Made available in DSpace on 2015-11-11T12:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_silva_ioc_dout_2014.pdf: 1893436 bytes, checksum: a728c60780229234c48d95aea41671ad (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fagócitos mononucleares são as células-alvo para micobactérias patogênicas que geralmente requerem um ambiente intracelular adequado para sua sobrevivência e replicação. Mycobacterium leprae, o agente etiológico da Hanseníase, é capaz de subverter mecanismos microbicidas de macrófagos e sobreviver e replicar no interior dessas células. Contudo o mecanismo molecular envolvido na modulação da célula hospedeira, não étotalmente compreendido. O presente estudo mostrou o potencial papel exercido pelo IGF-I na patogênese causada pelo M. leprae. Foi demonstrado que o M. leprae induz a expressão do fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-I), em macrófagos RAW 264.7. Curiosamente, apenas quando as células foram tratadas com anticorpo neutralizante para o receptor do tipo I de IGF-I (IGF-1R) o M. leprae foi capaz de regular positivamente a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) em macrófagos RAW 264.7 ou ativar o promotor de iNOS em células transfectadas com a construção contendo gene repórter da luciferase sob o controle do promotor de iNOS O bloqueio da sinalização de IGF-I reduziu a viabilidade intracelular do M. leprae determinada por qPCR. As células RAW 264.7 pré-tratadas com IGF-I apresentaram uma redução significativa da atividade do promotor iNOS em resposta ao Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis e consequentemente um aumento na viabilidade intracelular monitorada através de contagem de Unidades Formadoras de Colônia (CFU). Outro fato é que IGF-I foi capaz de atenuar a ativação de macrófagos mediada por IFN-\F067 medida através da expressão de iNOS e da quantificação da fosforilação de Ativador de transcrição e de transdução de sinal (pSTAT1). Além disso, o IGF-I foi capaz de induzir aumento de PGE2 em macrófagos, um eicosanoide previamente implicado na persistência micobacteriana no hospedeiro. Finalmente, a análise imuno-histoquímica de lesões cutâneas de pacientes lepromatosos (LL) revelou uma expressão abundante de IGF-I por macrófagos espumosos altamente infectados Além disso, uma alta expressão da proteína Supressora de sinalização de viii citocinas 3 (SOCS3) e diminuição a ativação STAT1 foi observada em lesões LL, em comparação com lesões tuberculóide BT. Esses resultados sugerem que o IGF-I pode contribuir para a persistência micobacteriana no hospedeiro, modulando negativamente s mecanismos microbicidas do hospedeiro durante a infecção / Mononuclear phagocytes are target ed cells for pathogenic mycobacteria that gener al ly require a favorable intracellular environment in wi c h they survive and replicate. Mycobacterium leprae, the etiologic agent of leprosy , is able to subvert macrophage microbicid al mechanisms and survive and replicate within these cells. However, the molecular mechanism involved in pathogen driven host cell modulation is not fully understood. The present study investigated the potenti al role of insulin - like growth factor - I (IGF - I) i n M. leprae pathogenesis. We showed that M. leprae induces IGF - I expression in RAW 264.7 macrophages in a dose - dependent manner . Notably, only when cells were treated with a neutr al izing antibody to IGF type 1 receptor (IGF - 1R) , M. leprae infection was able to upregulate inducible nitric oxide sintase ( iNOS ) expression in RAW cells or to activate the iNOS promoter in cells transfected with the iNOS - luciferase reporter construct . . The blockage of IGF - I sign al ing al so decreased the intracellular M. le prae viability as measured by qPCR . Mo reover, RAW cells p re - treated with IGF - I showed a significant reduction in iNOS promoter activity in response to Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium smegmatis with subsequent increase in bacteri al intracellular surviv al as accessed by colony - forming unit counts (CFU) . Of note, IGF - I was able to attenuate interferon gamma (IFN -  ) activating effects on macrophages as acessed by iNOS expression and quantification of phosphorylate d Sign al Transducers a nd Activators of Transcription 1 (p - STAT1). Addition al ly, IGF - I was able to induce PGE 2 secretion in murine macrophages, an eicosanoid previously implicated in mycobacteri al persistence in the host. Fin al ly, i mmunohistochemic al an al ysis of skin lesions of lepromatous leprosy (LL) patients reve al ed an abundant expression of IGF - I by highly infected foamy macrophages. Moreover, LL lesions reve al ed higher expression of Suppressor of cytokine sign al ing 3 (SOCS3), as well as decreased levels of p - STAT1 when compared to borderline tuberculoid (BT) lesions. Al together, our data suggest that IGF - I produced by macrophages in response to M. leprae infection constitutes a critic al regulator in subverting the immune response in leprosy

