O presente trabalho foi delineado considerando-se a importância de fungos filamentosos e leveduras, os quais estão associados a diversas patologias no homem e animais. Deve-se considerar ainda que o leite e seus derivados lácteos contaminados com estes microrganismos podem constituir potenciais vias de transmissão de zoonoses a eles relacionados. Foram analisadas amostras de leite cru dos tipos A, B e C colhidas nas próprias propriedades leiteiras, bem como amostras de leite comercializado diretamente ao consumidor, visando-se a comparação da qualidade destes produtos quanto à presença e quantidade de fungos. Procedeu-se ainda à avaliação da susceptibilidade dos fungos isolados das amostras de leite às relações temperatura/tempo empregados nos processos de pasteurização e avaliação da sensibilidade destes isolados à fervura do leite. Foram analisadas 70 amostras de leite, sendo 50 de tanques de refrigeração de propriedades leiteiras, 10 de latões de propriedades de exploração leiteira e 10 de latões de transportadores e distribuidores que armazenam e comercializam leite clandestino, sendo que não houve diferença estatisticamente significante entre as medianas das quantidades de unidades formadoras de colônias de fungos/mL de Leite das diferentes procedências, indicando que o nível de contaminação por fungos nas amostras destas três origens foi similar. Foram isolados, em diferentes percentagens, fungos filamentosos e leveduras de todas as amostras de leite das diferentes procedências: Candida spp. (C. krusei, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. kefyr, dentre outras), Geotrichum spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp., Aureobasidium sp., Penicillium spp., Acremonium spp., Chrysosporium sp., Mucor spp., Aspergillus spp. Todos os gêneros e espécies isoladas foram submetidos aos testes de pasteurização rápida e lenta, bem como a fervura. O processo de pasteurização rápida foi o procedimento no qual houve maior resistência (72,18%) por parte dos isolados de leveduras e fungos filamentosos submetidos ao teste na metodologia aplicada, seguido pelo processo de fervura (15,89%) e o de pasteurização lenta (0,99%). / The present study was outlined considering the importance of filamentous fungi and yeasts, associated to various pathologies in man and animals. It must be considered that milk and dairy products when contaminated with these microorganisms can represent a potential means of zoonosis transmission related to them. Samples of raw milk types A, B and C, collected in dairy farms, as well as milk sold directly to the consumer, were analysed, aiming the comparison of the quality of these products as to the presence and quantity of fungi. The susceptibility of the isolates to the temperature/time rates employed in pasteurization and boiling was also evaluated. Seventy samples of raw milk were analysed, 50 from bulk tanks, 10 from small tanks of milk from dairy farms, and 10 from transportation tanks and distributors that store and sell clandestine milk. No statistically significant difference was observed between medians of the quantity of colonies forming units of fungi/mL of milk from the different sources, indicating that the level of contamination by fungi was similar when the three sources were compared. Filamentous fungi and yeasts were isolated in different percentages from all the samples from the different sources: Candida spp. (C. krusei, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. kefyr, etc.), Geotrichum spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp., Aureobasidium sp., Penicillium spp., Acremonium spp., Chrysosporium sp., Mucor spp., Aspergillus spp. All isolates were submitted to pasteurization and boiling. Quick pasteurization was the procedure in which the highest resistance (72.18%) of the isolates was verified, followed by boiling (15.89%) and slow pasteurization (0.99%).

