Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La Enfermedad de Chagas (ECh) es una zoonosis causada por el parásito Trypanosoma cruzi. En Chile, se estima que existen aproximadamente 160.000 personas infectadas. La ECh cursa con dos etapas clínicas, la etapa aguda y la crónica; un 30% de los pacientes desarrolla cardiopatía, megasíndromes digestivos o ambos. La mayoría de los individuos se encuentran en la fase crónica indeterminada, donde los resultados de tratamiento farmacológico no han sido concluyentes, debido a que la negativización total de las pruebas serológicas convencionales requiere años de seguimiento. Nifurtimox (NF) y Benznidazol (BZ) son los únicos fármacos autorizados para el tratamiento etiológico. El objetivo fue evaluar la eficacia de NF en el tratamiento de la ECh crónica en seguimiento prolongado utilizando parámetros serológicos, determinando si existen diferencias estadísticamente significativas entre dos grupos de estudio, utilizando las técnicas de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y ELISA. La población en estudio estuvo conformada por 100 individuos con ECh crónica tratados (6,6 años promedio), 100 individuos con ECh crónica no tratados y 100 individuos negativos para ECh. Se realizó el análisis estadístico utilizando pruebas no paramétricas en ELISA (Mann Withney: p= 0,0003) y paramétricas en IFI (t Student: p=0,0001). Se logró determinar que existen diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en ambas pruebas. Concluyéndose que los niveles de IgG en individuos con ECh son menores en individuos tratados con NF, respecto a los no tratados, lo que indica eficacia quimioterapéutica en seguimiento prolongado / Human American Trypanosomiasis or Chagas disease (ChD) is caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi. Probably affects 160.000 people in Chile. ChD has two successive phases: acute and chronic. Several years of starting the chronic phase, 30% of infected individuals develop irreversible lesions of the autonomous nervous system in the heart, digestive system, or both. Mostly infected are in the indeterminate form of human chronic ChD, without conclusive results, because the total negativization of conventional serological tests requires years of follow-up. Nifurtimox (NF) and benznidazole (BZ) are the availables drugs for the etiological treatment. The aim was to evaluate the efficacy of NF in the treatment of chronic ChD using serological parameters, determining if there are statistically significant differences between three study groups, using Indirect Immunofluorescence (IFA) and ELISA techniques. Study population consisted of 100 individuals with treated chronic ChD (6.6 years average), 100 individuals with chronic untreated ChD and 100 individuals negative for ChD. Statistical analysis was performed using nonparametric tests in ELISA (Mann Withney: p = 0.0003) and parametric tests in IFA (Student t test: p = 0.0001), which allowed determining that there are statistically significant differences (p <0.05) in both tests. It is concluded that the levels of IgG in individuals with ChD are lower in individuals treated with NF, compared to those not treated, indicating chemotherapeutic efficacy in prolonged follow-up / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No. 1161485.

Apresentam-se os resultados dos primeiros experimentos com o novo acelerador de elétrons do Laboratório do Acelerador Linear (LAL) do Instituto de Física da USP, cuja primeira fase de montagem encontra-se concluída. Adicionou-se uma linha de irradiação ao projeto original do Microtron, que permite usar o feixe de elétrons com 1,9 MeV de energia do injetor. Espectros de bremsstrahlung de elétrons em alvos finos de Ag e Au, observados a 30o e 60o em relação ao feixe, foram medidos com um detector coaxial de HPGe, cujas dimensões, inclusive do orifício interno e da camada morta do cristal, foram determinadas por medidas experimentais e simulações de Monte Carlo com o código MCNPX, a fim de estimar a resposta do detector para a deconvolução dos espectros. As secções de choque de produção de bremsstrahlung foram medidas tanto para todo o espectro observado (100 1910 keV) quanto para a região próxima ao tip (1700 1910 keV). Os resultados na região do tip concordam com as previsões dos códigos MCNPX e PENELOPE. As causas das discrepâncias observadas para energias menores que 1800 keV são discutidas. Apresenta-se também o projeto de um sistema de medidas de Ressonância Fluorescente Nuclear (NRF) para o estudo de excitações dipolares dos núcleos com fótons de bremsstrahlung, que se pretende usar assim que a energia dos elétrons do Microtron alcance 10 MeV. O projeto desse sistema leva em conta as particularidades da instalação do acelerador e da sala de irradiação e busca minimizar a radiação devida aos fótons espalhados nas paredes e aos nêutrons produzidos em reações fotonucleares. O comportamento dos elementos que conformam o sistema de NRF: radiador, colimador, blindagem dos detectores e coletor do feixe de fótons foram estudados por simulação em função