A castanheira (Bertholletia excelsa Humb. & Bonpl.) é uma árvore nativa da região Amazônica muito valorizada por suas sementes, as castanhas-do-Brasil, que apresentam alto valor nutritivo e são uma rica fonte de selênio, um agente antioxidante. O Brasil está entre os países que mais produzem e exportam estas castanhas. As condições climáticas da região Amazônica, assim como as demais etapas da cadeia produtiva, podem favorecer a infecção fúngica neste substrato, principalmente por Aspergillus nomius, espécie extremamente relacionadas à produção de aflatoxinas. Esta micotoxina está associada ao desenvolvimento de tumores, imunossupressão e alterações hepáticas tornando-a um risco para a saúde pública. Sendo assim, a realização de estudos que forneçam informações adequadas sobre o comportamento de A. nomius é de extrema relevância, pois contribuem no conhecimento das condições propícias para a produção de aflatoxinas. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a resposta ecofisiológica de cepas de A. nomius isoladas de castanhas-do-Brasil (crescimento micelial, expressão gênica e produção de aflatoxinas) em diferentes temperaturas (25, 30 e 35 °C). O crescimento micelial foi mensurado diariamente a partir da inoculação de 8 cepas em ágar coco, mantidas no escuro até 7 dias. A partir destas colônias foi feita análise da expressão dos genes aflR, aflD e aflQ, envolvidos na biossíntese das aflatoxinas, com utilização de PCR em Tempo Real. Com as mesmas colônias também foi feita análise do potencial aflatoxigênico (B1, B2, G1 e G2) qualitativo (Cromatografia em Camada Delgada) e quantitativo (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência). A temperatura ideal para crescimento micelial das cepas de A. nomius foi 30 °C. Esta condição foi a melhor para a expressão dos genes aflR, aflD e aflQ. Contudo, o gene aflQ também apresentou alta expressão a 25 °C e foi o gene mais expresso em todas as temperaturas avaliadas. Em relação ao potencial toxigênico das cepas, a maior produção ocorreu a 25 °C. Em todas as temperaturas avaliadas houve maior produção de aflatoxinas do grupo B do que do grupo G. Pôde-se observar que a temperatura que propiciou a maior produção destas toxinas coincide com as da região Amazônica, território nativo das castanheiras. Com base nos resultados reportados, este estudo poderá servir como ferramenta na elaboração de eficientes estratégias para o controle de A. nomius e aflatoxinas em castanhas-doBrasil. / The Brazil nut tree (Bertholletia excelsa Humb. & Bonpl.) is an Amazonian native species that produce seeds with high nutritional value and rich source of selenium, an antioxidant agent. Brazil is one of the major producers and exporters of these nuts. The Amazon weather conditions in the production area and also on the productive chain play a critical role in the fungal infection, specially by Aspergillus nomius, important species associated to the aflatoxin contamination. This mycotoxin is related to the development of tumors, immunosuppression and liver alterations that becomes a risk to public health. Therefore, studies that provides adequate informations about the behavior of A. nomius are extremely relevant, contributing to better understand the favorable conditions to the aflatoxins production. The main goal of the present study was to evaluate the ecophysiological response of A. nomius strains isolated from Brazil nuts (mycelial growth, gene expression and aflatoxin production) at different temperatures (25 °C, 30 °C, and 35 °C). The mycelial growth of 8 strains was measured daily for 7 days in coconut agar. From these colonies, the expression of aflR, aflD, and aflQ genes, that are involved in aflatoxin biosynthesis was analyzed by using Real Time PCR. From the same colonies, the aflatoxigenic potential (B1, B2 , G1 and G2 ) were analyzed qualitative and quantitative by Thin Layer Chromatography and High Performance Liquid Chromatography, respectively. Mycelial growth assessment revealed that the optimal temperature for the radial growth rate and the average of final growth was at 30 °C. This was also the best condition for the expression of aflR, aflD, and aflQ genes. However, the aflQ also showed high expression at 25 °C and was the most expressed gene at all evaluated temperatures. The highest aflatoxin production occurred at 25 °C, with higher toxins production on group B than group G. It was possible to notice that the optimum temperature to aflatoxin production coincides with those in Amazon region, the most important producing area. These results also may contribute to enhance the management strategies of aflatroxin control in Brazil nuts.