A antracnose é uma das doenças mais importantes do pimentão em vários países. Por muitos anos, somente C. gloeosporioides foi relatado como agente causal da antracnose desta cultura no Brasil. Entretanto, recentemente C. acutatum e C. capsici também tem sido associados a esta doença em algumas regiões do país. Neste trabalho, 56 isolados de Colletotrichum obtidos de pimentão e procedentes de diferentes regiões produtoras do país foram caracterizados e identificados por meio de algumas características morfológicas e culturais, e pela análise por PCR utilizando oligonucleotídeos espécie-específicos. Isolados representativos de cada espécie identificada na população amostrada também foram caracterizados quanto à patogenicidade em frutos de pimentão verdes e maduros, feridos e não feridos e quanto a sensibilidade aos fungicidas azoxistrobina, carbendazim, tiabendazol, tebuconazol, captana, clorotalonil e cloreto de benzalcônio. Os resultados demonstram que C. acutatum é a espécie predominante nas principais regiões produtoras de pimentão do país, representando cerca de 72% da população amostrada. C. capsici foi encontrada com freqüência aproximada de 14%, nos estados de São Paulo e Minas Gerais. C. gloeosporioides representou apenas 5% da população amostrada e teve distribuição restrita ao estado de São Paulo e ao Distrito Federal. Um único isolado de C. coccodes foi encontrado no Rio Grande do Sul. Além dessas espécies, isolados identificados como C. boninense foram encontrados em São Paulo e no Rio Grande do Sul, com freqüência de 7% na população amostrada. Este parece ser o primeiro relato de C. boninense infectando pimentão no Brasil e em outras partes do mundo. A caracterização patogênica mostrou que isolados representativos de todas as espécies foram patogênicos aos frutos maduros feridos e não feridos. Nos frutos verdes feridos, apenas os isolados de C. acutatum e de C. capsici promoveram sintomas. Não foram observados sintomas nos frutos verdes sem ferimentos durante o período de avaliação do experimento (12 dias) para nenhum dos isolados. C. acutatum demonstrou ser a espécie mais agressiva, apresentando os menores períodos de latência e a maior esporulação tanto em frutos verdes (feridos) como nos maduros (feridos e não feridos). Os isolados pertencentes a diferentes espécies de Colletotrichum apresentaram sensibilidade diferenciada para todos os fungicidas sistêmicos avaliados. Os isolados de C. acutatum foram mais sensíveis a azoxistrobina, enquanto os isolados de C. gloeosporioides demonstraram a menor sensibilidade para este fungicida. Os isolados de C. gloeosporioides e C. boninense foram os mais sensíveis aos benzimidazóis (carbendazim e tiabendazol), enquanto o isolado de C. coccodes teve a menor sensibilidade para estes fungicidas. O fungicida tebuconazol promoveu o maior controle sobre o crescimento micelial dos isolados. Para este fungicida, C. capsici demonstrou ser a espécie menos sensível. Os resultados deste trabalho demonstram a presença de pelo menos cinco espécies de Colletotrichum responsáveis pela antracnose do pimentão no país e evidenciam a presença de importantes diferenças entre essas, que devem ser consideradas durante o manejo da doença. / In several countries, anthracnose is one of the most serious diseases in pepper. C. gloeosporioides has, for many years, been reported as the causal agent of anthracnose in Brazil. C. acutatum and C. capsici have only recently been reported as agents of anthracnose in some regions of the country. In this study, 56 isolates of Colletotrichum obtained from pepper from different areas of the country were characterized and identified based on the morphological characteristics of the conidia, as well as culture characteristics and PCR analysis with species-specific pairs of primers. Isolates representative of each identified species in the sampled population were also characterized according to their pathogenicity in pepper fruits (unripe, ripe, wounded and nonwounded) and also according to their sensitivity to fungicide (azoxystrobin, carbendazim, thiabendazole, tebuconazole, captan, chlorothalonil and benzalkonium chloride). The results have showed that C. acutatum is the most prevalent species found in the main production areas of pepper, present in about 72% of the sampled population. C. capsici was equivalent to 14% of the sampled population and found in the states of São Paulo and Minas Gerais. C. gloeosporioides was present in only 5% of the samples and it was restricted to the state of São Paulo and Distrito Federal. Only one isolate of C. coccodes was found in Rio Grande do Sul. Besides theses species, isolates of C. boninense were found in São Paulo and Rio Grande do Sul, with an occurrence of 7% in the sampled population. This seems to be the first report of C. boninense infecting pepper in Brazil and other parts of the world. The pathogenic characterization showed that representative isolates of all species were pathogenic in ripe, wounded, or nonwounded fruits. In wounded green fruit, only isolates of C. acutatum and C. capsici caused infection resulting in disease symptoms. No disease symptoms were observed in green nonwounded fruits inoculated with all Colletotrichum isolates, after 12 days of inoculation. C. acutatum was the most aggressive species with the shortest periods of latency and the highest rate of sporulation in either green wounded fruits or ripe fruits (wounded and nonwounded). Isolates of different species of Colletotrichum showed different sensitivity to the systemic fungicides evaluated. The isolates of C. acutatum were more sensitive to azoxystrobin, whereas C. gloeosporioides showed the lowest sensitivity to this fungicide. C. gloeosporioides and C. boninense isolates were the most sensitive to benzimidazoles fungicides (carbendazim and thiabendazole), whereas C. coccodes isolates showed the lowest sensitivity to these fungicides. The tebuconazol fungicide exerted the highest effect on mycelial growth for all Colletotrichum species. C. capsici showed to be less sensitive to this fungicide. The results of this work have shown the presence of at least five species of Colletotrichum responsible for anthracnose in pepper in Brazil and have made evident the importance of the differences between these species, which must be taken into account for the control of the disease.

