que las aves hicieron uso de la temperatura ambiental en tal de ajustarse a las variaciones de la fenología del alimento, haciendo uso de las características de la vegetación para reducir la detección por parte de los depredadores. Las aves también se las arreglaron en relación a factores ambientales e intrínsecos cuando alimentaban a sus pollos, disminuyendo o aumentando su esfuerzo. Han compensado demandas conflictivas, por ejemplo, entre la coloración y la predación del nido. Hembras coloridas evitaron la predación del nido eligiendo lugares camuflados. Además, se ha demostrado cómo se las arreglaron los Herrerillos Capuchinos que se reprodujeron en un ambiente poco usual para la especie (carrascar), mediante la elección de cajas nido rodeadas de pino. Finalmente, las tres especies de aves utilizadas coexisten dentro de un mismo hábitat alimentándose de presas de distinto tamaño, reproduciéndose en lugares con características de la estructura de la vegetación diferente, o a través de distintos tiempos de reproducción. Dado que los datos fueron obtenidos mediante el uso de cajas nido, algunos de los resultados obtenidos podrían no ser relevantes o comparativos en aquellos casos en los que se estudie las aves nidificando en agujeros naturales debido a las diferencias, por ejemplo, en la presión por predación.

El enorme desarrollo y las dimensiones que ha cobrado la Ciencia moderna exige la evaluación de los resultados de la actividad investigadora y de los actores que intervienen en este proceso, evaluación que resulta fundamental para los propios investigadores, organismos gestores de las políticas científicas, editores y organizaciones implicadas en la generación y difusión del conocimiento científico. La tesis doctoral analiza las investigaciones difundidas en las principales revistas biomédicas editadas en España a lo largo del período 2003-2007, integrando las aportaciones de la Bibliometría para caracterizar la productividad, colaboración e impacto de los trabajos; el aporte del Análisis de Redes Sociales para identificar los grupos de investigación; y las contribuciones de la Documentación para determinar los contenidos abordados en los documentos. Para la realización del estudio se han seleccionado las revistas biomédicas editadas en España que formaban parte de la cobertura del Journal Citation Reports entre 2003-2007, recogiendo la información bibliográfica y de contenido de los trabajos publicados en las mismas a partir de las bases de datos Science Citation Index-Expanded y Medline. Se ha efectuado un exhaustivo proceso de normalización para unificar las variantes en la presentación de los nombres de un mismo autor y homogeneizar las afiliaciones institucionales como paso previo a la obtención de los indicadores y su análisis e interpretación. Se han analizado 12.335 trabajos, un 86,4% publicados en once revistas editadas en español y un 13,59% en cinco revistas editadas en inglés. El índice de firmas por trabajo o índice de colaboración de los artículos originales en el conjunto de revistas es de 5,22; mientras que el índice de transitoriedad del 71,47%. El conjunto de artículos analizados han recibido 25.102 citas, de las que 15.586 corresponden a artículos originales, con un 63,07% de artículos originales citados (febrero de 2009). Las revistas editadas en español se adscriben a disciplinas del área de la Medicina Clínica y son generalmente publicaciones oficiales de sociedades médicas que constituyen un importante canal de comunicación científica para sus miembros. Estas revistas aglutinan el 86,35% de los grupos de investigación identificados, con un 85,8% de los trabajos firmados por centros asistenciales hospitalarios y un predominio de la colaboración nacional y regional. Las revistas editadas en inglés se adscriben al ámbito de las Ciencias de la Vida, presentan una productividad reducida y recogen fundamentalmente investigaciones básicas, con un 87,62% de trabajos realizados por centros universitarios, una destacada participación internacional (16-22% de las colaboraciones) y grado de citación. Se ha constatado que no existe una igualdad entre hombres y mujeres en cuanto a número de investigadores, ya que de los 6.845 autores de los que se ha identificado el sexo (>1 trabajo), el 66,91% son hombres y únicamente el 33,09% mujeres. La relación desfavorable a las mujeres se acentúa progresivamente en relación con la mayor productividad, ya que han pasado de ser un 40,16% las autoras que han firmado dos trabajos a