O etanol contribui significativamente para que a matriz energética do país se apresente extremamente favorável quanto à participação da energia renovável. A demanda por este biocombustível é crescente e tecnologias que permitam a sua produção de forma sustentável é de suma importância, como a fermentação com alto teor de etanol, já empregada em alguns países. Linhagens de leveduras com tolerância a múltiplos estresses muito contribuíram para a implantação de tal tecnologia no Brasil. Neste contexto se insere o presente trabalho, o qual busca linhagens de leveduras capazes de suportar os estresses impostos por uma fermentação com alto teor alcoólico. Para tal, 3 entre as melhores linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae atualmente disponíveis (CAT-1, PE-2 e SA- 1), foram utilizadas num programa para a seleção de híbridos para tolerância múltipla aos estresses etanólico, osmótico, ácido, além de outros, inerentes à fermentação com alto teor de etanol. Estas linhagens foram esporuladas e dissecadas para obtenção de células haplóides, as quais foram submetidas a cruzamentos entre- e intra-linhagens. Foram conduzidos cruzamentos massais (aleatórios) cujos produtos foram submetidos à evolução adaptativa em meios com os fatores estressantes em intensidades crescentes no transcorrer de 80 gerações. Ao final da evolução buscou-se variantes prevalentes na população de híbridos, os quais foram submetidos a novos procedimentos seletivos com imposições de várias condições estressantes. Igualmente foram conduzidos cruzamentos direcionados entre haplóides mediante micromanipulação, sendo tais híbridos submetidos ao mesmo procedimento seletivo nos meios estressantes. Assim, a partir de 230 haplóides das 3 linhagens, 174 isolados (120 oriundos dos cruzamentos massais e 54 dos cruzamentos direcionados) foram pré-selecionados pela maior tolerância aos meios seletivos, tendo os seus cariótipos estabelecidos mediante a cariotipagem eletroforética. Os isolados com maior tolerância (27) foram novamente avaliados em fermentações com reciclo de células e sob condições de elevado teor alcoólico (até 14,5% v/v) em mosto de melaço e água. Em todas as etapas da seleção os isolados foram comparados com as linhagens parentais (CAT-1, PE-2 e SA-1), sendo que ao final do processo seletivo destacou-se a linhagem 35B (híbrido entre CAT-1 e PE-2) com atributos fermentativos superiores aos exibidos pelos parentais. Tais atributos fermentativos contemplaram parâmetros bioquímicos, fisiológicos e tecnológicos (rendimento em etanol, viabilidade celular, crescimento em biomassa, formação de glicerol e teores celulares de carboidratos de reserva glicogênio e trealose). Os resultados permitem sugerir que devido às características fermentativas desejáveis do híbrido 35B, o mesmo possa ser empregado no processo industrial para ser avaliado como uma promissora linhagem a conduzir a fermentação com alto teor alcoólico. / Ethanol contributes significantly to the energy country matrix, which presents itself as extremely favorable to the share of renewable energy. The demand for this biofuel is increasing and technologies for its production in a sustainable way is of paramount importance such as fermentation with very high gravity, already used in some countries. Yeast strains tolerant to multiple stresses greatly contributed to the deployment of such technology in Brazil. In this context the present work is inserted, which seeks yeast strains capable of withstanding the stresses imposed by high ethanol content fermentation. In order that, three of the best industrial strains of Saccharomyces cerevisiae currently available (CAT-1, PE-2 and SA-1), were used in a program to select hybrids with tolerance towards multiples stresses: ethanolic, osmotic and acid, besides other factors involved in a high ethanol content fermentation. These strains were sporulated and dissected to obtain haploid cells, which were submitted to inter- and intra-strains crossings. Hybrids from polycrossings (random crossings) were subjected to an adaptative evolution in media with increasing stressing action over the course of 80 generations. At the end of evolution, prevalent variants were sought in the hybrids population, and submitted to new selective procedures with several stressing conditions. In the same way, directed crossings (between identified haplois) were performed by micromanipulation, and the resulting hybrids were subjected to the same selective procedure. Therefore, from 230 haploid from the 3 parent strains, 174 were isolated (120 from polycrossings and 54 from directed crossings) and pre-selected for higher tolerance in selective media; moreover their karyotypes were established by electrophoretic karyotyping. Strains showing greater tolerance (27) were again evaluated during cell recycling fermentations with high ethanol content (up to 14.5% v/v) using must formulated with water and molasses. At all stages, the isolates were compared with the parental strains (CAT-1, PE-2 and SA-1), and at the end of the selection process, the strain 35B (hybrid between CAT-1 and PE-2) standed out with fermentative attributes higher than the parentals. The fermentative performance was assessed by biochemical, physiological and technological parameters (ethanol efficiency, cell viability, biomass gain, glycerol formation and cellular levels of reserve carbohydrates - glycogen and trehalose). The results suggest that due to desirable fermentation traits, the hybrid 35B, could be used as starter in industrial fermentation process with high ethanol content.