das suas características dimensões, formas, materiais com o código MCNPX. Com o projeto final do arranjo experimental, avaliaram-se as intensidades de NRF que serão observadas pelos detectores de fótons com um alvo de 27Al, típico nesse tipo de medições, que indica a viabilidade desse tipo de experimento com o Microtron. / The results of the first experiments carried out in the new electron accelerator of the Linear Accelerator Laboratory (LAL) of the Physics Institute of Universidade de São Paulo are reported here. A 1.9 MeV beam line, which allows the use of the injector beam for experimental physics, was added to the original accelerator design. Electron bremsstrahlung spectra for Ag and Au thin targets observed at 30o and 60o with respect to the beam direction were collected in a HPGe coaxial detector, whose dimensions, including crystal inner hole dimensions and dead layer thickness, were estimated by means of combined experimental measurements and Monte Carlo simulations with the MCNP code, to evaluate the detector response function to perform the deconvolution of the spectrum. Cross sections for bremsstrahlung yield were determined for the entire measured energy range (100 1910 keV) and for the tip region (1700 1970 keV). The results in the tip region are in agreement with MCNPX and PENELOPE predictions. The possible causes for the disagreement at energies lower than 1800 keV are discussed. The design of a Nuclear Resonance Fluorescence (NRF) setup, aiming the study of dipolar excitations in nuclei with bremsstrahlung photons when the Microtron electron energy reaches 10 MeV, is also shown. The setup was designed with the characteristics of the Microtron building and facilities in mind, and searches to minimize the radiation caused by scattered photons and neutrons from photonuclear reactions. The behavior of the NRF setup elements: converter, collimator, detector shielding and photon beam dump, were studied by simulation as functions of their characteristics dimensions, shapes, materials using the MCNPX code. The spectral intensity to be observed by the photon detector in the designed NRF setup with a 27Al reference target, typical for NRF measurements, was assessed by simulation and shows the feasibility of this sort of experiment with the Microtron.

Os métodos de análises por fluorescência ganham destaque frente a outros métodos devido a simplicidade nos protocolos de análise, equipamentos de baixo custo e alta sensibilidade (ppb). Devido a isso, sensores moleculares fluorescentes são ferramentas analíticas muito poderosas na detecção de diversos analitos. Nas últimas duas décadas, diversos grupos de pesquisa vêm desenvolvendo sensores cada vez mais seletivos e sensíveis. Nesse contexto, os calcogênios estão ganhando cada vez mais destaque como ligantes seletivos para uma série de analitos, especialmente para espécies oxidantes. Entretanto, sensores baseados em selênio e, especialmente telúrio, são pouco explorados na elaboração de sensores na detecção de cátions metálicos. Este trabalho teve como objetivo a utilização de selênio e telúrio no design, síntese e aplicação de novas estruturas moleculares fluorescentes para detecção de metais pesados e tóxicos. Para isso, a partir de uma matriz fluorescente, a rodamina B, foram preparados três novos sensores baseados em Se (Rh-Se) e Te (TR e TBR) para detecção seletiva de Hg2+ e Pd2+. O primeiro composto preparado foi TR, e o planejamento da sua estrutura fundamentou-se em um diaril telureto conjugado com a rodamina B. A síntese foi conduzida em quatro etapas com um rendimento global de 11%. Através de um mecanismo envolvendo a rápida oxidação do telúrio ocasionado por Hg2+/H2O, foi observado uma forte emissão de fluorescência (&#934; = 0,41) ocasionada pela formação de um teluróxido. O sensor TR apresentou alta seletividade para Hg2+ e uma boa sensibilidade, tendo um limite de detecção de 2,95 &#181;mol/L. O segundo sensor sintetizado TBR é baseado em um dímero de TR contendo duas unidades de rodamina, preparado em apenas duas etapas, em 17% de rendimento. Semelhante a TR, TBR também apresentou ótima seletividade para Hg2+, entretanto, apresentou maior sensibilidade, com limite de detecção de 1,71 &#181;mol/L. Esses sensores TR e TBR representaram uma contribuição importante na química de telúrio, já que foi a primeira vez que foi possível empregar o processo de oxidação de telúrio (II) a um teluróxido, assistido por Hg2+ em meio aquoso, no desenvolvimento de um sensor molecular fluorescente. O terceiro sensor desenvolvido foi Rh-Se, que consistiu na estrutura de um metil seleneto de arila, ligado à rodamina através de um espaçador (etilenodiamina). O sensor Rh-Se demostrou alta seletividade para Pd2+, entre 25 cátions submetidos a análise. A interação entre Rh-Se e Pd2+ ocorre por coordenação através da formação de um complexo quadrado planar que emite uma forte fluorescência em 588 nm ( = 0,17). Além disso, Rh-Se apresentou alta sensibilidade, podendo detectar Pd2+ em soluções altamente diluídas (32 nmol/L; 4 ppb). O sensor Rh-Se demostrou um alto