Neste trabalho descreve-se o estudo química dos extratos de quatro esponjas e dois fungos de origem marinha oriundos da costa do Brasil. Os extratos de três esponjas (Petromica ciocalyptoides, Topsentia ophiraphidites e Callyspongia sp.) apresentaram atividade inibitória à enzima adenosina fosforribosil transferase de Leishmania tarentolae. A partir desses extratos foram isolados 4 compostos. O trissulafato de halistanol, isolado das esponjas P. ciocalyptoides e T. ophiraphidites, e o ilhabelanol, ilhabreno e isoakaterpina, isolados da esponja Callyspongia sp. A partir do extrato bruto da esponja Axinella cf corrugata foram isolados dois derivados cumarínicos, provavelmente artefatos de isolamento do ácido 4-esculetínico, o qual é inédito como produto natural. O extrato bruto da esponja Axinella cf. corrugata apresentou atividade citotóxica, mas os compostos puros não apresentaram esta atividade. Os dois compostos puros foram testados ainda quanto sua atividade contra o vírus da SARS, na qual o éster etílico do ácido 4-esculetínico se apresentou ativo. A partir de dois extratos oriundos do fungo Beauveria felina, isolado da alga marinha Caulerpa sp, foram isoladas 17 frações puras que após diversas análises foram agrupadas em seis compostos conhecidos na literatura: a (Phe3, N-Val5) destruxina B, a cloroidrina da destruxina E, a roseotoxina B, a roseocardina, a isariina e a isariina B. Além disso, foram isolados dois compostos inéditos, a pseudodestruxina C e a cloloidrina Beta-Me-Pro da destruxina E. Os extratos brutos de Beauveria felina apresentaram atividades em bioensaios de atividade antituberculose e de citotoxicidade em linhagem de células de câncer. Os compostos puros avaliados no bioensaio antituberculose não foram ativos. Somente o composto roseotoxina B apresentou atividade citotóxica in vitro para quatro linhagens de células: mama, cólon, sistema nervoso e leucemia. / In this work we report the chemical investigation of bioactive crude extracts obtained from four sponges and two fungal strains of marine origin. The crude extracts of three sponges species (Petromica ciocalyptoides, Topsentia ophiraphidites and Callyspongia sp.) displayed inhibitory activity towards the enzyme adenine fosforribosyl transferase of Leishmania tarentolae (L-APRT). Four compounds have been isolated from these extracts: the known halistanol sulfate was isolated of sponges P. ciocalyptoides and T. ophiraphidites, while the novel ilhabelanol, ilhabrene and isoakaterpin have been isolated from the sponge Callyspongia sp. All compounds exhibited inhibition of L-APRT at micro M concentrations. Two coumarin derivatives have been isolated from the crude extract of the sponge Axinella cf. corrugata, probably as artifacts of isolation: esculetin-4-carboxylic acid methyl ester and esculetin-4-carboxylic acid ethyl ester. While the crude extract of the sponge Axinella cf. corrugata presented cytotoxic activity, the pure compounds were inactive in these assays. The esculetin-4-carboxylic acid ethyl ester was found to be an in vitro inhibitor of SARS virus. The crude extract obtained of a marine-derived Beauveria felina strain, isolated from the alga Caulerpa sp., displayed antituberculosis activity against Mycobacterium tuberculosis H37Rv and cytotoxic activity against MCF-7 (breast), HCT-8 (colon) and B16 (murine melanoma) cancer cell lines. Chemical fractionation of the crude extract led to the isolation of two new cyclodepsipeptides pseudodestruxin C and [Beta-Me-Pro] destruxin E chlorohydrin, and of the known destruxin E chlorohydrin, [Phe3, N-Me-Val5] destruxin B, roseotoxin B, roseocardin, isariin and isariin B. The depsipeptides [Phe3, NMe- Val5] destruxin B and rosetoxin B, have been tested against M. tuberculosis H37 Rv and in cytotoxicity bioassays against SF 295 (human CNS) MDA-MB435 (human breast) HCT8 (colon) and HL60 (leukemia) cancer cell lines. Only roseotoxin B displayed moderate cytotoxicity against the cancer cell lines.