Endófitos são todos os microrganismos, cultiváveis ou não, que habitam o interior dos tecidos vegetais, não causando danos ao hospedeiro e nem o desenvolvimento de estruturas externas, excluindo, dessa forma, bactérias noduladoras e micorrizas. Theobroma cacao L. é importante para as indústrias alimentícia e cosmética, por constituir a matéria prima para a produção de manteiga de cacau. Considerando a importância do estudo do cacaueiro e sua comunidade fúngica endofítica associada, os objetivos desse trabalho foram: i) estudar a diversidade da comunidade endofítica de cacau; ii) avaliar o potencial dessa comunidade para o controle biológico de Crinipellis perniciosa, o agente causal da vassoura de bruxa e outros fitopatógenos e iii) estudar a interação endófito-patógeno e endófito-hospedeiro. O trabalho foi iniciado com o isolamento de fungos endofíticos de cacau, que foram caracterizados com base em características morfológicas e moleculares. A diversidade foi avaliada por análises de rDNA (regiões ITS1, ITS2 e 5.8) (ARDRA e sequenciamento). A análise de ARDRA gerou 64 haplótipos, os quais incluíram no mínimo, 16 espécies. A seguir, fungos endofíticos antagônicos de cacau foram selecionados in vitro contra C. perniciosa. Foi observado que, dentre os 145 isolados avaliados, 38.6% foram classificados como antagônicos, enquanto 13.1% foram classificados como parasitas. Após a seleção, os isolados foram usados para extração de metabólitos secundários e outras caracterizações. Também foi feita a detecção do gene da δ-(L-α- aminoadipil)-L-cisteinil-D-valin (ACV), que é a precursora das β-lactanas, antibióticos como as penicilinas e cefalosporinas. A amplificação desse gene gerou um fragmento de 600 pb em 9.1% dos isolados avaliados. Alguns isolados foram testados contra fungos fitopatogênicos (Colletotrichum falcatum, C. sublineorum, Erythricium salmonicolor, Rhizoctonia solani, Ceratocystis paradoxa, Phytophthora sp., P. parasitica, P. palmivora e Fusarium moniliforme). Apenas C. sublineorum de sorgo e Ceratocystis paradoxa de cana-de-açúcar foram inibidos in vitro pelos endófitos 42.3 e 2, respectivamente. Foi feita a investigação da habilidade de penetração e colonização do fungo endofítico 42.3 em cacau comum suscetível, usando as técnicas de RAPD e SEM. A penetração do fungo foi iniciada entre 3 e 6 horas após a inoculação. A interação entre o endófito de cacau 42.3 com C. perniciosa 281 (patogênico), foi avaliada por SDS-PAGE, visando a detecção de proteínas expressas pelo patógeno e pelo endófito. A SDSPAGE permitiu a visualização de bandas expressas na interação, quando os microrganismos foram crescidos juntos. Na presença do substrato de crescimento do endófito, C. perniciosa não expressou proteínas visíveis, ou distinguíveis em SDS-PAGE, mas o co-cultivo desses fungos, geraram bandas não observadas em análises prévias. / Endophytes are all microorganisms, culturable or not, that inhabit the interior of plant tissues, causing no harm to the host, and that do not develop external structures, excluding in this way, nodulating bacteria and mycorrhizal fungi. Theobroma cacao L. is important to food and cosmetic industry due the fact that it is used for production of cacao butter. Considering the importance of cacao and associated endophytic fungal community studies, the objectives of this work were to: i) study the diversity on endophytic community of cacao; ii) evaluate the potential of this community to biological control of Crinipellis perniciosa, causal agent of witches’ broom disease and other phytopathogens and iii) study the interaction endophyte-pathogen and endophyte-host. The work began with isolation of the cacao endophytic fungi that was characterizated based on morphological and molecelar characters. The diversity was evaluated by rDNA (ITS1, ITS2 e 5.8 subunit regions) analyses (ARDRA and sequencing). The ARDRA analysis generated 64 haplotypes, which included at least 16 species. Following, antagonistic endophytic fungi from cacao were selected in vitro against C. perniciosa. It was observed that in 145 evaluated isolates, 38.6% was classified as antagonic, while 13.1% were classified as parasitic. After the selection, isolates were used for secondary metabolites extraction and further characterization. Also, detection of δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valin (ACV) gene, which is the precursor of β-lactans, antibiotics like penicilins and cephalosporins, was carried out. The amplification of this gene generated a fragment of 600pb in 9.1% of the isolates evaluated. Some isolates were further evaluated against phytophathogenic fungi (Colletotrichum falcatum, C. sublineorum, Erythricium salmonicolor, Rhizoctonia solani, Ceratocystis paradoxa, Phytophthora sp., P. parasitica, P. palmivora and Fusarium moniliforme). Only C. sublineorum of sorghum and Ceratocystis paradoxa of sugarcane were in vitro inhibited by the endophytes 42.3 and 2, respectively. The investigation of the penetration and colonization ability of endophytic fungus 42.3 on susceptible cacao comum was carried out, using RAPD and SEM techniques. The penetration of the fungus was initiated between 3 and 6 hours after inoculation. The interaction between cacao endophyte 42.3 with C. perniciosa 281 (pathogenic), was evaluated by SDSPAGE, aiming the detection of expressed proteins by pathogen and endophyte. The SDS-PAGE allowed the visualization of bands expressed in the interaction, when the microorganisms were grown together. In the presence of the endophyte growth substrate, C. perniciosa do not express visible proteins or, at least, distinguishable in SDS-PAGE, but the co-cultive of these fungi generated non observed bands in previously analysis.

