Un nombre alarmant de personnes signalent une maladie persistante appelée COVID longue après leur infection par le virus SRAS-CoV-2. Il y a 650 million de cas de COVID-19 dans le monde, dont 10% de ces personnes développent des symptômes persistants. Parmi les symptômes observés, on remarque une fatigue profonde, de la myalgie, des troubles cognitifs, etc. Ces symptômes sont étonnamment similaires à ceux de l'encéphalomyélite myalgique (EM), une maladie chronique débilitante. L’EM est une maladie complexe souvent caractérisée par une fatigue profonde et le malaise après-effort. Environ 70% des patients atteints d'EM décrivent des épisodes d'infections virales comme élément déclencheur. Une autre maladie qui partage des symptômes similaires à l’EM est la fibromyalgie (FM). La FM est une autre maladie chronique et débilitante qui se caractérise par une douleur musculosquelettique et une sensibilisation centrale. Il n’existe toujours pas de traitement ni de test diagnostic à ce jour. Auparavant, nous avons découvert et validé onze microARN en tant que premier panel diagnostic pour l'EM et la FM. La majorité de ces petits ARN non codants participent à la régulation de gène, l'immunité et l'inflammation. Ce projet consiste à déterminer les trajectoires cliniques des personnes atteintes de la COVID longue à l’aide d’un nouveau test pronostic constitué de 11 miARN circulants permettant de différencier les diverses séquelles de la COVID longue. Par la suite, une recherche pan-génomique a permis d’établir une signature moléculaire plus précise pour chacun des six sous-groupes COVID longue. Nous proposons que les effets du virus SRAS-CoV-2 sur les microARN de l'hôte pourraient déclencher la persistance des symptômes de la COVID longue et que l’expression différentielle de certains microARN puissent contribuer au développement de différentes séquelles à long terme. Nous avons recruté des participants âgés de plus de 18 ans ayant été infectés par le virus SRAS- CoV-2, non-hospitalisés et présentant une COVID longue de plus de six mois et des sujets sains (groupe pré-pandemie) n’ayant pas reportés d’infection. L’analyse des symptômes a été réalisée à l’aide de trois questionnaires (SF-36, MFI-20, DSQ) complétés par tous les participants. Les niveaux d’expression de 11 microARN, précédemment identifiée dans l’EM, ont été mesurés par RT-qPCR dans des échantillons de plasma et la détermination des différentes trajectoires associées à des séquelles à long terme a été réalisée par analyse des composantes principales et validée par Random Forest Model (RFM). En stratifiant les patients selon leur signature de 11 miARN, nous avons évalué l’expression globale des 2549 miARN pour chaque séquelle et identifié de nouveaux miRNA spécifiques pour chacun des groupes à l’aide de la technologie microRNA array Agilent, une biopuce de la société Agilent. Nos données préliminaires nous ont permis d’identifier une signature moléculaire spécifique à chacune des séquelles de la COVID longue. Ces résultats nous permettrons de développer un nouveau test diagnostic basé sur les miRNA afin de prédire les conséquences à la suite de l’infection par le virus SRAS-CoV-2. / An alarming number of people are reporting a persistent illness called long COVID after their infection with the SARS-CoV-2 virus. There are an estimated 650 million cases of COVID-19 worldwide, with 10% of these people developing persistent symptoms. Among the symptoms observed, we notice profound fatigue, myalgia, cognitive disorders, etc. These symptoms are strikingly similar to those of myalgic encephalomyelitis (ME), a debilitating chronic disease. ME is a complex disease often characterized by profound fatigue and post-exertional malaise. Approximately 70% of ME patients describe episodes of viral infections as a trigger. Another disease that shares similar symptoms to ME is fibromyalgia (FM). FM is another chronic and debilitating disease that is characterized by musculoskeletal pain and central sensitization. There is still no treatment or diagnostic test to date. Previously, we discovered and validated eleven microRNAs as the first diagnostic panel for ME. Most of these small non-coding RNAs participate in gene regulation, immunity and inflammation. The objective of this project was to build a new diagnostic test to differentiate the various after-effects of long COVID using miRNAs. This project consists of determining the clinical trajectories of people with long COVID using a new prognostic test made up of 11 circulating miRNAs making it possible to differentiate the various after-effects of long COVID. Subsequently, a pan-genomic search made it possible to establish a more precise molecular signature for each of the six long COVID subgroups. We recruited participants aged over 18 years who had been infected with the SARS-CoV-2 virus, who were not hospitalized and had symptoms of long COVID for more than six months and healthy subjects (pre-pandemic group) who had not reported infection. The analysis of symptoms was carried out using three questionnaires (SF-36, MFI-20, DSQ) completed by all participants. The expression levels of 11 microRNAs previously identified in EM, from plasma samples were measured by RT-qPCR and the determination of the different trajectories associated with long-term sequelae was carried out by principal component analysis (PCA) and validated by Random Forest Model (RFM). By stratifying patients according to their signature of 11 miRNAs, we evaluated the overall expression of the 2549 miRNAs for each sequelae and identified new miRNAs specific for each of the groups using the Agilent microRNA array technology, a biochip from the company Agilent. Our preliminary data allowed us to identify a molecular signature specific to each of the after-effects of long COVID. These results will allow us to develop a new diagnostic test based on miRNAs in order to predict the consequences following infection by SARS-CoV-2 viruses.