Desde a revolução verde, na década de 1950, o processo tradicional de produção agrícola passou por mudanças com a inserção do uso intensivo de agrotóxicos como os piretróides, que são a terceira classe química de pesticidas mais comercializada no mundo. Estes compostos geralmente são ésteres que contêm um anel dimetilciclopropano com grupamentos variáveis e a presença de anéis aromáticos. Cada vez mais os cientistas vêm explorando a diversidade microbiana na biodegradação de pesticidas e neste contexto, o emprego de fungos de ambiente marinho possui grande potencialidade devido ao seu sistema enzimático único com a presença de compostos altamente oxigenados e halogenados, assim como o esfenvalerato empregado neste trabalho. Entretanto, estes micro-organismos não têm sido explorados na biotransformação de pesticidas piretróides. Neste estudo foi avaliada a eficiência de fungos de ambiente marinho [Penicillium raistrickii CBMAI 931, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Cladosporium sp. CBMAI 1237, Microsphaeropsis sp. Dr(A)6, Acremonium sp. Dr(F)1, Westerdykella sp. Dr(M2)4 e Cladosporium sp. Dr(M2)2] na degradação do pesticida piretróide esfenvarelato. Observou-se que o esfenvalerato e seus principais metabólitos de degradação causam efeitos inibitórios significativos no crescimento dos fungos, mas não o suficiente para inviabilizar o estudo da biodegradação por meio destes micro-organismos. Os resultados obtidos sugerem que diversas espécies fúngicas contribuem para a biodegradação do pesticida esfenvalerato, entretanto a eficiência da degradação deste composto varia muito entre linhagens. Observou-se a degradação de 3 a 35% de 100 mg.L-1 de esfenvalerato presente na formulação comercial (SUMIDAN 150SC®) em 14 dias para diferentes fungos. Os metabólitos identificados [3-fenoxibenzaldeído, ácido 3-fenoxibenzoico, álcool 3-fenoxibenzílico e ácido 3-(hidroxifenoxi)benzoico] tornaram possível uma proposta de rota biodegradativa, onde se observou metabólitos cada vez mais polares, aumentando a possibilidade de carreamento para o meio aquoso. Constatou-se que em geral ocorre a formação de grandes quantidade do ácido 3-fenoxibenzoico e do ácido 2-(4-clorofenil)-3-metilbutanoico, compostos considerados tóxicos e que podem causar efeitos nocivos à saúde humana e ao meio ambiente. Para a linhagen Acremonium sp. Dr(F)1 que apresentou os melhores resultados de biodegradação, após 28 dias de cultivo com 100 mg.L-1 de esfenvalerato observou-se 20 mg.L-1 de acido 3-fenoxibenzoico, que posteriormente foi convertido ao ácido 3-(hidroxifenoxi)benzoico. Observou-se também uma biodegradação mais eficiente do princípio ativo esfenvalerato puro do que na formulação comercial, que pode ser causada por diversos fatores, como a toxicidade do xileno presente na formulação comercial ou a adsorção do esfenvarelato aos componentes da formulação emulsionável dificultando a ação enzimática. A partir destes resultados toma-se interessante o emprego destes micro-organismos visando a biorremediação deste pesticida. / Since the green revolution in the 1950s, the traditional agricultural production has undergone changes such as the intensive use of pesticides, including pyrethroids, which is the third most sold chemical class of pesticide. These compounds are generally esters containing a dimethylcyclopropane ring with different groups and aromatic rings. Scientists are exploring the microbial diversity for the biodegradation of pesticides. The use of marine fungi may show great potential to an efficient biodegradation, because of its unique enzymatic system and the presence of halogenated and oxygenated compounds, such as the pesticide esfenvalerate used in this work. However, these microorganisms have not been explored in the biotransformation of pyrethroid pesticides. In this study, marine-derived fungi [Penicillium raistrickii CBMAI 931, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Cladosporium sp. CBMAI 1237, Microsphaeropsis sp. Dr(A)6, Acremonium sp. Dr(F)1, Westerdykella sp. Dr(M2)4 and Cladosporium sp. Dr(M2)2] were applied in the biodegradation