Nos últimos anos, o emprego da aspiração folicular (OPU) e produção in vitro de embriões (PIVE) têm crescido mundialmente nos rebanhos bovinos. A OPU-PIVE viabiliza a rápida multiplicação do material genético, utilizando tanto a base genética da fêmea como do macho. No entanto, fêmeas de leite Bos taurus apresentam algumas peculiaridades, como menor população de folículos antrais e inferior qualidade oocitária, as quais foram apontadas como fatores responsáveis pela reduzida eficiência da técnica nesses rebanhos. Frente às dificuldades para o estabelecimento de programas de OPU-PIVE eficientes em vacas de leite Bos taurus, três experimentos foram conduzidos envolvendo diferentes tipos de tratamentos superestimulatórios em doadoras de oócitos lactantes e não lactantes. O primeiro estudo teve como objetivo aumentar a PIVE em doadoras da raça Holandesa lactantes e não lactantes submetidas ao tratamento tradicional de superstimulação com doses decrescentes de FSH porcino (FSHp) a cada 12 h, previamente à OPU. Nesse estudo, as doadoras (n = 15 vacas lactantes e n = 15 não lactantes da raça Holandesa) receberam protocolo para sincronização da emergência da onda folicular [protocolo a base de benzoato de estradiol (BE) e progesterona (P4)] e foram submetidas aos tratamentos de superestimulação em um delineamento experimental cross-over. Os outros dois estudos (n = 23 novilhas da raça Holandesa e n = 72 vacas não lactantes da raça Holandesa) foram desenvolvidos para avaliar diferentes diluentes para o FSHp com o objetivo de viabilizar a superestimulação com apenas uma aplicação de FSHp. No geral, os estudos avaliaram o efeito da superestimulação no perfil plasmático de FSH, na proporção de folículos classificados como pequenos (<6mm), médios (6-10mm) ou grandes (>10mm), conforme diâmetro folicular, na PIVE e no estabelecimento gestacional após transferência de embriões. A superestimulação aumentou a proporção de folículos médios, aumentou a competência oocitária e resultou em maior produção de blastocistos por sessão de OPU. A aplicação única de FSHp associado ao diluente de liberação lenta (ácido hialurônico), resultou em semelhante área sob a curva de FSH, semelhante proporção de folículos pequenos, médios e grandes e semelhante PIVE comparado ao tratamento superestimulatório tradicional com doses de FSHp administradas a cada 12h. Independentemente do diluente e da dose de FSHp utilizada, o tratamento superestimulatório resultou em maior produção de blastocistos por sessão de OPU comparado às vacas não tratadas com FSHp. Adicionalmente, semelhante taxa de estabelecimento gestacional foi observada, independentemente do tratamento utilizado na doadora. Portanto, os dados obtidos no presente estudo permitem concluir que independentemente do tipo de tratamento (diluente para FSHp ou dose utilizada de FSHp), a superestimulação previamente ao processo de OPU, aumentou o desenvolvimento de embriões in vitro, número de blastocistos por sessão de OPU e resultando em semelhante taxa de estabelecimento gestacional após transferência de embriões. / In the last years, the use of ovum pick-up (OPU) and in vitro produced embryo (IVEP) technology has worldwide increased in cattle herds. The OPU-IVEP enable a rapid individual multiplication based on the female and male donor genetic. However, Bos taurus dairy females present some peculiarities, as reduced antral follicle population and lower oocyte quality, and these factors have been awarded as responsible to the reduced technique efficiency among these herds. Given the difficulties of establishing OPU-IVEP programs with high efficiency in Bos taurus dairy cows, three studies were carried out, involving different types of superstimulation treatments in lactating and non-lactating Holstein donors. The first study aimed to increase IVEP in lactating and non-lactating Holstein dairy donors submitted to the traditional twice-daily porcine FSH (pFSH) superstimulation treatment prior to the OPU. For this purpose, donors (n = 15 lactating and n = 15 non-lactating Holstein cows) received the follicular wave synchronization protocol [estradiol benzoate (EB) and progesterone (P4) based protocol] and were submitted to superstimulation treatment in a cross-over design. Other two experiments were performed (n = 23 Holstein heifers and n = 72 non-lactating Holstein cows) to evaluate different pFSH diluents to enable superstimulation with a single injection. In general, these studies evaluated the effect of superstimulation on the plasmatic FSH profile, proportion of follicles sizes previous to OPU (small: <6mm; medium: 6-10mm; and large follicles: >10mm), on in vitro embryo production and pregnancy establishment after the produced embryo transfer. The superstimulation treatment improved the proportion of medium sized-follicles, improved oocyte competence and resulted in greater amount of blastocyst per OPU session. A single injection of pFSH combined with a slow release carrier (hyaluronan), resulted in similar FSH area under curve, proportion of follicles sizes previous to OPU and in vitro embryo production compared to the twice-daily superstimulating treatment. Regardless pFSH diluent and dose, superstimulating hormone resulted in greater number of blastocysts per OPU session compared to the non-pFSH treated donors. Additionally, similar pregnancy establishment was observed, regardless embryo donor treatment. Therefore, with the present data, we can conclude that regardless treatment type (pFSH diluent or dose), the superstimulation procedure prior to the OPU, enhanced in vitro embryo development, increased the number of blastocyst per OPU session and resulted in similar pregnancy establishment after embryo transfer.