A degradação enzimática rápida, eficiente e robusta de polissacarídeos derivados de biomassa lignocelulósica é atualmente um grande desafio na produção de biocombustíveis e considerada uma alternativa viável e promissora para se enfrentar a crise energética mundial e diminuir a dependência das fontes fósseis de energia. O bagaço de cana-de-açúcar no Brasil é a principal matéria lignocelulósica sustentável de grande potencial para a produção do etanol de 2ª geração. O principal requisito para a consolidação dessa abordagem é a disponibilidade de enzimas que hidrolisam a celulose, hemicelulose e outros polissacarídeos em açúcares fermentescíveis e em condições adequadas para a utilização industrial. O presente estudo visou à caracterização molecular, estrutural e funcional da endoglucanase GH12 do fungo Aspergillus terreus (AtGH12) por diferentes técnicas. O gene que codifica para essa enzima foi clonado e expressado no fungo filamentoso A. nidulans linhagem A773. A cepa com maior secreção foi selecionada e a sequência da enzima confirmada por espectrometria de massas MALDI TOF MS. Posteriormente, através de estudos funcionais de parametrização enzimática como pH e temperatura ótimos, estabilidade térmica, efeitos supressores e potencializadores de aditivos, a enzima AtGH12 foi caracterizada bioquímica e fisicamente. A espectrometria de massas do substrato hidrolisado pela catálise enzimática foi tomada como uma forma de investigar o padrão de clivagem da hidrólise e estudo do reconhecimento enzima/substrato para a AtGH12. As caracterizações estruturais das enzimas recombinantes obtidas utilizando as técnicas de espalhamento dinâmico de luz, dicroísmo circular, espalhamento de raios X a baixo ângulo e gel nativo serviram para determinação do enovelamento e estado oligomérico em solução da AtGH12. Com o intuito de fornecer subsídios para o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos mais eficazes para hidrólise da biomassa lignocelulósica, a atividade da AtGH12 foi avaliada frente ao bagaço de cana-de-açúcar pré-tratados pelos processos hidrotérmicos e organossolve. Posteriormente, o seu grau de sinergismo nesse tipo de substrato foi determinado com o coquetel enzimático comercial Acellerase&reg. / Fast, more efficient and robust enzymatic degradation of lignocellulosic biomassderived polysaccharides is currently a major challenge in the production of biofuels and considered a feasible and promising alternative to confront the global energy crisis and reduce the dependence on fossil energy resources. The sugarcane bagasse in Brazil is the most abundant and sustainable lignocellulosic material for the production of 2nd generation ethanol. The main requirement for the consolidation of this approach is the availability of enzymes that hydrolyze cellulose, hemicelluloses and other polysaccharides into fermentable sugars suitable for industrial use. The present study was aimed at molecular, structural and functional characterization of an endoglucanase from the fungus Aspergillus terreus (AtGH12) using different techniques. The gene encoding this enzyme has been cloned and expressed in the filamentous fungus Aspergillus nidulans strain A773. The strain with increased secretion was selected and the enzyme sequence was confirmed by mass spectroscopy MALDI TOF MS. Later, functional studies such as analysis of optimal pH and temperature, thermal stability, suppression and enhance effects of additives were applied to the AtGH12 characterization. The mass spectrometry of hydrolyzed substrate from the enzyme catalysis was acquired as a way to investigate the cleavage pattern of hydrolysis and the study of the enzyme/substrate interaction. Structural characterization of the recombinant enzymes was obtained using techniques such as dynamic light scattering, circular dichroism as well as small angle X-ray scattering and native gel, aided to determine the folding and oligomeric state of AtGH12 in solution. In order to provide support for the development of more effective enzyme cocktails for hydrolysis of lignocellulosic biomass, the activity of AtGH12 was evaluated using sugarcane bagasse pretreated by hydrothermal and organosolv processes. Subsequently, the degree of synergism in this type of substrate was measured using a commercial enzyme cocktail Acellerase&reg.

Desde a revolução verde, na década de 1950, o processo tradicional de produção agrícola passou por mudanças com a inserção do uso intensivo de agrotóxicos como os piretróides, que são a terceira classe química de pesticidas mais comercializada no mundo. Estes compostos geralmente são ésteres que contêm um anel dimetilciclopropano com grupamentos variáveis e a presença de anéis aromáticos. Cada vez mais os cientistas vêm explorando a diversidade microbiana na biodegradação de pesticidas e neste contexto, o emprego de fungos de ambiente marinho possui grande potencialidade devido ao seu sistema enzimático único com a presença de compostos altamente oxigenados e halogenados, assim como o esfenvalerato empregado neste trabalho. Entretanto, estes micro-organismos não têm sido explorados