of the esfenvalerate. It was observed that the esfenvalerate and its degradation metabolites cause an inhibitory effect on the fungi growth, however not enough to make unfeasible the study of the biodegradation by these microorganisms. The results suggest that different fungal species contribute to the degradation of esfenvalerate, although the efficiency of degradation varies widely between strains. It was observed 3-35% of degradation at a concentration of 100 mg.l-1 of esfenvalerate present in the commercial formulation (SUMIDAN 15OSC®) in 14 days. The identified metabolites [3-phenoxybenzaldehyde, 3-phenoxybenzoic acid, 3- phenoxybenzyl alcohol and 3-(hydroxyphenoxy)benzoic acid ) enabled the proposal of a biodegradative pathway, in which was noted the increasingly polar character of metabolites, raising the possibility of entrainment for aqueous medium . It was observed, in general, the large formation of 3- phenoxybenzoic and 2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutanoic acid, compounds that are considered toxic and may cause harmful effects to human health and the environment. For the strain Acremonium sp. Dr (F)1, which showed the best results of 100 mg.l-1 esfenvalerate biodegradation after 28 days, it was observed 20 mg.l-1 of 3-phenoxybenzoic acid, which was later converted to 3- (hydroxyphenoxy)benzoic acid. It was also observed a more efficient biodegradation of the pure active ingredient than the commercial formulation, what can be caused by various reasons, such as the toxicity of the xylene present in the commercial formulation or the esfenvarelate adsorption in the components of the emulsifiable formulation, difficulting the enzymatic activity. These results shows the potential use of these microorganisms in the bioremediation of esfenvalerate.

A vinhaça e o bagaço de cana são os principais subprodutos oriundos do processamento da cana-de-açúcar nas indústrias sucroalcooleiras, sendo geradas grandes quantidades dos mesmos. O fungo basidiomiceto Pleurotus ostreatus tem a capacidade de degradar materiais lignocelulolíticos e produzir enzimas lignolíticas de interesse para as indústrias. Com o objetivo de avaliar a produção das enzimas lacases e peroxidase, o fungo Pleurotus ostreatus, foi cultivado em meio contendo bagaço pré-tratado e vinhaça, ou em meio contendo apenas vinhaça, em sistema de fermentação semissólido ou submerso; as enzimas extracelulares foram avaliadas após 7, 10 e 12 dias de cultivo. O bagaço peneirado foi considerado pré-tratado fisicamente (T1); para o pré-tratamento T2 o bagaço umedecido foi submetido a autoclave (121°C e 1 atm por 15 min); nos pré-tratamentos químicos, T3 e T4, o bagaço foi tratado com peróxido de hidrogênio e hidróxido de sódio nas seguintes concentrações: 0,75% H2O2 + 0,75% NaOH (T3) e 0,75% H2O2 + 1% NaOH (T4) na proporção 1:10 (p/v) e, em seguida foram submetidos à autoclave (121°C e 1 atm por 15min). A vinhaça utilizada foi proveniente de uma indústria sucroalcooleira (V1) e outra de destilaria (V2); a composição físico-química mostrou que a primeira possuía os índices de matéria orgânica e fósforo mais elevados que na vinhaça V2, enquanto que a relação C:N foi menor na vinhaça V1. Os extratos enzimáticos foram obtidos após filtração do meio submerso; para o meio semissólido foi necessário a adição de tampão citrato (1:5 p/v) antes da filtração. A atividade de lacasse e peroxidase em meio submerso, nos tratamentos com a vinhaça V1, foi superior ao observado em meio semissólido. A produção das enzimas em fermentação submersa, utilizando a vinhaça V1, apresentou valores de atividade de lacase, no tratamento TL1 e TL2, de 784,9 e 707,5 U.L-1, com atividade específica de 3,04 e 2,86 U.mg-1, respectivamente, e a amostra VL1, contendo apenas vinhaça, de 1,91 U.mg-1, no 12º dia de fermentação. Os valores mais altos de atividade de peroxidase foram obtidos nos tratamentos TL1, TL2, VL1, com 133,1; 131,2 e 126,1 U.L-1, respectivamente, após 12 dias de cultivo. A maior atividade específica obtida foi na VL1 (0,86 U.mg-1) no 7º dia de cultivo. O pré-tratamento físico do