La FSH est une hormone qui joue un rôle central dans la fonction de reproduction. De ce fait, elle est utilisée en assistance médicale à la procréation (AMP) afin de recruter un pool de follicules et de l’amener jusqu'à l'ovulation. La FSH agit sur un récepteur spécifique (RFSH) qui active des voies de signalisation par l'intermédiaire des protéines G et des β-arrestines. L'étude in vitro d’un mutant et de variants du RFSH décrits chez l’homme nous a permis de mettre en évidence différents mécanismes conduisant à des biais de signalisation de ce récepteur. Ces altérations génétiques, en modifiant l'équilibre qui existe entre les différentes voies de signalisation activées par le RFSH, conduisent à des manifestations cliniques. En parallèle, nous avons mené une étude clinique sur le polymorphisme N680S du RFSH, qui nous a permis de confirmer et de prolonger les résultats de la littérature tout en corrélant les résultats obtenus in vitro à la signalisation des récepteurs N680 et S680. L’ensemble de nos résultats ouvre des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies en AMP. / FSH is a hormone which is centrally involved in reproduction. For this reason, FSH is extensively used in in vitro fertilization (IVF) to recruit and lead a pool of follicle to ovulation. FSH acts on its cognate receptor (FSHR) which activates signaling pathways through the canonical G-protein pathways as well as through β-arrestin-dependent transduction mechanisms. In vitro studies of a mutant and of variants of the FSHR identified in patients allowed us to highlight different mechanisms leading to bias in the signaling pathways triggered by this receptor. These genetic alterations, by modifying the equilibrium that exists between the different signaling pathways activated by the FSHR, lead to clinical consequences. In parallel, we have carried out a clinical study centered on the N680S polymorphism of the FSHR. Our results confirm and extend previous studies from the literature while correlating the results we obtained in vitro with the functional consequences of the N680S polymorphism of the FSHR. Together, our results open new avenues for developing new strategies in IVF.

La FSH est une hormone clé dans la fonction de reproduction. La compréhension de ces mécanismes moléculaires est essentielle pour comprendre ses effets biologiques. Nous montrons ici pour la première fois que non seulement la FSH induit le recrutement de polysomes dans la cellule de Sertoli, mais qu’en plus, elle stimule la traduction de deux ARNm sélectivement, c-fos et vegfa. La p70S6K est impliquée dans ce mécanisme. La FSH active et induit le recrutement de la p70S6K sur la coiffe des ARNm où elle active ses cibles traductionnelles. Les β-arrestines, des protéines d’échafaudage qui régulent la signalisation du RFSH, semblent participer à l’activation de la p70S6K. La déplétion des β-arrestines augmente massivement le recrutement de la p70S6K à la coiffe et diminue son activité enzymatique. De plus, la p70S6K et les β-arrestines interagissent mais cette interaction ne semble pas modulée par la FSH. Nos résultats suggèrent que les β-arrestines séquestreraient la p70S6K inactive pour permettre son activation et son recrutement à la coiffe m7GTP en réponse à la FSH. Ce travail apporte de nouvelles connaissances sur le rôle de la FSH dans la traduction et les mécanismes de signalisation impliqués. / FSH is a key hormone of the reproductive function. A clear understanding of its molecular mechanism is essential to fully understand its biological effects. Here, we show for the first time that FSH not only enhances the assembly of polysomes but also stimulates the translation of at least two mRNA selectively, c-fos and vegfa, in Sertoli cells. p70S6K participates in this mechanism. FSH activates and enhaced p70S6K recruitment to the m7GTP cap structure of mRNA where this kinase phosphorylates its targets. β-arrestins, which are scaffolding proteins that regulate FSH signalling, seem to participate in p70S6K activation. Accordingly, β-arrestins depletion increased p70S6K recruitment to the cap and reduced its enzymatic activity. Importantly, p70S6K and β-arrestins interact but the interaction is not FSH-dependent. We assume that β-arrestins sequester inactive p70S6K to activate it locally and then p70S6K translocates to the cap in response to FSH. In conclusion, this work brings new knowledge about FSH function in translational control and the signaling mechanisms involved.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Os objetivos deste estudo foram investigar o efeito de diferentes concentraÃÃes de jacalina e da interaÃÃo de jacalina e FSH sobre a sobrevivÃncia, ativaÃÃo e expressÃo gÃnica em folÃculos primordiais caprinos cultivados in vitro. Para isto, os fragmentos do cÃrtex ovariano foram cultivados em Meio Essencial MÃnimo (MEM) suplementado com diferentes concentraÃÃes de jacalina (0, 10, 25, 50 e 100 &#956;g/mL - experimento I), por um e seis dias. ApÃs o tÃrmino do perÃodo de cultivo, os fragmentos de cÃrtex ovariano foram fixados para histologia clÃssica. Em seguida, avaliou-se a percentagem de folÃculos primordiais ou em desenvolvimento no controle nÃo cultivado e no tecido ovariano cultivado nos diferentes tratamentos. ApÃs a determinaÃÃo da concentraÃÃo de jacalina mais eficiente (50 &#956;g/mL), realizou-se o cultivo de fragmentos de cÃrtex ovariano em MEM suplementado com a jacalina (50 &#956;g/mL), FSH (50 ng/mL) ou ambos (experimento II). ApÃs 6 dias de cultivo, os fragmentos ovarianos foram fixados para histologia clÃssica. AlÃm disso, para cada tratamento, foram coletadas amostras de tecido para avaliar o perfil de expressÃo de RNAs mensageiros para BMP-15, KL, c-kit, GDF-9 e PCNA em folÃculos ovarianos caprinos