na biotransformação de pesticidas piretróides. Neste estudo foi avaliada a eficiência de fungos de ambiente marinho [Penicillium raistrickii CBMAI 931, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Cladosporium sp. CBMAI 1237, Microsphaeropsis sp. Dr(A)6, Acremonium sp. Dr(F)1, Westerdykella sp. Dr(M2)4 e Cladosporium sp. Dr(M2)2] na degradação do pesticida piretróide esfenvarelato. Observou-se que o esfenvalerato e seus principais metabólitos de degradação causam efeitos inibitórios significativos no crescimento dos fungos, mas não o suficiente para inviabilizar o estudo da biodegradação por meio destes micro-organismos. Os resultados obtidos sugerem que diversas espécies fúngicas contribuem para a biodegradação do pesticida esfenvalerato, entretanto a eficiência da degradação deste composto varia muito entre linhagens. Observou-se a degradação de 3 a 35% de 100 mg.L-1 de esfenvalerato presente na formulação comercial (SUMIDAN 150SC®) em 14 dias para diferentes fungos. Os metabólitos identificados [3-fenoxibenzaldeído, ácido 3-fenoxibenzoico, álcool 3-fenoxibenzílico e ácido 3-(hidroxifenoxi)benzoico] tornaram possível uma proposta de rota biodegradativa, onde se observou metabólitos cada vez mais polares, aumentando a possibilidade de carreamento para o meio aquoso. Constatou-se que em geral ocorre a formação de grandes quantidade do ácido 3-fenoxibenzoico e do ácido 2-(4-clorofenil)-3-metilbutanoico, compostos considerados tóxicos e que podem causar efeitos nocivos à saúde humana e ao meio ambiente. Para a linhagen Acremonium sp. Dr(F)1 que apresentou os melhores resultados de biodegradação, após 28 dias de cultivo com 100 mg.L-1 de esfenvalerato observou-se 20 mg.L-1 de acido 3-fenoxibenzoico, que posteriormente foi convertido ao ácido 3-(hidroxifenoxi)benzoico. Observou-se também uma biodegradação mais eficiente do princípio ativo esfenvalerato puro do que na formulação comercial, que pode ser causada por diversos fatores, como a toxicidade do xileno presente na formulação comercial ou a adsorção do esfenvarelato aos componentes da formulação emulsionável dificultando a ação enzimática. A partir destes resultados toma-se interessante o emprego destes micro-organismos visando a biorremediação deste pesticida. / Since the green revolution in the 1950s, the traditional agricultural production has undergone changes such as the intensive use of pesticides, including pyrethroids, which is the third most sold chemical class of pesticide. These compounds are generally esters containing a dimethylcyclopropane ring with different groups and aromatic rings. Scientists are exploring the microbial diversity for the biodegradation of pesticides. The use of marine fungi may show great potential to an efficient biodegradation, because of its unique enzymatic system and the presence of halogenated and oxygenated compounds, such as the pesticide esfenvalerate used in this work. However, these microorganisms have not been explored in the biotransformation of pyrethroid pesticides. In this study, marine-derived fungi [Penicillium raistrickii CBMAI 931, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Cladosporium sp. CBMAI 1237, Microsphaeropsis sp. Dr(A)6, Acremonium sp. Dr(F)1, Westerdykella sp. Dr(M2)4 and Cladosporium sp. Dr(M2)2] were applied in the biodegradation of the esfenvalerate. It was observed that the esfenvalerate and its degradation metabolites cause an inhibitory effect on the fungi growth, however not enough to make unfeasible the study of the biodegradation by these microorganisms. The results suggest that different fungal species contribute to the degradation of esfenvalerate, although the efficiency of degradation varies widely between strains. It was observed 3-35% of degradation at a concentration of 100 mg.l-1 of esfenvalerate present in the commercial formulation (SUMIDAN 15OSC®) in 14 days. The identified metabolites [3-phenoxybenzaldehyde, 3-phenoxybenzoic acid, 3- phenoxybenzyl alcohol and 3-(hydroxyphenoxy)benzoic acid ) enabled the proposal of a biodegradative pathway, in which was noted the increasingly polar character of metabolites, raising the possibility of entrainment for aqueous medium . It was observed, in general, the large formation of 3- phenoxybenzoic and 2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutanoic acid, compounds that are considered toxic and may cause harmful effects to human health and the environment. For the strain Acremonium sp. Dr (F)1, which showed the best results of 100 mg.l-1 esfenvalerate biodegradation after 28 days, it was observed 20 mg.l-1 of 3-phenoxybenzoic acid, which was later converted to 3- (hydroxyphenoxy)benzoic acid. It was also observed a more efficient biodegradation of the pure active ingredient than the commercial formulation, what can be caused by various reasons, such as the toxicity of the xylene present in the commercial formulation or the esfenvarelate adsorption in the components of the emulsifiable formulation, difficulting the enzymatic activity. These results shows the potential use of these microorganisms in the bioremediation of esfenvalerate.