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.

A mancha preta dos citros (MPC), incitada pelo fungo Guignardia citricarpa, causa lesões em frutos depreciando-os para a comercialização no mercado interno de fruta fresca, restringindo-os para a exportação e pode causar queda prematura. Para auxiliar nos estudos epidemiológicos, foi desenvolvida uma escala diagramática para a severidade da MPC que contempla os dois tipos de sintomas usualmente observados no campo, "mancha dura", cujos valores variam entre 0,5 e 49,0%, e "falsa melanose", cujos valores variam entre 1,1 e 68%. O grau de suscetibilidade das variedades cítricas ‘Hamlin’, ‘Pera’ e ‘Valência’ à MPC foi avaliado em pomar comercial, sob infecção natural. O modelo monomolecular ajustou-se às curvas de progresso da incidência e da severidade da doença para as três variedades. Não houve diferença estatística significativa entre as taxas de progresso da MPC, concluindo-se que as três variedades possuem o mesmo grau de suscetibilidade à doença. O agente causal da MPC em sua fase epidêmica forma ascósporos e conídios. Os ascósporos, formados em folhas em decomposição no solo, são disseminados a curtas e longas distâncias pela ação do vento. Os conídios, formados em ramos e frutos fixados à planta, são disseminados a curtas distâncias pela ação da água. O padrão de distribuição espacial de plantas com MPC foi avaliado pelo índice de dispersão e pela função K de Ripley. As plantas doentes mostraram-se agregadas independentemente da incidência da doença, indicando elevada importância da dispersão do inóculo a curtas distâncias. Avaliou-se, também, o padrão de distribuição de frutos sintomáticos dentro da planta, pelo índice de dispersão e pela forma binária da lei de Taylor. Pelo índice de dispersão 84% das plantas avaliadas mostraram agregação de frutos sintomáticos. Pela lei de Taylor concluiu-se que a agregação de frutos sintomáticos independe da incidência da doença na planta, sugerindo a participação dos conídios no incremento da doença em condições de campo. Estudou-se o efeito da supressão de ascósporos, pela retirada periódica de folhas cítricas em decomposição do campo e o de conídios, pela colheita antecipada de frutos de maturação tardia, na intensidade da MPC, por dois anos, em área com alta pressão de inóculo. Esses tratamentos reduziram a severidade da doença, no segundo ano de avaliação, entretanto não foram suficientes para controlá-la adequadamente. Estas medidas de sanitização são importantes no controle da MPC, devendo ser adotadas em conjunto com o controle químico. Danos causados pela redução na produtividade e perdas medidas pelo retorno financeiro foram avaliados em dois experimentos. Tratamentos cujo incremento na produção por hectare que, em comparação com a isenção de tratamento, excederam 100 caixas de 40,8 kg, foram rentáveis. A amostragem de áreas para diagnosticar a presença da MPC depende da finalidade da produção. Em áreas para exportação e mercado interno de fruta fresca deve-se avaliar todas as plant as do talhão, uma vez que esta doença é quarentenária e causa danos qualitativos. Em áreas para a indústria de suco cítrico concentrado, 285 plantas são suficientes para amostrar incidências superiores a 15% de MPC, em pomares médios de 2200 plantas. / The fungus Guignardia citricarpa is the causal agent of citrus black spot (CBS), which is a disease that become the fruits unsightly and unsuitable for the fresh fruit market. Besides, premature fruit drop may occur, reducing the productivity. A diagrammatic scale for the two symptoms of CBS (hard spot and false melanose) was developed to evaluate the severity and help in epidemiological studies of this disease. The susceptibility level of ‘Hamlin’, ‘Pera’ and ‘Valência’ sweet orange to CBS was evaluated in commercial orchard, under natural infection. The monomolecular model was fitted to the incidence and severity progress curves of the disease for the three sweet oranges. According to the progress curves, there was not significant difference among cultivars, showing that ‘Hamlin’, ‘Pera’ and ‘Valência’ sweet orange have similar susceptibility level to CBS. G. citricarpa in the epidemic phase produce ascospores and conidia. The ascospores, produced in leaves on soil, are disseminated by wind, while conidia, produced in plant twigs and fruits, are disseminated by water. The pattern of spatial distribution of CBS plants was evaluated by dispersion index and Ripley K function. The groups of symptomatic plants were distributed independently of disease incidence, suggesting that short distance dispersion of the inocullum could be the most important factor in distribution of the disease. The binary form of Taylor´s power law and dispersion index were used to evaluate the distribution of symptomatic fruits in the plant. According to dispersion index 84% o f the evaluated plants showed aggregation of symptomatic fruits, while by the Taylor´s power law the symptomatic fruits aggregation occurred independently of the incidence of plant disease, suggesting that the increase of disease in field conditions is related to conidia production. The effect of ascospore suppression on intensity of CBS was evaluated by removing citrus leaves from the orchard soil surface, while the conidia suppression was evaluated by early harvesting of late maturation fruits. These treatments, carried out during two years in a high inocullum incidence area, reduced the disease severity in the second year, but the satisfactory control was not observed. However, these treatments could be important in CBS control whether used in association with chemical control. Damages caused by yield reduction and losses of financial return were evaluated in two experiments. In relation to non-treated orchards, those treated orchards where the production/ha increased more than hundred boxes (40.8 kg each box) were considered profitable. The destination of the orange production (juice of fresh fruit market) are important for determine the size of samples to assess the CBS incidence. Since the G. citricarpa fungus is considered a quarentine organism that causes qualitative losses, in areas used for production of fresh fruit market whole orchard has to be evaluated. However, in areas used for production of fruits to concentrated orange juice, 285 plants sampled are enough to determinate the CBS incidence superior to 15%, in average orchards containing 2200 plants.