cultivado in vitro por 6 dias. Os resultados demonstraram que apÃs seis dias de cultivo, a presenÃa de 50 &#956;g/mL de jacalina no meio de cultivo promoveu um aumento de folÃculos morfologicamente normais, bem como uma reduÃÃo da percentagem de folÃculos primordiais e aumento de folÃculos em desenvolvimento, quando comparado ao meio controle. No experimento II, demonstrou-se que jacalina ou FSH estimulam a ativaÃÃo dos folÃculos e contribuem para a manutenÃÃo da viabilidade, mas nÃo foi observada uma interaÃÃo positiva entres essas duas substÃncias. A expressÃo de RNAm para a BMP-15 e KL apÃs o cultivo in vitro de fragmentos de ovÃrio nos diferentes tratamentos por 6 dias nÃo foi alterada. No entanto, a presenÃa de FSH aumentou os nÃveis de RNAm para o c-kit e para o PCNA, enquanto que o GDF-9 teve sua expressÃo reduzida em meio suplementado com jacalina. Em conclusÃo, jacalina e FSH foram capazes de promover a sobrevivÃncia e ativaÃÃo de folÃculos primordiais caprinos apÃs 6 dias de cultivo. A presenÃa de FSH aumentou a expressÃo do RNAm para PCNA e c-kit, enquanto que a presenÃa da jacalina reduziu a expressÃo do GDF-9. / The aims of this study were to investigate the effect of different concentrations of jacalin and the interaction of jacalin and FSH on survival, activation and gene expression of goat primordial follicles cultured in vitro. For this, fragments of ovarian cortex were cultured in Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with different concentrations of jacalin (0, 10, 25, 50 and 100 mg/mL - experiment I) for one and six days. After the end of cultured period, the fragments of ovarian cortex were fixed for histology. Then, the percentage of primordial follicles in uncultured or cultured ovarian tissue in different treatments were evaluated. After determining the most effective concentration of jacalin (50 &#956;g/mL), ovarian cortex fragments were cultured in MEM supplemented with jacalin (50 &#956;g/ml), FSH (50 ng/ml) or both (experiment II). After 6 days of culture, the ovarian fragments were fixed for histology. Furthermore, for each treatment, tissue samples were collected to evaluate the expression profile of mRNA for c-kit, KL, GDF-9, BMP-15 and PCNA in goats ovarian follicles cultured in vitro for 6 days. The results showed that after six days of culture, the presence of 50 &#956;g/ml jacalin in culture medium increased the percentage of normal follicles, and promoted a reduction in the percentage of primordial follicles and increase of developing follicles, when compared to control medium. In experiment II, jacalin or FSH stimulated primordial follicle activation and contributed to maintain follicle viability, but there was no positive interaction between these two substances. The levels of mRNA for BMP-15 and KL after in vitro culture of ovarian fragments in different treatments was not altered. However, the presence of FSH increased levels of mRNA for c-kit and PCNA, while the GDF-9 expression was reduced in medium supplemented with jacalin. In conclusion, jacalin and FSH were able to promote the survival and activation of goat primordial follicles after 6 days of culture. The presence of FSH increased expression mRNA of PCNA and c-kit, while the presence of jacalin reduced the expression of GDF-9.

O Pirarucu (Arapaima gigas) é um peixe gigante da família Arapaimidae, nativo das bacias amazônicas que pode chegar a dois metros de comprimento e pesar mais de 200 Kg. Está presente no Equador, na Colômbia, no Peru, na Bolívia e no Brasil. Atualmente a espécie está ameaçada de extinção devido à pesca predatória e ao aumento da presença humana em seus viveiros naturais. No presente trabalho, os cDNAs da subunidade (ag-GTH&alpha;) e da subunidade &beta; do hormônio folículo estimulante de A. gigas (ag-FSH) foram isolados e clonados pela primeira vez, possibilitando uma melhor compreensão da diversidade e evolução desta glicoproteína em peixes e a futura síntese biotecnológica deste hormônio para fins reprodutivos e alimentícios. Tanto o cDNA do ag-GTH&alpha; quanto aquele do ag-FSH&beta; foram sintetizados pela reação de transcriptase reversa (RT) e pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando como molde RNA total proveniente das glândulas hipofisárias de A. gigas. O cDNA da subunidade ag-GTH&alpha; possui uma sequência codificadora (Open Reading Frame, ORF) de 348 pb, o que corresponde a uma proteína de 115 aminoácidos com um suposto peptídeo sinal de 24 aminoácidos e com um peptídeo maduro de 91 aminoácidos. Dez resíduos de cisteínas responsáveis pela formação de cinco pontes dissulfeto, dois sítios de N-glicosilação e três resíduos de prolinas apresentaram-se altamente conservados quando comparados com outras espécies de peixes. A comparação baseada em sequências de aminoácidos de GTH&alpha; de 38 espécies de peixes revelou alta identidade do A. gigas com membros das seguintes ordens: Acipenseriformes, Anguiliformes, Siluriformes e Cypriniformes (87,1-89,5%), e, a menor identidade com os Gadiformes e Cyprinodontiformes (55%). A identidade com a análoga sequência de GTH&alpha; de Homo sapiens foi de 67%. Para a subunidade ag-FSH&beta;, a ORF correspondente foi de 381 pb, produzindo uma proteína de 126 aminoácidos com um peptídeo sinal de 18 e um peptídeo maduro de 108 aminoácidos. Quando comparado com as sequências de Anguilla marmorata, Acipenser gueldenstaedtii e Homo sapiens, o peptídeo maduro de ag-FSH&beta; mostrou conter 12 resíduos de cisteínas responsáveis pela formação de seis pontes dissulfeto, duas prolinas e um sítio de glicosilação perfeitamente conservados, apresentando identidades de 63, 50 e 45% respectivamente em suas sequências de aminoácidos. As árvores filogenéticas construídas mostraram, em geral, que o A. gigas, da