A vinhaça e o bagaço de cana são os principais subprodutos oriundos do processamento da cana-de-açúcar nas indústrias sucroalcooleiras, sendo geradas grandes quantidades dos mesmos. O fungo basidiomiceto Pleurotus ostreatus tem a capacidade de degradar materiais lignocelulolíticos e produzir enzimas lignolíticas de interesse para as indústrias. Com o objetivo de avaliar a produção das enzimas lacases e peroxidase, o fungo Pleurotus ostreatus, foi cultivado em meio contendo bagaço pré-tratado e vinhaça, ou em meio contendo apenas vinhaça, em sistema de fermentação semissólido ou submerso; as enzimas extracelulares foram avaliadas após 7, 10 e 12 dias de cultivo. O bagaço peneirado foi considerado pré-tratado fisicamente (T1); para o pré-tratamento T2 o bagaço umedecido foi submetido a autoclave (121°C e 1 atm por 15 min); nos pré-tratamentos químicos, T3 e T4, o bagaço foi tratado com peróxido de hidrogênio e hidróxido de sódio nas seguintes concentrações: 0,75% H2O2 + 0,75% NaOH (T3) e 0,75% H2O2 + 1% NaOH (T4) na proporção 1:10 (p/v) e, em seguida foram submetidos à autoclave (121°C e 1 atm por 15min). A vinhaça utilizada foi proveniente de uma indústria sucroalcooleira (V1) e outra de destilaria (V2); a composição físico-química mostrou que a primeira possuía os índices de matéria orgânica e fósforo mais elevados que na vinhaça V2, enquanto que a relação C:N foi menor na vinhaça V1. Os extratos enzimáticos foram obtidos após filtração do meio submerso; para o meio semissólido foi necessário a adição de tampão citrato (1:5 p/v) antes da filtração. A atividade de lacasse e peroxidase em meio submerso, nos tratamentos com a vinhaça V1, foi superior ao observado em meio semissólido. A produção das enzimas em fermentação submersa, utilizando a vinhaça V1, apresentou valores de atividade de lacase, no tratamento TL1 e TL2, de 784,9 e 707,5 U.L-1, com atividade específica de 3,04 e 2,86 U.mg-1, respectivamente, e a amostra VL1, contendo apenas vinhaça, de 1,91 U.mg-1, no 12º dia de fermentação. Os valores mais altos de atividade de peroxidase foram obtidos nos tratamentos TL1, TL2, VL1, com 133,1; 131,2 e 126,1 U.L-1, respectivamente, após 12 dias de cultivo. A maior atividade específica obtida foi na VL1 (0,86 U.mg-1) no 7º dia de cultivo. O pré-tratamento físico do bagaço mostrou melhores condições para a produção das enzimas. Para a produção da lacase e da peroxidase é fundamental a composição da vinhaça. / The vinasse and bagasse are the principal by-products derived from the processing of sugarcane in the sugarcane industry, which generated large amounts of them. The basidiomycete fungus Pleurotus ostreatus, has the ability to degrade lignocellulolytic materials and produce lignolíticas enzymes of interest to industry. In order to evaluate the production of laccase and peroxidase enzymes, fungus P. ostreatus was grown in medium containing pre-treated bagasse and vinasse, or in medium containing only vinasse in semi-solid or submerged fermentation system; extracellular enzymes were evaluated after 7, 10 and 12 days of cultivation. The screened bagasse was considered pretreated physically (T1); for the pretreatment T2 moistened residue was subjected to autoclaving (121°C and 1 atm for 15 min). The chemical pretreatments, T3 and T4, the residue was treated with hydrogen peroxide and sodium hydroxide solution in the following concentrations 0,75% H2O2 + 0,75% NaOH (T3) and 0,75% H2O2 + 1% NaOH (T4) 1:10 (w/v) and then underwent autoclaving (121°C and 1 atm for 15 min). Vinasse used was coming from a sugar and alcohol industry (V1) and a distillery (V2); the physico-chemical composition showed that the former had the rates of organic matter and phosphorus higher than in V2 vinasse, whereas the C: N ratio was lower in V1 vinasse. The enzymatic extracts were obtained after filtration medium the submerged; to semisolid medium was necessary the addition of citrate buffer (1:5 w/v) prior to filtration. The activity of peroxidase and lacasse in submerged medium, in the treatments with the V1 vinasse, was higher than observed in semi-solid medium. The production of enzymes by submerged fermentation using the vinasse V1, presented laccase activity values, in the treatment TL1 and TL2, of 784,9 and 707,5 UI.L-1, with specific activity of 3,04 e 2,86 U.mg-1, on the 12th day of fermentation. Higher values peroxidase activity were obtained in the treatments TL1, TL2, VL1, with 133,1; 131,2 and 126,1 UI.L-1, respectively, after 12 days of culture. The highest specific activity was obtained at VL1 (0,86 U.mg-1) on the 7th day of culture. Physical bagasse pretreatment showed better conditions for the production of enzymes. For the production of the laccase and peroxidase is fundamental composition of vinasse.