bagaço mostrou melhores condições para a produção das enzimas. Para a produção da lacase e da peroxidase é fundamental a composição da vinhaça. / The vinasse and bagasse are the principal by-products derived from the processing of sugarcane in the sugarcane industry, which generated large amounts of them. The basidiomycete fungus Pleurotus ostreatus, has the ability to degrade lignocellulolytic materials and produce lignolíticas enzymes of interest to industry. In order to evaluate the production of laccase and peroxidase enzymes, fungus P. ostreatus was grown in medium containing pre-treated bagasse and vinasse, or in medium containing only vinasse in semi-solid or submerged fermentation system; extracellular enzymes were evaluated after 7, 10 and 12 days of cultivation. The screened bagasse was considered pretreated physically (T1); for the pretreatment T2 moistened residue was subjected to autoclaving (121°C and 1 atm for 15 min). The chemical pretreatments, T3 and T4, the residue was treated with hydrogen peroxide and sodium hydroxide solution in the following concentrations 0,75% H2O2 + 0,75% NaOH (T3) and 0,75% H2O2 + 1% NaOH (T4) 1:10 (w/v) and then underwent autoclaving (121°C and 1 atm for 15 min). Vinasse used was coming from a sugar and alcohol industry (V1) and a distillery (V2); the physico-chemical composition showed that the former had the rates of organic matter and phosphorus higher than in V2 vinasse, whereas the C: N ratio was lower in V1 vinasse. The enzymatic extracts were obtained after filtration medium the submerged; to semisolid medium was necessary the addition of citrate buffer (1:5 w/v) prior to filtration. The activity of peroxidase and lacasse in submerged medium, in the treatments with the V1 vinasse, was higher than observed in semi-solid medium. The production of enzymes by submerged fermentation using the vinasse V1, presented laccase activity values, in the treatment TL1 and TL2, of 784,9 and 707,5 UI.L-1, with specific activity of 3,04 e 2,86 U.mg-1, on the 12th day of fermentation. Higher values peroxidase activity were obtained in the treatments TL1, TL2, VL1, with 133,1; 131,2 and 126,1 UI.L-1, respectively, after 12 days of culture. The highest specific activity was obtained at VL1 (0,86 U.mg-1) on the 7th day of culture. Physical bagasse pretreatment showed better conditions for the production of enzymes. For the production of the laccase and peroxidase is fundamental composition of vinasse.

Endófitos são todos os microrganismos, cultiváveis ou não, que habitam o interior dos tecidos vegetais, não causando danos ao hospedeiro e nem o desenvolvimento de estruturas externas, excluindo, dessa forma, bactérias noduladoras e micorrizas. Theobroma cacao L. é importante para as indústrias alimentícia e cosmética, por constituir a matéria prima para a produção de manteiga de cacau. Considerando a importância do estudo do cacaueiro e sua comunidade fúngica endofítica associada, os objetivos desse trabalho foram: i) estudar a diversidade da comunidade endofítica de cacau; ii) avaliar o potencial dessa comunidade para o controle biológico de Crinipellis perniciosa, o agente causal da vassoura de bruxa e outros fitopatógenos e iii) estudar a interação endófito-patógeno e endófito-hospedeiro. O trabalho foi iniciado com o isolamento de fungos endofíticos de cacau, que foram caracterizados com base em características morfológicas e moleculares. A diversidade foi avaliada por análises de rDNA (regiões ITS1, ITS2 e 5.8) (ARDRA e sequenciamento). A análise de ARDRA gerou 64 haplótipos, os quais incluíram no mínimo, 16 espécies. A seguir, fungos endofíticos antagônicos de cacau foram selecionados in vitro contra C. perniciosa. Foi observado que, dentre os 145 isolados avaliados, 38.6% foram classificados como antagônicos, enquanto 13.1% foram classificados como parasitas. Após a seleção, os isolados foram usados para extração de metabólitos secundários e outras caracterizações. Também foi feita a detecção do gene da δ-(L-α- aminoadipil)-L-cisteinil-D-valin (ACV), que é a precursora das β-lactanas, antibióticos como