ordem dos Osteoglossiformes, se apresenta como grupo irmão dos Clupeocefala, enquanto os Elopomorpha (Anguiliformes) formam o grupo mais basal de todos os teleósteos aqui analisados. / Pirarucu (Arapaima gigas) is a giant fish of the Arapaimidae family native to the Amazon river basin, that can reach 3 meters in length, weighing up to 250 Kg. It is present in Equador, Colombia, Peru, Bolivia and Brazil. This species is in danger of disappearing due to exploitation by the fishing industry and increasing human presence in its natural habitat. In the present work the cDNAs of the gonadotropin -subunit (ag-GTH) and of follicle-stimulating hormone &beta; subunit (ag-FSH&beta;) were isolated and cloned for the first time. As a consequence, a better understanding of the diversity and evolution of this glycoprotein in fish and its future biotechnological synthesis for reproductive and alimentary purposes will be possible. Both cDNAs of ag-GTH&alpha; and ag-FSH&beta; have been synthesized via reverse transcriptase reaction (RT-PCR) and polymerase chain reaction (PCR) using as a template total RNA extracted from A. gigas pituitary glands. Ag-GTH&alpha;- subunit has a coding sequence (open reading frame, ORF) of 348 bp, corresponding to a 115 amino acid protein, with a putative signal peptide of 24 aminoacids and a mature peptide of 91 amino acids. Ten cysteine residues, responsible for the formation of five disulfide linkages, two N-glycosylation sites and three proline residues were found highly conserved when compared to other fish species. A comparison based on the amino acid sequence of the GTH&alpha;- subunit from 38 different species of fish showed high identity of A. gigas with members of the following orders: Acipenseriformes, Siluriformes and Cypriniformes (87.1-89.5%), while the lowest identity was found with Gadiformes and Cyprinodontiformes (55%). In comparison with the analogous sequence of Homo sapiens an identity of 67% was found. For the ag-FSH&beta; subunit an ORF of 381 bp, coding for a 126 amino acid protein, with a signal peptide of 18 and a mature peptide of 108 amino acids, was found. When compared with the Anguilla marmorata, Acipenser gueldenstaedtii and Homo sapiens, the mature peptide of ag-FSH&beta; showed the presence of the twelve cysteine residues responsible for the formation of six disulfide linkages, two proline residues and one glycosylation site, all of them perfectly conserved. The identity with the mentioned species were 63, 50 and 45% respectively. The obtained phylogenetic trees have shown, in general, that A. gigas of the order of Osteoglossiformes appears as sister group of Clupeocephala, while Elopomorpha (Anguilliformes) forms the most basal group of all analyzed teleosts.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:29:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eduardo Camelo.pdf: 5882040 bytes, checksum: ca0ec607eeffcfa39c85964f5b3ad2ee (MD5) Previous issue date: 2011-12-06 / OBJECTIVES: To establish the correlation between the curves of the AFC and serum basal FSH as well as to construct a nomogram correlating age with different values of antral follicles counts percentiles in infertile patients. METHODS: A cross-sectional study of patients treated at Fêmina Reprodução Humana was made from March 2010 to October 2011. The patients were submitted to transvaginal ultrasonography and basal FSH dosage from days 2 to 4 of their menstrual period. The patients included were the ones who were 21 to 45 years old, with regular menses, two healthy ovaries, without any evidence of endocrinopathies and that signed the consent. Patients excluded: smokers, with galactosemia or ovarian cysts, with antecedents of hepatopathies, ovarian surgeries or treated with chemotherapy or radiotherapy. Pearson s correlations coefficient was used to analyze the parametric data and Spearman`s test to the non parametric data. To evaluate the evolution of the AFC in relation to age of patients the percentiles 5th, 25th, 50th, 75th and 95th were used. A linear regression was made to understand the effect of age on the AFC. RESULTS: One hundred and seventy-two patients were included in the trial with a mean age of 32.7 years old. There was a weak correlation between the dose of basal FSH and the AFC (r = - 0,269). The age-related normogram for the 5rd, 25th, 50th, 75th and 95th percentile of antral follicle count revealed that changes were best fitted by a linear function. The percentiles that showed the highest correlations were 25 (r = - 0,960; p < 0,001), 50 (r = - 0,948; p < 0,001) and 75 (r = - 0,917; p < 0,001). All were statistically significant. CONCLUSIONS: The correlation between serum levels of FSH and AFC was negative and weak. A nomogram was constructed correlating age with different values of the percentiles of the antral follicle count in infertile women without endocrinopathies. There was a linear, strong and negative correlation in all percentiles. / OBJETIVOS: Estabelecer a correlação entre as curvas da CFA e da dosagem sérica do FSH basal. Construir um nomograma correlacionando a idade com diferentes valores dos percentis da contagem dos folículos antrais em mulheres inférteis. MÉTODO: Estudo transversal de todas as pacientes atendidas no Centro de Reprodução Humana Fêmina no período 01/03/2010 a 01/10/2011. As pacientes foram submetidas à ultrassonografia transvaginal e a dosagem do FSH basal do 2º ao 4º dia do ciclo menstrual. Foram incluídas as pacientes de 21 a 45 anos, com ciclos regulares, dois ovários íntegros, sem evidência de endocrinopatias e que assinaram o consentimento. Foram excluídas as tabagistas, portadoras de galactosemia, cistos ovarianos, com antecedente de hepatopatia, cirurgia ginecológico-ovariana, tratamento com quimioterapia