potencial analítico, podendo ser aplicado na detecção de traços de paládio (II) em amostras \"idealizadas\" de produtos sintéticos e farmacêuticos. / The analytical methods by fluorescence gain emphasis on other methods due to their simple analytical protocols, low cost equipments and high sensibility (ppb). Because of this, florescent molecular sensors are very powerful analytical tools in the detection of several analytes. In the last two decades, many research groups have been developing more and more selective and sensible sensors. In this context, the chalcogens gain more and more prominence as selective ligands for a series of analytes, especially for oxidant species. However, sensors based on selenium and especially tellurium are less explored in the detection of metallic cations. The present work aims to use selenium and tellurium in the design, synthesis and application of new fluorescent molecular structures to detect heavy and toxic metals. For this, from a fluorescent matrix, rhodamine B, three new sensors based on selenium (Rh-Se) and tellurium (TR and TBR) were prepared to detect selectively Hg2+ and Pd2+. The first compound prepared was TR and the planning of the structure was substantiated in the diaryl telluride conjugated with the rhodamine B. The synthesis was conducted in four steps with a global yield of 11%. Through a mechanism involving the fast oxidation of tellurium involving the rapid oxidation of tellurium caused by Hg2+/H2O it is observed a strong emission of fluorescence (&#934; = 0.41) caused by the formation of a telluroxide. The sensor TR presented high selectivity to Hg2+ and a good sensibility, having a limit of detection of 2.95 &#181;mol/L. The second sensor synthetized TBR was based in a dimer of TR containing two unities of rhodamine, prepared in only one step, with a yield of 17%. Similar to TR, TBR also presented great selectivity for Hg2+ however, presented higher sensibility, with a limit of detection of 1.71 &#181;mol/L. These sensors TR and TBR represent an important contribution in the chemistry of tellurium once it was the first time that it was possible to use the process of oxidation of tellurium (II) to a telluroxide, assisted by Hg2+ in aqueous environment, in the development of a fluorescent molecular sensor. The third sensor developed was Rh-Se that consisted in the structure of a aryl methyl selenide bonded to the rhodamine by a spacer (ethylenediamine). The sensor Rh-Se demonstrated high selectivity for Pd2+, among the 25 metallic cations analyzed. The interaction between Rh-Se and Pd2+ occurs by coordination through the formation of a square planar complex that emits a strong fluorescence emission in 588 nm (&#934; = 0,17). Besides, Rh-Se presented high sensibility, being able to detect Pd2+ in a highly diluted solution (32 nmol/L; 4 ppb). The sensor Rh-Se demonstrated a high analytical potential and it can be applied in the detection of traces of Pd2+ in idealized samples of synthetic and pharmaceutical product.

Orientador: Marcel Otavio Cerri / Resumo: Avanços na biotecnologia proporcionaram possibilidades para o eficiente desempenho da produção em larga escala de diversas biomoléculas e consequentemente suas aplicações industriais. A Escherichia coli se destaca dentre a gama de microrganismos que agem como hospedeiros de genes, desempenhando a função de codificar a síntese proteica. Os vetores mais veiculados na produção de proteínas recombinantes em E. coli são baseados no operon lac, onde o isopropil β-D1-tio-galactopiranosídeo (IPTG), análogo a molécula de lactose, é utilizado para a indução da produção da proteína de interesse. Estudos descritos na literatura também observaram o bom desempenho da lactose como agente de indução da E. coli recombinante na expressão de proteína verde fluorescente melhorada (Enhanced Green Fluorescent Protein – EGFP), e suas vantagens quando comparada ao IPTG, como por exemplo menor custo e menor toxicidade. A EGFP se tornou promissora pelo fato de ser monomérica e não precisar de auxilio de quaisquer agentes adicionais para exibir atividade de fluorescência. Possui variadas utilidades no campo biológico como excelente biomarcador da expressão genica e biosensor. Em bioprocessos, operados em biorreatores convencionais é fundamental o estudo dos parâmetros interferentes nos cultivos para a otimização da expressão do produto desejado. A oxigenação em processos conduzidos de maneira aeróbica, também é uma tarefa desafiadora em biorreatores convencionais, sendo imprescindível o controle da con... