Orientador: Eliana Regina Forni Martins / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Engel_ThaissaBrogliatoJunqueira_M.pdf: 3058703 bytes, checksum: 0c07b7bfd8295f9d32498e3cb53cd894 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O gênero Griffinia Ker Gawl pertence à subfamília Amaryllidoideae que, junto às subfamílias Agapanthoideae e Allioideae, compõem a família Amaryllidaceae, com cerca de 73 gêneros e 1605 espécies. As Amaryllidaceae, incluindo as Griffinia, são apreciadas pelas suas flores e cultivadas para a jardinagem e ornamentação. Endêmico do Brasil, esse importante gênero está ameaçado de extinção pela constante degradação de seu ambiente natural, sendo que muitas espécies não foram mais encontradas na natureza e nem em cultivo. A taxonomia de Griffinia é bastante dificultada pela morfologia floral e vegetativa bastante semelhante entre algumas espécies, e pela variação morfológica dentro de uma mesma espécie, ocasionada pelo isolamento entre populações e pela existência de diferentes citótipos. Os objetivos deste trabalho foram obter o cariótipo de diferentes espécies de Griffinia e de espécies proximamente relacionadas, e fornecer à sistemática informações que auxiliem na compreensão das relações filogenéticas e evolutivas das espécies desse gênero. Foram estudadas 10 espécies e duas morfoespécies não identificadas de Griffinia, bem como quatro espécies de gêneros próximos. Pontas de raízes coletadas dessas espécies foram pré-tratadas em colchicina e fixadas em solução Farmer para a produção de lâminas com metáfases mitóticas. Foram determinados número e morfologia cromossômicos e realizados bandamentos com os fluorocromos cromomicina3 (CMA3) e 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), e in situ fluorescent hybridization (FISH) com DNA ribossomal (DNAr 5S). Todas as espécies de Griffinia apresentaram 2n=20. Os números cromossômicos para as espécies analisadas de Eithea, Hippeastrum, Tocantinia e Worsleya foram 2n=18, 44, 22, e 42 respectivamente. Foram observadas espécies de Griffinia com duas, quatro, cinco e seis bandas CMA3+. De um a três sítios de DNAr 5S foram observados em dois a seis pares cromossômicos, em posição terminal, subterminal ou pericentromérica. Para cada espécie, foi observado um padrão único de distribuição de sítios de DNAr 5S, sendo assim possível a delimitação de espécies por meio das técnicas citogenéticas aplicadas. As espécies do grupo reportado na literatura como complexo Liboniana apresentaram semelhanças cariotípicas que podem corroborar a proximidade entre espécies: possuem apenas um par cromossômico com banda CMA3+ e dois pares cromossômicos com sítios de DNAr 5S. Variações cariotípicas foram observadas não apenas entre as espécies, mas também entre populações de uma mesma espécie. Casos de variação intraespecífica são conhecidos para plantas. Contudo, essa variação pode não ser uma variação interpopulacional, mas sim, reflexo da dificuldade taxonômica no gênero. Os resultados obtidos nesse estudo, apontam a citogenética como uma ferramenta útil na delimitação dos gêneros e espécies, e no reconhecimento de grupos dentro de Griffinia. / Abstract: The genus Griffinia Ker Gawl belongs to the subfamily Amaryllidoideae which together with the subfamilies Agapanthoideae and Allioideae, forms the Amaryllidaceae family, with about 73 genera and 1605 species. Amaryllidaceae plants, including Griffinia, are aprecciated because of their flowers and cultivated for gardening and ornamentals. Endemic to Brazil, the genus is endangered by the continuous degradation of their natural environment, and many species have not been found in nature. Taxonomy of Griffinia is very complicated because of its vegetative and floral morphology, which are quite similar between some species. There is also some morphological variation within a single species, caused by the isolation between populations and the existence of different cytotypes. The aim of this study was to obtain the karyotype of different species of Griffinia and closely related species, thus providing for systematic studies some information to assist in the understanding of the evolutionary and phylogenetic relationships of the species of this genus. We studied 10 species and two unidentified morphospecies of Griffinia, as well as four species of closely related genera. Root tips collected from these species were pretreated with colchicine and fixed in Farmer solution for the production of slides with