únicamente un 11,17% las "grandes productoras" (autoras con >9 trabajos). La cuantificación de la frecuencia de asignación de descriptores a los documentos a partir de un instrumento de control terminológico como el Medical Subject Headings, ofrece una aproximación muy precisa a los contenidos abordados en los trabajos. Se han integrado en un mismo análisis los indicadores bibliométricos y los resultados derivados del análisis terminológico, tratando los grupos identificados mediante el Análisis de Redes Sociales como agregados y vinculando los mismos con los temas sobre los que han publicado, obteniendo resultados significativos para caracterizar con precisión los ámbitos de investigación de un número importante de grupos, así como las metodologías e instrumentos o técnicas de investigación que utilizan, su colaboración e impacto científico. / The evaluation of scientific research is an essential process for organisations responsible of developing scientific policies, scientists, editors and organizations connected to scientific knowledge diffusion process. The study analyzes the scientific production of Spanish Biomedical journals indexed in Journal Citation Reports database between 2003-2007, by means of a Bibliometric approach with the aim to characterise the productivity, collaboration and scientific impact. Alike, a Social Network Analysis to identify research groups and a quantitative analysis of the Medical Subject Headings terms (descriptors assigned to papers indexed in Medline) are performed to determinate main research areas. 12,335 papers have been analysed, 86.4% published in eleven Spanish language journals and 13.59% published in five English language journals. Collaboration index of articles was 5,22; the transience index of 71.47% and 63.07% of papers were cited (February 2009). The great majority of Spanish language journals belong to official publications of Spanish medical societies which disseminate research topics of interest for its members. A remarkable number of Spanish research groups have been identified in Spanish language journals, 85.8% of papers have been generated in Health Care institutions and domestic and regional collaboration prevails. On the other hand, English language journals are focused on basic research. They have a lower productivity, but a higher international participation and outstanding citation rates. 87.62% of papers have been published by academic scientists and international collaboration ranges between 16% and 22% of the collaborations. There is no gender equality, particularly when considering the most productive researchers. Gender of 6,845 authors (>1 paper) have been identified, 66.91% men and 33.09% women. It has been observed a women’s decrease while the productivity thresholds are increased, from 40.16% of women with two papers to 11.17% of women with more than nine papers. An approach to characterise the scientific activity of research groups identified by means of Social Network Analysis which combines bibliometric indicators and the descriptors of the Medical Subject Headings assigned to papers in Medline is described.

Trabajos clínicos y experimentales han demostrado que el etanol altera al sistema inmunitario. Aunque los mecanismos moleculares se desconocen, se ha demostrado que sus acciones sobre el sistema inmunitario son complejas y dependen de la dosis, el tiempo de exposición (agudo o crónico), tipo celular y presencia o ausencia de estímulos adicionales, como patógenos. Evidencias recientes indican el papel de los receptores tipo Toll (TLR) en la respuesta inmunitaria innata y, posiblemente, en la adquirida. De hecho, el tratamiento agudo de alcohol parece inhibir la respuesta inflamatoria y la liberacion de citocinas mediada por los receptores TLR en macrófagos. Por el contrario, el tratamiento crónico causa una activación de la vía NFκB, incrementando la expresión de citocinas, que a su vez, activan diferentes vías de señalizacion en hígado, hepatocitos y cerebro, que pueden conllevar a daño inflamatorio. Estos resultados sugieren que el etanol podría activar las vías de señalización asociadas a los receptores IL-1RI/TLR4. En el presente trabajo se han estudiado las posibles interaciones del etanol con los receptores TLR y se han evaluado los mecanismos por los que el etanol puede modular las respuestas de estos receptores, tomando como variables: diferentes dosis de etanol, tipos celulares y presencia o ausencia de ligandos. Para estos objetivos hemos utilizado las celulas RAW 264.7 (línea celular de macrófagos de ratón), macrófagos peritoneales y células microgliales en cultivo primario (principales células inmunes del sistema nervioso central). Los resultados obtenidos demuestran: 1) El etanol, a dosis moderadas, activa la respuesta innata inmunitaria tanto in vivo como in vitro, en macrófagos y en microglía, induciendo la cascada de señalización asociada al receptor TLR4 e incrementando la liberación de mediadores inflamatorios. En ratones deficientes en el TLR4-/- no se observa la inducción por el etanol de citocinas y mediadores inflatorios. 