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Advances in biotechnology have provided possibilities to the performance of large-scale of biomolecules and therefore of their industrial applications. Escherichia coli stands out among microorganisms that act as host genes, functioning as a synthetic protein. The most useful vectors for the production of recombinant proteins in E. coli are based on the operon lac, where isopropyl β-D1-thiogalactopyroside (IPTG), analogous to lactose, is used to induce the production of proteins of interest. Studies in the literature have also observed the good performance of lactose as an inducer of recombinant E. coli in the expression of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), and its advantages when compared to IPTG, such as lower cost and toxicity. EGFP becomes promising because it is monomeric and does not need to help the main agents for fluorescence activity. It has several uses in the biological field as an excellent biomarker of gene expression and biosensor. In bioprocesses, operated in conventional bioreactors, it is fundamental to study the interfering parameters in the cultures to optimize the expression of the desired product. Oxygenation in aerobically conducted processes is also a challenging task in conventional bioreactors, with control of the concentration of dissolved oxygen in the culture medium is essential, which may be limiting for growth and expression of the protein of interest. In processes of production of heterologous proteins, it is assumed that the productiv... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A avaliação da estabilidade dos medicamentos e sua correta utilização em diferentes veículos de infusão são fundamentais para garantir a manutenção das características terapêuticas do fármaco e para promover minimização de eventos adversos. Incompatibilidades entre as estruturas dos fármacos, em diferentes veículos de administração, podem gerar possíveis associações antagônicas ou sinérgicas, resultando em alterações das propriedades físico-químicas e, consequentemente, dos efeitos farmacológicos e das respostas clínicas esperadas. A proteína verde fluorescente (GFP) por apresentar propriedades de sensibilidade e especificidade, mostra-se promissora como potencial biossensor da estabilidade de fármacos em soluções parenterais de grande volume (SPGV), por apresentar sensibilidade a alterações das propriedades físico-químicas do meio. GFP é uma proteína compacta, globular e ácida, composta de um monômero de 27kDa, que vem sendo extensivamente utilizada como indicador biológico em processos de esterilização e desinfecção devido a sua estabilidade a altas temperaturas. O surgimento de métodos analíticos modernos e de alta precisão como a espectrofotometria de UV e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), alinhados a potencial utilização das proteínas fluorescentes como forma de avaliar as alterações da estabilidade de fármacos nas SPGV, vêm contribuir para a correta e racional utilização dos medicamentos no ambiente hospitalar. Diante disso a avaliação da estabilidade do coquetel de fármacos composto por furosemida e aminofilina em solução parenteral de 20% manitol e 0,9% NaCl foi sugerida. Amostras foram preparadas nas seguintes soluções (v/v): 20% manitol ou 0,9% NaCl na seguintes proporções utilizadas frequentemente na prática clínica: (i) 80% solução parenteral adicionada de 16% furosemida e 4% água para injeção (excipiente do fármaco aminofilina), (ii) 80% solução parenteral adicionada de 4% aminofilina e 16% água para injeção + NaOH (excipiente do fármaco furosemida), (iii) 80% solução parenteral, adicionada de 16% furosemida e 4% aminofilina (coquetel). As amostras foram avaliadas em espectrofotômetro imediatamente após o preparo e após um período 20h, em y=228nm e y=275nm para os fármacos furosemida e aminofilina, respectivamente. Para os fármacos individualmente associados às SPGV na faixa de pH 10-11, as concentrações finais obtidas foram correspondente ás inicialmente adicionadas e para o fármaco aminofilina foi estável até o período de 20h. Para avaliar a estabilidade dos fármacos associados à solução de 20% manitol a utilização de HPLC mostrou manutenção da estabilidade dos fármacos durante o período de infusão de até 20h. A proteína GFP adicionada as soluções das amostras na concentração 8?g/mL e determinada em espectrofluorímetro (yex=394nm, yem=509nm), mostrou resultados promissores quanto ao sua potencial utilização como biossensor da estabilidade dos fármacos furosemida e aminofilina nas soluções parenterais, mostrando comportamento de concentração e intensidade de fluorescência característicos e proporcionais a perda da estabilidade das soluções. A utilização de proteínas fluorescentes como potencial biossensor da estabilidade de fármacos em soluções parenterais é importante por fornecer parâmetros que garantam a eficácia dos medicamentos veiculados em soluções parenterais, racionalizando a sua utilização no ambiente hospitalar. / Parenteral solutions (PS) are used as vehicles in drugs administration to the organism. The development of analytical techniques that enables the detection of incompatibilities between drugs and PS is mandatory to guarantee their correct association with minimum adverse events. Incompatibilities of drugs in different infusion vehicles change according to physical-chemical properties of solutions, because of the molecular structure, chemical compounds used for preservation and stability of PS components. This fact can promote antagonic or synergic effects with loss of clinical response. The