as penicilinas e cefalosporinas. A amplificação desse gene gerou um fragmento de 600 pb em 9.1% dos isolados avaliados. Alguns isolados foram testados contra fungos fitopatogênicos (Colletotrichum falcatum, C. sublineorum, Erythricium salmonicolor, Rhizoctonia solani, Ceratocystis paradoxa, Phytophthora sp., P. parasitica, P. palmivora e Fusarium moniliforme). Apenas C. sublineorum de sorgo e Ceratocystis paradoxa de cana-de-açúcar foram inibidos in vitro pelos endófitos 42.3 e 2, respectivamente. Foi feita a investigação da habilidade de penetração e colonização do fungo endofítico 42.3 em cacau comum suscetível, usando as técnicas de RAPD e SEM. A penetração do fungo foi iniciada entre 3 e 6 horas após a inoculação. A interação entre o endófito de cacau 42.3 com C. perniciosa 281 (patogênico), foi avaliada por SDS-PAGE, visando a detecção de proteínas expressas pelo patógeno e pelo endófito. A SDSPAGE permitiu a visualização de bandas expressas na interação, quando os microrganismos foram crescidos juntos. Na presença do substrato de crescimento do endófito, C. perniciosa não expressou proteínas visíveis, ou distinguíveis em SDS-PAGE, mas o co-cultivo desses fungos, geraram bandas não observadas em análises prévias. / Endophytes are all microorganisms, culturable or not, that inhabit the interior of plant tissues, causing no harm to the host, and that do not develop external structures, excluding in this way, nodulating bacteria and mycorrhizal fungi. Theobroma cacao L. is important to food and cosmetic industry due the fact that it is used for production of cacao butter. Considering the importance of cacao and associated endophytic fungal community studies, the objectives of this work were to: i) study the diversity on endophytic community of cacao; ii) evaluate the potential of this community to biological control of Crinipellis perniciosa, causal agent of witches’ broom disease and other phytopathogens and iii) study the interaction endophyte-pathogen and endophyte-host. The work began with isolation of the cacao endophytic fungi that was characterizated based on morphological and molecelar characters. The diversity was evaluated by rDNA (ITS1, ITS2 e 5.8 subunit regions) analyses (ARDRA and sequencing). The ARDRA analysis generated 64 haplotypes, which included at least 16 species. Following, antagonistic endophytic fungi from cacao were selected in vitro against C. perniciosa. It was observed that in 145 evaluated isolates, 38.6% was classified as antagonic, while 13.1% were classified as parasitic. After the selection, isolates were used for secondary metabolites extraction and further characterization. Also, detection of δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valin (ACV) gene, which is the precursor of β-lactans, antibiotics like penicilins and cephalosporins, was carried out. The amplification of this gene generated a fragment of 600pb in 9.1% of the isolates evaluated. Some isolates were further evaluated against phytophathogenic fungi (Colletotrichum falcatum, C. sublineorum, Erythricium salmonicolor, Rhizoctonia solani, Ceratocystis paradoxa, Phytophthora sp., P. parasitica, P. palmivora and Fusarium moniliforme). Only C. sublineorum of sorghum and Ceratocystis paradoxa of sugarcane were in vitro inhibited by the endophytes 42.3 and 2, respectively. The investigation of the penetration and colonization ability of endophytic fungus 42.3 on susceptible cacao comum was carried out, using RAPD and SEM techniques. The penetration of the fungus was initiated between 3 and 6 hours after inoculation. The interaction between cacao endophyte 42.3 with C. perniciosa 281 (pathogenic), was evaluated by SDSPAGE, aiming the detection of expressed proteins by pathogen and endophyte. The SDS-PAGE allowed the visualization of bands expressed in the interaction, when the microorganisms were grown together. In the presence of the endophyte growth substrate, C. perniciosa do not express visible proteins or, at least, distinguishable in SDS-PAGE, but the co-cultive of these fungi generated non observed bands in previously analysis.