2) Los efectos del etanol sobre la activación de los macrófagos dependen de la dosis suministrada: concentraciones moderadas (50 mM), activan la respuesta de los TLR4 y su cascada de señalización, mientras que altas dosis (100 ó 200 mM) inhiben esta respuesta. 3) El etanol inhibe la respuesta de los TLR4 inducida por su ligando LPS. Refrente al mecanismo de la activacion del TLR4 por el etanol, demostramos que el etanol, a través de sus interacciones con los lípidos de membrana, induce un reclutamiento de este receptor y de las moléculas asociadas a su señalización hacia los microdominios de membrana “lipid rafts”. Sugerimos que a través de sus interaciones con estos microdominios podría interacionar con otros receptores de membrana, como el TLR2. Además, demostramos que tratamientos agudos de etanol modulan la inmunidad adaptativa produciendo un aumento de la expresión de moléculas que interviene en la presentación antigénica (MHC-I y MHC-II) y su reclutamiento hacia lipid rafts. Por el contrario, el consumo crónico de etanol inhibe la expresión de estas moléculas, lo que podría causar supresión de la respuesta a patógenos, tal y como se observa en pacientes alcohólicos. Globalmente, nuestros resultados no sólo proporcionan la primera evidencia del papel crítico de la respuesta del TLR4 en la activación inducida por el etanol en células fagocitarias, sino también una nueva comprensión de los mecanismos básicos que participan en el daño inducido por etanol a nivel sistémico y en procesos neuroinflamatorios. / Clinical and experimental research have shown that ethanol alters the immune system, although the molecular mechanisms are unknown. Recent evidence indicates the role of Toll-like receptors (TLRs) in immune responses. In fact, alcohol treatment modulate the inflammatory response and cytokine release in macrophages suggesting the role of TLR4 in the ethanol-induced damage. We have studied the interactions of ethanol with TLRs and evaluated the mechanisms by which ethanol can modulate the responses of this receptor in RAW 264.7 cells, and primary culture of peritoneal macrophages and microglial cells. Our results show: 1) Moderate doses of ethanol activates the innate immune response both in vivo and in vitro, in macrophages and microglia, inducing a signalling pathway associated with TLR4 and increasing the release of inflammatory mediators. The inflammatory response induced by ethanol is completely abrogated in microglia of TLR4 deficient mice 2) The effects of ethanol on the activation of macrophages depend on the dose administered: low/moderate concentrations (10-50 mM) activates the response of TLR4 and its signalling pathways, whereas high doses (100 or 200 mM) inhibit TLR4 response. 3) Ethanol interferes and inhibits the response induced by the TLR4 ligand, LPS. An important finding of this study is the involvement of lipid rafts in the activation mechanism of the TLR4 by ethanol. We demonstrated that ethanol, through its interaction with membrane lipids induces a recruitment into the lipid rafts of this receptor, as well as signalling molecules. We suggest that ethanol, through interactions with these microdomains, might modulate other membrane receptors such as TLR2. Furthermore, we demonstrate that acute ethanol treatment modulate adaptive immunity leading to increased expression of molecules involved in antigen presentation (MHC-I and MHC-II) and their recruitment into lipid rafts. By contrast, chronic ethanol consumption inhibits the expression of these molecules, which might lead to the suppression of the immune response to pathogens, as observed in alcoholic patients. Overall, our results not only provide the first evidence of the critical role of TLR4 response in ethanol-induced activation in phagocytic cells, but also a new understanding of the basic mechanisms involved in ethanol-induced damage and causes neuroinflammatory processes.