A antracnose, doença causada por fungos do gênero Colletotrichum, é uma das doenças mais importantes em muitas plantas cultivadas. Nas cucurbitáceas, como pepino, chuchu, melão e melancia, a antracnose é muito freqüente e causa prejuízos bastante elevados. O agente causal é o Colletotrichum lagenarium, que apresenta como sinonímias C. orbiculare e C. gloeosporioides f. sp. cucurbitae. O presente trabalho visa caracterizar cultural, morfológica e patogenicamente, e identificar molecularmente, os isolados de C. lagenarium, obtidos de plantas da família Cucurbitaceae. Os isolados foram obtidos através de isolamento de tecidos de plantas que apresentavam sintomas de antracnose. A caracterização cultural envolveu a avaliação do crescimento micelial, esporulação, coloração da colônia, topografia da colônia, formação de setores, presença e coloração de massa conidial. A caracterização morfológica compreendeu a avaliação das formas e dimensões dos conídios e apressórios. A caracterização patogênica envolveu a avaliação da virulência de todos os isolados em inoculações cruzadas com pepino, melão, melancia, abóbora e chuchu, além da avaliação do período de incubação, do período latente e do índice de crescimento da lesão. A identificação molecular compreendeu a análise de PCR, utilizando "primer" específico para C. lagenarium, para auxílio na identificação da espécie. Quanto à caracterização cultural, os isolados apresentaram uma variabilidade muito grande quanto à cor e topografia da colônia e formação de setores, contudo, quando analisada a coloração de massa micelial, nos isolados em que esta se fez presente, a coloração não apresentou grandes variações. Apesar da grande variação encontrada nos índices de crescimento micelial diário entre os isolados, não existiu grande variação para cada isolado quando se alterou o meio de cultivo. A esporulação não apresentou correlação com o crescimento micelial, e não constituiu um bom parâmetro para caracterização, devido à variação que apresentou tanto entre os isolados, quanto entre os meios de cultivo. Os conídios apresentaram formatos cilíndrico, clavado e levemente curvo, com dimensões variando de 2,25 a 6,38µm de largura e 5,34 a 15,73µm de comprimento. Os apressórios apresentaram os formatos globoso, clavado e lobado, com dimensões variando de 5,54 a 8,68µm de largura e 6,71 a 10,75µm de comprimento. Dos 25 isolados testados nas inoculações cruzadas, apenas 14 se apresentaram virulentos aos hospedeiros testados. Não foi encontrada correspondência entre a virulência do isolado e o hospedeiro, o local de coleta, suas características culturais ou morfológicas. Cada isolado apresentou um comportamento diferente perante os demais, quando se considerou a gama de hospedeiros a ele suscetíveis, e ao seu comportamento quanto aos períodos latente e de incubação, e ao índice de crescimento de lesão. O período de incubação variou de dois a sete dias, e período latente variou de três a nove dias. O índice de crescimento de lesão variou de 0,5 a 4,9mm/dia. Não foi observada correlação entre o período latente, o período de incubação e o índice de crescimento de lesão. Através da identificação molecular, cinco isolados puderam ser identificados pelo "primer" específico utilizado, contudo não foi encontrada correspondência entre a identificação molecular e as caracterizações cultural, morfológica e patogênica. / Anthracnose is one of the most important diseases of cucurbitaceous plants, causing severe damages to cucumber, chayote, melon, watermelon and pumpkin. The causal agent is Colletotrichum lagenarium (syn. C. orbiculare, C. gloeosporioides f. sp. cucurbitae). The objective of this work was to determine cultural, morphological and pathogenic characterization, and molecular identification of C. lagenarium, isolated from plants of the Cucurbitaceae family. The isolates used in this study were obtained through isolation from plants presenting symptoms of Anthracnose. The cultural characterization involved the evaluation of mycelial growth, sporulation, colony colour, colony topography, sectors formation, presence and colour of conidial mass. The shape and size of the conidia and apressoria were assessed to the morphological characterization. The pathogenic characterization involved the evaluation of the virulence of all isolates on cross inoculations with cucumber, melon, watermelon, pumpkin and chayote, evaluation of the incubation period, the latent period and the lesion growth. For the molecular identification PCR analysis was