metaphasic cells. We determined the number and chromosomal morphology. We performed banding with chromomicin3 (CMA3) and 4',6-diamidino-2-phenilindole (DAPI) fluorochromes and fluorescent in situ hybridization (FISH) with ribosomal DNA (5S rDNA). All Griffinia species presented 20 chromosomes. Chromosome numbers for the analyzed species of Eithea, Hippeastrum, Tocantinia and Worsleya were 2n= 18, 44, 22 and 42 respectively. Griffinia species presented two, four, five or six CMA3+ bands. One to three 5S rDNA sites were observed in two to six chromosome pairs in the terminal, subterminal or pericentromeric position. For each species, there was a unique pattern of distribution of DNAr 5S sites, so it is possible to delimitate species trough this cytogenetic technique. The species of a group reported in the literature as Liboniana complex showed similar karyotypes that can corroborate the closeness among the species of the group: they have only one chromosome pair with a CMA3+ band and two chromosome pairs with 5S rDNA sites. We observed karyotypic variations not only among species but also between populations of the same species. Cases of intraspecific variation are known for plants. However, this variation may be either an interpopulational variation, or a simple reflection of the difficulty in taxonomy of the genus. The data found at this analysis proved cytogenetic studies to be a quite useful tool in the delimitation of genera and species, and recognition of groups within Griffinia. / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestra em Biologia Vegetal

Orientadores: Eliana Regina Forni Martins, Vidal de Freitas Mansano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T00:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinto_RafaelBarbosa_M.pdf: 4856945 bytes, checksum: 7af922214bf499ea2e8fe2cfb2e9e2f4 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Swarzia é um gênero basal da subfamília Papilionoideae (Leguminosae). Apesar do seu posicionamento ter gerado debate entre muitos autores no passado, estudos sistemáticos recentes confirmam a monofilia de Swartzia, compondo o clado swartzióide juntamente com mais sete gêneros. A diversidade morfológica e a ampla distribuição geográfica na região neotropical tornam o gênero um interessante objeto de estudos taxonômicos e sistemáticos. Embora Swartzia apresente centro de diversidade amazônico, também possui alta riqueza de espécies na região extra-amazônica, apresentando complexos de espécies, com difícil delimitação morfológica de alguns táxons, necessitando de ferramentas adicionais para uma melhor compreensão da evolução no grupo. A citogenética, mediante estudos cromossômicos, fornece informações importantes na elucidação de relações supra e infra genéricas e, através de uma abordagem citotaxonômica, pode contribuir para o esclarecimento de problemas sistemáticos e taxonômicos. O presente trabalho visa ampliar os estudos do gênero, contribuindo com um inédito estudo citogenético e ampliando estudos taxonômicos das Swartzia na região extra-amazônica brasileira. Para o capítulo 1 foram coletadas sementes de 18 espécies distribuídas no território brasileiro para análise cromossômica e no capítulo 2 é apresentado um estudo taxonômico de Swartzia na região extra-amazônica brasileira, com chave de identificação. Swartzia apresentou número cromossômico constante entre as espécies analisadas (2n=2x=26). Entretanto, S. leptopetala demonstrou potencial de autopoliploidização ao apresentar sementes 2n=2x=26 e 2n=4x=52 numa mesma árvore, configurando processos de poliploidização em meristemas isolados. O tamanho dos cromossomos (tamanho relativo dos cromossomos e comprimento total de cromatina - TCL) foi medido para todas as 18 espécies coletadas. No geral, os cromossomos são pequenos, sendo o menor cromossomo encontrado em S. acuminata (0.25?m), enquanto o maior foi encontrado em S. euxylophora (1.41?m). Os números de bandas CMA+/DAPI- (2) e sítios de rDNA 45S (2) e 5S (2) também não apresentaram variação interespecífica. Swartzia euxylophora, cuja inclusão no gênero havia sido anteriormente questionada, apresentou as características citogenéticas semelhantes às demais Swartzia e, somadas à morfologia observada em campo, sustentam o posicionamento do táxon dentro do gênero. Os dados cariotípicos (número e tamanho cromossômicos, e número de bandas CMA/DAPI e de genes ribossomais) não permitem a diferenciação das espécies em nível de sessão. Até o momento