As formigas cortadeiras (Hymenoptera-Formicidae) estão distribuídas desde o sul dos Estados Unidos até a Argentina. São herbívoros comuns de florestas que coletam material vegetal para cultivar um fungo mutualista específico. São conhecidas pelo seu papel ecológico na aeração do solo, na infiltração da água e na ciclagem de nutrientes. Atividades humanas, como o desmatamento e a agricultura, afetam o ambiente, alterando também o comportamento das saúvas, que acabam atacando os espécimes cultivados. Devido aos prejuízos causados à agricultura, novos inseticidas específicos são necessários. Muitos trabalhos têm sido desenvolvidos usando metabólitos secundários para essa finalidade. Este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito da cafeína na mortalidade de Atta sexdens rubropilosa (Forel, 1908) e no crescimento in vitro de seu fungo mutualístico Leucoagaricus gongylophorus (Möller) Singer (Leucocoprineae: Agaricaceae), obtidos de sauveiros mantidos em laboratório. Foram utilizadas quatro concentrações de cafeína, 0,01%, 0,05%, 0,10% e 0,50%. Mortalidade das formigas foi avaliada pelo ensaio de ingestão, acrescentando a cafeína a dietas artificiais sólidas. A cafeína foi incorporada ao meio de cultura para medir a sua influência no crescimento in vitro. Independente das concentrações de cafeína, esse metabólito parece atuar como repelente para a saúvas. A respeito do fungo, quanto maior a concentração de cafeína, menor o crescimento in vitro. Inibição do crescimento foi observada em 0,10% e 0,50% e morte do fungo foi observada em algumas amostras Em conclusão, os resultados sugerem que a cafeína pode ser usada como fungicida, sendo adicionada a iscas que serão coletadas pelas formigas e carregada aos ninhos, causando a redução do fungo e/ou a morte e consequentemente, a morte das formigas. / The leaf-cutting ants (Hymenoptera-Formicidae) are found from south of United States to Argentina. They are common florest herbivorous which collect plant material to feed a specific mutualist fungus. These insects are known by their ecological role at soil aeration, water permeation and nutrient cycling. Human activities, like deforestation and agriculture, affect the environment, affecting the behavior of leaf-cutting ants, which start to attack the crops. Due to crops lost, new specific pesticides are needed. Several researches have been developed using secondary metabolites for this purpose. The present work aimed to evaluate the effect of caffeine at Atta sexdens rubropilosa (Forel, 1908) mortality, and at in vitro growth of the mutualist fungus Leucoagaricus gongylophorus (Möller) Singer (Leucocoprineae: Agaricaceae), collected from laboratory nests. Four caffeine concentrations were tested: 0.01%, 0.05%, 0.10% and 0.50%. Ant\'s mortality was evaluated by ingestion assay, adding caffeine to artificial diets. Caffeine was added to culture medium, to measure its influence on in vitro fungus growth. Despite caffeine concentrations, this compound seems to act as repellent to ants. Concerning to the fungus, the higher the caffeine concentration, the lower the in vitro fungus growth. Growth inhibition was observed at both 0.10% and 0.50% concentrations and death of fungus was observed in some samples. In conclusion, the results suggest that caffeine could be used as fungicide, being added to baits which could be collected by ants and carried to the nests, causing fungus reduction and/or death and consequently, the death of the nests.