Made available in DSpace on 2016-03-01T13:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tatiana_silva_ioc_mest_2015.pdf: 3067653 bytes, checksum: 41c1cf15490ae626f7e3749c47bd19a5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As manifestações mais severas da doença de Chagas são a cardiomiopatia e fibrose cardíaca, mas o tecido muscular esquelético também é afetado pela infecção pelo T. cruzi, resultando em necrose e miosite. O acúmulo de matriz extracelular (MEC) durante o processo de fibrose está envolvido com a patogenia da doença de Chagas, mas seus mecanismos de regulação durante a infecção ainda não estão elucidados. Assim, nos propomos a comparar a resposta de cardiomiócitos (CM), fibroblastos cardíacos (FC) e mioblastos esqueléticos (L6E9) infectados pelo T. cruzi frente ao estímulo de TGF-\03B2, importante citocina fibrogênica envolvida no desenvolvimento da cardiomiopatia chagásica, analisando também os mecanismos de sinalização envolvidos neste processo. FC foram purificados a partir de culturas de CM. Purificação adequada de FC foi obtida somente a partir da 5ª dissociação de culturas de CM, revelada pela baixa detecção de desmina, proteína específica de cardiomiócitos. Culturas de CM, FC e L6E9 normais e infectados pelo T. cruzi (cepa Y) foram tratadas por 1h ou 48h com TGF-\03B2 (1-10 ng/ml). A expressão de FN, SMAD 2 fosforilada (PS2), fosfo-p38 e fosfo-c-Jun foram avaliadas por Western blot (WB) após 1h e 48h de tratamento com TGF-\03B2 (1-10 ng/ml). Análises de WB revelaram que mioblastos L6E9 e FC apresentam aumento de FN já a partir de 1ng/ml de TGF-\03B2, em contraste com CM, em que só foi observado aumento de MEC com 15ng/mL. A infecção pelo T. cruzi induziu uma diminuição da expressão deste componente de MEC em L6E9. FC, por sua vez, apresentam modulação de FN de acordo com o grau de infecção da cultura, com culturas com baixo grau de infecção apresentando redução de FN e culturas altamente infectadas mostrando aumento desta proteína de MEC. A distribuição de fibronectina (FN) também foi analisada por imunofluorescência indireta FC e L6E9 apresentaram um aumento na expressão de FN a partir de 1ng/ml de TGF-\03B2, confirmando o WB. Após infecção pelo T. cruzi, foi observada uma desorganização e redução na expressão de FN em CM, FC e L6E9 infectados, enquanto células não infectadas adjacentes apresentaram perfis de FN similares ao controle. A resposta diferencial entre os tipos celulares frente ao estímulo com TGF-\03B2 resulta de mecanismos distintos de sinalização intracelular, uma vez que FC e L6E9 apresentam maior disparo da via de SMADs que CM, enquanto a via de p38 (independente de SMADS) é menos estimulada em FC quando comparados com CM e L6E9. Também foi avaliado o perfil de expressão de proteínas das vias de sinalização clássica e alternativa do TGF-\03B2 em culturas de FC normais e infectados com T. cruzi e tratados com 10ng/ml da citocina. Culturas infectadas e tratadas com TGF-\03B2 (10ng/ml) apresentaram uma redução nos níveis de fosforilação de SMAD 2 quando comparados com células normais tratadas. Culturas de FC infectadas não apresentaram aumento de fosfo-p38MAPK, mas disparo na via foi observado após tratamento com 10ng/ml de TGF-\03B2 em FC infectados. Aumento na fosforilação de c-Jun após a infecção e após tratamento com 10ng/ml de TGF-\03B2 também foi detectado em FC. Em conjunto, nossos dados sugerem que a expressão de FN é modulada diferencialmente por TGF-\03B2 em mioblastos L6E9, FC e CM, e que as vias moduladas por SMADS, p38 MAPK e c-Jun possam estar participando no processo de regulação de fibrose mediado pela citocina TGF-\03B2 após infecção pelo T. cruzi / The most severe manifestations of Chagas disease are cardiomyopathy and cardiac fibrosis, but the skeletal muscle tissue is also affected by T. cruzi infection, resulting in necrosis and myositis. The accumulation of extracellular matrix (ECM) during the fibrosis process is involved in the pathogenesis of Chagas disease, but the mechanisms of its regulation during infection are not clear yet. Therefore, we propose to compare the response of cardiomyocytes (CM), cardiac fibroblasts (CF) and skeletal myoblasts (L6E9) infected with T. cruzi after TGF - β stimulation, which is an important fibrogenic cytokine involved in the development of Chagas cardiomyopathy, also analyzing the signaling mechanisms involved in this process. CF were purified from CM cultures . Adequate purification was obtained after the 5th dissociation of CM cultures , as revealed b y low detection of desmin, a cardiomyocyte - specific protein. Cultures of normal and T. cruzi (Y strain) infected CM, CF and L6E9 were treated for 1h or 48 hs with TGF - β (1 - 10 ng/ml) . The expression of FN , phosphorylated SMAD 2 (PS2), phospho - p38, and phospho - c - Jun were also evaluated by Western blot (WB) after 1h and 48h treatment with TGF - β (1 - 10 ng / ml). WB analysis revealed that CF and L6E9 showed an increase in FN expression from 1ng/ml of TGF - β , contrasting to CM, in which an increased in ECM was only o bserved after 15ng/ml treatment . T. cruzi infection induced a decrease in the expression of this ECM component in L6E9. CF presented FN modulation according to the d egree of infection of the culture, with cultures containing a low degree of infection presenting a reduction of FN and highly infected cultures showing an increase of this