são disponibilizadas informações cromossômicas para cerca de 10% das Swarztia, não sendo possível sugerir mecanismos de evolução cariotípica no gênero. Mediante a análise dos dados citogenéticos fornecidos neste trabalho e disponíveis na literatura é possível afirmar que os gêneros do clado swartzióide apresentam números cromossômicos diferentes, sendo este um caráter diagnóstico. No capítulo 2, os estudos taxonômicos para as Swartzia extra-amazônicas resultaram na descrição de cinco novas espécies e na elaboração de uma chave de identificação para táxons da região. Quatro delas, S. alagoensis, S. arenophila, S. revoluta e S. submontana, pertencem à seção Acutifoliae que se destaca por possuir alta diversidade e por ser exclusivamente brasileira. Swartzia thomasii pertence à seção Glabriplantae, anteriormente uma seção exclusivamente amazônica / Abstract: Swartzia is a basal genus of subfamily Papilionoideae (Leguminosae). Although the positioning of the genus has been a controversial issue among some authors in the past, recent systematic studies confirm the monophily of Swartzia as being part of a swartzioid clade with other seven genera. The morphological diversity and the widespread geographical distribution at the Neotropical region, make the genus an interesting object of taxonomic and systematic studies. Although Swartzia present an amazonian diversity center, it also has high species richness at extra-amazonian region, presenting species complex, with hard morphological delimitation of some taxa, requiring additional tools for a better comprehension of evolution within the group. Cytogenetics, by studying chromosomes, provides important informations for elucidating supra- and infrageneric relations and, by a citotaxonomic approach, it can contribute to solve systematic and taxonomic problems. The present study aims to increase the studies of the genus, contributing with an inedit cytogentic study and extending taxonomic studies of Brazilian extra-amazonian Swartzia. For chapter 1, there were collected 18 species distributed through Brazilian territory for chromosomal analyses and in chapter 2 we presenting a taxonomic study of Swartzia in extra-Amazonian region of Brazil with a description key. Swartzia presented a conservated chromosome number among species (2n=2x=26). However, S. leptopetala demonstrated an autopolyploidization potential, presenting seeds with 2n=2x=26 and 2n=4x=52 in the same tree, being a polyploidization process in isolated meristems. Chromosome length (relative chromosome length and total chromatin length - TCL) were measured for all 18 species collected. In general, Swartzia chromosomes are small, being the shortest chromosome found in S. acuminata (0.25?m) and the longest in S. euxylophora (1.41?m). The number of CMA+/DAPI- bands (2) and rDNA sites 45S (2) and 5S (2) did not present interspecific variation too. Swartzia euxylophora, which the inclusion in the genus was questioned, presented all cytogentics characteristics similar to all other analyzed Swartzia and together with morphological features observed in the field, it supports the taxon as belonging to the genus. The karyotypic data (number and size of chromosomes, and number of CMA/DAPI and ribosomal genes) do not allow the differentiation of species at section level. Until now, there is chromosomal information for about 10% of Swartzia species available, not being possible suggest karyotypic evolution mechanisms in the genus. By analyzing cytogentic data provided by this study and available in the literature, it is possible to say that genera in swartzioid clade have different chromosome number, being a diagnostic character. In chapter 2, the taxonomic studies of extra-Amazonian Swartzia resulted in a description of five new species and the elaboration of a regional key for the regional taxa. Four of them, S. alagoensis, S. arenophila, S. revoluta and S. submontana, belong to section Acutifoliae, which stands out for having high diversity and for be exclusively Brazilian. Swartzia thomasii belongs to section Glabriplantae, otherwise an exclusively Amazonianian section / Mestrado / Taxonomia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal

Orientadores : Antonio Carlos Corsini, Marcos Garcia Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T08:29:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ciampi_DeniseBalduino_M.pdf: 1277475 bytes, checksum: d505c7efe9461b32ab939b4f5838dff9 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Neste trabalho estudamos a presença de anticorpos líticos contra o T. cruzi, cepa Y durante a infecção em camundongos (CBA/J x C57Bl/10)F1 e Biozzi "Bons" e "Maus" respondedores (seleção III) e correlacionamos os títulos dos soros obtidos através da técnica da lise imune mediada pelo complemento humano com os títulos verificados nas reações de imunofluorescência. Nossos resultados nos permitem concluir que: 1 - A resposta humoral para os anticorpos pertencentes à classe IgM foi detectada logo nos primeiros dias após a infecção somente nos camundongos Biozzi "Bons" respondedores. Nos híbridos F1 e nos Biozzi "Maus" respondedores esse anticorpo aparece mais tardiamente. 2 - Para os anticorpos da classe IgG, durante a resposta humoral primária, os camundongos BH foram os que responderam mais rapidamente. Os índices de mortalidade porém foram semelhantes aos dos camundongos Bl. 3 - Durante a resposta secundaria observamos títulos consideravelmente aumentados para os anticorpos da classe IgG, em relação aos títulos obtidos durante a resposta primária para os camundongos F1. Esses valores mostraram-se aumentados tanto para o grupo de animas reinfectados no 42º dia, como para aqueles reinfectados no 97º dia após a primo-infecção. 4 - A titulação dos soros pela técnica da lise imune mediada pelo complemento, indicou que os soros de todas as linhagens de animais testadas possuem anticorpos líticoso. 5 - Camundongos BL apresentaram altas porcentagens de lise em seus soros quando comparados aos F1 e aos BH, principalmente no 20º dia de infecção. 6 - A reinfecção nos camundongos F1 não causou um aumento nos níveis dos anticorpos líticos, portanto não se observou uma resposta secundária, diferentemente do que ocorreu com as reações de imunofluorescência. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

BCG é uma das vacinas mais usadas no mundo. Avanços na manipulação genética têm permitido o seu uso como carreador de antígenos heterólogos, porém o aprimoramento dos sistemas de expressão se faz necessário, sendo o promotor um importante elemento, uma vez que regula o nível de produção do antígeno, induzindo uma resposta imunológica adequada. Avaliamos a atividade de diferentes promotores de micobactérias, como o PAg, PAN, PBlaF*, Phsp60 e um promotor ainda não caracterizado do micobacteriófago L5, usando o gene gfp como repórter da expressão, todos clonados no vetor extracromossomal, pLA71. Foi possível avaliar as cepas de M. smegmatis e BCG fluorescentes para quase todas as construções e alguns plasmídeos pLA71-p mostraram características diferentes dependentes da micobactéria transformada. Numa escala de força de expressão, os diferentes promotores se apresentaram como fraco (pLA71-PAN-gfp), médio (pLA71-PBlaf*-gfp) e forte (pLA71-Phsp60-gfp). Os rBCG foram usados para infecção de macrófagos e a atividade dos promotores não foi afetada após a internalização. Para ensaio de localização, camundongos foram inoculados com BCG e foi possível confirmar a presença de colônias (recombinantes ou não) nos pulmões após 1 e 3 dias de inoculação, por plaqueamento em meio sólido e por microscopia confocal. / BCG is one of the most widely used vaccines in the world. Advances in genetic manipulation have allowed their use as a carrier for heterologous antigens, however the improvement of systems of expression is necessary, the promoter being an important element, since it regulates the expression level of the antigen, inducing an adequate immune response. We evaluated the activity of different promoters of mycobacteria, such as PAg, PAN, PBlaF* and Phsp60, and the not yet characterized promoter of the micobacteriophage L5, using GFP as a reporter gene expression activity, all cloned in the extrachromosomal vector, pLA71. It was possible to evaluate promoters in the M. smegmatis and BCG strains, fluorescent for almost all constructions and some pLA71-p plasmids showed different characteristics dependent on the transformed mycobacterium. The different promoters showed expression levels as weak (pLA71-PAN-gfp), medium (pLA71-PBlaf*-gfp) and strong (pLA71-Phsp60-gfp). The rBCG were used for infection of macrophages and the activity of the promoters wasnt affected after internalization. For BCG location test, mice were inoculated and it was possible to confirm the presence of colonies (recombinant or not) in the lungs after 1 and 3 days after inoculation by plating on solid medium and by confocal microscopy.