used, with specific "primer" for C. lagenarium, to assist the identification of the species. Colonies of all isolates presented great variability in color, topography, and sectors formation; however the color of the mycelial mass did not present great variations. Despite the great variation found in the daily micelial growth indices among the isolates, great variation for each one did not exist when the culture medium was changed. The sporulation did not present correlation with the micelial growth, showing a high variation among the isolates and the culture media. This later parameter was not useful for characterization. The conidia of the isolates were classified in the shapes cylindrical, clavate and slightly curved, with average dimensions varying from 2.25 to 6.38µm in width, and from 5.34 to 15.73µm in length. The apressoria had the shapes globose, clavate and lobed, with average dimensions varying from 5.54 to 8.68µm in width, and 6.71 to 10,75µm in length. From the 25 isolates tested in the cross inoculations, only 14 were virulent to the tested host plants. Correspondence was not found between the virulence of the isolates and de host plants origin, the local origin, and the cultural and morphological characteristics. Analyzing the variability of susceptible host plants, the inoculation and latent periods, and the lesion growth, each isolate showed a different behavior compared to the others. The incubation period varied from two to seven days, and the latent period varied from three to nine days. The lesion growth varied from 0,5 to 4,9mm/day. It was not observed correlation between the latent and incubation periods, as well as in lesion growth. Five isolates were identified to the pair of primers used, although correspondence was not found among the molecular identification and the cultural, morphological and pathogenic characterization.

O Brasil apresenta cerca de 10 a 17,6% da biodiversidade mundial e apenas uma fração dela é conhecida. Os fungos filamentosos são bons produtores de enzimas e despertam um grande interesse biotecnológico. O amido é o principal carboidrato de reserva das plantas. Dentre as enzimas amilolíticas estão as glucoamilases, que catalisam a hidrólise das ligações -1,4 e -1,6 das extremidades da cadeia do amido liberando glucose. Neste trabalho foram isolados 25 fungos filamentosos de amostras de materiais em decomposição da Mata Atlântica. Dos micro-organismos com alta atividade amilolítica foram selecionados e identificados Aspergillus brasiliensis e Rhizopus oryzae. Foi realizada a otimização do cultivo e caracterização das amilases do extrato bruto de ambos os fungos. Após a obtenção destes dados foi selecionado A. brasiliensis, pois, sua amilase é mais termoestável e ainda não reportada na literatura. Após purificação a enzima foi identificada como glucoamilase, a qual é monomérica com 69 kDa e contém aproximadamente 21% de carboidratos. Apresenta um domínio de ligação ao amido na porção terminal e estrutura secundária rica em -hélice. Sua atividade ótima ocorre em pH 4,5 a 60°C, seu pI é de 3,21, pode ser ativada com a adição de Mn2+, e é inibida por glucose em concentrações maiores que 0,1 M. A glucoamilase apresenta excelente estabilidade ao pH e boa estabilidade a temperatura (a 50°C mantém 67% de atividade após 7 horas; a 55°C a meia vida é de 147 minutos). Com amido de batata a enzima apresentou as seguintes constantes cinéticas (km 2,21 mg/mL; Vmáx 155 U/mg; kcat 179 s-1; kcat/km 81,06). A glucoamilase foi imobilizada em DEAE-PEG com ativação de 12 vezes e possibilidade de reuso de 10 vezes com perda de apenas 31% de atividade. O derivado demostrou maior facilidade para hidrolisar a amilopectina do que à amilose. Também foi realizada uma análise de neighbor joining, que agrupou a glucoamilase de A. brasiliensis próxima às glucoamilases de espécies de Aspergillus, que são consideradas as mais derivadas. / Brazil holds about 10-17.6% of the world\'s biodiversity and just a percentage of it is known. Filamentous fungi are enzyme producers that have great biotechnological application. Starch is the main reserve carbohydrate in plants. Among the amylolytic enzymes there are the glucoamylases, that catalyze the hydrolysis of -1,4 and -1,6 linkages of the end of starch chains, and releases glucose. In this research 25 filamentous fungi from Atlantic forest decaying material samples were isolated. Among microorganisms with high amylolytic activity Aspergillus brasiliensis and Rhizoupus oryzae were selected and identified. The