ECM protein. T he distribution of fibronectin (FN) was also analyzed by indirect immu nofluorescence. CF and L6E9 displayed a raise in FN expression rfom 1 ng/mL, confirming WB. After T. cruzi infection, disorganization and reduced FN expression was observed in infected CM , CF and L6E9, while adjacent uninfected cells showed similar FN prof iles as controls. The differential response between cellular types facing TGF - β stimulation results from distinct intracellular signaling mechanisms, since CF and L6E9 have higher activation of SMAD s pathway than CM, while p38 pathway (independent of SMAD S ) is less stimulated in CF when compared to CM and L6E9. We also evaluated the protein expression profile of classical and alternative TGF - β signaling pathways in normal and T. cruzi infected CF cultures, treated with 10 ng/ml of the cytokine. Infected CF cultures treated with TGF - β (10ng/ml) showed a reduction in the levels of phosphorylation of SMAD 2 when compared with normal and treated controls. CF infected cultures did not show increased phosphorylation of p38MAPK, but activation in the pathway was ob served after treatment with 10 ng/ml TGF - β . An increase in phosphorylation of c - Jun after infection and after treatment with 10 ng/ml TGF - β was also detected in CF. When considered together, o ur data suggest that FN expression is differentially modulated b y TGF - β in L6E9 mioblasts, CF and CM, and pathways modulated by SMAD S, p38 MAPK and c - Jun may be participating in fibrosis regulatory process mediated by with TGF - β cytokine after T. cruzi infection

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 patricia_ferrao_ioc_dout_2014.pdf: 5118660 bytes, checksum: d25122b18e1bcb82dee22e425b2ed062 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Estudos recentes mostraram que TGF-\03B2 esta envolvido na cardiopatia chagásica aguda e crônica. O aumento de seus níveis plasmáticos e a ativação da sua via de sinalização celular são aspectos peculiares da doença chagásica crônica. Além do seu relevante papel na patologia chagásica, também se observou que esta citocina está intimamente associada ao T. cruzi como um regulador de diferentes etapas de seus ciclo de vida. Trabalhos anteriores demostraram que T. cruzi é capaz de ativar TGT-\03B2 latente, utilizando-o na invação às células hospedeiras e que amastigotas de T. cruzi se ligam e internalizam TGF-\03B2 recombinante, estando este evento relacionado à capacidade de proliferação de amastigotas e sua diferenciação em tripomastigotas no final do ciclo intracelular. Este conjunto de informações nos levou ao questionamento de quais moléculas de T. cruzi poderiam estar envolvidas nos processos de proliferação e diferenciação celular frente ao estímulo por TGF-\03B2. Neste sentido, o presente projeto tem por principal objetivo a caracterização de moléculas responsivas ao estimulo de TGF-\03B2 através de uma abordagem fosfoproteômica. Para tal, extratos de proteínas totais de epimastigotas de T. cruzi (cepa Y), incubadas ou não com TGF-\03B2, foram preparados durante a fase exponencial de crescimento do parasito. Evidenciamos que a dose ótima de TGF-\03B2 para maior indução de fosforilação seria de 5 ng/ml. em seguida, o tempo ótimo de indução com TGF-\03B2 (1,5,15,30 e 60 minutos) foi testado e concluímos que as diferenças entre os padrões de fosforilação são muitos sutis em géis unidimensionais, nos fazendo optar pela análise exclusiava dos perfins em géis bidimensionais de 7 cm com faiza de PH 3-10 não-linear. A avaliação dos perfis bidimensionais demonstrou diferenças nos padrões de fosforilação entre os tempos estudados, nos levando a manter um estudo de cinética de tempo. As imagens dos géis foram analisadas e algumas das proteínas consideradas responsivas a TGF-\03B2 foram identificadas por espectrometria de massas. Observamos que as proteínas de choque térmico, tubulinas, desidrogenases, enolases, ciclofilina A, GrpE, cruzipaína, fator de elongamento 1-\03B1, fator de iniciação eucariótica 5a, entre outras, têm sua fosforilação e/ou expressão moduladas em resposta a TGF-\03B2. Buscamos correlacionar a função já descrita na literatura para cada proteína com seu possível papel na sinalização intracelular dsparada por TGF-\03B2, em concordância com o comportamento de fosforilação e/ou expressão apresentado em novas análises. Por último, foi avaliado se a adição de TGF-\03B2 a culturas de epimastigotas teria algum efeito sobre a proliferação dos parasitos. Verificamos que a adição de TGF-\03B2 promoveu um aumento de até 73% no crescimento dos parasitos nas primeiras 24 horas de estudo. O conjunto de dados obtidos contribui para a elucidação dos mecanismos moleculares relacionados à sinalização de TGF-\03B2, proporcionando uma fonte para detecção de novos alvos terapêuticos para a doença de Chagas / Recent studies show that TGF - β is involved in the acute and chronic chagasic cardiopathy. High levels of TGF - β and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chron ic Chagas disease. Besides its relevant role in the pathology of Chagas dis ease, this cytokine was also observed to be intimately associated with Trypanosoma cruzi as a regulator of different