Le monoxyde d’azote (NO), un neurotransmetteur important en biologie, a attiré l’attention ces dernières années pour son rôle majeur joué dans l’apparition d’une myriade de maladies telles que certains cancers, diabètes etc. Comprendre les mécanismes biologiques liés à la production du NO pourrait aboutir à la découverte de nouveaux moyens thérapeutiques. Cependant, le fonctionnement de l’enzyme qui produit le monoxyde d’azote, la NO-Synthase, n’est pas complétement élucidé. Dans ce but, des approches biomimétiques peuvent apporter une solution. Les microréacteurs ou proto-cellules, enveloppes imitant sommairement la compartimentation cellulaire sont un outil de choix, permettant de répliquer un environnement contrôlé où les concentrations et distances de réactions sont proches d’une cellule, permettant ainsi d’étudier le fonctionnement de la NO-Synthase. Cette thèse présente trois problématiques qui ont pour but de développer un tel microréacteur encapsulant la NO-Synthase : (1) la libération contrôlé d’espèces réactives déclenchée par un stimulus lumineux, (2) le suivi de l’activité de l’enzyme par des sondes fluorescentes et (3) le contrôle de la réaction enzymatique dans l’espace et dans le temps. Deux systèmes ont été étudiés pour libérer de manière contrôlée des espèces: la première consiste à déstabiliser des nano polymersomes par photo-clivage du copolymère qui le constitue. Le deuxième système est basé sur une rapide augmentation de la pression osmotique par irradiation à l’intérieur des polymersomes, induisant un éclatement de ceux-ci et la libération d’espèces encapsulées. La deuxième problématique abordée est le suivi de l’activité enzymatique au moyen de sondes hydrophobes et hydrophiles fluorescentes qui détectent le monoxyde d’azote à différent endroits du microréacteur. Le dernier point abordé est l’étude des microréacteur et la libération contrôlé en leur sein. / Nitric oxide (NO) has been identified as an important chemical messenger in cells and living organisms. Understanding the mechanism involved in NO production by NO-synthase is of fundamental importance. Mimicking basic cell functions by encapsulating NO-synthase in a controlled and confined cell like environment, could help provide information about the enzyme. Polymersomes resulting from the self-assembly of amphiphilic block copolymers were used as the synthetic cell like microreactor. To this end, three major challenges were addressed in this thesis: (1) controlling species release and concentration inside the microreactor, (2) measuring the enzyme response by NO detection and (3) controlling enzymatic reactions in space and time inside a microreactor. Light was used as the exogenous stimulus to induce release; its application is instantaneous, non-invasive and easy to control spatially and temporally. Two different ways to release species via light excitation were explored. The first strategy involves destabilization of nanopolymersomes by block separation, induced by copolymer photocleavage. The second strategy was to induce fast osmotic pressure increase of the polymersomes internal medium, resulting in bursting and species release. In order to monitor NO production by NO-synthase in different parts of the microreactor, hydrophobic and hydrophilic fluorescent NO probes have been synthesized and studied showing excellent correlation with NO concentration. The release of species inside microreactor was finally achieved in order to control enzymatic reaction.

La thérapie génique utilisant les vecteurs viraux est une des approches thérapeutiques possible pour le développement d’une thérapie pour les maladies génétiques mono-géniques dont l’ataxie de Friedreich (FRDA). Dans le but de vérifier l’efficacité des virus adéno-associés (AAV) à transférer la copie normale du transgène dans les tissus qu’ils infectent, nous avons insérer le gène codant pour la forme améliorée de la protéine fluorescente verte (eGFP) dans les AAV sérotype 9 (AAV9). Ces AAV recombinants (AAVr) ont été ensuite administrés aux souris femelles gestantes par voie intraveineuse et intra-péritonéale. Les résultats obtenus montrent que le transgène a été transféré à la fois dans les tissus des souris femelles ainsi que dans ceux des souriceaux. / Gene therapy using viral vectors is one of the therapeutic approaches possible for the development of genetic therapies for monogenic diseases including Friedriech's Ataxia (FRDA). In order to verify the effectiveness of adeno-associated virus (AAV) to transfer a transgene in the tissues they infect, we inserted the gene encoding the enhanced form of the green fluorescent protein (eGFP) in AAV Serotype 9 (AAV9). These recombinant AAV (rAAV) were then administered by intravenous and intraperitoneal to pregnant female mice. The results obtained show that the transgene was transferred in both in the female’ mouse tissues and in those of young mice.