ou radioterapia. Os testes utilizados foram os coeficientes de correlação de Pearson, para dados paramétricos, e de Spearman para dados não paramétricos. Para verificar a evolução da CFA em relação à idade dos pacientes foram utilizados os percentis 5, 25, 50, 75 e 95. Foi feito uma regressão linear que possibilitasse perceber o efeito da idade sobre a CFA. Foi utilizado como nível de significância o valor de 5% (p<0,05). RESULTADOS: Cento e setenta e duas pacientes foram incluídas no estudo, a idade média foi de 32,7 anos. A correlação entre a dosagem sérica do FSH basal e a CFA foi negativa e fraca (r = - 0,269). O nomograma correlacionando a idade com os percentis 5, 25, 50, 75 e 95 da contagem dos folículos antrais foi melhor ajustado por uma função linear. Os percentis que apresentaram as correlações mais altas foram o 25 (r = - 0,960; p < 0,001), 50 (r = - 0,948; p < 0,001) e 75 (r = - 0,917; p < 0,001). Todas as correlações foram estatisticamente significantes. CONCLUSÃO: A correlação entre a dosagem sérica do FSH basal e a CFA foi negativa e fraca. Construiu-se um nomograma correlacionando a idade com diferentes valores dos percentis da contagem dos folículos antrais em mulheres inférteis sem endocrinopatias. Houve uma correlação linear, negativa e forte em todos os percentis.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os caprinos sÃo considerados importantes fontes de carne, leite e pele, e, portanto, desempenham importante papel econÃmico especialmente na regiÃo nordeste do Brasil Diante disso, o desenvolvimento de sistemas de cultivo de folÃculos ovarianos pode otimizar potencial reprodutivo desta espÃcie. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da lectin PHA de Phaseolus vulgaris sobre o desenvolvimento de folÃculos ovarianos caprino cultivados in vitro. FolÃculos secundÃrios (~ 0,2mm) foram isolados de cÃrtex ovariano e individualmente cultivados por seis dias em &#945;-MEM+ suplementado com 0, 1, 10, 50, 100 o 200Âg/mL da lectina PHA. Ao final do perÃodo de cultivo, os nÃveis de RNAm para FSH-R PCNA e NOS1 nestes folÃculos foram quantificados por qRT-PCR . Os resultados mostraram que, apÃs o cultivo, todos os tratamentos foram capazes de manter a sobrevivÃncia folicula AlÃm disso, nÃo foram observadas diferenÃas significativas entre os tratamentos e o control no aumento do diÃmetro folicular durante o cultivo. Entretanto, a PHA na concentraÃÃo de 10Âg/mL promove uma maior taxa de formaÃÃo de antro em relaÃÃo ao controle (&#945;-MEM+ Nessa concentraÃÃo houve maior expressÃo dos nÃveis de RNAm para FSH-R e PCNA. Em conclusÃo, a PHA na concentraÃÃo de 10Âg/mL mostrou aÃÃo biolÃgica na formaÃÃo antro estimulou um aumento nos nÃveis de expressÃo de RNAm para FSH-R e PCNA em folÃculo secundÃrios caprinos cultivados in vitro por 6 dias. / Goats are considered important sources of meat, milk and skin, and therefore play an important economic role, especially in northeastern Brazil. Thus, the development of culture systems can optimize the reproductive potential of this species. This study aimed to evaluate the effect of lectin PHA of Phaseolus vulgaris on the development of caprine secondary follicles cultured in vitro. Secondary follicles (~0,2mm) were isolated from the cortex of caprine ovaries and individually cultured for six days in &#945;-MEM+ supplemented with PHA at concentrations of 0, 1, 10, 50, 100 or 200Âg/mL. The levels of mRNA for R-FSH, PCNA and NOS1 in these follicles were also evaluated. The results showed that, after culture, all treatments were capable of maintaining the follicular survival. Moreover, there was no significant difference among all treatments regarding follicular growth. However, PHA at concentrations of 10Âg/mL increased the antrum formation rate when compared with control. In this concentration, there was a higher expression of mRNA for R-FSH and PCNA. In conclusion, PHA at concentration 10Âg/mL showed a biological action in antro formation and stimulated an increase of levels of expression of RNAm in caprine ovarian follicles cultured for six days.

Apesar do grande volume de pesquisas e dos avanços da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, a eficiência da técnica ainda está distante do desejável, principalmente quando comparada a embriões produzidos in vivo. A maturação in vitro é etapa importante da PIV, visto que a qualidade dos embriões é dependente da qualidade do oócito e, assim, modificações nas condições de maturação in vitro podem trazer avanços à produção de embriões. A melatonina é um hormônio que foi detectado no fluido folicular de humanos, suínos e, mais recentemente, de bovinos. Ainda, seus receptores foram localizados em oócitos e células da granulosa. Estudos in vitro apontam efeitos benéficos de sua utilização na maturação e cultivo in vitro de oócitos e embriões, embora os resultados sejam por vezes contraditórios. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da melatonina na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e também seu potencial como indutor de genes de enzimas antioxidantes e inibidor de fragmentação nuclear em células do cumulus. Para tanto, complexos cumulus-oócitos (CCOs), obtidos de ovários de abatedouro, foram maturados in vitro na presença de melatonina (10-9 e 10-6 M), FSH (controle positivo) ou sem hormônios (controle negativo). As taxas de maturação nuclear foram avaliadas às 6, 12, 18 e 24 horas de cultivo (Experimento 1). No Experimento 2, os mesmos grupos experimentais foram avaliados quanto à abundância relativa de transcritos de genes de enzimas antioxidantes (Cu,ZnSOD, MnSOD e GPx) em oócitos e células do cumulus (24 horas de MIV) por PCR em tempo real. No Experimento 3 foi avaliado o efeito dos tratamentos sobre a fragmentação nuclear em células