stages of the parasite ́s life cycle. Previous works have show n that T. cruzi , using it in the process of h ost cell invasion. In addition, amastigote forms are able to bind and internalize recombinant TGF - β , and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate int o trypomastigote forms at the end of the intracellular cycle. Taken togethe r, this set of information raises the question as molecules are involved in the processe of cellular proliferation and differentiation stimulated by TGF - β . Therefore, this work aims to characterize TGF responsive molecules through a pho sphoproteomic approach. For this purpose, total T. cruzi epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF were prepared from parasites in the exponential gro wth phase. We determined that 5 was the dose that induce d the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed only subtle differences using 1 -DE analysis, leadi ng us to evaluate these profiles DE gels (7cm pH 3 -10 non- linear). The profiles obtained showed differences in phosphorylation patterns duri ng the time - which led us to maintain a time - kinetics study. Gel images wer responsive proteins were identified by mass spectr ometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydr ogenases, enolases, cyclophilin A, GrpE, cruzipain, elongation factor - 1 α , eukaryotic initiation factor their phosphorylation and/or expression levels modu lated by TGF correlate the function already described in the lit erature for each protein with their possible role in intracellular signaling triggered by TGF - β , in agreement with thei phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we assessed whether the addition of TGF - β to epimastigotes cultures would have some effect on parasite proliferation. We found that TGF - β addition led to an increase of up in parasite growth in the first 24 hours of culture . The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mec hanisms related to TGF , providing a source of new potential therapeutic t argets against in response to TGF - β is involved in the acute and chronic chagasic and the activation of its signaling pathway were shown to be peculiar aspects of patients with chron ic Chagas disease. Besides its ease, this cytokine was also observed to as a regulator of different stages of T. cruzi is able to activate ost cell invasion. In addition, amastigote , and this event is related to their capacity to proliferate and differentiate int o trypomastigote forms at the end of r, this set of information raises the question as molecules are involved in the processe of cellular proliferation and . Therefore, this work aims to characterize TGF - β sphoproteomic approach. For this purpose, total epimastigotes (Y strain), incubated or not with TGF - β , were prepared from parasites in the exponential gro wth phase. We determined that 5 d the highest number of phosphorylation events. Next, the optimal induction time (1, 5, 15, 30 and 60 minutes) was evaluated and we concluded that the phosphorylation patterns from the studied times showed ng us to evaluate these profiles linear). The profiles obtained - course under study, kinetics study. Gel images wer e analyzed and responsive proteins were identified by mass spectr ometry. We observed that heat shock proteins, tubulins, dehydr ogenases, enolases, cyclophilin , eukaryotic initiation factor -5a and others had their phosphorylation and/or expression levels modu lated by TGF - β . We tried to correlate the function already described in the lit erature for each protein with their , in agreement with thei r phosphorylation and/or expression behavior shown in our analysis. Finally, we to epimastigotes cultures would have some addition led to an increase of up in parasite growth in the first 24 hours of culture . The data presented here contributes to the elucidation of the molecular mec hanisms related to TGF - β , providing a source of new potential therapeutic t argets against Chagas disease

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fabiane_oliveira_ioc_mest_2011.pdf: 3896096 bytes, checksum: 9a40f48ee5a31a58097d262a13401dc9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O fator de crescimento de transformação beta (TGF-\03B2) é uma citocina multifuncional envolvida na modulação de diversos processos celulares, como proliferação celular, formação e degradação de matriz extracelular, tanto em eventos fisiológicos como patológicos. Nosso grupo tem demonstrado o papel regulador de TGF-\03B2 na invasão, crescimento e diferenciação do Trypanosoma cruzi (T. cruzi), o agente etiológico da doença de Chagas, uma importante causa de mortalidade e morbidade em países endêmicos na América latina. Haja vista que o remodelamento da matriz extracelular está diretamente relacionado à extensa fibrose observada no curso da doença de Chagas, nosso objetivo foi avaliar a ação terapêutica de um inibidor da via de sinalização de TGF-\03B2 (GW-788388) sobre a infecção aguda experimental pelo T. cruzi. Para essa análise foi utilizado o modelo de infecção pelo T. cruzi (cepa Y) em camundongos suíços submetidos ao tratamento oral com o composto em diferentes dias pós-infecção (3º, 13º e 20º dpi). Nossos