Austropuccinia psidii, the causal agent of myrtle rust, is a biotrophic pathogen, and therefore its growth and development depend on the host tissues. The uredospores of A. psidii infect Eucalyptus by engaging in close contact with the host surface and interacting with the leaf cuticle that provides important chemical and physical signals to trigger the infection process. Due to the inherent characteristics of the Eucalyptus cuticle, it was hypothesized that the preformed mechanism, comprised mostly by cuticular waxes, plays a crucial role in Eucalyptus resistance against A. psidii and its ability to modulate the expression of genes associated to the pathogenicity of A. psidii during the early stage of infection. In chapter 2, the cuticular waxes of Eucalyptus spp. were analyzed to determine their composition or structure and then correlated to susceptibility/resistance to Austropuccinia psidii. Twenty-one Eucalyptus spp. in the field were classified as resistant or susceptible. From these, the resistance/susceptibility level of six Eucalyptus spp. was evaluated in controlled conditions using qPCR, revealing that the pathogen can germinate on the eucalyptus surface of some species without multiplying in the host. CG-TOF-MS analysis detected 26 compounds in the Eucalyptus spp. cuticle and led to the discovery of the role of hexadecanoic acid in the susceptibility of E. grandis and E. phaeotricha to A. psidii. The scanning electron microscopy check revealed differences in A. psidii germination during host infection. It was found a correlation between epicuticular morphology and the resistance to A. psidii. In chapter 3, we investigated gene expression of A. psidii through bioassays in vitro containing cuticular waxes from E. grandis (E. g), E. urograndis (E. ug) and E. urophylla (E. u). Mineral oil (MO) treatment was used to all comparative analysis (negative control). The presence of cuticular waxes from E. g induced the expression of genes encoding proteins related to growth and colonization of A. psidii such as binding proteins (peptidylprolyl isomerase and ribosomal) and cell wall degrading proteins (beta-xylanase). However, other pathogenic proteins were repressed in presence of cuticular wax of E. g, for instance, triosephosphate isomerase, family 18 glycoside hydrolase, mitochondrial ATP carrier, and glutamine-dependent NAD synthetase. The E. ug x MO analysis resulted in DEGs associated with proteins related to membrane transporters and receptors, DNA repair and glycine dehydrogenase. As to the cuticular wax of E. u, it up-regulated the expression of genes encoding proteins associated with pheromone, cutinases, and prefoldin. Thus, for the first time, it was demonstrated a considerable interspecific variation in Eucalyptus species on the susceptibility to A. psidii and its correlation with cuticular waxes chemical compounds that seem to play a synergistic role as a preformed defense mechanism. We also demonstrated that Eucalyptus spp. cuticular waxes may modulate the A. psidii gene expression, suggesting the importance of early plant-pathogen molecular interaction to the development of myrtle rust. / Austropuccinia psidii é o agente causal da ferrugem das mirtáceas com crescimento biotrófico, ou seja, o patógeno depende dos tecidos do hospedeiro para crescer e se desenvolver. Os uredósporos de A. psidii infectam Eucalyptus por meio do contato inicial com a superfície do hospedeiro e também pela interação com a cutícula da folha que por sua vez fornece importantes sinais químicos e físicos capaz de desencadear o processo de infecção. Devido às características inerentes à cutícula de Eucalyptus, consideramos as hipóteses de que o mecanismo pré-formado, composto principalmente pelas ceras cuticulares, desempenha um papel crucial na resistência de Eucalyptus spp. contra A. psidii, e, também, é capaz de modular a expressão fúngica de genes associados a patogenicidade durante o estágio inicial de infecção de A. psidii. No capítulo 2, as ceras cuticulares de Eucalyptus spp. foram analisadas para determinar a composição/estrutura e sua correlação com suscetibilidade/resistência de A. psidii. Vinte e uma espécies de Eucalyptus foram classificadas em campo como resistentes ou suscetíveis. A análise de qPCR de seis Eucalyptus spp. revelou que o patógeno pode germinar na superfície de algumas espécies de eucaliptos sem se multiplicar no tecido hospedeiro. Foram identificados 26 compostos presentes na cutícula de Eucalyptus spp. e descobrimos o papel do ácido hexadecanóico na suscetibilidade