La douleur est une réponse normale qui nous permet de réagir en réponse à un trauma ou une situation qui pourrait potentiellement causer du tort à notre corps. Cette expérience désagréable n’est pas seulement physiologique, mais elle est aussi psychologique, émotionnelle et socio-culturelle. C’est ce qui la rend aussi complexe et subjective. Lorsque les mécanismes de modulation de la douleur ne fonctionnent plus normalement, ces douleurs peuvent devenir chroniques et être très handicapantes pour les patients. Dans cette étude, nous nous sommes plus particulièrement focalisés sur certaines maladies musculosquelettiques présentant de la douleur chronique telles que l’encéphalomyélite myalgique (EM), la fibromyalgie (FM) et l’arthrose ou l’ostéoarthrite (OA). L’EM et la FM sont deux maladies complexes et hétérogènes qui ont plusieurs symptômes qui se chevauchent. L’EM se caractérise généralement par de la fatigue chronique qui n’est pas soulagée par le repos et par des malaises après-effort (PEM). Alors que la FM se caractérise davantage par de la douleur chronique musculaire et articulaire. Puis, l’OA est une maladie débilitante où les patients ont une dégradation progressive du cartilage articulaire causant de la douleur chronique qui est davantage localisée au niveau des joints articulaires atteints. Actuellement, il n’existe pas de biomarqueurs idéaux pour mesurer le niveau de douleur pour ces maladies dont l’étiologie reste incertaine. Toutefois, une étude récente a démontré une diminution de l’expression du gène MFAP3 au niveau des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) chez des individus présentant des états de douleur élevée à la suite d’un syndrome post-traumatique. Ce gène code pour une protéine appelée protéine associée aux microfibrilles 3 (MFAP3), qui participent dans plusieurs processus biologiques dont l’assemblage des microfibrilles, l'élastinogenèse et l'homéostasie tissulaire, et pourrait aussi être une protéine clé impliquée dans l’inhibition de la douleur. L’objectif de cette étude est de mieux comprendre le rôle de la protéine MFAP3 et son implication dans la douleur dans ces différentes pathologies. L’expression du gène MFAP3 a été mesurée dans les PBMC de patients atteints d’EM, de FM, d’OA et de sujets sains (HC) et a été corrélée aux niveaux de douleur des patients. Une recherche in silico nous a permis d’identifier des récepteurs membranaires impliqués dans la douleur et pouvant interagir physiquement avec la protéine MFAP3 dont le récepteur HTR3A (le récepteur à sérotonine 3A). La spectroscopie cellulaire diélectrique a été utilisée pour valider cette interaction dans des cellules Jurkat (lymphocytes T humains immortalisés) dans des conditions standards. Il a été observé que la protéine MFAP3 inhibait la réponse induite par la stimulation de ce récepteur. Cette recherche pourrait éventuellement conduire au développement de nouvelles thérapies pour traiter la douleur associée à ces maladies musculosquelettiques. / Pain is a normal response that allows us to react in response to trauma or in situations that are dangerous or could potentially harm our body. This unpleasant experience is not only physiological, but it is also psychological, emotional, and socio-cultural. This is what makes it so complex and subjective. When pain modulation mechanisms no longer function normally, pain can become chronic and be very disabling for patients. In this study, we particularly focused on some musculoskeletal diseases presenting chronic pain such as myalgic encephalomyelitis (ME), fibromyalgia (FM) and osteoarthritis (OA). ME and FM are two complex and heterogeneous diseases that exhibit several overlapping symptoms. ME is characterized by a chronic fatigue that is not relieved by rest and post-exertional malaise (PEM), whereas FM is rather characterized by more chronic muscle and joint pain. In regard to OA, this debilitating disease leads to a progressive degradation of articular cartilage joints resulting in chronic pain which is more localized in the affected joints. Currently, there are no ideal biomarkers to measure pain level for these diseases and their etiology remains unclear. However, a recent study demonstrated a decrease in MFAP3 gene expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in individuals presenting high pain states following a post-traumatic syndrome. This gene encodes a protein called Microfibril-associated protein 3 (MFAP3), which participates in several biological processes including microfibril assembly, elastinogenesis and tissue homeostasis, and could also be a key protein involved in pain inhibition. The objectives of this study were to better understand the role of the MFAP3 protein and its involvement in pain in these different pathologies. MFAP3 gene expression was measured in PBMCs from patients with ME, FM, OA and healthy subjects (HC) and correlated with their pain levels. In silico research allowed us to identify membrane receptors involved in pain that can physically interact with the MFAP3 protein, including the HTR3A receptor (Serotonin receptor 3A). Cellular dielectric spectroscopy was used to validate this interaction in Jurkat cells (immortalized human T lymphocytes) under standard conditions. It was observed that MFAP3 inhibits the response induced by this receptor stimulation. This research could eventually lead to the development of new therapies to treat pain associated with these musculoskeletal diseases.