green fluorescent protein (GFP) is compact, globular, and acidic, with 27KDa and has been used as a biologic indicator of sterilization and disinfection process because it is easily detected using UV light, spectrofluorometry, with high thermal stability. GFP specificity and sensibility to physical-chemical changes in the media favors its use as a biosensor for drugs stability in parenteral solutions. The development of analytical methods such as spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC) in association with the fluorescent properties of some proteins enable the detection of potential incompatibilities between drugs and parenteral solutions, promoting a rational utilization of drugs in hospital. The evaluation of a diuretic cocktail with furosemide and aminophylline administrated in parenteral solutions of 20% mannitol and 0.9% NaCl was studied. Samples were prepared either in 20% mannitol or 0.9 % NaCl (PS), as follows: (i) 80% parenteral solution added with 16% furosemide and 4% WFI (solvent for aminophylline), (ii) 80% parenteral solution 4% aminophylline and 16% WFI+NaOH (pH 9-10, solvent for furosemide), (iii) 80% parenteral solution, added with 16% furosemide and 4% aminophylline (cocktail). Samples were diluted and prepared in a pH range of 6.5-7.5 and pH 10-11 for aminophylline and furosemide, individually and associated. The samples were prepared with PS including the excipients used in the drugs formulations. The absorbance was determined immediately after preparation and after 20 hours at 25°C and y= 228 nm, 275 nm, respectively for furosemide and aminophylline. GFP stability was determined in a spectrofluorometer (yex=394nm, yem=509nm) by adding 8 µg/mL of the purified protein in a 3.0mL sample (25°C) and the fluorescence intensity was evaluated after 20 hours. For both drugs in parenteral solutions (pH 10-11) the final concentrations observed were similar to the expected, aminophylline was also stable after 20h. When both drugs were associated in parenteral solutions of 20% mannitol, the use of HPLC showed stability for both drugs in the first 20h. The fluorescence intensity of GFP added to the samples was determined in spectrofluorometer (yex=394nm, yem=509nm), showing that fluorescence intensity was proportional to the drugs stability loss. Therefore, the utilization of fluorescence proteins is important to assure the drugs effectiveness and rational utilization in hospital places.

BCG é uma das vacinas mais usadas no mundo. Avanços na manipulação genética têm permitido o seu uso como carreador de antígenos heterólogos, porém o aprimoramento dos sistemas de expressão se faz necessário, sendo o promotor um importante elemento, uma vez que regula o nível de produção do antígeno, induzindo uma resposta imunológica adequada. Avaliamos a atividade de diferentes promotores de micobactérias, como o PAg, PAN, PBlaF*, Phsp60 e um promotor ainda não caracterizado do micobacteriófago L5, usando o gene gfp como repórter da expressão, todos clonados no vetor extracromossomal, pLA71. Foi possível avaliar as cepas de M. smegmatis e BCG fluorescentes para quase todas as construções e alguns plasmídeos pLA71-p mostraram características diferentes dependentes da micobactéria transformada. Numa escala de força de expressão, os diferentes promotores se apresentaram como fraco (pLA71-PAN-gfp), médio (pLA71-PBlaf*-gfp) e forte (pLA71-Phsp60-gfp). Os rBCG foram usados para infecção de macrófagos e a atividade dos promotores não foi afetada após a internalização. Para ensaio de localização, camundongos foram inoculados com BCG e foi possível confirmar a presença de colônias (recombinantes ou não) nos pulmões após 1 e 3 dias de inoculação, por plaqueamento em meio sólido e por microscopia confocal. / BCG is one of the most widely used vaccines in the world. Advances in genetic manipulation have allowed their use as a carrier for heterologous antigens, however the improvement of systems of expression is necessary, the promoter being an important element, since it regulates the expression level of the antigen, inducing an adequate immune response. We evaluated the activity of different promoters of mycobacteria, such as PAg, PAN, PBlaF* and Phsp60, and the not yet characterized promoter of the micobacteriophage L5, using GFP as a reporter gene expression activity, all cloned in the extrachromosomal vector, pLA71. It was possible to evaluate promoters in the M. smegmatis and BCG strains, fluorescent for almost all constructions and some pLA71-p plasmids showed different characteristics dependent on the transformed mycobacterium. The different promoters showed expression levels as weak (pLA71-PAN-gfp), medium (pLA71-PBlaf*-gfp) and strong (pLA71-Phsp60-gfp). The rBCG were used for infection of macrophages and the activity of the promoters wasnt affected after internalization. For BCG location test, mice were inoculated and it was possible to confirm the presence of colonies (recombinant or not) in the lungs after 1 and 3 days after inoculation by plating on solid medium and by confocal microscopy.