dados revelaram diferentes respostas terapêuticas de acordo com o dia pós-infecção no qual o composto foi administrado. Quando administrado no 3º dpi, GW-788388 foi capaz de reduzir: (i) o parasitismo tissular e inflamação no coração e fígado; (ii) os níveis plasmáticos de AST, ALT e uréia e; (iii) a deposição de colágeno I e fibronectina no coração dos animais infectados. Neste esquema de tratamento, GW-788388 reverteu ainda a queda na expressão de conexina-43 e os danos de condução elétrica, sugerindo um papel protetor contra os danos cardíaco, hepático e renal, induzidos na infecção por este parasito. Interessantemente, o tratamento no 13º dpi com GW-788388, apesar de não alterar os parâmetros parasitológicos e clínicos avaliados em relação ao grupo não tratado, aumentou a mortalidade, sugerindo a relevância da via de TGF-\03B2 neste período da infecção em que os camundongos estão em choque sistêmico. No entanto, quando a administração do composto foi realizada no 20º dpi, os resultados revelaram uma significativa diminuição na expressão de colágeno I, indicando a eficiência deste tratamento em promover a degradação dos elementos de matriz no tecido cardíaco infectado. Em resumo, a inibição da via de sinalização de TGF-\03B2 reduziu a infecção pelo T. cruzi, previniu os danos cardíacos e reverteu a deposição de componentes de matriz extracelular, observados durante esta infecção in vivo. O conjunto dos resultados apresentados sugere que o bloqueio da atividade de TGF-\03B2 pode representar uma importante intervenção terapêutica a ser investigada em modelos de infecção aguda e crônica pelo T. cruzi. / Transforming growth factor beta (TGF - β ) is a multifunctional cytokine involved in modulating many cellular processes such as cell prolife ration, formation and degradation of extracellular matrix in physiological and pathological events. Our group has demonstrated the regulatory role of TGF - β in parasite host - cell invasion, growth and differentiation of Trypanosoma cruzi ( T. cruzi ), the eti ologic agent of Chagas disease, an important cause of morbidity and mortality in endemic countries in Latin America. Considering that the extracellular matrix remodeling is directly related to the extensive fibrosis observed in Chagas disease outcome, our objective was to evaluate the therapeutic action of an inhibitor of the signaling pathway of TGF - β (GW - 788388) during acute experimental T. cruzi infection. For this analysis we used the model of T. cruzi infection (Y strain) in Swiss mice subjected to oral treatment with the compound at different days post - infection (3 rd , 13 th and 20 th dpi). Our data revealed different therapeutic responses according to the day post - infection in which the compound was administered. When administered in the 3 rd dpi, GW - 788388 was able to reduce: (i) the tissue parasitism and inflammation in heart and liver, (ii) the pl asma levels of AST, ALT and urea, and (iii) collagen I and fibronectin deposition in the hearts of infected animals. In this treatment scheme, GW - 788388 reversed the decrease of connexin - 43 expression and electrical conduction damages, suggesting a protect ive role of this compound in the heart, kidney and liver damage, induced by this parasitic infection. Interestingly, treatment in the 13 th dpi with GW - 788388, although presented similar parasitological parameters in relation to the untreated group, an incr eased mortality was observed, suggesting the relevance of TGF - β pathway in this period of the infection, in which mice were in systemic shock. However, when the compound administration was performed at the 20 th dpi, the results revealed a significant collagen I expression decrease, indicating the effectiveness of thi s treatment in promoting the degradation of extracellular matrix elements in the infected cardiac tissue. In summary, TGF - β signaling pathway inhibition reduced the infection by T. cruzi , prevented heart damage and reversed the extracellular matrix compone nts deposition, observed during this infection in vivo . The combined results suggest that blocking the activity of TGF - β may represent an important therapeutic intervention to be investigated in acute and chronic models of T. cruzi infection.

Introdução. A Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) é uma condição prevalente na senescência masculina, caracterizada pelo aumento não maligno das células do tecido epitelial e principalmente estromal da próstata. Já foi demonstrado que a ligação dos androgênios ao seu receptor (AR) tem papel vital para o desenvolvimento prostático, mantendo não só a função tecidual, mas também sua possível contribuição para a patogênese de doenças prostáticas. Alguns estudos têm sugerido que o aumento dos hormônios IGF e Insulina circulantes podem afetar direta ou indiretamente a sinalização molecular promovendo o crescimento prostático. Uma proteína importante, componente da via de sinalização dos receptores de Insulina e IGF, é a Akt/PKB. Esta proteína está relacionada com a regulação do metabolismo, apoptose e a proliferação celular. Entretanto, os eventos moleculares que levam a interação dos receptores Insulina e IGF com o Receptor de Androgênios (AR) ainda foram bem estabelecidos. Objetivos. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma técnica de estimulação pela insulina e IGF-I em tecido prostático e em células provenientes de pacientes com HPB, avaliar a fosforilação da Akt/PKB, e a fosforilação do AR. Materiais e Métodos. Participaram deste estudo 15 pacientes com HPB oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre para análise das proteínas Akt/PKB e AR. A análise proteica foi realizada a partir da técnica de western blot. Os protocolos de estudo e os termos de consentimentos foram aprovados pelo comitê de ética local e nacional. Resultados. Foram realizadas duas técnicas de estimulação, uma com insulina em fatias de tecido de HPB e outra com insulina e IGF-I em suspensão celular de HPB. Ocorreu um aumento na fosforilação da proteína Akt/PKB nas células de HPB estimuladas com insulina (P=0,0113) quando comparadas com a condição controle pelo tempo de 10 minutos. Foi visto um aumento na porcentagem da fosforilação do AR quando as células foram estimuladas com insulina. Conclusão. É possível avaliar a via de ativação da Akt/PKB em um modelo de células prostáticas derivadas de Hiperplasia Prostática Benigna sob estímulo da Insulina por 10 minutos. Neste modelo, também é possível avaliar a fosforilação do Receptor de Androgênios. A padronização da técnica de estimulação in vitro poderá ser útil para novas pesquisas. Estes achados podem vir a elucidar um possível mecanismo intracelular de interação entre a transdução do sinal de Insulina e IGF-I e a fosforilação do Receptor de Androgênios, e assim, possivelmente contribuir para o entendimento da proliferação celular na HPB. / Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a prevalent disease characterized by high levels of prostate cell proliferation. The interaction of androgen hormone with its receptor (AR) has a central role in the development of prostate growth, maintaining the tissue function as the pathogenesis of the prostate disease. Increased levels of circulating insulin and IGF can directly and/or indirectly affect different signaling pathways and promote prostatic growth. The protein AKT/PKB, member of the insulin/IGF pathway, participates in metabolism, apoptosis and cell proliferation regulation. The molecular events related to the interaction of IGF-I and insulin receptor in BPH have not been defined yet. The aim of this study were to establish an in vitro protocol with insulin or IGF-I stimulation in prostatic tissue from BPH and to evaluate both Akt and AR phosphorylation. Samples were obtained from 15 BPH patients and the Akt and AR proteins were analyzed by western blot. Slices of prostatic tissues from BPH patients were stimulated with insulin. Fragmented and dissociated prostatic tissues were stimulated with insulin or IGF-I.BPH cells stimulated with insulin for 10 minutes showed higher percentage of AR and Akt phosphorylation in relation to control (P= 0.0113). These findings may suggest that insulin and IGF-I signaling pathways may contribute to distinct signals to common downstream components in response to both insulin and IGF-I for BPH development. Our study has established insulin or IGF-I stimulation of BPH cells and can contribute to elucidate a possible intracellular interaction mechanism of AR phosphorylation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Mestrado Profissional Associado à Residência Médica em Cuidados Intensivos e Paliativos / Made available in DSpace on 2012-10-26T11:37:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 310452.pdf: 738905 bytes, checksum: 0bcc62fdd79111a6eb1b838c5fca307b (MD5) / Introdução: IGF-I e IGFBP-3 fazem parte do sistema IGF e, por terem síntese predominantemente hepática, parecem se correlacionar com a intensidade da disfunção hepática. Objetivos: Estudar o significado dos níveis séricos de IGF-I e IGFBP-3 em pacientes admitidos por complicações da cirrose hepática. Material e Métodos: Estudo transversal que incluiu pacientes cirróticos admitidos por complicação da doença. Os níveis séricos de IGF-I e IGFBP-3 foram determinados por quimioluminescência. A correlação entre as variáveis numéricas foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Spearman e as demais comparações foram feitas pelo teste Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis. Resultados: Foram incluídos 74 pacientes com média de idade de 53,1 ± 11,6 anos, 73% homens. Os níveis de IGF-I se correlacionaram positivamente com IGFBP-3 e albumina e negativamente com a pontuação total do escore de Child-Pugh, escore de MELD, creatinina, RNI e razão-TTPA. Os níveis de IGFBP-3 se correlacionaram positivamente com IGF-I e albumina e negativamente com a pontuação total do escore Child-Pugh, escore de MELD, creatinina, RNI, bilirrubina total e razão-TTPA. Níveis significativamente mais baixos de IGF-I e IGFBP-3 foram observados em pacientes com maiores valores de MELD e estádios mais elevados da classificação de Child-Pugh (P< 0,05). Conclusões: Em pacientes cirróticos admitidos por complicações da doença, níveis séricos de IGF-I e IGFBP-3 se associaram a variáveis relacionadas à disfunção hepática e doença hepática mais avançada. Os níveis destes marcadores parecem sofrer pouca interferência de outras variáveis clínicas e laboratoriais, refletindo, portanto majoritariamente a capacidade de síntese hepática