L'encéphalomyélite myalgique (EM) est une maladie chronique complexe et hétérogène dont l'étiologie et la physiopathologie restent mal comprises. Cette maladie comporte une multitude de symptômes et se caractérise par une fatigue constante inexpliquée, non soulagée par le repos et un malaise post-effort (MPE), qui se traduit par une aggravation des symptômes à la suite d’une activité physique ou cognitive minimale. Bien que le MPE soit le symptôme caractéristique de l'EM, plusieurs symptômes peuvent varier au fil du temps selon les personnes affectées en termes de fréquence et d'intensité. Environ 60 % des personnes atteintes d'EM souffrent d’une dysautonomie, plus fréquemment d’une intolérance orthostatique (IO) et, souvent, d’un syndrome de tachycardie orthostatique posturale (STOP). L’IO et le STOP sont déclenchés par un changement de position de couché à debout et sont aggravés par le MPE. Les patients gravement atteints par l’EM sont confinés à la maison et souvent cloués au lit. L'EM est une maladie qui affecte globalement des millions de personnes, incluant plus de 500,000 Canadiens. Cependant, le nombre de personnes souffrant de cette maladie pourrait en fait être une sous-représentation de la réalité car environ 84 à 91 % d’entre elles ne sont toujours pas diagnostiquées. Le diagnostic de l’EM est difficile en raison du manque de biomarqueurs validés et du chevauchement dans les symptômes avec d'autres maladies telles que la fibromyalgie (FM). La FM est une autre maladie chronique dont l'étiologie demeure inconnue avec une prévalence d'environ 2 à 3 % de la population et présente plusieurs symptômes en commun avec l'EM, tels que la fatigue, les problèmes de sommeil et les troubles cognitifs. Alors que l'EM est davantage caractérisée par la MPE, la FM est associée aux douleurs chroniques, à un faible seuil de douleur et à une sensibilité musculaire. Avec des preuves à l’appui et compte tenu de la nature hétérogène de l’EM, il est reconnu que la pathogénèse de cette maladie est le résultat d’une combinaison de facteurs. D’abord, il y a les prédispositions génétiques, car souvent plusieurs membres de la famille sont atteints. Ensuite, il y a les expositions environnementales telles que les toxines, les moisissures, l’exposition aux métaux lourds (mercure, arsenic, etc.). De plus, les infections par des agents pathogènes viraux (H1N1, EBV, etc.) ou bactériens (Borrelia burgdorferi), ainsi que des stress majeurs peuvent jouer un rôle comme agent déclencheur dans la maladie. Les microARN (miARN) sont une classe de petits ARN non codants qui possèdent la capacité de réguler l'expression de plusieurs gènes et ont donc un impact considérable sur les fonctions physiologiques. Il est important de noter que l’expression de nombreux miARN est modulée par les facteurs génétiques, épigénétiques et environnementaux. Nous proposons que les miARN jouent un rôle dans la pathogenèse de l'EM en modulant plusieurs voies physiologiques dont la réponse au stress. L'objectif général de cette thèse était d'examiner le rôle des miARN dans la physiopathologie de l'EM et leur contribution dans la variabilité et à la gravité des symptômes. Dans le premier article, nous avions pour objectif d’identifier les miARN impliqués dans l’EM. Ceci nous a conduit à découvrir 11 miARN circulants qui sont dérégulés et associés au MPE déclenché par l'application d'une provocation standardisée. Basé sur les changements d’expression de ces miARN après un stress appliqué provoquant un MPE chez les participants EM, nous avons pu créer un algorithme capable de différentier avec succès les individus EM des témoins sains. De plus, en utilisant le regroupement k-means, nous avons identifié quatre sous-groupes distincts de patients atteints d'EM présentant des profils de miARN et une gravité de la maladie différents. Parmi les 11 miARN identifiés, l'expression dérégulé de hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-150-5p et hsa-miR-374b-5p avait été précédemment associée à la FM dans la population norvégienne. L'objectif du deuxième article était d'évaluer les niveaux d'expression des 11 miARN associés à l'EM chez les patients atteints de FM ainsi que chez ceux présentant un diagnostic comorbide d'EM et de FM (EM+FM). Nous avons observé des signatures d'expression différentielles des 11 miARN entre les individus EM, FM et EM+FM. Ces