cultivation parameters were optimized and the enzymes of crude extract were characterized. Considering the previous data Aspergillus brasiliensis was selected because its amylases are more thermostable and it has not been described in the literature yet. After purification the enzyme was identified as a glucoamylase, which is monomeric with 69 kDa and about 21% of carbohydrates in its composition. The enzyme has a starch binding domain in the terminal position and its secondary structure is rich in -helix. The optimum pH for glucoamylase activity is 4.5, the temperature is 60ºC and its pI is 3.21. The enzyme can be activated by the addition of Mn+2, and inhibited in concentrations above 0,1M glucose. The glucoamylase has an excellent pH stability and a good temperature stability (at 50ºC 67% of the activity was retained after 7 hours; at 55°C its half-life was 147 minutes). The best kinetic values were obtained with potato starch (km 2.21 mg/mL; Vmax 155 U/mg; kcat 179 s-1; kcat/km 81,06). The glucoamylase was immobilized on DEAE-PEG, with an activation of 12 times and enzyme reuse 10 times with just 31% loss of its activity. The immobilized enzyme has a greater activity on amylopectin than amylose. A neighbor joining analysis with glucoamylases from filamentous fungi species was made and Aspergillus brasiliensis glucoamylase was grouped close to the glucoamylases of Aspergillus species, which are considered the most derivative.

A região espaçadora ITS rDNA tem sido utilizada como uma importante ferramenta molecular para a identificação de fungos. Neste estudo a região ITS1 - 5.8S - ITS2 foi analisada em diferentes espécies do fungo entomopatogênico Metarhizium incluindo M. anisopliae, M. album e M. flavoviride com o objetivo de se construir primers específicos para a detecção e identificação do fungo no interior de larvas infectadas de Diatraea saccharalis. A amplificação desta região produziu um fragmento único de aproximadamente 540 pb para as linhagens E9, B/Vi e C, e de 600 pb para a linhagem 14 de M. anisopliae var. anisopliae; de 650 bp para M. album e 600 pb para M. flavoviride. Os produtos de PCR obtidos foram digeridos com diferentes enzimas de restrição Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II e Sau 3A I; e os perfis de PCR-RFLP mostraram nítidas diferenças entre as espécies analisadas. O sequenciamento da região ITS1 - 5.8S - ITS2 permitiu o desenho de primers específicos para as linhagens de M.a. var. anisopliae do Brasil e da Austrália. A amplificação não ocorreu em linhagens de M. álbum, M. flavoviride e Beauveria bassiana. Os DNAs extraídos de larvas infectadas pelas linhagens E9, B/Vi e C do Brasil e linhagem 14, da Austrália, foram testados utilizando-se os primers desenvolvidos. Em todos os experimentos o fungo M.a. var. anisopliae foi detectado 48 horas após a inoculação. A técnica molecular empregada neste estudo permite a rápida e segura detecção e identificação de M.a. var. anisopliae em bioensaios de laboratório e de campo, programas de manejo de pragas e estudos de epizootiologia. / The ITS rDNA have been used as an important molecular tool for fungi identification. In this study the ITS1 - 5.8S - ITS2 rDNA regions were analyzed in different species of the entomopathogenic fungus Metarhizium including M. anisopliae, M. album and M. flavoviride, in order to construct specific primers for their detection and identification within infected Diatraea saccharalis larvae. The amplification of this region yielded a unique fragment of approximately 540 bp for E9, B/Vi and C, and 600 bp for strain 14 of M. anisopliae var. anisopliae; of 650 bp for M. album and 600 bp for M. flavoviride. The PCR products were digested with the different restriction endonucleases Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II and Sau 3A I; and the PCR-RFLP profiles showed clear differences amongst the species. The sequencing of the ITS-5.8S rDNA regions allowed for the design of specific primers for M. anisopliae var. anisopliae. The amplification was not observed with M. album, M flavoviride and Beauveria bassiana strains. DNAs extracted from infected larvae by E9 and C strains from Brazil and the strain 14 from Australia in individual bioassays were tested using previously designed specific primers. In all experiments, the fungus was detected after 48 hours of post-inoculation. This molecular technique allows a fast and secure detection and identification of the entomopathogen in bioassays, in pest management programs and epizootiology.