O adenocarcinoma de estômago foi a principal causa de morte por neoplasia maligna no mundo durante grande parte do século XX e atualmente é superado somente pelas neoplasias epiteliais malignas de pulmão. Cerca de 750.000 novos casos são diagnosticados anualmente. Apresenta grande variação geográfica, sendo suas maiores incidências encontradas no Japão, América do Sul, Europa Oriental e Oriente Médio. É duas vezes mais freqüente em homens do que em mulheres; é pouco comum antes dos 40 anos e atinge sua maior incidência por volta da sétima década de vida. No Brasil as estimativas para o ano de 2005 apontavam para aproximadamente 23 mil casos novos e 11 mil óbitos. O único tratamento potencialmente curativo é a ressecção completa, macro e microscópica, de toda neoplasia. Mesmo após gastrectomia curativa, a recidiva, regional ou à distância, pode ocorrer em 80% dos casos. Esforços para melhorar estes resultados têm se focalizado no desenvolvimento de terapias pré e pós-operatórias mais efetivas.O oncogene p16 é conhecido por estar implicado na patogênese de muitos tumores humanos e também na regulação do crescimento celular normal, juntamente com as ciclinas, os complexos tirosinoquinases e os fatores de crescimento e transformação tumoral, entre eles o TGF-alfa e beta e os fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF) e seus receptores (PDGFR alfa e beta). A perda de expressão do p16 no adenocarcinoma gástrico tem sido amplamente estudada. O PDGFR tem sido encontrado ativado e mutado nos tumores gástricos estromais em que o c-KIT, o marcador mais comumente encontrado, está em sua forma selvagem. Os receptores PDGF atuam sobre células de origem estromal e não se expressam em células epiteliais em condições fisiológicas normais. . Isoladamente, o PGDF-beta e o seu receptor ainda não foram objetivamente estudados nem quanto à expressão nem quanto à resposta aos inibidores do crescimento celular no tecido gástrico tumoral quenão de origem estromal.O objetivo deste estudo foi determinar a expressão imunohistoquímica do p16 e do PDGFR-beta no adenocarcinoma gástrico. Foram avaliados no estudo 36 pacientes submetidos à cirurgia por adenocarcinoma de estômago entre os anos de 1998 e 2002 no Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre. As variáveis estudadas foram idade, sexo, localização do tumor, tamanho do tumor, número de linfonodos ressecados, número de linfonodos metastáticos, tipo histológico, tipo de cirurgia e estadiamento patológico (TNM). Não foi detectada expressão do PDGFRbeta em nenhuma das lâminas estudas. O p16 apresentou expressão menor que 10% em 89% dos casos e menor que 1% em 78% dos casos. Não foi detectada correlação entre a perda de expressão do p16 e as variáveis estudadas. / Gastric adenocarcinoma has been the main cause of cancer death during most of the twentieth century, now overcame by lung cancer. Annually 750,000 new cases are diagnosed. Great geographic variations are seen and highest incidences can be found in Japan, South America, Eastern Europe and Middle East. It is twice as frequent in men as in women, has o low incidence before the fourth decade with a peak incidence in the seventh decade. In Brazil 23,000 new cases and 11,000 deaths are estimated to 2005. Complete resection of all gross and microscopic disease is the only potentially curative treatment. However, disease recurs in 80% of patients even after curative resection. Efforts to improve these results concentrate on development of new pre and postoperative therapies. Oncogene p16 is implicated in pathogenesis of many human tumors and even in regulation of normal cellular growth, together with cycline, tyrosine kinasis and tumoral transforming and growth factors, like TGF-alpha and -beta and platelet derived growth factors (PDGF) ligands and receptors (alpha and beta). Loss of p16 has been exhaustively studied.PDGFR has been found activated and mutated on gastric stromal tumors where c-KIT, the most commonly marker found, is in wild type. PDGF receptors act over stromal origin cells and are not expressed in epithelial cells under normal physiologic conditions. PDGF-beta and its receptor have not been studied concerning expression and response to cellular growth inhibitors on non-stromal gastric tumors. The aim of this study has been detect immunohistochemistry expression of p16 and PDGFR-beta on gastric adenocarcinoma. Thirty six patients submitted to surgery for gastric adenocarcinoma among 1998-2002 years at Santa Casa de Porto Alegre Hospital have been studied. Variables investigated were: age, gender, tumor size and localization,number of ressected and metastatic nodes, histological type, surgical resection extension and pathological staging. No expression of PDGFR-beta has been detected on surgical specimens. Concerning to p16, loss of expression lower than 10% and 1% has been detected respectively on 89% and 79% of the specimens studied. There has been no correlation among p16 loss and the variables studied.

Resumo não disponível.