L'origine et la fonction des cellules immunitaires du système nerveux central (SNC), connues sous le nom de microglies, sont controversées. Les objectifs de cette thèse étaient de déterminer si les cellules souches de la moelle osseuse peuvent infiltrer le SNC et se différencier en cellules microgliales, et d'élaborer plus précisément si les microglies sont bénéfiques ou dommageables aux neurones lors des maladies neurodégénératives. Premièrement, nous établissons que les cellules de la moelle osseuse peuvent en effet infiltrer différentes régions du SNC, et qu'elles se différencient en microglies périvasculaires et parenchymateuses. De plus, les microglies originaires de la moelle osseuse expriment fortement la protéine CD1 le, suggérant qu'elles sont de meilleures cellules présentatrices d'antigène que les microglies parenchymateuses déjà présentes dans le SNC. Il est alors possible que les microglies infiltrantes jouent un rôle important dans le maintien du bon fonctionnement du SNC, surtout durant les infections cérébrales et les maladies neurodégénératives. Nous démontrons ensuite que la réponse immunitaire microgliale protège les neurones contre l'excitotoxicité aiguë par un mécanisme qui dépend de la voie de signalisation MyD88/NF-icB. De plus, les cellules de la moelle osseuse sont fortement attirées vers les régions affectées par la mort neuronale, mais que ces cellules ne sont pas critiques à la protection neuronale dans les stages initiaux de l'excitotoxicité. Au contraire, dans ce model neurodégénératif aiguë, ce sont les microglies résidentes du cerveau qui sont bénéfiques. Nous avons ensuite étudié le rôle des microglies infiltrantes dans un modèle animal de la maladie neurodégénérative chronique d'Alzheimer. Ces cellules microgliales sont attirées en grand nombre par la P-amyloïde, se dirigent vers les plaques séniles et les infiltrent. Nous confirmons aussi qu'une réponse immunitaire spécifique est engendrée par la Pamyloïde. Finalement, nous démontrons que les microglies provenant de la moelle osseuse restreignent la formation des plaques séniles en phagocytant la p-amyloïde. En conclusion, les résultats de cette thèse démontrent qu'il y a en effet deux populations de microglies et que le rôle de ces cellules varie en fonction du processus neurodégénératif aigu ou chronique. Il serait possible d'utiliser les cellules souches hématopoiétiques comme véhicule thérapeutique, surtout pour contrôler la cascade amyloïde et le déficit cognitif.

El aumento de la actividad minera en el Perú hace necesario el desarrollo de tecnologías rápidas y económicas de detección de contaminantes para su monitoreo y control. Implementando conocimientos de biología molecular y de la regulación génica podemos construir un circuito genético sintético que posibilite el monitoreo de sustancia toxicas que generen estrés oxidativo como son los compuestos cianurados. El objetivo de esta investigación es desarrollar un circuito genético sintético conformado por el promotor de la proteína del shock por fagos (psp) de Escherichia coli y las secuencia codificante del gen de la proteína verde fluorescente (GFP). La construcción de dicho circuito se logró usando estrategias de clonamiento por topoisomerasas y clonamiento clásico con enzimas de restricción, se usó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para confirmar que todos los segmentos del circuito estén presentes en el vector. Los estudios preliminares de la actividad del nuevo circuito se realizaron transformando genéticamente células competentes de E. coli. La observación de dichas bacterias muestra una expresión de GFP continua, lo que indica que el circuito sintético está siendo activado sin estar en presencia de agentes de estrés oxidativo, lo que suponía una posible interacción con otros sistemas de regulación de estrés en la célula. Due to the increase of mining activity in Peru new technologies that can detect and monitor hazardous pollutants in a faster and cheaper way must be developed. Implementing molecular biology knowledge about genetic regulation we are able to construct a synthetic genetic circuit that can allow the monitoring of toxic substances that generate oxidative stress such us cyanide compounds. The objective of this research is to develop a synthetic genetic circuit from the promoter of the phage shock protein operon from E. coli and the complementary DNA of the green fluorescent gene (GFP). The construction of the circuit was achieved using classic cloning strategies with restriction enzymes and also more advanced strategies such us topoisomerase cloning, the polymerase chain reaction (PCR) was used to confirm the presence of all the desire segments in the vector. Preliminary studies of the circuit activity were carried out by genetically transforming competent E. coli cells. The observation of the bacteria shows a continuous expression of GFP without any inducer, this indicates that the synthetic circuit is being activated through a possible interaction with other stress response pathway.