The study of desiccation tolerance of lichens, and of their phycobionts in particular, has been mainly focused on the antioxidant system that protects the cell against photo-oxidative stress produced during dehydration and rehydration. However, desiccation tolerance cannot be achieved in lichen phycobionts with antioxidant activity alone. The main objective of the thesis was to expand the knowledge of the poorly understood desiccation tolerant mechanisms. The first chapter presents an introduction to the subject of the thesis, based on the available background information, and explains the rationale of the thesis. The aim of the chapter 2 was to establish the optimal growing conditions for the isolated phycobiont Trebouxia erici Ahmadjian (SAG 32.85 = UTEX 911) and to determine how these working procedures could modify the results of further experiments. We concluded that cellulose-acetate discs for agar cultures should be inoculated with 14-day-old liquid cultures, and growth under irradiance of 30 mol m-2 s-1 PAR at 20 ºC. Experiments should be carried out with 21day-old algal discs. The experiments carried out in third chapter were designed on one hand, to determine the grade of desiccation tolerance of the isolated lichen phycobiont T. erici, and on the other hand, we studied the response of some protective mechanisms. The results showed that both long desiccations and rapid drying produced greater membrane damage and lower recovery of metabolic and photosynthetic activity than after brief desiccations and slow drying, respectively. Photosynthesis was never recovered totally neither after rapid nor slow drying. Classical mechanisms involved in the protection of the cell against oxidative stress were present in hydrated algae although were not enhanced during dehydration/rehydration. Likewise, in T. erici, dehydrins were also constitutively expressed. However, a slow drying time was required for activating the conformational change in the photosystem II which protect against photoinhibition in desiccation state. In the fourth chapter we decided to carry out proteomic and genetic expression analyses of the changes associated with desiccation and rehydration in the isolated phycobiont Trebouxia erici, in order to find out other proteins that may be involved on desiccation tolerance mechanisms of phycobionts. Proteomic analysis showed that desiccation caused up-regulation of around 19 proteins and down-regulation of 43 proteins. Among the proteins up-regulated during drying were found: a putative cation transport protein; a protein with an F-box domain; a cell division cycle 48 protein; -tubulin protein; a 90 kDa Heat shock protein. We observed that five Hsp90 and two -tubulin genes were activated during dehydration and mRNA was accumulated until the cell was completely dried. In the fifth chapter we investigated the role of the NO in the biochemical interaction between lichen symbionts and whether the NO may increase the endurance of lichenized phycobionts under desiccation. Rehydration of the lichen R. farinacea caused the release of NO together with a high production of ROS. The amount of NO detected decreased significantly with the addition of c-PTIO. In the isolated phycobionts, scavenging of the self produced NO caused a decrease in the recovery of photosynthetic activity after dehydration, probably due to the higher levels of photo-oxidative stress. The aim of the work presented in the sixth chapter was to determine the effect of cell ageing in desiccation resistance of T. erici. Phycobiont capacity to recover photosynthesis activity after desiccation was inversely related with cell ageing, suggesting that desiccation tolerance is age-dependent. The results presented in this thesis demonstrate that desiccation tolerance of T. erici is achieved by a complex system of constitutive and induced mechanisms. Moreover, some factors such as drying rate, desiccation duration, lichenization and ageing may alter the recovery capacity of T. erici after desiccation. / El estudio de la tolerancia a la desecación de los líquenes, y de sus fotobiontes en particular, ha sido principalmente enfocado hacia los sistemas antioxidantes que protegen a la célula frente al estrés fotoxidativo. Sin embargo, la tolerancia a la desecación no puede ser alcanzada solamente con sistemas antioxidantes. Por esta razón, el objetivo principal de esta tesis fue profundizar en el conocimiento de los mecanismos de tolerancia a la desecación en fotobiontes liquénicos. El fotobionte liquénico Trebouxia erici Ahmadjian mostró ser tolerante a la desecación incluso cuando es cultivado separado de su compañero micobionte. Sin embargo, la resistencia a la desecación dependió de la velocidad de deshidratación, del tiempo de desecación y del envejecimiento del cultivo. Tasas de deshidratación altas, largos periodos de desecación y cultivos viejos redujeron la capacidad de recuperación. Esto es debido a que la tolerancia a la desecación del fotobionte se consigue por un lado mediante mecanismos de protección celular que son constitutivamente expresados como, enzimas antioxidantes, xantofilas o proteínas LEA, junto con la activación Mientras que por otro, existen mecanismos que se activan durante la deshidratación, como son de la síntesis de proteínas implicadas en el transporte, la protección de membranas y proteínas, el citoesqueleto, el ciclo celular y el marcaje y la degradación de proteínas. Aunque los fotobiontes liquénicas tienen sus propios mecanismos para resistir la desecación, en la relación simbióntica la tolerancia a la desecación podría ser aumentada por otros mecanismos. Nuestros estudios con el liquen Ramalina farinacea Ach. y fotobiontes aislados mostraron que el gas bioactivo oxido de nitrógeno (NO) es liberado principalmente por el hongo durante la rehidratación del talo, el cual podría tener un papel importante en la maquinaria antioxidante del fotobionte durante las primeras fases de la rehidratación.