Neste trabalho descreve-se o estudo química dos extratos de quatro esponjas e dois fungos de origem marinha oriundos da costa do Brasil. Os extratos de três esponjas (Petromica ciocalyptoides, Topsentia ophiraphidites e Callyspongia sp.) apresentaram atividade inibitória à enzima adenosina fosforribosil transferase de Leishmania tarentolae. A partir desses extratos foram isolados 4 compostos. O trissulafato de halistanol, isolado das esponjas P. ciocalyptoides e T. ophiraphidites, e o ilhabelanol, ilhabreno e isoakaterpina, isolados da esponja Callyspongia sp. A partir do extrato bruto da esponja Axinella cf corrugata foram isolados dois derivados cumarínicos, provavelmente artefatos de isolamento do ácido 4-esculetínico, o qual é inédito como produto natural. O extrato bruto da esponja Axinella cf. corrugata apresentou atividade citotóxica, mas os compostos puros não apresentaram esta atividade. Os dois compostos puros foram testados ainda quanto sua atividade contra o vírus da SARS, na qual o éster etílico do ácido 4-esculetínico se apresentou ativo. A partir de dois extratos oriundos do fungo Beauveria felina, isolado da alga marinha Caulerpa sp, foram isoladas 17 frações puras que após diversas análises foram agrupadas em seis compostos conhecidos na literatura: a (Phe3, N-Val5) destruxina B, a cloroidrina da destruxina E, a roseotoxina B, a roseocardina, a isariina e a isariina B. Além disso, foram isolados dois compostos inéditos, a pseudodestruxina C e a cloloidrina Beta-Me-Pro da destruxina E. Os extratos brutos de Beauveria felina apresentaram atividades em bioensaios de atividade antituberculose e de citotoxicidade em linhagem de células de câncer. Os compostos puros avaliados no bioensaio antituberculose não foram ativos. Somente o composto roseotoxina B apresentou atividade citotóxica in vitro para quatro linhagens de células: mama, cólon, sistema nervoso e leucemia. / In this work we report the chemical investigation of bioactive crude extracts obtained from four sponges and two fungal strains of marine origin. The crude extracts of three sponges species (Petromica ciocalyptoides, Topsentia ophiraphidites and Callyspongia sp.) displayed inhibitory activity towards the enzyme adenine fosforribosyl transferase of Leishmania tarentolae (L-APRT). Four compounds have been isolated from these extracts: the known halistanol sulfate was isolated of sponges P. ciocalyptoides and T. ophiraphidites, while the novel ilhabelanol, ilhabrene and isoakaterpin have been isolated from the sponge Callyspongia sp. All compounds exhibited inhibition of L-APRT at micro M concentrations. Two coumarin derivatives have been isolated from the crude extract of the sponge Axinella cf. corrugata, probably as artifacts of isolation: esculetin-4-carboxylic acid methyl ester and esculetin-4-carboxylic acid ethyl ester. While the crude extract of the sponge Axinella cf. corrugata presented cytotoxic activity, the pure compounds were inactive in these assays. The esculetin-4-carboxylic acid ethyl ester was found to be an in vitro inhibitor of SARS virus. The crude extract obtained of a marine-derived Beauveria felina strain, isolated from the alga Caulerpa sp., displayed antituberculosis activity against Mycobacterium tuberculosis H37Rv and cytotoxic activity against MCF-7 (breast), HCT-8 (colon) and B16 (murine melanoma) cancer cell lines. Chemical fractionation of the crude extract led to the isolation of two new cyclodepsipeptides pseudodestruxin C and [Beta-Me-Pro] destruxin E chlorohydrin, and of the known destruxin E chlorohydrin, [Phe3, N-Me-Val5] destruxin B, roseotoxin B, roseocardin, isariin and isariin B. The depsipeptides [Phe3, NMe- Val5] destruxin B and rosetoxin B, have been tested against M. tuberculosis H37 Rv and in cytotoxicity bioassays against SF 295 (human CNS) MDA-MB435 (human breast) HCT8 (colon) and HL60 (leukemia) cancer cell lines. Only roseotoxin B displayed moderate cytotoxicity against the cancer cell lines.

Metarhizium anisopliae é um fungo entomopatogênico usado como agente de controle biológico devido a sua capacidade de infectar mais de 300 espécies de artrópodes. É um organismo muito utilizado como modelo de estudo de interação patógeno-hospedeiro sendo um dos focos de estudo a descrição de genes envolvidos no processo de infecção pela construção de mutantes funcionais. Esse processo pode ser facilitado pelo uso da metodologia do sistema CRISPR/Cas9 para manipulação genômica, que foi derivada do sistema imune adaptativo de procariotos que vem demonstrando potencial tecnológico em edição genética de eucariotos pela incorporação de protoespaçadores (sequencias oriundas de bacteriófagos ou plasmídeos invasores) em seus loci. CRISPR e a proteína associada à CRISPR (Cas) formam uma endonuclease guiada (Cas9) a qual tem como alvo o sítio específico do DNA invasor, provocando a clivagem da dupla fita do DNA alvo em uma sequência específica. Muitos estudos realizados pela edição gênica têm sido desenvolvidos em diferentes organismos por meio da sua adaptação em eucariotos. Com o objetivo de melhorar a eficiência na geração de mutantes em em M. anisopliae, o sistema CRISPR/Cas9 e um sistema de RNAi foram usados a fim de desenvolver novas ferramentas. As metodologias CRISPR/Cas9 e RNAi foram desenvolvidas para ter como alvo o gene reporter gfp da linhagem M. anisopliae E6 GFP+. Para realizar a edição genômica em M. anisopliae, foram gerados, por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, fungos transgênicos estáveis que expressam a endonuclease Cas9 códon-otimizada para fungos filamentosos. Oligonucleotídeos foram projetados para ter como alvo quatro regiões diferentes na sequencia do gene gfp com o auxílio da ferramenta CRISPR RGEN tool com o objetivo de evitar o pareamento aleatório. O vetor binário utilizado foi o plasmídeo pPZP com o promotor U6-1 para a expressão do RNA guia. Para a metodologia de RNA interferente foi reproduzido o knockdown do gene repórter gfp por meio de agrotransformação do vetor pPZP::SUR::DP que contém um sistema de dois promotores em direções opostas (dual promoter Pdgp e Ptrpc) e um cassette de expressão com o gene marcador sur (resistência a sulfoniluréia) para a seleção dos transformantes. Foram clonados 420 pares de bases do gene gfp entre os promotores gerando o plasmídeo pPZP::SUR::DP::GFP. O desenvolvimento dessas duas metodologias se mostra viável para análise funcional de genes de M. anisopliae. / Metarhizium anisopliae is an entomopathogenic fungus used as a biological control agent due to its capacity to infect more than three hundred species of arthropods. It is broadly used as a model to the development of host-pathogen interaction studies, including