A avaliação da estabilidade dos medicamentos e sua correta utilização em diferentes veículos de infusão são fundamentais para garantir a manutenção das características terapêuticas do fármaco e para promover minimização de eventos adversos. Incompatibilidades entre as estruturas dos fármacos, em diferentes veículos de administração, podem gerar possíveis associações antagônicas ou sinérgicas, resultando em alterações das propriedades físico-químicas e, consequentemente, dos efeitos farmacológicos e das respostas clínicas esperadas. A proteína verde fluorescente (GFP) por apresentar propriedades de sensibilidade e especificidade, mostra-se promissora como potencial biossensor da estabilidade de fármacos em soluções parenterais de grande volume (SPGV), por apresentar sensibilidade a alterações das propriedades físico-químicas do meio. GFP é uma proteína compacta, globular e ácida, composta de um monômero de 27kDa, que vem sendo extensivamente utilizada como indicador biológico em processos de esterilização e desinfecção devido a sua estabilidade a altas temperaturas. O surgimento de métodos analíticos modernos e de alta precisão como a espectrofotometria de UV e a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), alinhados a potencial utilização das proteínas fluorescentes como forma de avaliar as alterações da estabilidade de fármacos nas SPGV, vêm contribuir para a correta e racional utilização dos medicamentos no ambiente hospitalar. Diante disso a avaliação da estabilidade do coquetel de fármacos composto por furosemida e aminofilina em solução parenteral de 20% manitol e 0,9% NaCl foi sugerida. Amostras foram preparadas nas seguintes soluções (v/v): 20% manitol ou 0,9% NaCl na seguintes proporções utilizadas frequentemente na prática clínica: (i) 80% solução parenteral adicionada de 16% furosemida e 4% água para injeção (excipiente do fármaco aminofilina), (ii) 80% solução parenteral adicionada de 4% aminofilina e 16% água para injeção + NaOH (excipiente do fármaco furosemida), (iii) 80% solução parenteral, adicionada de 16% furosemida e 4% aminofilina (coquetel). As amostras foram avaliadas em espectrofotômetro imediatamente após o preparo e após um período 20h, em y=228nm e y=275nm para os fármacos furosemida e aminofilina, respectivamente. Para os fármacos individualmente associados às SPGV na faixa de pH 10-11, as concentrações finais obtidas foram correspondente ás inicialmente adicionadas e para o fármaco aminofilina foi estável até o período de 20h. Para avaliar a estabilidade dos fármacos associados à solução de 20% manitol a utilização de HPLC mostrou manutenção da estabilidade dos fármacos durante o período de infusão de até 20h. A proteína GFP adicionada as soluções das amostras na concentração 8?g/mL e determinada em espectrofluorímetro (yex=394nm, yem=509nm), mostrou resultados promissores quanto ao sua potencial utilização como biossensor da estabilidade dos fármacos furosemida e aminofilina nas soluções parenterais, mostrando comportamento de concentração e intensidade de fluorescência característicos e proporcionais a perda da estabilidade das soluções. A utilização de proteínas fluorescentes como potencial biossensor da estabilidade de fármacos em soluções parenterais é importante por fornecer parâmetros que garantam a eficácia dos medicamentos veiculados em soluções parenterais, racionalizando a sua utilização no ambiente hospitalar. / Parenteral solutions (PS) are used as vehicles in drugs administration to the organism. The development of analytical techniques that enables the detection of incompatibilities between drugs and PS is mandatory to guarantee their correct association with minimum adverse events. Incompatibilities of drugs in different infusion vehicles change according to physical-chemical properties of solutions, because of the molecular structure, chemical compounds used for preservation and stability of PS components. This fact can promote antagonic or synergic effects with loss of clinical response. The green fluorescent protein (GFP) is compact, globular, and acidic, with 27KDa and has been used as a biologic indicator of sterilization and disinfection process because it is easily detected using UV light, spectrofluorometry, with high thermal stability. GFP specificity and sensibility to physical-chemical changes in the media favors its use as a biosensor for drugs stability in parenteral solutions. The development of analytical methods such as spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC) in association with the fluorescent properties of some proteins enable the detection of potential incompatibilities between drugs and parenteral solutions, promoting a rational utilization of drugs in hospital. The evaluation of a diuretic cocktail with furosemide and aminophylline administrated in parenteral solutions of 20% mannitol and 0.9% NaCl was studied. Samples were prepared either in 20% mannitol or 0.9 % NaCl (PS), as follows: (i) 80% parenteral solution added with 16% furosemide and 4% WFI (solvent for aminophylline), (ii) 80% parenteral solution 4% aminophylline and 16% WFI+NaOH (pH 9-10, solvent for furosemide), (iii) 80% parenteral solution, added with 16% furosemide and 4% aminophylline (cocktail). Samples were diluted and prepared in a pH range of 6.5-7.5 and pH 10-11 for aminophylline and furosemide, individually and associated. The samples were prepared with PS including the excipients used in the drugs formulations. The absorbance was determined immediately after preparation and after 20 hours at 25°C and y= 228 nm, 275 nm, respectively for furosemide and aminophylline. GFP stability was determined in a spectrofluorometer (yex=394nm, yem=509nm) by adding 8 µg/mL of the purified protein in a 3.0mL sample (25°C) and the fluorescence intensity was evaluated after 20 hours. For both drugs in parenteral solutions (pH 10-11) the final concentrations observed were similar to the expected, aminophylline was also stable after 20h. When both drugs were associated in parenteral solutions of 20% mannitol, the use of HPLC showed stability for both drugs in the first 20h. The fluorescence intensity of GFP added to the samples was determined in spectrofluorometer (yex=394nm, yem=509nm), showing that fluorescence intensity was proportional to the drugs stability loss. Therefore, the utilization of fluorescence proteins is important to assure the drugs effectiveness and rational utilization in hospital places.