Em 1978, o trabalho realizado por Stephenson e Zamecnik demonstrou a capacidade de um oligonucleotídeo de impedir a expressão de uma proteína específica. Atualmente, duas tecnologias são mais utilizadas para este propósito: os oligodeoxiribonucleotídeos antisense e o RNA de interferência (siRNA), que se aproveitam da capacidade de anelação entre as fitas complementares. A maior diferença entre as duas técnicas é a maquinaria proteica recrutada, isso é, o complexo RISC atua no funcionamento do siRNA, e a protease RNase H atua na clivagem da fita de RNA quando hibridizada com DNA. Apesar da grande aplicabilidade destas tecnologias, tanto para doenças metabólicas quanto para canceres, o veículo de entrega e proteção dessas sequências é de fundamental importância, visto que a aplicação desses oligonucleotídeos livres está sujeita à rápida degradação e ineficiência. A modificação das bases é uma das estratégias para conferir maior estabilidade às sequências, porém estas tem sido relacionadas a um aumento da toxicidade. Nessa dissertação, a quitosana, um polissacarídeo catiônico é utilizado para síntese de nanopartículas e encapsulamento dos oligodeoxiribonucleotídeos antisense (ASO). Para isso, foram realizadas modificações na quitosana comercial como despolimerização, trimetilação ou conjugação com PEG, seguida da síntese das nanopartículas com a adição de tripolifosfato de sódio (TPP) pelo método de gelatinização ionotrópica. A estabilidade das nanopartículas foi medida em função do tempo, da variação de temperatura e da diferença de pH. Além disso, a toxicidade dessas nanopartículas foi analisada através da viabilidade celular em diferentes linhagens, NB-4, HepaRG, HTC e BHK-570. A expressão da proteína verde fluorescente (GFP) na célula NB-4 foi utilizada para avaliar a entrega do ASO desenhado, sendo sua fluorescência monitorada por microscopia confocal. Os resultados demonstram que as nanopartículas se mantiveram estáveis durante o período de tempo analisado, assim como com a temperatura variando de 22 a 45°C e em pH ácido. Cada linhagem celular respondeu de forma diferente ao tratamento com as nanopartículas sem ASO, sendo a linhagem saudável BHK-570 com a maior resistência. Ademais, todas as células apresentaram viabilidade reduzida quando tratadas com concentrações na ordem de 1011 nanopartículas/mL a base de quitosana trimetilada. A fluorescência das células NB-4 quando tratada com as nanopartículas com ASO diminuiu consideravelmente nas 18 primeiras horas, seguida de um aumento após 42 horas. Dessa forma, pode-se concluir que as nanopartículas de quitosana propostas nessa dissertação apresentaram uma excelente alternativa para a entrega de material genético, principalmente para o trato gastro-intestinal, devido à sua estabilidade em pH ácido. / The property of an oligonucleotide to interfere in the expression of a protein was observed in 1978 by Stephenson and Zamecnik. To perform such interference, there are today, two main techniques being explored: antisense oligodeoxyribonucleotides and interference RNA. In both cases, the particularity of their chemical structure is taken into account as soon as they can bind in a complementary manner to the messenger RNA and inhibit its translation. The great difference between these techniques is related to the proteases involved in the process, while for interference RNA the RISC machinery acts, for antisense oligodeoxyribonucleotides RNase H cleaves the RNA in the duplex DNA-RNA. Although these tools to edit the translation process are relevant to the treatment and even cure of metabolic disorders and cancers, it is still not effective when employed without a coating to protect the sequences before it reaches the destiny in vivo. Efforts have been made in developing modified bases to be more stable, but they show some toxicity. In this dissertation, chitosan, a natural cationic polyssacharide, is used to produce nanoparticles