INTRODUCCIÓN: Considerando la participación de los canales de calcio voltaje dependientes y de las especies reactivas de oxígeno, en la fisiopatología del dolor neuropático, hemos establecido la siguiente hipótesis de trabajo. HIPÓTESIS: La administración de gabapentina y de sustancias antioxidantes de forma preventiva, a dosis bajas, tiene efecto analgésico si se realiza antes de provocar la lesión nerviosa, en un modelo experimental de dolor neuropático en ratas. OBJETIVOS: Valorar los efectos analgésicos de gabapentina (G, 100 mg/kg/día), superóxido dismutasa (SOD, 100 U/kg/día) y catalasa (C, 50.000 U/kg/día) vía intraperitoneal (i.p.), solas o combinadas, durante 3 días consecutivos, antes o después de una lesión de constricción crónica (LCC) del nervio ciático. Evaluar la hipersensibilidad mecánica y térmica, los posibles efectos secundarios de los tratamientos y los resultados histopatológicos de los nervios lesionados. MATERIAL Y MÉTODO: Realizamos un estudio prospectivo, randomizado, a doble ciego, utilizando 96 ratas Wistar con edades y peso similares. La neuropatía fue inducida por la LCC del nervio ciático izquierdo de los animales, anestesiados con ketamina 75 mg/kg más medetomidina 0,25 mg/kg i.p. Estos se distribuyeron en trece grupos: el grupo control no recibió ningún fármaco a pesar de la LCC, seis grupos recibieron fármacos tres días antes de la lesión (Ga, SODa, Ca, Ga+SODa, Ga+Ca, Ga+SODa+Ca) y otros seis (Gd, SODd, Cd, Gd+SODd, Gd+Cd, Gd+SODd+Cd) tres días después de la misma. La hipersensibilidad mecánica fue valorada con un Dynamic plantar aesthesiometer y la hipersensibilidad térmica con un Hot plate analgesia meter a 50 ºC, midiendo en gramos y en segundos respectivamente, el reflejo de retirada de cada pata trasera. Las mediciones se realizaron los días -3, -2, -1, 1, 2, 3, 7, 15 y 30, siendo cero el día de la lesión nerviosa. Para ver si los tratamientos producían sedación, utilizamos un sistema de puntuación propuesto por Devor y Zalkind. También observamos cambios de conducta, tróficos y cutáneos secundarios a la neuropatía. Al mes y tras las correspondientes valoraciones, tomamos muestras de los nervios ciáticos lesionados en todos los grupos. RESULTADOS: En la hipersensibilidad mecánica, la gabapentina antes de la lesión (Ga) tiene un efecto preventivo, y su combinación con SOD y catalasa, no potencia esta acción. Después de la lesión (Gd), no mejora respecto al grupo control. Además, SOD y catalasa, solas o en combinación con gabapentina, no muestran diferencias significativas respecto al control. El sexo influye en la respuesta mecánica, siendo los umbrales medios de los machos más altos, con diferencias significativas respecto a las hembras. En la hipersensibilidad térmica, Gd+SODd+Cd tiene los umbrales térmicos más altos, y a largo plazo, Gd+SODd+Cd y Ga+SODa+Ca, presentan diferencias significativas respecto al grupo control. No hay diferencias por sexo. Los grupos con gabapentina, tenían un efecto sedante a las 2 horas de su administración. Los resultados histopatológicos mostraron una degeneración axonal walleriana, más acentuada en el control y con menos lesiones en Ga. CONCLUSIONES: 1. Este modelo experimental ha sido útil y eficaz, para el estudio del dolor neuropático. 