O meloeiro (Cucumis melo L.) é uma frutífera largamente cultivada no Brasil, principalmente no nordeste brasileiro, onde vem alcançando grande importância econômica, visto que grande parte da produção é voltada para a exportação. Plantas da família do meloeiro, como pepino e abóbora, são afetadas pelo oídio (Podosphaera xanthii) que causa uma das doenças foliares mais destrutivas destas espécies. Este fungo apresenta diversas raças fisiológicas e a correta identificação destas é de elevada importância para o manejo da doença, pois o melhoramento de meloeiro com o emprego de genes de resistência é o método mais eficiente para o seu controle. A identificação destas raças por meio da prática tradicional de inoculações em uma série diferenciadora de variedades de meloeiro é um método laborioso e passível de erros. Devido a isso, uma alternativa seria o uso de métodos moleculares para determinar a identidade da raça de forma rápida e econômica. O presente trabalho objetivou verificar a variabilidade de isolados de P. xanthii através da técnica de AFLP e de seqüenciamento da região ITS 5.8S do rDNA. A partir de AFLP obteve-se um dendrograma no qual não houve separação de raças, origem geográfica e nem hospedeiro. Com esta técnica verificou-se alta variabilidade entre isolados, com similaridade genética máxima de 69% e similaridade mínima de 23%. Ao contrário, os mesmos isolados apresentaram seqüências idênticas através do seqüenciamento da região ITS 5.8S do rDNA. As duas técnicas são distintas e o AFLP proporciona a obtenção de maior quantidade de fragmentos e com isso mais chances de polimorfismos. O AFLP indica que os isolados testados têm composição genética heterogênea embora isto não tenha sido evidenciado com o seqüenciamento da região ITS. / Melon (Cucumis melo L.) is a largely cultivated fruit in Brazil, especially in the northeastern region where it is achieving great economic importance since a great part of its production is destined to exportation. Plants of the melon crop family, such as cucumbers and pumpkins, are affected by powdery mildew (Podosphaera xanthii) that causes one of the most destructive foliar diseases of this species. This fungus presents various physiological races and their correct identification is of great importance to determine the control of the disease since breeding with the use of resistant genes is the most effective method for its control. Identification of these races by traditional practice of inoculation in a differential series of melon varieties is a laborious method and misleading. Due to this, an alternative would be the use of molecular methods to quickly and economically determine the race identity. The present research has the objective of verifying the variability of isolated P. xanthii through the AFLP technique and sequencing of the rDNA\'s ITS 5.8S region. From the AFLP a dendrogram was obtained where there was no separation of race, geographic region or host. With this technique, a high variability among isolated samples was verified, with 69% maximum genetic similarity and 23% minimum similarity. On the other hand, the same isolated samples presented identical sequence through the sequencing of the rDNA\'s ITS 5.8S region. The two techniques are distinct and the AFLP helps get highest amount of fragments and with this more incidence of polymorphisms. AFLP indicates that the tested isolated samples have an heterogeneous genetic composition although this was not evidenced with the sequencing of the ITS region.