résultats nous ont permis de développer un modèle de prédiction basé sur une approche d’apprentissage automatique, capable de différentier les maladies EM et FM. L'un des miARN identifiés dans notre panel diagnostic d’EM, hsa-miR-150-5p, est prédit de réguler l'expression du gène SLC6A2 codant pour le transporteur de norépinephrine (NET). L’inactivation du transporteur NET a été mise en évidence par la découverte de mutations inactivatrices associées à une forme familiale rare de STOP ce qui n’est pas le cas pour la majorité des personnes atteintes de STOP. Néanmoins, chez ces personnes le niveau de la protéine NET et son expression sont souvent réduites. L'objectif du troisième manuscrit était d'étudier l'implication de miR-150-5p dans le STOP et IO survenant chez les personnes souffrant d'EM, EM+FM et STOP sans EM ni FM. Dans cette étude, nous avons confirmé une élévation du taux plasmatique de norépinephrine chez les participants atteints de STOP (avec et sans EM), suggérant une réduction de la protéine NET. Parmi les patients atteints d'EM avec STOP/IO et les patients STOP uniquement (sans EM), nous avons déterminé un mécanisme double par lequel le STOP est déclenché, centré sur deux profils distincts impliquant des taux plasmatiques faibles et élevés de miR-150-5p. Nous avons réalisé des expériences in vitro permettant de moduler les niveaux d’expression du miR-150-5p dans la lignée cellulaire SH-SY5Y, et mis en évidence une augmentation de l'expression du gène SLC6A2 suggérant un mécanisme indirect impliquant une réduction significative dans les niveaux de protéine EZH2, un puissant répresseur transcriptionnel de SLC6A2 et une autre cible confirmée de miR-150-5p. Dans cette thèse, nous avons identifié un panel diagnostic constitué de 11 miARN circulants qui, grâce à une combinaison d'un test d'effort, peuvent aider au diagnostic des individus atteints d'EM et révéler de nouvelles informations sur la physiopathologie de l'EM. De plus, ce panel de miARN peut être utilisé pour différentier les conditions de EM, FM et EM+FM, ce qui est vital pour la compréhension de la physiopathologie de chaque maladie. Finalement, nous proposons un nouveau mécanisme par lequel l'altération de miR-150-5p peut déclencher le STOP/IO chez les individus atteints d'EM, EM+FM ainsi que chez ceux souffrant de STOP sans EM. Le diagnostic précis des individus à l'aide des miARNs en tant que biomarqueurs aidera à déterminer des mesures préventives, à établir des traitements efficaces et à identifier des cibles thérapeutiques pour la maladie EM par une manipulation directe ou indirecte de l'expression des miARN. / Myalgic encephalomyelitis (ME) is a complex chronic heterogeneous illness whose etiology and pathophysiology remain poorly understood. This disease has a multitude of symptoms, and it is characterised by unexplained constant fatigue unrelieved by rest and post-exertional malaise (PEM), which is reported as a worsening of symptoms following a minimal physical or cognitive activity. While PEM is the hallmark symptom of ME, some symptoms can vary overtime among affected individuals in frequency and intensity. About 60% of people with ME experience autonomic dysfunctions often refereed as dysautonomia and can result in orthostatic intolerance (OI) and in some cases in Postural Orthostatic Tachycardia Syndrome (POTS). Both OI and POTS are triggered by a change of position from supine to standing and are worsened by PEM. Severely affected patients are housebound and often bedridden. ME is common in all populations and it is known to affect over 500,000 Canadians. However, the number of people suffering from this disease may be in fact an underrepresentation of the reality because about 84-91% remain undiagnosed. Diagnosis is challenging due to a lack of validated biomarkers and overlap in symptoms with other diseases such as Fibromyalgia (FM). FM is another chronic illness with unknown etiology with a prevalence of about 2-3% of the population and has several common symptoms with ME such as fatigue, sleep problems and cognitive impairment. While ME is more characterised by PEM, FM is associated with more chronic pain, low pain threshold and muscle tenderness. With supporting evidence and the heterogeneous nature of ME, it is evident that the pathophysiology of this disease includes a combination of factors. First of all, there