2. La gabapentina preventiva y de forma aislada, es eficaz en la hipersensibilidad mecánica, pero no en la térmica. Su asociación con SOD y catalasa, no potencia el efecto anterior. 3. SOD y catalasa, a las dosis administradas, no mejoran ni la hipersensibilidad mecánica, ni la térmica. 4. La asociación de gabapentina, SOD y catalasa, antes o después de la lesión, muestra eficacia significativa en la hiperalgesia térmica a largo plazo. 5. El sexo influye en la hipersensibilidad mecánica. 6. La gabapentina produce sedación, independientemente de su asociación o no a antioxidantes. 7. La degeneración axonal walleriana es la lesión histopatológica evidenciada en este modelo experimental. / Background: Recent studies suggest that reactive oxygen species and voltage-gated calcium channels are involved in the pathophysiology of neuropathic pain. We examined the hypothesis that systemic administration of low doses of gabapentin and antioxidants produce preemptive analgesia, using a chronic constriction injury (CCI) model of neuropathic pain. Objectives: We investigated the analgesic effects of gabapentin (G, 100 mg/kg/day), superoxide dismutase (SOD, 100 U/kg/day) and catalase (C, 50.000 U/kg/day) intraperitoneally (i.p.), alone or in combination for three consecutive days, before or after the CCI, using behavioral tests in response to mechanical and thermal stimuli; we also investigate side-effects of these treatments and histopathological injuries. Methods: Neuropathy was induced by CCI of left sciatic nerve, in 96 Wistar rats anaesthetized with ketamine and medetomidine (i.p.). The animals were divided into 13 groups: control (no treatment), six before the CCI (Ga, SODa, Ca, Ga+SODa, Ga+Ca, Ga+SODa+Ca) and six thereafter (Gd, SODd, Cd, Gd+SODd, Gd+Cd, Gd+SODd+Cd). The mechanical and thermal thresholds were assessed on days -3, -2, -1, 1, 2, 3, 7, 15 and 30 (zero was the day of injury). To see whether the treatments produced sedation we used a scoring system proposed by Devor and Zalkind. We observed secondary changes to neuropathy. After 30 days we sampled injured nerves. Results: For mechanical hypersensitivity, gabapentin before the injury (Ga) has preemptive analgesia and its combination with antioxidants does not increase its action. SOD and catalase, alone or in combination with gabapentin, have no significant differences from control. Mechanical thresholds of male rats were higher, with significant differences from females. For thermal hypersensitivity, Gd+SODd+Cd has the highest thresholds. Gd+SODd+Cd and Ga+SODa+Ca showed significant differences in long term. Sex does not affect the thermal hypersensitivity. Gabapentin, alone or in combination, produced sedation in two hours. The histopathology showed wallerian degeneration, more pronounced in the control and with fewer injuries in Ga. Conclusions: In our study, gabapentin has preemptive analgesia on mechanical hypersensitivity, however in the thermal hypersensitivity needs its combination with SOD and catalase to be effective. Antioxidants alone do not improve either the mechanical or the thermal hypersensitivity. Sex influences the mechanical response.