do cumulus pela técnica de TUNEL e citometria de fluxo (24 horas de MIV). A taxa de maturação avaliada às 6 h de MIV foi de 100% de oócitos imaturos em vesícula germinativa (VG) (P&GT;0,05). Às 12 horas de cultivo foi observado o efeito da melatonina similar ao FSH, variando a proporção de oócitos em metáfase I (MI) de 54,0 a 80,7 % entre os grupos (P&LT;0,05). Após 18 h de MIV observou-se que a maioria dos oócitos já havia atingindo o estádio de metáfase II (MII) variando de 57,2 a 74,2 % (P&GT;0,05). Após 24 h de MIV, observou-se que a maioria dos oócitos atingiu o estádio de MII (50,7 a 89,5%), sendo que a melatonina na maior concentração apresentou efeito similar ao da gonadotrofina (P&LT;0,05). Em relação à expressão de enzimas antioxidantes em oócitos não houve efeito de nenhum tratamento (P&GT;0,05%). Já em células do cumulus houve maior expressão do MnSOD no grupo com FSH em relação ao grupo maturado sem hormônios ou imaturo (P&LT;0,05). A melatonina nas diferentes concentrações apresentou efeito similar ao da gonadotrofina (P&GT;0,05). Transcritos para a enzima Cu,ZnSOD foram mais abundantes em cumulus de CCOs maturados com a maior concentração de melatonina (10-6 M) em relação ao grupo imaturo (P&LT;0,05), não havendo variação nos demais (P&GT;0,05). GPX4 não foi afetado pelos tratamentos (P&GT;0,05). A quantidade de células do cumulus com fragmentação nuclear não foi afetada por nenhum tratamento (33,4 a 41,5/10.000 células; P&GT;0,05) Com base nestes resultados conclui-se que a melatonina nas concentrações avaliadas (10-9 e 10-6 M), embora seja capaz de estimular a maturação nuclear e induzir a expressão de alguns genes antioxidantes em células do bovinas, ainda que de forma semelhante ao FSH, não provocou redução da fragmentação nuclear nestas células. / Nevertheless the great volume of research and the advances in in vitro production (IVP) of bovine embryos, the efficiency of this techinque is still beyond the desireable, specially when compared to embryos produced in vivo. in vitro maturation (IVM) is an important step in IVP, since the quality of embryos is dependent on the quality of oocytes, and, therefore, modifications to in vitro maturation conditions can bring improvements to embryo production. Melatonin is a hormone which has been detected in the folicular fluid of humans, pigs, and more recently, in bovine. Also, its receptores have been identified in oocytes and granulosa cells. Studies in vitro have shown that melatonin may have beneficial effects when used in oocyte maturation and embryo culture, although results are sometimes contradictory. The aim of the present work was to assess the effect of melatonin during IVM on nuclear maturation of bovine oocytes as well as its potential to induce expression of antioxidant enzymes and to reduce nuclear fragmentation in cumulus cells. Cumulus-oocyte comprexes (COCs), obtained from abbattoir ovaries, were matured in vitro in the presence of melatonin (10-9 e 10-6 M), FSH (positive controle) or without hormones (negative control). Maturation rates were evaluated at 6, 12, 18 and 24 h (Experiment 1). In Experiment 2, the same groups were evaluated for the relative abundance of transcripts encoding antioxidant enzymes (Cu,ZnSOD, MnSOD and GPx) in oocytes and cumulus cells (24 h IVM) by real time PCR. In Experiment 3, the effect of treatments on nuclear fragmentation in cumulus cells was determined by TUNEL and flow cytometry (24 h IVM). At 6 h IVM, all oocytes were at immature germinal vesicle (GV) stage. After 12 h of cuture the effect of melatonin was similar to that of FSH, with proportions of oocytes in metaphase I (MI) varying from 54.0 to 80.7% between groups (P&GT;0.05). After 18 h IVM most oocytes had reached metaphase II (MII) stage (57.2 to 74.2%, P&GT;0.05). At 24 h IVM, oocytes were also mostly in MII stage (50.7 to 89.5%), and the highest melatonin concentration was similar to the gonadotrophin (P&GT;0.05). Regarding expression of antioxidant enzymes in oocytes there was no effect of treatments for any of the genes (P&GT;0.05). However, in cumulus cells MnSOD expression was higher in FSH compared with the groups matured without hormones or immature cells (P&LT;0.05). Melatonin in both concentrations were similar to FSH (P&GT;0.05). Transcripts for Cu,ZnSOD were more abundant in cumulus from COCs matured with the highest melatonin concentration (10-6 M) in relation to immature cells (P&LT;0.05), but was not diferent from other groups (P&GT;0.05). GPx was not affected by treatments (P&GT;0.05). The number of nuclear fragmentation in cumulus cells was also not affected by treatments (33.4 to 41.5/10,000 cells; P&GT;0.05). According to these results it is concluded that melatonin is able to induce meiosis resumption in oocytes (10-9 and 10-6 M) and expression of some antioxidant genes in bovine cumulus cells, similar to the effect of FSH, but was ineffective in reducing nuclear fragmentation in these cells.