O Brasil é o segundo maior produtor e um dos maiores exportadores de etanol no mundo e tal biocombustível tem grande impacto na economia do país. A expectativa é de grande demanda por tal produto, quer pelo crescente consumo interno, como também em decorrência do fim do protecionismo nos Estados Unidos. Portanto, o Brasil deverá produzir mais etanol e a um custo mais reduzido para manter a competitividade frente aos combustíveis fósseis. Dentre as inovações tecnológicas estaria a fermentação com alto teor alcoólico. Contudo, um dos fatores limitantes para a implantação desta tecnologia é a ausência de leveduras apropriadas para tolerar as condições severas impostas por este tipo de fermentação, onde múltiplos estresses são impostos simultaneamente às leveduras. Assim, este trabalho se propôs a selecionar, da biodiversidade de leveduras encontradas nas destilarias brasileiras, linhagens de Saccharomyces cerevisiae com capacidade de conduzir fermentações com alto teor alcoólico e em condições de reciclo celular. A estratégia de seleção consistiu na busca de linhagens com tolerâncias múltiplas, frentes aos estresses etanólico, osmótico, ácido e térmico. Para tal, um total de 525 linhagens, obtidas de diferentes destilarias, foram submetidas a uma seleção para destacar linhagens com múltipla tolerância. Cerca de metade destas linhagens foram submetidas a uma seleção prévia avaliando-se o crescimento (D.O.570nm, durante 24 horas a 30ºC) em meio constituído de mosto misto (melaço e caldo de cana) com 25% de ART, selecionando 200 linhagens. Estas, acrescidas de mais 249 não avaliadas no meio anterior, foram igualmente submetidas a processo seletivo em meio contendo múltiplos estresses (etanólico, osmótico, ácido e térmico). Tal meio foi desenvolvido após avaliações de 26 combinações com os diferentes estresses acima mencionados e com diferentes intensidades. O objetivo foi buscar um meio que melhor discriminasse as tolerâncias das leveduras referencias: as linhagens de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e de panificação, com e sem capacidade de implantação no processo industrial, respectivamente. A tolerância foi avaliada pela formação de biomassa (D.O.570nm, durante 24 horas a 30ºC). Assim, tal meio seletivo permitiu a seleção de 34 linhagens com perfis de tolerância igual ou superior ao da linhagem PE-2. Estas linhagens foram, a seguir, avaliadas quanto à viabilidade celular e ao crescimento em fermentações de mosto misto com teores crescentes de açúcares, ao longo de 10 reciclos a 30oC, atingindo teores de etanol de 15 a 16% (v/v). As 10 linhagens com os melhores desempenhos foram submetidas à avaliação final em fermentações simulando condições industriais, em reciclos fermentativos a 32ºC empregando-se mosto misto com teores crescentes de açúcares, permitindo aumentos nos teores de etanol de 11 a 15% (v/v) ao longo dos reciclos. Para esta avaliação final os seguintes parâmetros foram estimados: rendimento em etanol, formação de biomassa e glicerol, teores de açúcares residuais, viabilidade celular, e teores celulares dos carboidratos de reserva (glicogênio e trealose). Pelo menos 4 linhagens mostraram atributos fermentativos superiores ao da linhagem referência (PE-2), permitindo concluir que linhagens capazes de conduzirem a fermentação com alto teor de etanol podem ser obtidas da biodiversidade encontrada no ambiente das destilarias. / Brazil is the second largest ethanol producer and one of the leading ethanol exporter in the world, and this biofuel has great impact on the country economy. Huge demand is expected for this product, not only to supply the growing domestic consumption but due to the end of the United States market protectionism. In view of this, Brazil should produce more ethanol and at a lower cost to maintain competitiveness in relation to fossil fuels. One of the technological approaches which emerges is the high ethanol content fermentation. However, one of the limiting factors for this technology is the absence of proper strains to face the very harsh fermentation condition, where several stresses are simultaneously imposed to the fermenting yeast. This work aimed at selecting Saccharomyces cerevisiae strains from the biodiversity of yeasts found in Brazilian distilleries to conduct high ethanol fermentation with cell reuse. The selection strategy was to search for multiple tolerant strains to ethanol, acid, osmotic and thermal stresses. For that, a total of 525 strains, which were obtained from several distilleries, were subjected to a selection in order to highlight multi-tolerant strains. About half of these strains were subjected to a pre-screening procedure to evaluate growth (O.D.570nm, for 24 hours at 30ºC) in medium containing molasses and sugarcane juice (25% TRS), and 200 strains were selected. These 200 strains, together with 249 strains not previously evaluated, were screened in a medium imposing multiple stresses (ethanol, acid, osmotic and thermal). This medium was chosen after assessments of 26 different medium formulations with the above mentioned stresses and with different intensities. The purpose of that was to find a medium which best discriminate the tolerance of the reference yeasts: PE-2 and bakery Saccharomyces cerevisiae strains, with and without ability to persist in the industrial process, respectively. The strain tolerance was evaluated by biomass formation (O.D.570nm, for 24 hours at 30ºC). By this mean 34 strains were selected displaying similar or superior performance in comparison with PE-2 strain. These strains were then assessed for cell viability and growth in cell reuse fermentations (10 cycles), using cane juice/molasses substrates with increasing sugar content, at 30ºC, reaching 15-16% ethanol (v/v). The 10 strains with the best performances were subjected to final evaluation in fermentations simulating the industrial process with cell reuse, at 32ºC, using the same substrate with increasing sugar content, which allowed rises in ethanol content from 11 to 15% (v/v) over the cycles. For this final evaluation, the following parameters were determined: ethanol yield, biomass and glycerol formation, residual sugar levels, cell viability and storage carbohydrate levels (trehalose and glycogen). At least four strains showed superior fermentative attributes to reference strain (PE-2), leading to the conclusion that strains able to conduct high ethanol content fermentations can be obtained from the natural biodiversity found in Brazilian distilleries.