Objective: To identify genetic susceptibility variants for hypertension associated microalbuminuria. Methods: The study design was a nested case-control genetic association study. Three hundred and three patients were selected from one prospective cohort recruited in the hypertension clinic of two different hospitals with the objective of identify clinical factors associated with microalbuminuria. All the patients were less than 50y, hypertensive grade I and naïve regarding to the treatment at the time of the recruitment. Cases were those who developed microalbuminuria (UAE>=30 mg/day) during the follow up and controls were those who remained with an UAE less than 30 mg/day. UAE was assessed in 24 hour urinary and in two or three samples. The Nsp array of the Affymetrix Gene-Chip Human Mapping 500K was used for genotyping, BRLMM algorithm for inferring the genotypes and PLINK software for performing the association analysis after quality control procedures. Results: The final sample size compromised of 201 controls and 102 cases with genotypes for 250000 SNPs. A few polymorphisms and haplotypes resulted in an association with the presence of an increment in UAE expressed as a qualitative or as a quantitative trait. The significantly associated loci were 8p22 for UAE as a qualitative trait and 8q12.1, 2p11.2, 9p22.2 and 18q23 for the quantitative trait. Some possible candidate genes within the significantly associated loci are: MSR1 for the qualitative trait and IMPAD1, REEP1, BNC2, and CNDP1 for the quantitative trait. There was another group of SNPs which did not reach the statistical significance but they seemed to stand out from the rest of SNPs. Within those regions there were also some possible candidate genes such as ELMO, LOX1, NRP1 or PEBP1 among others. Conclusions: GWAS strategy has enabled the identification of some genomic areas with potential influence on UAE in hypertensive patients. We were able to replicate some of the previously reported linked or associated loci with renal damage. / Objetivo: Identificar variantes genéticas de susceptibilidad al desarrollo de microalbuminuria en la hipertensión arterial esencial Métodos: Se trata de un estudio de asociación genética tipo caso-control anidado. Trescientos tres pacientes fueron seleccionados en las unidades de hipertensión de dos hospitales dentro un estudio de cohortes encaminado al estudio de aquellos factores clínicos que influyen en el desarrollo de microalbuminuria. Los pacientes seleccionados eran menores de 50 años con niveles de presión arterial en rango normal-alto o hipertensión grado 1 al inicio del periodo de seguimiento. Los casos fueron aquellos pacientes que desarrollaron microalbuminuria (EUA >=30 mg/día) durante el seguimiento y los controles aquellos que permanecieron normoalbuminuricos (EUA menor de 30 mg/día). EUA se determinó en orina de 24 horas y en dos o tres muestras consecutivas. Como plataforma de genotipado se utilizó el array Nsp del Gene-Chip Human Mapping 500K de Affymetrix. El algoritmo BRLMM se utilizó para inferir los genotipos y el software PLINK para realizar el estudio de asociación una vez realizados todos los controles de calidad oportunos característicos de este tipo de estudios. Resultados: La muestra final incluyó 201 controles y 102 casos con genotipos para mas de 250000 SNPs. Unos pocos polimorfismos y haplotipos resultaron asociados con el incremento de los niveles de EUA expresados como variable cualitativa o cuantitativa. Los loci que presentaron asociación significativa fueron: 8p22 para la EUA expresada como variable cualitativa y 8q12.1, 2p11.2, 9p22.2 y 18q23 fpara la asociación con la variable cuantitativa. Algunos de los posibles genes candidatos en la zonas de asociación geneética fueron:: MSR1 para la variable qualitativa y IMPAD1, REEP1, BNC2, y CNDP1 para la EUA expresada de forma cuantitativa. Otro grupo de marcadores no alcanzó la significación estadística a nivel de genoma completo pero aparecieron claramente destacados del resto. Dentro de esas regiones algunos posibles genes candidatos fueron : ELMO, LOX1, NRP1 o PEBP1 entre otros. Conclusiones: La estrategia de estudio genómico completo ha permitido la identificación de regiones cromosómicas con influencia potencial sobre la EUA en hipertensos. Algunas de las regiones cromosómicas previamente asociadas en estudios de asociación o de ligamiento han podido ser replicadas.