A região espaçadora ITS rDNA tem sido utilizada como uma importante ferramenta molecular para a identificação de fungos. Neste estudo a região ITS1 - 5.8S - ITS2 foi analisada em diferentes espécies do fungo entomopatogênico Metarhizium incluindo M. anisopliae, M. album e M. flavoviride com o objetivo de se construir primers específicos para a detecção e identificação do fungo no interior de larvas infectadas de Diatraea saccharalis. A amplificação desta região produziu um fragmento único de aproximadamente 540 pb para as linhagens E9, B/Vi e C, e de 600 pb para a linhagem 14 de M. anisopliae var. anisopliae; de 650 bp para M. album e 600 pb para M. flavoviride. Os produtos de PCR obtidos foram digeridos com diferentes enzimas de restrição Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II e Sau 3A I; e os perfis de PCR-RFLP mostraram nítidas diferenças entre as espécies analisadas. O sequenciamento da região ITS1 – 5.8S – ITS2 permitiu o desenho de primers específicos para as linhagens de M.a. var. anisopliae do Brasil e da Austrália. A amplificação não ocorreu em linhagens de M. álbum, M. flavoviride e Beauveria bassiana. Os DNAs extraídos de larvas infectadas pelas linhagens E9, B/Vi e C do Brasil e linhagem 14, da Austrália, foram testados utilizando-se os primers desenvolvidos. Em todos os experimentos o fungo M.a. var. anisopliae foi detectado 48 horas após a inoculação. A técnica molecular empregada neste estudo permite a rápida e segura detecção e identificação de M.a. var. anisopliae em bioensaios de laboratório e de campo, programas de manejo de pragas e estudos de epizootiologia. / The ITS rDNA have been used as an important molecular tool for fungi identification. In this study the ITS1 - 5.8S – ITS2 rDNA regions were analyzed in different species of the entomopathogenic fungus Metarhizium including M. anisopliae, M. album and M. flavoviride, in order to construct specific primers for their detection and identification within infected Diatraea saccharalis larvae. The amplification of this region yielded a unique fragment of approximately 540 bp for E9, B/Vi and C, and 600 bp for strain 14 of M. anisopliae var. anisopliae; of 650 bp for M. album and 600 bp for M. flavoviride. The PCR products were digested with the different restriction endonucleases Afa I, Alu I, Dde I, Hae III, Hpa II and Sau 3A I; and the PCR-RFLP profiles showed clear differences amongst the species. The sequencing of the ITS-5.8S rDNA regions allowed for the design of specific primers for M. anisopliae var. anisopliae. The amplification was not observed with M. album, M flavoviride and Beauveria bassiana strains. DNAs extracted from infected larvae by E9 and C strains from Brazil and the strain 14 from Australia in individual bioassays were tested using previously designed specific primers. In all experiments, the fungus was detected after 48 hours of post-inoculation. This molecular technique allows a fast and secure detection and identification of the entomopathogen in bioassays, in pest management programs and epizootiology.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:44:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PATRICIA RABELO DE FREITAS.pdf: 2747031 bytes, checksum: 9bc40ace4655abf6757b02c63ae2a6e0 (MD5) Previous issue date: 2012-05-15 / Avaliou-se o efeito de uma solução de amilase produzida por Aspergillus awamori sobre a digestibilidade in vitro da matéria seca (DIVMS) de milho. Foram realizados dois experimentos, onde o primeiro a solução de enzima amilase foi aplicada por pulverização em 24g de milho moído (2 mm) e o segundo a solução de enzima amilase foi aplicado no fluido ruminal. Os tratamentos foram: controle (0 enzima), T1 (5Ml de enzima) e T2 (10Ml de enzima) para cada experimento. O ensaio da DIVMS foi obtido usando a técnica de rúmens artificiais adapatada durante os períodos de 15 ; 1,30 , 3, 6, 12 e 24 horas. Para a coleta de líquido ruminal foi utilizado um bovino de peso aproximado de 380 kg. O animal foi mantido em baia e adaptado a dieta durante um período de 10 dias antes do recolhimento do líquido ruminal com acesso livre à água e sal mineral. Para os dois experimentos foi adotado o delineamento inteiramente casualizado, em esquema de parcelas subdivididas 3 x 6, com quatro repetições (jarros). As parcelas foram constituídas por milho tratado com três diferentes níveis de enzima e as subparcelas por seis momentos de digestão. Para enzima amilase aplicada no líquido ruminal o resultado de DIVMS para os três tratamentos nos períodos de 3, 6 e 12 horas não diferiram estatisticamente entre si. Entre o tratamento controle e T1 houve diferença significativa nos tempos 15 e 1,30 horas. Foi observado maior DIVMS para o tratamento controle, em relação ao T1, com valores de 54,54% e 49,05 , e não houve diferença nos tempos 3, 6, 12 e 24 horas. Entre o tratamento controle e T2 não houve diferença no tempo 15 e 24 horas. O controle foi superior a T2 28,74% e 10,53%, respectivamente. A DIVMS foi superior para o tratamento controle, indicando que os níveis de 5 e 10 ml de enzimas injectados no fluido ruminal não aumentaram a DIVMS. Para amilase aplicada por pulverização em 24g de milho moído, no tempo de 15 , observou-se que o tratamento controle e T1 não diferiram. No entanto, o T2 melhorou a DIVMS em 55,54%, comparado ao grupo controle. O tratamento T1 aumentou a DIVMS apenas em tempos de 3 e 24 horas de incubação, em relação ao controle. Com a aplicação de 10 ml de enzima, a DIVMS aumentou em todos os tempos de incubação, em comparação com o controle.