No processo de produção de etanol a partir de cana-de-açúcar, a destilação do mosto fermentado resulta na geração de grande volume de vinhaça. Em média, para cada litro de etanol produzido são gerados aproximadamente 12 litros de vinhaça. Devido ao volume de vinhaça produzido e ao limite de aplicação de vinhaça por área, estabelecido pela CETESB, os gastos com o gerenciamento deste resíduo tornaram-se muito altos (R$ 17,33 por m3, considerando a distribuição por caminhão para uma distância de 20 a 25 Km). Isso levou o setor sucroenergético a buscar alternativas visando diminuir do volume de vinhaça produzida. Dentre essas alternativa, destaca-se o processo de fermentação com alto teor alcoólico. Este processo pode diminuir em até 50% o volume de vinhaça gerado, além de apresentar inúmeras vantagens técnicas, econômicas e ambientais. Por esses motivos, o objetivo deste trabalho foi realizar a adaptação das linhagens de leveduras C22 e Y904 para fermentações com altos teores alcoólicos e verificar as alterações morfológicas das linhagens C22 e Y904 ao longo do processo de adaptação e após a fermentação com alto teor alcoólico, por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para tal, foram realizadas fermentações com concentrações crescentes de açúcares nos mostos (50 à 274,52 g L-1). No ciclo de fermentação com alto teor alcoólico, a viabilidade das leveduras C22 e Y904 adaptadas foi 70,1% (83,5% e 56,7%, respectivamente); já a viabilidade média das leveduras C22 e Y904 não adaptadas foi 62% (68,8% e 55,2%, respectivamente). As imagens do MEV mostraram que a linhagem C22 adaptada apresentou aspecto morfológico de melhor resposta ao estresse exposto do que as demais leveduras. Conclui-se que a escolha da linhagem e sua adaptação prévia são fundamentais para a condução de fermentações com alto teor alcoólico. / In ethanol production process, the distillation of sugarcane fermented must result in large volume of vinasse. For each liter of ethanol produced around 12 liters of vinasse are generated. Due to the vinasse application limit per area, established by CETESB, the costs to manage this waste became very high (R$ 17,33 per m3, considering the distribution by truck for a distance of 20 to 25 km). This led the sugarcane industry to seek alternatives to reduce the volume of vinasse produced. The process of fermentation with high alcohol content is one of the options; it can reduce by 50% the volume of vinasse generated and presents numerous technical, economic and environmental advantages. For these reasons, the aim of this study was to adapt the yeasts strains C22 and Y904 for fermentations with high alcohol levels and verify the morphological changes of C22 and Y904 strains in the process of adaptation and fermentation with high alcohol content, by scanning electron microscopy (SEM). For this purpose, fermentations with increasing concentrations of sugar in the must (50 to 274.52 g L-1) were performing. In the fermentation cycle with high alcohol content, the viability of C22 and Y904 yeast adapted was 70.1% (83.5% and 56.7%, respectively); the viability of the yeast C22 and Y904 unadapted was 62% (68.8% and 55.2%, respectively). The SEM images showed that the C22 adapted strain presented better morphological response to stress exposure than other yeast strains. We conclude that the choice of yeast strain and his previous adaptation are essential for conducting fermentations with high alcohol content.

O gênero Eucalyptus é uma das principais espécies arbóreas comercialmente plantadas em todo o mundo. Apresenta inúmeras características favoráveis para a produção e comercialização de sua madeira, tais como o rápido crescimento, rotação de ciclo curto e produção de biomassa renovável, com potencial para geração de biocombustível. Apesar de sua grande importância econômica, pouco é conhecido sobre os processos moleculares que envolvem a formação da madeira e casca, principalmente no que diz respeito ao metabolismo primário. Ademais, não se têm muitas informações sobre mudanças moleculares que ocorrem durante a formação desses tecidos em resposta a variações sazonais. Sabe-se que a região cambial das árvores apresenta maior atividade metabólica durante o verão, quando comparada ao inverno. Deste modo, visando compreender mudanças dinâmicas ao nível transcricional, protéico e metabólico, principalmente em relação ao metabolismo primário, o presente trabalho teve por objetivo comparar os tecidos da região cambial e casca, coletados em diferentes períodos climáticos (verão e inverno). A expressão do padrão transcricional foi analisada por PCR em tempo real, seguido de normalização e análise estatística, usando os programas NormFinder e Rest, respectivamente. O perfil protéico foi obtido por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), seguido de análise por espectrometria de massas associada a cromatografia líquida (LC-MS/MS) e posterior identificação das proteínas pelo programa Mascot Daemon. Já o perfil metabólico foi obtido por espectrometria de massas associada à cromatografia gasosa (GC/MS), com posterior análise dos picos identificados pelo programa MatLab. Em seguida, as análises estatísticas foram geradas pelo programa SIMCA P+ e \"R\". Para os transcritos, foi possível observar tanto para a região cambial quanto para a casca padrão diferencial na expressão dos genes analisados, principalmente aqueles atuantes na glicólise, durante os dois períodos sazonais. Quanto ao perfil protéico, foram identificadas um total de 77 e 75 proteínas estatisticamente significativas na região cambial e casca, respectivamente. Proteínas pertencentes ao metabolismo primário foram identificadas em ambos os tecidos. Metabólitos relacionados ao metabolismo de açúcares também foram encontrados. / Eucalyptus genus is the most widely planted hardwood crop in the world because of its superior growth, broad adaptability and multipurpose wood properties. In today\'s \"new carbon economy\", eucalypts are receiving attention as fast-growing, short-rotation, renewable biomass crop for energy production. In spite of its economical importance, little information is available about the molecular changes that occur in primary metabolism in the wood and bark forming tissues. Furthermore, there is less information about molecular changes that occur during wood and bark formation in response to seasonal variation. It\'s known that Eucalyptus cambial region presents higher metabolic activity in summer than in winter. Thus, in order to observe the dynamic changes in transcript, protein and metabolite levels, mainly related to primary metabolism, we compared cambial tissue and bark collected in two different seasons (summer high temp + high rainfall) and winter (lower temp and little rainfall). Transcript expression patterns were analyzed by Real-Time PCR, normalization chosen by NormFinder and statistical analysis carried out using REST. The protein profile was obtained by bidimensional electrophoresis (2D-PAGE) followed by liquid chromatography associated with mass spectrometry (LC-MS/MS) and analyzed by Mascot Daemon. Metabolite profile was obtained by GC-TOF/MS, peaks were analyzed in MatLab and statistical analyses were done using SIMCA and \"R\". The results obtained with transcripts indicate differential gene expression in the cambial region and bark during summer and winter. A total of 77 and 75 proteins in cambium and bark, respectively, presented statistically significant alterations and were identified and classified into functional categories. We identified many proteins from primary metabolism. Metabolites from carbohydrate metabolism were also identified.