A família de Tumores de Ewing pode ser compreendida como um espectro de neoplasias de células neuroectodérmicas primitivas, dentre eles se inclui uma classe menos diferenciada chamada Sarcoma de Ewing (SE), no qual o diagnóstico é mais frequente entre 11 e 20 anos. O índice de sobrevida pode chegar em 70%; todavia, estima-se que apenas 55% dos pacientes recebam um tratamento efetivo. Alguns estudos sugerem relevância do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) no processo de tumorigênese e metátase em cânceres de cabeça e pescoço, pulmão e colorretal. Algumas vias de sinalização que poderiam explicar a relação do EGFR a estes processos incluem a MAPK/ERK e PI3K/AKT. No entanto, estes complexos de sinalização podem ser ativados por outras cascatas de transdução de sinal como do sistema BDNF/TrkB. As neurotrofinas, mais recentemente, estão sendo relacionadas ao processo tumoral. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a importância de EGF/EGFR na progressão tumoral do Sarcoma de Ewing, bem como o crosstalking entre este sistema e neurotrofinas. Linhagens celulares foram expostas a EGF ou ao inibidor da fosforilação do respectivo receptor (AG1478). A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas em hemocitômetro. A análise do ensaio clonogênico foi feita em software ImageJ®. Para análise do ciclo celular, após exposição ao AG1478, realizou-se a avaliação por citometria de fluxo e uma provável indução de senescência foi analisada com X-Gal. Western Blotting foi padronizado para avaliação das vias MEK/ERK, PI3K/AKT, Ciclina D1, p53 e BDNF quando da exposição ao AG1478. Análises de viabilidade celular também foram feitas usando inibidores de MEK ou PI3K em combinação ao AG1478 ou não. A exposição das linhagens SK-ES-1 E RD-ES ao EGF afeta positivamente a taxa de proliferação destas e, quando essas são tratadas com o inibidor AG1478, existe um decréscimo desta taxa além de um impacto da razão de viabilidade. O índice de citotoxicidade (IC50) resultante é de 12,8uM e 9,8uM para SK-ES-1 e RD-ES, respectivamente. Foi observado que a inibição de EGFR reduziu o número e tamanho de colônias, e que a sua ativação reflete em um aumento dos parâmetros. Alterações das porcentagens populacionais nas fases do ciclo celular foram observadas. O ensaio colorimétrico mostrou aumento da percentagem de células senescentes e sugere-se envolvimento da via da ERK; AKT; Ciclinas, P53 e BDNF no efeito mediante exposição ao AG1478. A exposição ao EGF, portanto, aumenta a proliferação e a clonogenicidade de células de SE, bem como a diminuição destas quando da inibição do receptor. Também, a inibição de EGFR resulta em alterações no ciclo celular, senescência e morte celular. / The family of Ewing's tumors may be understood as a spectrum of primitive neuroectodermal cell neoplasms, including a less differentiated class called Ewing's sarcoma (ES), wherein the diagnosis is most common between 11 and 20 years. The survival rate can reach 70%; however, it is estimated que only 55% of Patients receive effective treatment. Some published studies suggest relevance of epidermal growth factor receptor (EGFR) in tumorigenesis and metastatic process in head and neck, lung and colorectal tumors. Some signaling pathways, which could explain its relation with these processes, include MAPK / ERK and PI3K / AKT. However, other signal transduction cascades such as BDNF / TrkB system may activate these signaling complexes, the neurotrophins being related to the tumoral process. This study aims to assess the importance of EGF / EGFR in Ewing's Sarcoma tumor progression, and the crosstalking between this system and neurotrophins. Cell lines were exposed to EGF or the inhibitor of phosphorylation of its receptor (AG1478). The viability and cell proliferation were evaluated in hemocytometer. The analysis of the clonogenic assay was performed in ImageJ® software. For cell cycle analysis after exposure AG1478, the evaluation was performed by flow cytometry and a probable induction senescence was analyzed with X-Gal. Western Blott was standardized to evaluate the pathways MEK / ERK, PI3K / AKT, cyclin D1 and P53 when exposure to AG1478. Cell viability analyzes were also performed on exposure to MEK and PI3K inhibitor in combination or not with AG1478. Exposure of SK-ES-1 and RD-ES lines to EGF positively affects the rate of proliferation and when these are treated with the inhibitor AG1478, there is a decrease in this rate as well as an impact reason viability. The cytotoxicity index (IC50) is 12,8uM resulting 9,8uM and SK-ES-1 and RD-ES, respectively. We observed that inhibition of EGFR reduced the number and size of colonies, and their activation reflects an increase in the parameters. Changes in population percentages in the cell cycle phases were observed. The colorimetric assay showed an increased percentage of senescent cells and it is suggested involvement of the ERK pathway; AKT; Cyclin P53 and the effect upon exposure AG1478. Therefore, the EGF exposure increases the proliferation and clonogenicity of ES cells, as well as the reduction is observed when these receptor inhibited. Also, inhibition of EGFR results in changes in the cell cycle, senescence and cell death.

Introdução: Osteossarcoma é um tipo de câncer ósseo agressivo encontrado geralmente em jovens. VEGF e HER-2 têm sido utilizados em diversos tipos de tumores como possíveis marcadores de imuno-histoquímica relacionados ao prognóstico; no entanto, estudos realizados em osteossarcomas ainda apresentam resultados contraditórios. Objetivos: Identificar a prevalência de HER-2 e do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) em biópsias de osteossarcoma e correlacioná-los com possíveis fatores de prognóstico. Métodos: Estudo retrospectivo realizado no Hospital de Câncer de Barretos-SP incluindo 27 biópsias de osteossarcoma imuno-histoquimicamente coradas para VEGF e HER- 2. Características clínico-patológicas foram coletadas dos prontuários médicos dos pacientes para correlação com marcadores. Resultados: Em 27 biópsias, quatro foram superexpressas para VEGF e três para HER-2. Dois terços dos pacientes eram não metastáticos. Quase todos pacientes com VEGF superexpresso apresentaram metástases. A superexpressão para HER-2 apresentou relação inversa à presença de metástases. Não houve associação significativa entre os marcadores e o prognóstico. Conclusão: Identificamos baixa prevalência de VEGF e HER-2 na amostra. Não houve associação significativa entre superexpressão dos marcadores e características clínicopatológicas. A ampliação da amostra e do tempo de seguimento, além do emprego de novas técnicas laboratoriais pode determinar a real expressão de VEGF e HER-2 e seu papel em osteossarcomas.