the study of the description of the involved genes in the infection process by the construction of functional mutants. This process may be facilitated by the use of the CRISPR/Cas9 methodology to genomic manipulation, which was derived from the immune adaptive system in prokaryotes and has demonstrated technological potential in genetic of eukaryotes edition through the activity of incorporation of protospacers (sequences arising from bacteriophages or plasmids invaders) in their loci. CRISPR and CRISPR associated protein (Cas) code a guided nuclease (Cas9) that targets a specific site of the invading DNA leading to breakage of double-stranded target DNA in a specific sequence. Multiple gene editing studies have been developed in different organisms including its adaptation to eukaryotes. In order to improve the efficiency of the generation of mutants in M. anisopliae, CRISPR/Cas9 system and a RNAi system were used in order to develop new tools. Both CRISPR/Cas9 and RNAi methodologies were developed having as a target the gfp gene from M. anisopliae E6 GFP+ strain. To perform genome editing in M. anisopliae, stable transgenic fungi that express fungal codon-optimized Cas9 were generated by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Oligonucleotides were designed to target four different regions along the gfp gene by using the CRISPR RGEN tool in order to avoid off-targets. The binary vector was the pPZP plasmid with the U6-1 to RNAi expression. For RNAi analysis, gene knockdown were developed by agrotransformation with a suitable plasmid (pPZP::SUR::DP) containing dual promoters with opposite directions (Pdgp and Ptrpc) and a cassette for the expression of the selective marker (gene sur, conferring sulfonylurea resistance) for the selection of transformants. The 420 bp gfp sequence was cloned between promoters, obtaining thus the plasmid pPZP::SUR::DP::GFP. The development of these two techniques proves itself viable for functional analysis of M. anisopliae genes.

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-03T12:52:10Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Breseghelo do Nascimento - 2010.pdf: 1202324 bytes, checksum: 56c8aee88b007b5162aa73419f965d0d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-04T11:34:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Breseghelo do Nascimento - 2010.pdf: 1202324 bytes, checksum: 56c8aee88b007b5162aa73419f965d0d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-04T11:34:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Breseghelo do Nascimento - 2010.pdf: 1202324 bytes, checksum: 56c8aee88b007b5162aa73419f965d0d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2010-08-31 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The fungus Sclerotinia sclerotiorum is among the most successful pathogens, omnivores, and without specific hosts, is considered one of the most important fungal pathogens in the world. Is distributed in all producing regions, temperate, subtropical or tropical. The fungus produces resistant structures called sclerotia on the surface and within tissues colonized, they returned to the soil with crop residues and are responsible for the survival of the fungus in the same area for up to eight years. The objectives of this study were to quantify the variability within and between populations of the fungus S. sclerotiorum in bean and soybean crops in different producing places of those varieties. 46 isolates were collected of S. sclerotiorum in six locals of grain production in different regions of Brazil. The sites chosen were Monte Carmelo-MG, Formosa-GO, Lucas do Rio Verde-MT, Montividiu-GO, Londrina, PR and Santo Antonio de Goiás-GO. All areas of the original host of the gathering was the bean with the exception of Londrina-PR in which the host was soybeans. A population study of the fungus through RAPD markers using 13 primers was carried out for the analysis of genetic variability of the fungus. In parallel, tests were also made for the the Mycelial compatibility groups among isolates and test production of hydrolytic enzymes. The statistical analysis was performed using the Arlequin software, which indicated variability among populations of 16.94% and 83.06% within populations. Were found 10 mycelial compatibility groups without specific populations .Enzyme activities performed indicated significant differences within the populations of all enzymes, a comparison between populations also showed significant differences among populations in polygalacturonases, 1,3-β-glucanase and xylanase. The results indicate a high level of variability within populations and low variability among populations. / O fungo Sclerotinia sclerotiorum está entre os fitopatógenos mais bem sucedidos, onívoros e sem hospedeiros definido, é considerado um dos patógenos fúngicos mais importantes no mundo. Está distribuído em todas as regiões produtoras, sejam elas temperadas, subtropicais ou tropicais. O fungo produz estruturas de resistência denominadas escleródios, na superfície e no interior dos tecidos colonizados. Estes retornam ao solo com os resíduos da cultura e são responsáveis pela sobrevivência do fungo na mesma área por até 8 anos. Os objetivos desse trabalho foram quantificar a variabilidade intra e inter populacional do fungo S. sclerotiorum em culturas de feijão e soja de diferentes localidades produtoras dessas espécies. Para isso foram coletados 46 isolados de S. sclerotiorum de seis locais de produção de grãos em diferentes regiões do Brasil. Os locais escolhidos foram Monte Carmelo-MG, Formosa-GO, Lucas do Rio Verde-MT, Montividiu-GO, Londrina-PR e Santo Antonio de Goiás-GO em todas as áreas o hospedeiro de origem da coleta foi o feijoeiro, com exceção de Londrina-PR, na qual o hospedeiro foi soja. Foi feito um estudo populacional do fungo através de marcadores do tipo RAPD com a utilização de 13 primers para a análise da variabilidade genética do fungo. Paralelamente também foram feitos testes para a formação de grupo de compatibilidade micelial entre os isolados e testes de produção de enzimas hidrolíticas. A análise estatística dos dados se deu através do programa Arlequin, o qual indicou variabilidade de 16,94% entre populações e 83,06% dentro de populações. Foram formados 10 grupos de compatibilidade micelial sem especificidade de populações. As atividades enzimáticas realizadas indicaram diferenças significativas dentro de populações de todas as enzimas. A comparação entre populações também indicou diferenças significativas entre populações nas enzimas poligalacturonases, 1,3-β-glucanase e xilanase. Os resultados indicaram baixo nível de variabilidade entre populações e alta variabilidade dentre as populações.