Processos fermentativos que visam um salto tecnológico na produção de etanol, que potencialize o processo fermentativo, destaca-se a fermentação extrativa a vácuo. Assim buscou-se selecionar linhagens tolerantes à alta pressão osmótica para serem empregadas em processo de fermentação extrativa. Foram realizadas seleções a partir de 444 cepas de leveduras oriundas da biodiversidade das Usinas Brasileiras, que fazem parte do banco de leveduras do Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), tendo como base o meio formulado com melaço e vinhaça para simular a fermentação extrativa. A seleção se baseou em submeter as linhagens às fermentações em condições crescentes de estresse osmótico, buscando destacar linhagens com a tolerância desejada. Para tal, as linhagens em mistura foram submetidas à propagação durante 93 gerações em meios com crescentes quantidades de melaço e vinhaça. Em etapa seguinte, 90 cepas foram isoladas e avaliadas mediante o crescimento (μmax e biomassa) em condição de estresse osmótico e genotipadas. O método usado na genotipagem foi o PCR - microssatélite, o qual permitiu verificar se as cepas resultantes da seleção eram cepas industriais (BG-1, CAT-1, PE-2 e SA-1) ou cepas selvagens e/ou predominantes. Foram utilizados 5 pares de primers representando 5 diferentes loci. A genotipagem e a avaliação do crescimento em condições de estresse osmótico, baseado em características genéticas e fisiológicas, permitiu identificar 24 linhagens com potencial de tolerância a pressão osmótica. As cepas com desempenho superior foram submetidas à avaliação de crescimento em placa e as sete mais tolerantes à pressão osmótica foram selecionadas e utilizadas em reciclos fermentativos empregando-se mosto constituído de melaço e vinhaça. A linhagem com as melhores características para a fermentação com alta pressão osmótica foi avaliada em condições de fermentação extrativa à vácuo. A linhagem selecionada, denominada de F1-5, mostrou-se com grande potencial para a fermentação extrativa quando comparada com a referência CAT-1. / Fermentative processes that aim for technology innovations in the ethanol production, which improve the fermentative process, emphasizing the in vacuum extractive fermentation. So we have selected strains tolerant for high osmotic pressure to be in extractive fermentation process for ethanol production. We 444 yeast strains from Brazilian Mills biodiversity, which Sugarcane Technology Center\'s (CTC) yeast bank, based on a medium formulated with molasses and vinasse, to simulate the extractive fermentation. The selection was based on submiting strains to the fermentation in in high osmotic stress condition, trying to feature strains with desired tolerance, so, the mixed strains were submitted to propagation for 93 generations in medium with increasing amounts of molasses and vinasse. In the following step, 90 strains were isolated and evaluated by growth (μmax and biomass) in osmotic stress condition and genotyped. The method used in genotyping was the PCR - microsatellite, which enable to estimate if resulting selection strains were from industrial strains (BG-1, CAT-1, PE-2 and SA-1) or wild strains and / or prevalent. 5 pairs of primers were used representing 5 different loci. The genotyping and the growth evaluation in osmotic stress conditions allowed identify strains based on genetic and physiological characteristics, making possible to identify 24 strains with a potential tolerance to osmotic pressure. The strains with better performance were submitted to evaluation growth on boards and the 7 most tolerant to osmotic pressure were selected and used in fermentative recycles using medium containing molasses and vinasse. The strain with the best features in the fermentation in high osmotic pressure was evaluated in vacuum extractive fermentation conditions. The selected strain, named F1-5, proved to have a great potential for extractive fermentation when compared to the reference CAT-1.

A aplicabilidade do processo de produção de microrganismos fotossintetizantes depende da obtenção de altas concentrações de biomassa e para isso seria interessante o emprego de fotobiorreatores tubulares. Eles permitem redução da área de cultivo e menor perda de CO2 e nitrogênio amoniacal por volatilização. Em uma primeira etapa deste trabalho, Arthrospira platensis foi cultivada por processo contínuo, avaliando-se diferentes valores de vazão específica de alimentação (D = 0,2 a 1,0 dia-1) e diferentes intensidades luminosas (I = 60 e 120 µmol fótons.m-2.s-1). Verificou-se que 120 µmol fótons.m-2.s-1 associada a D igual a 0,2 dia-1 resultou em maior valor de concentração celular em regime permanente (XP = 2446 ± 74 mg.L-1.d-1), mas o mesmo I associado a maior valor de D (0,6 dia-1) levou ao melhor valor de produtividade em células (PX = 938,73 mg.L-1.d-1). Foi possível a obtenção do regime permanente em quase todos os ensaios, o que indica que o cultivo contínuo de A. platensis em fotobiorreator tubular, usando uréia como fonte de nitrogênio, pode levar a resultados satisfatórios. Considerando a preocupação em relação à substituição de combustíveis fósseis por biocombustíveis, é iminente o crescente aumento da produção de etanol ainda nos próximos anos, e esse trabalho propõe o uso do CO2 liberado pela fermentação alcoólica na produção de microrganismos fotossintetizantes como A. platensis. Para isso, em uma segunda etapa, A. platensis foi cultivada por processo contínuo, com I igual a 120 µmol fótons.m-2.s-1, empregando uréia e CO2 proveniente de fermentação alcoólica para manutenção de pH e reposição da fonte de carbono. O uso desse CO2, sem tratamento prévio, associado a D igual a 0,6 dia-1 e concentração de uréia de 3,2 mM no meio de alimentação, permitiu a obtenção de PX igual a 839 ± 25 mg.L-1.d-1, o que está próximo de 938 ± 30mg.L-1.d-1, obtido com CO2 puro de cilindro. Estes resultados mostram que o uso de CO2 de fermentação alcoólica, associado a uréia, é adequado para cultivo contínuo de biomassa fotossintetizante de potencial interesse na área farmacêutica, alimentícia e de cosméticos, promovendo não só a redução no custo de produção mas também outros benefícios relacionados a questões ambientais e sociais. / Appropriately designed tubular photobioreactors seem to be suitable for photosynthetic biomass production. It can reduce the cultivation area and provide lower loss of CO2 and ammoniacal nitrogen by volatilization. In a first step of this study, Arthrospira platensis was cultivated by continuous process, testing different values of dilution rate (D = 0.2 to 1.0 d-1) and light intensities (I = 60 and 120 µmol photons.m-2.s-1). The results of these runs showed that the maximum steady-state cell concentration (XS = 2446 ± 74 mg.L-1.d-1) was achieved at 120 µmol photons.m-2.s-1 and D of 0.2 d-1, but the same light intensity associated to higher dilution rate (0.6 d-1) provided the highest cell productivity (PX = 938 ± 30 mg.L-1.d-1), a value appreciably higher than that reported in other studies. Besides, steady-state conditions were achieved in most of the runs indicating that A. platensis continuous cultivation in the tubular photobioreactor, using urea as nitrogen source, can be performed effectively, thus appearing an interesting alternative for the large scale fixation of carbon dioxide to mitigate the green house effect. Taking into account the concern about the substitution of fossil fuel with biofuels, its evident that the ethanol production is going to increase even more in the next years, and this study propose the use of the CO2 released by the alcoholic fermentation for the production of photosynthetic microorganism such as A. platensis. For this purpose, in a second step, cultivations of A. platensis were carried out with 120 µmol photons.m-2.s-1 by continuous process, using urea and CO2 from Alcoholic fermentation for pH maintenance and carbon source replacement. The use of this CO2, without any treatment, associated with a D of 0.6 d-1 and feed urea concentration of 3.2 mM provide us a PX of 839 ± 25 mg.L-1.d-1, which is slightly lower than 938 ±30 mg.L-1.d-1, obtained with pure CO2 from cylinder. Our results showed that the use of CO2 from alcoholic fermentation, associated with urea, is suitable for the continuous cultivation cyanobacterial biomass, providing not only the production cost reduction but also other benefits related to environmental and social issues.

A contaminação bacteriana por espécies dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc entre outras bactérias lácticas é um dos principais fatores que afetam o rendimento da fermentação alcoólica. A formação de biofilmes acaba protegendo as bactérias e é uma fonte permanente de contaminação. Objetivando caracterizar tais contaminações em (1) biofilmes de centrífuga, dorna, trocador de calor e tubulação de água e (2) melaço, mosto, levedo, levedo tratado (com H2SO4) e vinho, amostras foram coletadas em diferentes períodos de um sistema fermentativo de alto teor alcoólico (16%). As enzimas de restrição AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI e MspI utilizadas nas análises de T-RFLP foram definidas por análises in silico com sequências do gene 16S rRNA de contaminantes freqüentes. Essas enzimas geram uma maior quantidade de T-RFs únicos entre 30 e 650 pb. Os DNAs extraídos das amostras foram submetidos às análises de T-RFLP para obtenção do perfil molecular das comunidades microbianas dos pontos de coleta. Os índices de diversidade de Shannon foram calculados com base no número dos T-RFs. Foram realizadas as análises dos componentes principais (PCA) e a inferência filogenética dos contaminantes com base nos perfis dos T-RFs. A quantificação dos principais táxons contaminantes foi feita por qPCR utilizando primers específicos delineados neste estudo e considerando a média de cópias do gene 16S rRNA presentes no genoma de cada táxon bacteriano. Na primeira coleta o biofilme de água apresentou maior índice de diversidade microbiana e na segunda, melaço e mosto. PCA sugere que os biofilmes (e não as fontes externas) são os principais contaminantes desse processo fermentativo devido as suas semelhanças com a composição das outras comunidades analisadas. Espécies de Lactobacillus e Bacillus predominaram entre as amostras da primeira coleta. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus e Pseudomonas foram detectados em amostras de biofilme e em amostras líquidas, sendo os principais contaminantes provindos de biofilme no momento da primeira coleta. Na segunda coleta Bacillus foi o principal contaminante e novamente gêneros produtores de ácido lático como Streptococcus, Lactobacillus e Staphylococcus foram os mais freqüentes. Os resultados concordam com o reportado na literatura sobre sistemas fermentativos convencionais. Apenas os primers desenhados para amplificação do gene 16S rRNA de Burkholderia, Pseudomonas e Weissella apresentaram especificidade em testes com isolados. Halomonas sp. foi encontrada em biofilme de dorna através do sequenciamento utilizando primers para esse gênero. Halomonas pode produzir levânio podendo haver o consumo da sacarose disponível para fermentação. Biofilme da centrífuga teve a maior quantidade de micro-organismos nos dois momentos de coleta (1,93E+06 UFC.mg-1 e 2,14E+07 UFC.mg-1, respectivamente) assim como as amostra de levedo entre as amostras líquidas (1,03E+08 UFC.ml-1 e 2,96E+06 UFC.ml-1, na primeira e segunda coleta, respectivamente), indicando níveis consideráveis de contaminantes. Burkholderia e Pseudomonas foram os mais abundantes entre as amostras de biofilmes da primeira e segunda coleta. Nas amostras líquidas Burkholderia apresentou-se em maior quantidade na maioria das amostras da primeira coleta; enquanto Pseudomonas e Weissella em geral predominaram equivalentemente entre as amostras da segunda coleta / Bacterial contamination by Lactobacillus, Bacillus and Leuconostoc and other lactic acid bacteria is one of the main factors that affects the yield in alcoholic fermentation process. Biofilm formation protects the bacteria community and it is a permanent source of contamination. For characterization of these contaminations in (1) biofilms from centrifuge, tank fermentation, heat exchanger and water pipe and (2) molasses, must, yeast, yeast treated (with H2SO4) and wine, samples were taken at two different periods from fermentation system characterized by high alcohol yields (16%). Restriction enzymes AluI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI and MspI used in T-RFLP analysis were defined by 16S rRNA gene sequences analysis in silico from common contaminants. These enzymes generate high number of unique T-RFs between 30 and 650 bp. DNA from samples were used as template in T-RFLP reactions in order to obtain molecular profiles of microbial communities present at each sample. Shannon diversity index was calculated based on T-RFs numbers. Principal component analysis (PCA) and phylogenetic inference of contaminants were performed based on T-RFs profiles. The main contaminant bacterial taxa were quantified by qPCR using specific primers designed in this study and considering the average of 16S rRNA gene copies previously counted into the genome of each bacterial taxon. Water pipe biofilm showed the highest rate of bacterial diversity in the samples collected in the first sampling period. For the samples collected in the second sampling, the highest rate of bacterial diversity was revealed for molasses and must. PCA suggested that biofilms (but not external sources) are the main contaminants in the studied fermentation process. It is probably due their similarities with the composition of other analyzed communities. Lactobacillus and Bacillus species predominated in first sampling period. Halomonas, Streptococcus, Lactococcus and Pseudomonas were detected in biofilm and liquid