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TelcioParreiraMinare- dissertacao.pdf: 1033418 bytes, checksum: 5214b443feda2d64e44b38ae6d5613b4 (MD5) Previous issue date: 2013-05-16 / Most of the previous studies aiming to improve superovulation evaluated only differences in the number of corpora lutea (CL) observed and of embryos recovered. Therefore, differences in total follicular population before hormonal stimulation and in response parameters associated to follicle growth were frequently neglected, causing bias in the conclusion. The aim of the present study was to characterize individual variation in both relative and absolute efficiency of superovulation, based on ovarian follicular population. Non-lactating Gir breed cows (n=2) and heifers (n=15), kept under the same management, were used. Four days before the start of superovulatory treatment, follicular growth was synchronized by the insertion of an intravaginal device of progesterone and estradiol benzoate application. Superovulations started on D1 with the injection of 200 UI FSHp, following a conventional protocol. The number and diameter of the follicles present before (D0) and during superovulation (D5 to D8), as well as the number of CL at flushing (D12), were evaluated by ultrasonography. Follicular population was ranked according to size (&#8804;4 mm, 5-7 mm, &#8805;8 mm), and changes in the percentage of follicles in each size class were used to calculate relative efficiency. The absolute efficiency was determined by the ratio number of embryos recovered : number of follicles &#8804;4 mm on D5. Results are shown as mean±SEM. As expected, there was a great individual variation in the superovulation outcomes, both considering the number of CL (0 to 28, mean 12.6±2.1; CV=68.2%) and embryos collected (0 to 15, mean 5.1±1.1; CV=92.4%). There was no increase (P>0.05) in total follicular population during treatment, and the correlation between the number of follicles during superovulation and the further number of CL or embryos remained relatively constant between D5 and D8 (r=0.56 to 0.65 and r=0.70 to 0.79, respectively; P<0.01). FSH treatment induced a progressive (P<0.05) but partial mobilization of small follicles to larger size classes. The relative efficiency of the follicle growth stimulation was 41.9±5.5% (0 to 75.6%), and this was the endpoint with the largest correlation (R=0.80; P<0.0001) with the absolute efficiency of the process (12.2±2.1%, ranging from 0.0 to 25.0%). Retrospective analysis demonstrated that donors with relative efficiency >50% had a number of follicles &#8804;4 mm on D1 similar to those with efficiency <50% (41.6±6.8 vs 42.1±3.1; P<0.001), but produced more CL and embryos (17.8±2.5 and 7.6±1.7 vs 6.9±2.1 and 2.4±0.9, respectively; P<0.001). In conclusion, individual differences in follicular population and in the follicle response to FSH are important sources of variation in superovulation results, and shall be taken into account for experimental design. Acknowledgement: FAPEMIG, CAPES, Biotran LTDA. / A maioria dos estudos que objetiva otimizar a técnica de superovulação em bovinos considera como parâmetros de avaliação apenas o número de corpos lúteos (CL) formados e de embriões recuperados. Desse modo, variações na população folicular no início do tratamento e parâmetros de resposta relacionados ao crescimento folicular são frequentemente desconsiderados, gerando vieses de interpretação. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as variações individuais na eficiência relativa e absoluta da superovulação, com base na população folicular ovariana. Foram utilizadas vacas não lactantes (n=2) e novilhas (n=15) da raça Gir, mantidas em condições semelhantes de manejo e alimentação. Quatro dias antes do início do tratamento superovulatório, o crescimento folicular foi sincronizado pela inserção de um dispositivo intravaginal de progesterona e aplicação de benzoato de estradiol. As superovulações foram iniciadas no D1 pela administração de 200 UI de FSHp, segundo protocolo convencional. O número e o tamanho dos folículos presentes no dia anterior ao início (D0) e durante a superovulação (D1 a D4), assim como o número de CL presentes no dia da coleta (D12), foram avaliados por ultrassonografia. A população folicular foi classificada em função do tamanho (&#8804;4 mm, 5-7 mm, &#8805;8 mm), e nas variações do percentual de folículos entre as classes de tamanho utilizadas para cálculo de eficiência relativa. A eficiência absoluta foi calculada pela razão entre o número de embriões recuperados e de folículos &#8804;4 mm presentes no D1. Os resultados são apresentados como média±EPM. Como esperado, observou-se uma grande variação individual de resposta, tanto considerando o número de CL formados (0 a 28, média de 12,6±2,1; CV=68,2%) quanto de embriões recuperados (0 a 15, média de 5,1±1,1; CV=92,4%). Não houve aumento (P>0,05) no número total de folículos presentes ao longo do tratamento, e a correlação entre população folicular total e o número de CL ou de embriões permaneceu relativamente constante entre o D1 e o D4 (r=0,56 a 0,65 e r=0,70 a 0,79, respectivamente; P<0,01). O tratamento superovulatório resultou em uma mobilização progressiva (P<0,05), porém parcial, da população de folículos pequenos para classes de tamanho superiores. A eficiência relativa do tratamento estimulatório foi de 41,9±5,5% (0 a 75,6%), e este foi o indicador parcial com maior correlação (R=0,80; P<0,0001) com a eficiência absoluta do processo (12,2±2,1%, variando de 0,0 a 25,0%). Em análise retrospectiva, demonstrou-se que doadoras com eficiência relativa acima de 50% apresentavam um número de folículos &#8804;4 mm no D1 semelhante àquelas com eficiência abaixo de 50% (41,6±6,8 vs. 42,1±3,1; P<0,001), mas produziram mais CL e embriões (17,8±2,5 e 7,6±1,7 vs. 6,9±2,1 e 2,4±0,9, respectivamente; P<0,001). Conclui-se que diferenças individuais na população folicular inicial e na resposta ao FSH são importantes fontes de variação na resposta superovulatória, e devem ser consideradas nos delineamentos experimentais. Agradecimentos: FAPEMIG, CAPES, Biotran LTDA.