to protect the antisense oligodeoxyribonucleotide (ASO). For this reason, the commercial chitosan was modified, depolymerized, trimetilated or PEGlated and the nanoparticles were synthesized with sodium tripolyphosphate (TPP) by ionotropic gelation method. The stability along time, in different pHs and temperatures was assessed. The toxicity of nanoparticles without ASO was quantified by MTT tests in NB-4, HepaRG, HTC and BHK-570 cell lines. A green fluorescent protein (GFP) expressed by NB-4 cells was the target to evaluate the delivery efficiency of the ASO, and its fluorescence was measured by confocal microscopy. Results showed that nanoparticles were stable over time as well as in temperatures ranging from 22 to 45°C and in acidic pH. Each cell line responded in a different manner to the treatment, with the health cell BHK-570 showing higher resistance. Furthermore, all of them presented lower viability when treated with trimetilated chitosan nanoparticles in the highest concentrations (ca 1011 nanoparticles/mL). NB-4 cells presented a decrease in fluorescence in 18 hours of treatment followed by an increase after 42 hours. We conclude that chitosan nanoparticles are a good alternative to the delivery of genetic material even more in the gastro intestinal tract due to its great stability in acid pH values.

O objetivo do presente trabalho foi determinar, através de medidas de Ressonância Fluorescente Nuclear (RFN) para o núcelo deformado de 153Eu, a intensidade integrada de ressonâncias localizadas de dipolo associadas a modos de movimento como o modo tesoura Ml (ressonâncias anãs). Foi utilizado o feixe de elétrons do acelerador Dynamitron da Universidade de Stuttgart (Eo = 4,3 MeV) e detetores de Ge(HP) e Ge(Li) de alta resolução para a obtenção de informações detalhadas acerca das energias de excitação, larguras de decaimento, probabilidades de transição e razões de ramificação. Os resultados obtidos para o 153Eu são comparados com os obtidos recentemente para seus vizinhos ímpares (161,163Dy, 155,157Gd e 159Tb) e com as previsões do Modelo de Bósons e Férmions Interagentes (MBFI). Enquanto os isótopos ímpares de Dy apresentam uma certa concentração de intensidade de dipolo ao redor de 3MeV, os isótopos ímpares de Gd apresentam uma extrema fragmentação de intensidade de dipolo (25 transições para o 155Gd e 90 transições para o 157Gd), na faixa de energia de 2-4 MeV. O núcleo de 153Eu quando comparado aos isótopos ímpares de Dy, Gd e Tb, apresenta uma pequena fragmentação, com baixa intensidade de dipolo. Em geral, a intensidade de dipolo total em núcleos ímpares é menor (por um fator 2-3), quando comparada com seus vizinhos pares. Esta diferença de intensidade entre os isótopos ímpares de Eu, Dy, Gd e Tb é inexplicável até agora. / The aim of this work was to perform Nuclear Resonance Fluorescence (NRF) measurements for the 153Eu deformed nucleus associated to Ml scissors mode. Using the bremsstrahlung photon beam of the Stuttgart Dynamitron (endpoint energy 4.3 MeV) and high resolution Ge spectrometers, detailed information was obtained on excitation energies, decay widths, transition probabilities, and branching ratios. The results are compared to those observed recently for the neighboring odd nuclei 161,163Dy, 155,157Gd and 159Tb and with the Interacting Boson Fermion Model (IBFM). Whereas in the odd Dy isotopes the dipole strength is rather concentrated, both Gd isotopes show a strong fragmentation of the strength into about 25 (155Gd) and 90 transitions (157Gd) in the energy range 2-4 MeV. The nucleus 153Eu as compared to these odd Dy, Gd and Tb isotopes exhibits a small fragmentation with low strength. In general the observed total strength in the odd nuclei is reduced by a factor of 2-3 as compared to their neighboring even-even isotopes. The different fragmentation behavior of the dipole strengths in the odd Dy, Gd, Tb and Eu isotopes is unexplained up to now.