samples. They were the main contaminants from biofilm at this time of sampling. In the second sampling period, Bacillus was the most common genera and other lactic acid bacteria such Streptococcus, Staphylococcus and Lactobacillus were also the most frequent contaminants. These results agree with other reported in the literature about conventional fermentation systems. Only the primers designed in this study to amplify the 16S rRNA gene of Burkholderia, Pseudomonas and Weissella showed specificity in tests with bacterial strains. Halomonas sp. was revealed in biofilms from tank fermentation by DNA sequencing using designed primers for genera. Halomonas can produce levan and may consume sucrose available for generation of alcohol. Centrifugal biofilm had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.93E+06 CFU.mg-1 and 2.14E+07 CFU.mg-1, respectively). In liquid samples, yeast had the highest amount of bacteria in both sampling periods (1.03E+08 CFU.ml-1 and 2.96E+06 CFU.ml-1, respectively); it shows significant levels of contaminants. Burkholderia and Pseudomonas were more abundant among biofilm samples of all samplings. Burkholderia was present in high quantities in the majority of liquid samples taken during the first sampling period; Pseudomonas and Weissella equivalently predominated among samples taken during the second sampling period

O etanol contribui significativamente para que a matriz energética do país se apresente extremamente favorável quanto à participação da energia renovável. A demanda por este biocombustível é crescente e tecnologias que permitam a sua produção de forma sustentável é de suma importância, como a fermentação com alto teor de etanol, já empregada em alguns países. Linhagens de leveduras com tolerância a múltiplos estresses muito contribuíram para a implantação de tal tecnologia no Brasil. Neste contexto se insere o presente trabalho, o qual busca linhagens de leveduras capazes de suportar os estresses impostos por uma fermentação com alto teor alcoólico. Para tal, 3 entre as melhores linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae atualmente disponíveis (CAT-1, PE-2 e SA- 1), foram utilizadas num programa para a seleção de híbridos para tolerância múltipla aos estresses etanólico, osmótico, ácido, além de outros, inerentes à fermentação com alto teor de etanol. Estas linhagens foram esporuladas e dissecadas para obtenção de células haplóides, as quais foram submetidas a cruzamentos entre- e intra-linhagens. Foram conduzidos cruzamentos massais (aleatórios) cujos produtos foram submetidos à evolução adaptativa em meios com os fatores estressantes em intensidades crescentes no transcorrer de 80 gerações. Ao final da evolução buscou-se variantes prevalentes na população de híbridos, os quais foram submetidos a novos procedimentos seletivos com imposições de várias condições estressantes. Igualmente foram conduzidos cruzamentos direcionados entre haplóides mediante micromanipulação, sendo tais híbridos submetidos ao mesmo procedimento seletivo nos meios estressantes. Assim, a partir de 230 haplóides das 3 linhagens, 174 isolados (120 oriundos dos cruzamentos massais e 54 dos cruzamentos direcionados) foram pré-selecionados pela maior tolerância aos meios seletivos, tendo os seus cariótipos estabelecidos mediante a cariotipagem eletroforética. Os isolados com maior tolerância (27) foram novamente avaliados em fermentações com reciclo de células e sob condições de elevado teor alcoólico (até 14,5% v/v) em mosto de melaço e água. Em todas as etapas da seleção os isolados foram comparados com as linhagens parentais (CAT-1, PE-2 e SA-1), sendo que ao final do processo seletivo destacou-se a linhagem 35B (híbrido entre CAT-1 e PE-2) com atributos fermentativos superiores aos exibidos pelos parentais. Tais atributos fermentativos contemplaram parâmetros bioquímicos, fisiológicos e tecnológicos (rendimento em etanol, viabilidade celular, crescimento em biomassa, formação de glicerol e teores celulares de carboidratos de reserva glicogênio e trealose). Os resultados permitem sugerir que devido às características fermentativas desejáveis do híbrido 35B, o mesmo possa ser empregado no processo industrial para ser avaliado como uma promissora linhagem a conduzir a fermentação com alto teor alcoólico. / Ethanol contributes significantly to the energy country matrix, which presents itself as extremely favorable to the share of renewable energy. The demand for this biofuel is increasing and technologies for its production in a sustainable way is of paramount importance such as fermentation with very high gravity, already used in some countries. Yeast strains tolerant to multiple stresses greatly contributed to the deployment of such technology in Brazil. In this context the present work is inserted, which seeks yeast strains capable of withstanding the stresses imposed by high ethanol content fermentation. In order that, three of the best industrial strains of Saccharomyces cerevisiae currently available (CAT-1, PE-2 and SA-1), were used in a program to select hybrids with tolerance towards multiples stresses: ethanolic, osmotic and acid, besides other factors involved in a high ethanol content fermentation. These strains were sporulated and dissected to obtain haploid cells, which were submitted to inter- and intra-strains crossings. Hybrids from polycrossings (random crossings) were subjected to an adaptative evolution in media with increasing stressing action over the course of 80 generations. At the end of evolution, prevalent variants were sought in the hybrids population, and submitted to new selective procedures with several stressing conditions. In the same way, directed crossings (between identified haplois) were performed by micromanipulation, and the resulting hybrids were subjected to the same selective procedure. Therefore, from 230 haploid from the 3 parent strains, 174 were isolated (120 from polycrossings and 54 from directed crossings) and pre-selected for higher tolerance in selective media; moreover their karyotypes were established by electrophoretic karyotyping. Strains showing greater tolerance (27) were again evaluated during cell recycling fermentations with high ethanol content (up to 14.5% v/v) using must formulated with water and molasses. At all stages, the isolates were compared with the parental strains (CAT-1, PE-2 and SA-1), and at the end of the selection process, the strain 35B (hybrid between CAT-1 and PE-2) standed out with fermentative attributes higher than the parentals. The fermentative performance was assessed by biochemical, physiological and technological parameters (ethanol efficiency, cell viability, biomass gain, glycerol formation and cellular levels of reserve carbohydrates - glycogen and trehalose). The results suggest that due to desirable fermentation traits, the hybrid 35B, could be used as starter in industrial fermentation process with high ethanol content.