Os estudos sobre o mecanismo de enovelamento das proteínas é o resultado de um estudo intenso utilizando métodos bioquímicos, biofísicos e teóricos. \"In vitro\", o estado inicial deste estudo é a proteína desnaturada. Neste trabalho, temos estudado o reenovelamento, após desnaturação térmica, de uma glicoproteína denominada frutalina; da família das lectinas. A característica principal desta classe de proteínas é sua habilidade para interagir com carboidratos e, portanto, combinar-se com glicocomponentes da superfície da célula, induzindo suas propriedades biológicas. A frutalina é uma lectina tetramérica extraída das sementes de Artocarpus incisa. Ela é ligante de D-galactose e o espectro de CD (dicroísmo circular) de sua estrutura nativa foi identificado como sendo dominado por folhas ?. A desnaturação térmica e as etapas do reenovelamento foram monitoradas por espectroscopia de CD, fluorescência e também pela perda da atividade hemaglutinante. As condições de desnaturação utilizadas foram aquecimento à 60°C por 30 a 60 minutos, dependendo do tempo de estocagem (a -18°C) da proteína na forma nativa. Os resultados indicaram que o reenovelamento é promovido por um processo de congelamento na presença de PBS contendo 0,l M de D-galactose seguida por centrífugoconcentração em Centriprep 3. A hemaglutinação positiva ocorreu tanto para a fração nativa quanto para a fração reenovelada. O reenovelamento da frutalina desnaturada também ocorreu com PBS contendo 0,1 M de solução de D-glicose. Quando a forma desnaturada foi concentrada antes do congelamento em PBS sem D-galactose ou em PBS contendo xilose, o reenovelamento não ocorreu. Estes resultados mostraram que o reenovelamento da frutalina foi dependente da ligação com a D-galactose ou D-glicose, bem como a importância do congelamento para obter a forma biologicamente ativa. A análise da estrutura secundária utilizando o programa CCA forneceu um resultado importante: para a forma nativa da frutalina obtivemos 85% de folhas ? paralelas e antiparalelas, incluindo voltas ?, enquanto que para a forma reenovelada obtivemos 73%, mostrando que a estrutura reenovelada, a nível secundário, se aproximou satisfatoriamente da nativa, concordando com os resultados obtidos nos testes de hemaglutinação. / Our current understanding of the protein folding mechanism is the result of intense study employing biophysical, biochemical and theoretical methods. \"In vitro\", the initial state of the protein in this puzzle is its unfolded form. In the present work we have studied the refolding, after thermal denaturation, of the glycoprotein frutalin, a member of the lectin class. The main characteristic of these proteins is their ability to interact with carbohydrates and thus combine with glycocomponents of the cell surface, leading to their biological properties. Frutalin is a tetrameric lectin extracted from the seeds of Artocarpus incisa. It is D-galactose specific and its native CD spectrum was identified as being dominated by ? -sheet. The thermal unfolding and refolding steps were measured by CD and fluorescence spectroscopies together with the loss of hemagglutinating activity. The unfolding conditions used were 60°C for 30 to 60 minutes, depending on the protein storage time. The results indicate that refolding is promoted by the freezing process in the presence of 0,1 M D-galactose-PBS followed by three-fold concentration in a Centriprep 3. Positive hemagglutination occurred for both the native and refolded forms. Refolding of denatured frutalin also occurred with PBS containing 0,1 M D-glucose. When the unfolded form was concentrated before freezing in PBS without D-galactose or in PBS containing xylose, refolding did not occur. These results show that the refolding of frutalin is dependent on the binding of D-galactose or D-glucose, and demonstrate the importance of freezing in order to obtain the biologically activity form. An analysis of secondary structure using the CCA program showed an important result: the native form, presented 85% ? -sheet/ ?-turns, while in the refolded form, this content fell to 73%. These results show that the refolded form is very similar to the native protein, which is in agreement with the hemagglutination results.