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaCarolina Nascimento Tirapelli-dissertacao.pdf: 835496 bytes, checksum: d1241371358fd9c1b5711519b6a38a32 (MD5) Previous issue date: 2013-05-17 / This experiment aimed to evaluate and compare result of superovulation of zebu females, using a product based on FSH/LH protocol, and with a smaller number of applications and similar dose (split dose). Were performed 32 superovulations in16 Zebu females, aged 17-42 months, body condition score 2,5 to 4 (scale 1-5), arrangedin arandomized cross-over. That is, all females were superovulated twice, once with each protocol .Before the beginning of the protocol, all animals underwent a synchronization: D0-introduction of a progesterone implant and applying 2 mL of estradiol benzoate. The females of the conventional group received 250 IU of FSH/LH, outline application for four days and eight decreasing doses. So, the administration of FSH/LH in D4, D5, D6 and D7 was in the morning and afternoon, with their respective strengths: 50,0 IU; 37,5 IU; 25,0 IU and 12,5 IU; D7 was added in 2 mL of application of cloprostenol in the morning and removal the implant of progesterone 12 hours after. On D8 was applied 2 mL of a GnRH analogue and held to first AI 12 hours after, and the second AI 12 hours after the first. D15 was performed on the collection of embryos. Female of split group received 250 IU of FSH/LH. D4 was administered 62,5 IU FSH/ LH intramuscular and 125,0 IU subcutaneously in the morning. Twenty-four hours after 62,5 IU was administered subcutaneously in the morning and on D7 was removed progesterone implantand applied 2 ml of cloprostenol sodico. On D8 was applied 2 mL of GnRH and AIs were performed 12 hours and 24 hours after. On D15 the embryos was collected. Before beginning the superovulation (D0) in the first day of superovulation (D4) in the middle of the superovulation protocol (D6) and on the end of the protocol (D8) were counted numbers of follicles present <3mm, between 3 and 8mm >8 mm in diameter, with the aid of ultrasound. The two groups were equivalent in number of follicles measured from day 4-6. From day 8, significant differences (P<0,05) between the conventional group and split up to 3mm follicles (2,19 ±1,22 and 4,06±2,59, respectively) and follicles >8mm (9,06 ± 4,54and 5,50±4,59, respectively).The evaluation of the superovulatory response was doneby counting the number of corpora luteaineach ovaryat harvest (D15) embryos. All embryos were collected by nonsurgical method and classified according to Lindner&Wright(1983). The amount of CLs were 8,12±3,26 for the conventional group and 4,69± 3,46 for the split group (P <0,05) and total number of embryos were collected: 6,69± 3,05 e3,37± 2,50, respectively (P <0,05). Also significant differences (P<0,05) for the number of viable embryos: 5,25 ±2,29 (conventional group) and 2,37±1,78(split group). From these results, it is concluded that the protocol split with three applications of FSH/ LH showed no equivalence or superiority in production of CLs and in total embryos produced and viable, compared to the conventional protocol superovulation. &#8195; / Este experimento teve como objetivo avaliar e comparar resultados de superovulação de fêmeas zebuínas, utilizando um produto a base de FSH/LH num protocolo convencional e com número menor de aplicações e similar dosagem (dose split). Foram realizadas 32 superovulações em 16 fêmeas zebuínas, com idade variando de 17 a 42 meses, com escore de condição corporal 2,5 a 4 (escala de 1-5), arranjadas num delineamento experimental tipo cross-over. Isto é, todas as fêmeas foram superovuladas duas vezes, uma com cada protocolo. Anteriormente ao início dos protocolos, todos os animais passaram por sincronização com: D0- introdução de um implante de progesterona e aplicação de 2mL de benzoato de estradiol. As fêmeas do grupo convencional receberam 250 UI de FSH/LH, num esquema de aplicação por quatro dias e oito doses decrescentes. Desta maneira, administrou-se FSH/LH no D4, D5, D6 e D7 no período da manhã e da tarde, com as respectivas dosagens: 50,0 UI; 37,5 UI; 25,0 UI e 12,5 UI; sendo acrescentado no D7 a aplicação de 2 mL de cloprostenol sódico no período da manhã e remoção do implante de progesterona 12 horas após. No D8 aplicou-se 2mL de um análogo de GnRH e realizou-se a primeira IA 12 horas após e, a segunda IA 12 horas após a primeira. No D15 foi realizada a colheita de embriões. As fêmeas do grupo split também receberam 250 UI de FSH/LH. No D4 administrou-se 62,5 UI de FSH/LH por via intramuscular e 125,0 UI por via subcutânea no período da manhã. Vinte e quatro horas após administrou-se 62,5 UI por via subcutânea e na manhã do D7 removeu-se o implante de progesterona e aplicou-se 2mL de cloprostenol sódico. No D8 aplicou-se 2mL de GnRH e as IAs foram realizadas as 12 horas e 24 horas após.No D15 colheu-se os embriões. Antes do início da superovulação (D0), no primeiro dia (D4), no meio do protocolo (D6) e ao final (D8), foram contabilizados os números de folículos presentes < 3 mm, entre 3 a 8 mm e >8 mm de diâmetro, com auxílio de ultrasson. Os dois grupos foram equivalentes na quantidade de folículos mensurados do dia 4 ao 6. A partir do dia 8, houve diferença (P<0,05) entre o grupo convencional e split para folículos até 3 mm (2,19±1,22 e 4,06±2,59, respectivamente) e para folículos > 8 mm (9,06±4,54 e 5,50±4,59, respectivamente). Foi realizada a avaliação da resposta superovulatória pela contagem do número de corpos lúteos de cada ovário no dia da colheita (D15) de embriões. Todos os embriões foram colhidos pelo método não cirúrgico e classificados segundo Lindner&Wright (1983). A quantidade de CLs foram: 8,12±3,26 para o grupo convencional e 4,69±3,46 para o grupo split (P<0,05), e o número de embriões totais coletados foram: 6,69±3,05 e 3,37±2,50, respectivamente (P<0,05). Também houve diferença (P<0,05) para o número de embriões viáveis: 5,25±2,29 (grupo convencional) e 2,37±1,78 (grupo split). Conclui-se que o protocolo split com três aplicações de FSH/LH não apresentou equivalência ou superioridade na produção de CLs e no total de embriões produzidos e viáveis, quando comparado com o protocolo de superovulação convencional.