O aumento da área de cultivo da aveia branca no Brasil, principalmente em plantio direto, tem ocasionado o aumento na intensidade da mancha foliar e do grão causada por Pyrenophora avenae. Por ser um patógeno necrotrófico, é extremamente dependente dos restos culturais da aveia para sobreviver entre uma estação de cultivo e outra. Assim, a suscetibilidade do hospedeiro, a presença de inóculo do patógeno e condições ambientais favoráveis tem sido as principais causas da ocorrência freqüente de epidemias no sul do Brasil. O objetivo deste trabalho foi identificar a fase do desenvolvimento das sementes que é mais suscetível para o estabelecimento do fungo e correlacioná-la com a quantidade de inóculo produzida nas folhas basais mortas. Sob condições de campo, panículas de aveia foram expostas ao inóculo por determinados períodos de tempo desde a sua emergência, em diferentes condições de temperatura e precipitação pluviométrica. As sementes em formação, expostas ao inóculo durante o estágio de grão leitoso e massa mole, apresentaram as maiores incidências do patógeno. A temperatura e a quantidade de chuva do período de observação não influenciaram a porcentagem de sementes infectadas pelo patógeno. No entanto, condições ambientais como temperaturas altas, acumulo de chuvas e ocorrência de outras moléstias, anteciparam a senescência das folhas basais das plantas de aveia, favorecendo uma maior produção de conídios pelo patógeno. O uso de cultivares que ofereçam resistência ou escape das sementes à infecção, a rotação de culturas e a aplicação de fungicidas no momento correto, são algumas medidas que podem ser adotadas para minimizar os prejuízos provocados por esse patógeno.

A maioria dos programas de melhoramento da macieira incluem a resistência à sarna, causada pelo fungo Venturia inaequalis (Cke.) Wint.. A resistência codificada pelo gene Vf, presente em cerca de 80% das cultivares lançadas como resistentes à sarna, foi superada com o surgimento das raças 6 e 7, na Europa. No Brasil, não há relatos sobre raças e a maioria das cultivares lançadas como resistentes possui o gene Vf. Na busca por novas fontes de resistência, acessos de macieiras antigas podem ser promissores. Esta pesquisa objetivou comparar a reação de V. inaequalis entre folhas de macieira destacadas ou não; identificar as raças de V. inaequalis existentes em pomares comerciais no Sul do Brasil; e, avaliar a resistência de acessos de macieiras antigas à sarna. Trabalho preliminar mostrou que embora houve produção de conídios de V. inaequalis em folhas destacadas de macieira, esta foi significativamente maior em meio de cultura Batata-Dextrose-Ágar-Extrato de Levedura (40; 5; 17; 3.L-1), após 12 dias de incubação à 16 oC e luz contínua. Não houve diferença nas reações entre folhas destacadas ou não quando inoculadas por aspersão com três isolados de V. inaequalis. A reação de plantas de macieira, diferenciadoras de raças, inoculadas em casa de vegetação, com nove isolados de V. inaequalis, oriundos de pomares comerciais de três municípios do Rio Grande do Sul e três de Santa Catarina, indicou que todos pertencem à raça 1. Em experimento com seis acessos de macieiras antigas, quatro mostraram evidências de maior resistência à raça 1 de V. inaequalis. / The most apple breeding programs includes the resistance of apple scab, caused by fungi Veturia inaequalis (Cke.) Wint.. The resistance codified by the Vf gene, present in around 80% of cultivars released as resistant to the apple scab, was overcame with the appearance of races 6 and 7, in Europe. In Brazil, there aren’t reports about races and most cultivars released carry the Vf gene. Searching for new sources of resistance, old apple trees can be promising. The objective of this research was to compare the reactions of V. inaequalis between apple detached leaves or not; to identify the races of V. inaequalis prevalent in commercials orchards in South of Brazil; and, to evaluate the resistance of old apple trees for the apple scab. Preliminary work showed that although were produced conidial of V. inaequalis in apple detached leaves, this was significantly greater in medium Potato-Dextrose-Agar-Yeast-Extract (40; 5; 17; 3 g.L-1), after 12 days, 16 oC and continuos light. There wasn’t difference in the reactions bewteen detached leaves or not when inoculated for arpersion with three strains of V. inaequalis. The apple trees reaction, differential of races, inoculated in a greenhouse, with nine strains of V. inaequalis, deriving of commercial orchards of three cities of Rio Grande do Sul and three of Santa Catarina, indicated that all pertain to race 1. In experiment with six old apple trees, four had shown evidences of greater resistance to race 1 of apple scab.