are predisposing genetic factors since it is common to observe several affected family members. Then, there are environmental exposures such as toxins, mold, exposure to heavy metals (mercury, arsenic, etc.). In addition, viral pathogen infections (H1N1, EBV, etc.) or bacterial infections (Borrelia burgdorferi) as well as major stress can play a role as a triggering agent in the disease. MicroRNAs (miRNAs) are a class small non-coding RNAs that possess the ability to regulate the expression of several genes and therefore greatly impact physiological functions. Of note, the expression of many miRNAs is modulated by genetic, epigenetic, and environmental factors. We propose that miRNAs play a role in the pathogenesis of ME by modulating several physiological pathways particularly in response to stress. The general objective of this thesis was to examine the role of miRNAs in the pathophysiology of ME and their contribution to symptom variability, and severity. In firstly paper, we aimed to determine the miRNAs involved in ME disease. We have identified using microarray technology and confirmed by qPCR a panel of 11 circulating miRNAs that are deregulated and associated with PEM in response triggered by the application of a standardized provocation maneuver. Based on the changes of those miRNAs due to the applied stress test that provokes PEM in ME participants, we were able to create an algorithm capable of successfully differentiate ME individuals from healthy controls (HC). In addition, using k-means clustering, we have identified four distinct subgroups of ME patients with different miRNA profiles and severity of the disease. Among the selected 11 miRNAs, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-150-5p and hsa-miR-374b-5p downregulated expression was previously associated with FM in the Norwegian population. The objective of the second paper was to investigate the expression levels of the 11 associated miRNAs with ME in FM patients as well as those with a comorbid diagnosis of ME and FM (ME+FM). We observed differential expression signatures of the 11 miRNAs between ME, FM and ME+FM individuals. These results prompted us to develop a prediction model based on machine learning approach, which can differentiate ME and FM illnesses. One of the miRNAs identified in our ME diagnostic panel, hsa-miR-150-5p is predicted to regulate the expression of SLC6A2 gene encoding norepinephrine transporter (NET). Inactivation of NET transporter by mutations was discovered in rare familial form of POTS which is not the case for most people with POTS. Nevertheless, in these people the level of the NET protein and its expression are often reduced. The objective of the third manuscript was to investigate the implication of miR-150-5p in POTS and OI occurring in people suffering of ME, ME+FM and POTS without ME or FM. In this study, we confirmed an elevation of plasma norepinephrine in participants with POTS (with and without ME), suggesting a reduction in NET protein. Among ME patients with POTS/OI, and POTS-only patients (without ME), we determined a dual mechanism by which POTS is triggered centered on two distinct profiles involving low and high plasma miR-150-5p levels. We performed in vitro experiments and with modulation of miR-150-5p expression levels in SH-SY5Y cells line, we observe an increase in SLC6A2 expression, suggesting an indirect mechanism involving a significant reduction in levels of EZH2 protein, a powerful transcriptional repressor of SLC6A2 and another confirmed target of miR-150-5p. In this thesis, we have identified a panel of circulating miRNAs, which in combination to a stress test, can aid in the accurate diagnosis of ME individuals and reveal new insights into the ME pathophysiology. In addition, this panel of miRNAs at baseline can be used to differentiate ME from FM or when it co-exists with the ME (ME+FM), which is crucial for understanding the pathophysiology of each illness. And finally, we propose a first mechanism by which alteration of miR-150-5p can trigger POTS/OI in individuals with ME, ME+FM as well as in those suffering of POTS without ME. The accurate diagnosis of individuals with the help of miRNAs as biomarkers will help to establish preventive measures, effective treatments, and therapeutic targets for ME disease by a direct or indirect manipulation of miRNA expression.