O Brasil é o segundo maior produtor e um dos maiores exportadores de etanol no mundo e tal biocombustível tem grande impacto na economia do país. A expectativa é de grande demanda por tal produto, quer pelo crescente consumo interno, como também em decorrência do fim do protecionismo nos Estados Unidos. Portanto, o Brasil deverá produzir mais etanol e a um custo mais reduzido para manter a competitividade frente aos combustíveis fósseis. Dentre as inovações tecnológicas estaria a fermentação com alto teor alcoólico. Contudo, um dos fatores limitantes para a implantação desta tecnologia é a ausência de leveduras apropriadas para tolerar as condições severas impostas por este tipo de fermentação, onde múltiplos estresses são impostos simultaneamente às leveduras. Assim, este trabalho se propôs a selecionar, da biodiversidade de leveduras encontradas nas destilarias brasileiras, linhagens de Saccharomyces cerevisiae com capacidade de conduzir fermentações com alto teor alcoólico e em condições de reciclo celular. A estratégia de seleção consistiu na busca de linhagens com tolerâncias múltiplas, frentes aos estresses etanólico, osmótico, ácido e térmico. Para tal, um total de 525 linhagens, obtidas de diferentes destilarias, foram submetidas a uma seleção para destacar linhagens com múltipla tolerância. Cerca de metade destas linhagens foram submetidas a uma seleção prévia avaliando-se o crescimento (D.O.570nm, durante 24 horas a 30ºC) em meio constituído de mosto misto (melaço e caldo de cana) com 25% de ART, selecionando 200 linhagens. Estas, acrescidas de mais 249 não avaliadas no meio anterior, foram igualmente submetidas a processo seletivo em meio contendo múltiplos estresses (etanólico, osmótico, ácido e térmico). Tal meio foi desenvolvido após avaliações de 26 combinações com os diferentes estresses acima mencionados e com diferentes intensidades. O objetivo foi buscar um meio que melhor discriminasse as tolerâncias das leveduras referencias: as linhagens de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e de panificação, com e sem capacidade de implantação no processo industrial, respectivamente. A tolerância foi avaliada pela formação de biomassa (D.O.570nm, durante 24 horas a 30ºC). Assim, tal meio seletivo permitiu a seleção de 34 linhagens com perfis de tolerância igual ou superior ao da linhagem PE-2. Estas linhagens foram, a seguir, avaliadas quanto à viabilidade celular e ao crescimento em fermentações de mosto misto com teores crescentes de açúcares, ao longo de 10 reciclos a 30oC, atingindo teores de etanol de 15 a 16% (v/v). As 10 linhagens com os melhores desempenhos foram submetidas à avaliação final em fermentações simulando condições industriais, em reciclos fermentativos a 32ºC empregando-se mosto misto com teores crescentes de açúcares, permitindo aumentos nos teores de etanol de 11 a 15% (v/v) ao longo dos reciclos. Para esta avaliação final os seguintes parâmetros foram estimados: rendimento em etanol, formação de biomassa e glicerol, teores de açúcares residuais, viabilidade celular, e teores celulares dos carboidratos de reserva (glicogênio e trealose). Pelo menos 4 linhagens mostraram atributos fermentativos superiores ao da linhagem referência (PE-2), permitindo concluir que linhagens capazes de conduzirem a fermentação com alto teor de etanol podem ser obtidas da biodiversidade encontrada no ambiente das destilarias. / Brazil is the second largest ethanol producer and one of the leading ethanol exporter in the world, and this biofuel has great impact on the country economy. Huge demand is expected for this product, not only to supply the growing domestic consumption but due to the end of the United States market protectionism. In view of this, Brazil should produce more ethanol and at a lower cost to maintain competitiveness in relation to fossil fuels. One of the technological approaches which emerges is the high ethanol content fermentation. However, one of the limiting factors for this technology is the absence of proper strains to face the very harsh fermentation condition, where several stresses are simultaneously imposed to the fermenting yeast. This work aimed at selecting Saccharomyces cerevisiae strains from the biodiversity of yeasts found in Brazilian distilleries to conduct high ethanol fermentation with cell reuse. The selection strategy was to search for multiple tolerant strains to ethanol, acid, osmotic and thermal stresses. For that, a total of 525 strains, which were obtained from several distilleries, were subjected to a selection in order to highlight multi-tolerant strains. About half of these strains were subjected to a pre-screening procedure to evaluate growth (O.D.570nm, for 24 hours at 30ºC) in medium containing molasses and sugarcane juice (25% TRS), and 200 strains were selected. These 200 strains, together with 249 strains not previously evaluated, were screened in a medium imposing multiple stresses (ethanol, acid, osmotic and thermal). This medium was chosen after assessments of 26 different medium formulations with the above mentioned stresses and with different intensities. The purpose of that was to find a medium which best discriminate the tolerance of the reference yeasts: PE-2 and bakery Saccharomyces cerevisiae strains, with and without ability to persist in the industrial process, respectively. The strain tolerance was evaluated by biomass formation (O.D.570nm, for 24 hours at 30ºC). By this mean 34 strains were selected displaying similar or superior performance in comparison with PE-2 strain. These strains were then assessed for cell viability and growth in cell reuse