A história de domesticação da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é atípica. As variedades modernas derivam de um processo que inclui hibridações entre a espécie domesticada S. officinarum e a silvestre S. spontaneum, sucessivos retrocruzamentos, no sentido de recuperar o genoma de S. officinarum e a seleção de progênies superiores. Além disso, as genealogias contemplam cruzamentos entre genótipos e eventualmente espécies, todos com elevado grau de ploidia e número de cromossomos distintos, assim como aneuploidias. Frente ao exposto, este trabalho teve como objetivos estabelecer o número de cromossomos e avaliar o comportamento meiótico da cultivar IACSP93-3046, bem como, identificar as associações cromossômicas em meiose I dos genótipos IACSP93-3046, IACSP95-3018 e de um representante de S. officinarum, Caiana Fita, pela marcação dos centrômeros usando FISH. O número de cromossomos da cultivar IACSP93-3046 foi determinado a partir de preparações do meristema radicular, pré-tratado com 8-hidroxiquinolina (0,03%, 4h), e corado pelo método de Feulgen. As células metafásicas foram analisadas sob microscopia óptica, preferencialmente intactas e com o mínimo de sobreposição de cromossomos. Para a análise do comportamento meiótico utilizou-se a técnica de esmagamento, e as células foram coradas com carmim propiônico. Foram observadas as fases meióticas desde a metáfase I até a telófase II, bem como as tétrades. O pareamento cromossômico em meiose I foi analisado usando a técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH). Para tanto, preparações dos genótipos IACSP93-3046, IACSP95-3018 e Caiana Fita foram realizadas pelo gotejamento de uma suspensão de células em diacinese. As sondas foram obtidas por PCR a partir da amplificação da região centromérica de cana-de-açúcar, marcadas com digoxigenina-11-dUTP, por nick translation, e detectadas com anti-digoxigenina-rodamina. As lâminas foram montadas em DAPI-Vectashield e analisadas sob microscopia de fluorescência. O número diplóide 2n = 112 foi observado para a cultivar IACSP93-3046, sendo caracterizado pela primeira vez neste estudo. A microsporogênese de IACSP93-3046 apresentou elevado percentual de irregularidades (68%). De modo geral, as anormalidades foram relativas à segregação dos cromossomos, e incluíram migração precoce para os polos em metáfase I e II, cromossomos retardatários em anáfase (I e II) e em telófase (I e II), cromossomos perdidos em prófase II, e micronúcleos nas tétrades. A análise dos sítios de hibridização permitiu comprovar que os cromossomos se associam predominantemente como bivalentes em IACSP93-3046, IACSP95-3018 e Caiana Fita. As irregularidades na segregação dos cromossomos conduzem a micrósporos aneuploides, como constatado em IACSP93-3046. Sugere-se que a assincronia do processo meiótico entre os genomas que compõem a cana-de-açúcar tem papel relevante na geração dessas irregularidades. / The history of the sugarcane domestication (Saccharum spp.) is atypical. Modern varieties are derived from a hybridization process between the domestic species S. officinarum and the wild species S. spontaneum, successive backcrossings to recover the genome of S. officinarum, and the selection of superior progenies. The genealogies include crossings among genotypes, and possibly Saccharum species, all with a high degree of ploidy and different numbers of chromosomes, as well as aneuploidies. The study aimed to establish the number of chromosomes and evaluate the meiotic behavior of cultivar IACSP93-3046, and identify chromosomal associations in meiosis I of genotypes IACSP93-3046, IACSP95-3018 and Caiana Fita (a representative of S. officinarum) by labeling centromeres using fluorescence in situ hybridization (FISH). The number of chromosomes in cultivar IACSP93-3046 was determined from the root meristem preparations, pretreated with 8-hydroxiquinoline and stained by the Feulgen method. Metaphasic cells, preferably intact and with minimum chromosome overlap, were analyzed under an optical microscope. Meiotic behavior was examined from the preparations by using squashing method and stained with propionic carmine. Meiotic phases were observed from metaphase I to telophase II, and tetrad stages. Chromosomal pairing in meiosis I was analyzed by using the FISH technique. The slides of genotypes IACSP93-3046, IACSP95-3018 and Caiana Fita were produced by dropping a suspension of meiocytes in diakinesis. The probes were obtained by PCR, with amplification of the centromere region, and labeled with digoxigenin-11-dUTP, by nick translation, and detected with anti-digoxigenin-rhodamine. The slides were mounted in DAPI-Vectashield and analyzed under a fluorescence microscope. The diploid number 2n = 112 was observed for cultivar IACSP93-3046 and characterized in this study for the first time. Microsporogenesis of IACSP93-3046 presented a high irregularity percentage regarding chromosome segregation, especially precocious migration to poles in metaphase I and II, laggard chromosomes in anaphase and telophase I and II, lost chromosomes in prophase II, and micronuclei in the tetrad stages. The analysis from the hybridization sites proved that the chromosomal pairing occurred predominantly as bivalents in IACSP93-3046, IACSP95-3018 and Caiana Fita. Chromosomal segregation irregularities led to aneuploid microspores, as confirmed in IACSP93-3046, suggesting the asynchrony in the meiotic process between the sugarcane genomes play an important role in producing these irregularities.