fermentations (10 cycles), using cane juice/molasses substrates with increasing sugar content, at 30ºC, reaching 15-16% ethanol (v/v). The 10 strains with the best performances were subjected to final evaluation in fermentations simulating the industrial process with cell reuse, at 32ºC, using the same substrate with increasing sugar content, which allowed rises in ethanol content from 11 to 15% (v/v) over the cycles. For this final evaluation, the following parameters were determined: ethanol yield, biomass and glycerol formation, residual sugar levels, cell viability and storage carbohydrate levels (trehalose and glycogen). At least four strains showed superior fermentative attributes to reference strain (PE-2), leading to the conclusion that strains able to conduct high ethanol content fermentations can be obtained from the natural biodiversity found in Brazilian distilleries.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A matriz energética mundial é baseada em fontes fósseis e renováveis. No Brasil, o bioetanol é gerado principalmente a partir da cana-de-açúcar. Resíduos agroindustriais (fontes celulósicas ou amiláceas) despontam como biomassas alternativas à cana-de-açúcar, para aumentar a competitividade deste combustível renovável frente aos de origem fóssil e também favorecer a sustentabilidade e a segurança alimentar e energética, pois são ricos em polissacarídeos não diretamente fermentescíveis, abundantes (problema ambiental) e apresentam baixo valor comercial. O farelo de mandioca é um exemplo de resíduo sólido gerado na produção de fécula (amido) e farinha de mandioca que ainda contém, em média, 75% de amido. Consequentemente, deve ser previamente hidrolisado e posteriormente fermentado por leveduras do gênero Saccharomyces para gerar etanol. O objetivo deste estudo foi produzir bioetanol a partir de hidrolisados enzimáticos de farelo de mandioca, usando levedura álcool resistente (AR). Primeiramente, a concentração de açúcares obtida a partir da hidrólise enzimática foi verificada através de um planejamento fatorial completo (24), com triplicata no ponto central, a fim de investigar a influência dos seguintes fatores na hidrólise: concentração de α-amilase (Termamyl 2X), tempo de liquefação, concentração de glucoamilase (AMG 300L) e o tempo sacarificação. A condição de hidrólise mais favorável foi a do ensaio com 0,517 mL de AMG/g amido, 0,270 mL de Termamyl/g amido, 1h de tempo de liquefação e 2h de tempo de sacarificação. O caldo resultante da condição escolhida alcançou altas concentrações de glicose (160 g/L). Os ensaios de fermentação alcoólica foram realizados em duplicata em biorreator de 3L, em regime de batelada, a 30C, 100 rpm e pH 5,5. Cerca de 3 g/L (massa seca) de uma linhagem de levedura álcool tolerante, Saccharomyces cerevisiae Hansen BY4741, crescida por 12h em meio YEDP (2% de glicose) foram usados como inóculo. O mosto consistiu de um litro de hidrolisado (160 g/L de glicose) fortificado com extrato de levedura (1%) e peptona de carne (1%), além da adição de um antiespumante (Tween 80) na concentração de 0,05% (m/v). Em 30 horas de fermentação, a média da concentração de etanol obtida foi de 65 g/L. A eficiência foi de 87,6% e o rendimento e a produtividade foram 0,448 e 2,16 g/L.h, respectivamente. Os resultados indicaram a aplicabilidade do farelo de mandioca como matéria-prima para a produção de bioetanol / The world energy matrix is based on fossil and renewable sources. In Brazil, bioethanol is generated mainly from sugarcane. Agro-industrial wastes (cellulosic or starchy sources) emerge as an alternative to sugarcane biomass, in order to increase this renewable fuel competitiveness against fossil ones, and also promote sustainability, food security and energy security, because they are rich in polysaccharides (not directly fermentable), abundant (environmental problem), and have low commercial value. The cassava bagasse is an example of a solid waste originated from starch and cassava flour industries, which still contains on average 75% of starch. Consequently, it should be hydrolyzed and then fermented by Saccharomyces yeasts in order to generate ethanol. This study aimed to produce bioethanol from enzymatic hydrolysate of cassava bagasse, using alcohol resistant (AR) yeast. At first, the concentration of sugars obtained from enzymatic hydrolysis was verified using a full factorial design (24) with triplicate at the center point to investigate the influence of α-amylase concentration (Termamyl 2X), liquefaction time, glucoamylase concentration (AMG 300L), and saccharification time. The best condition of hydrolysis was 0,270 mL of Termamyl/g starch, 1h of liquefaction, 0,517 mL of AMG/g starch, and 2h of saccharification. The resultant syrup of the chosen condition achieves high levels of glucose (160 g/L). Alcoholic fermentation assays were performed in duplicate in a 3L bioreactor under batch regime at 30C, 100 rpm and pH 5.5. About 3 g/L (dry weight) of an alcohol tolerant yeast strain, Saccharomyces cerevisiae Hansen BY4741, grown for 12 h in YEDP medium (2% glucose), were used as inoculum. The fermentation broth consisted of one liter of hydrolysate (160 g/L of glucose) supplemented with yeast extract (1%) and meat peptone (1%), plus the addition of an antifoam (Tween 80) in a concentration of 0.05% (w/v). At 30 hours of fermentation, the average ethanol concentration obtained was 65 g/L. The efficiency was 87.6% and the yield and the productivity were, respectively, 0.448 and 2.16 g/L.h. The results indicated the applicability of cassava bagasse as raw material for bioethanol production