de E. grandis e E. phaeotricha à ferrugem. Por meio da microscopia eletrônica de varredura encontramos uma correlação entre a morfologia epicuticular e a resistência contra A. psidii. No capítulo 3 para compreender a expressão gênica de A. psidii realizamos bioensaios (in vitro) contendo as ceras cuticulares de E. grandis (E. g), E. urograndis (E. ug) e E. urophylla (E. u). O tratamento com óleo mineral (MO) foi utilizado em todas as análises comparativas como controle negativo. A presença de ceras cuticulares de E. g induziu a expressão de genes que codificam proteínas relacionadas ao crescimento e colonização de A. psidii, como proteínas de ligação (peptidylprolyl isomerase e ribosomal) e proteínas de degradação da parede celular (beta xilanase). No entanto, outras proteínas patogênicas foram reprimidas na presença da cera cuticular de E. g, por exemplo, triosephosphate isomerase, family 18 glycoside hydrolase, mitochondrial ATP carrier e glutamine-dependent NAD synthetase. A análise de E. ug x MO resultou na ativação de proteínas associadas a transportadores e receptores de membrana, reparo de DNA e glycine dehydrogenase. Já a cera cuticular de E. u induziu a expressão de genes que codificam proteínas associadas a feromônios, cutinases e prefoldin. Pela primeira vez, está sendo apresentado a considerável variação interespecífica em espécies de Eucalyptus quanto à suscetibilidade a ferrugem, e, sua correlação com os compostos químicos de ceras cuticulares, os quais parecem ser um importante mecanismo de defesa pré-formado. Também foi revelado que as ceras cuticulares de Eucalyptus spp. são capazes de modular a expressão gênica de A. psidii, evidenciando o papel da interação molecular planta-patógeno precoce no desenvolvimento da ferrugem das mirtáceas.

O segundo mensageiro cGMP está envolvido em diversas funções celulares incluindo a visão em mamíferos. Embora trabalhos anteriores mostrassem variações nos níveis de cGMP durante o ciclo de vida de Blastocladiela emersonii e evidências da existência de enzimas específicas envolvidas na sua síntese (guanilato ciclase) e degradação (cGMP fosfodiesterase), nenhum genoma de fungo publicado até o momento mostrou a existência de genes codificando estas enzimas. Este fato é atribuído por evolucionistas à completa perda de motilidade dos fungos em geral, já que cGMP está primordialmente associado a células com cílios. Blastocladiomicetos, como Blastocladiella, apresentam células móveis em pelo menos um estágio do seu ciclo de vida, o que poderia explicar a existência dessa via nesses fungos. Uma investigação no banco de ESTs de B. emersonii revelou a existência de cDNAs codificando parte de prováveis guanilato ciclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) e uma possível cGMP fosfodiesterase (BePDE). Assim, este trabalho buscou confirmar a existência destas enzimas e caracterizar a sinalização por cGMP em B. emersonii. A proteína recombinante selvagem correspondente ao domínio catalítico de BePDE mostrou atividade de degradação sobre cGMP e a mutação E389A foi capaz de alterar a especificidade por cGMP. Com o sequênciamento do genoma de B. emersonii obteve-se as sequências completas das guanilato ciclases. Em BeGC2 não foi possível identificar o ligante responsável por sua ativação. Em BeGC3, a presença de um domínio Heme-Pas sugeriu sua ativação por óxido nítrico. A presença de um domínio rodopsina em BeGC1 sugeriu sua ativação por luz. Experimentos de microscopia por imunofluorescência localizaram BeGC1 no \"eyespot\", BeGC2 no capacete nuclear e BeGC3 no citoplasma de zoósporos de B. emersonii. Verificamos também que zoósporos realizam fototaxia em direção à luz verde e que a adição de hidroxilamina, inibidor de rodopsina, ou do inibidor de guanilato ciclase LY83583 tem efeito negativo na fototaxia, bem como impede o aumento dos níveis de cGMP observado em zoósporos expostos à luz verde. O bloqueio da síntese de retinal por Norflurazon também inibiu a fototaxia sendo esta restaurada quando adicionamos retinalA1. Estes dados, juntamente com o fato de o domínio rodopsina de BeGC1 ser a única rodopsina presente no genoma, indicam que BeGC1 é responsável pela fototaxia nos zoósporos de B. emersonii. O genoma do fungo apresenta ainda um possível canal de potássio ativado por cGMP (BeCNG1) localizado na membrana plasmática de zoósporos, similar ao canal regulado por cGMP envolvido na visão em humanos. Ensaios de microfluorimetria também evidenciaram a presença de um canal ativado por cGMP relacionado com o influxo de potássio e a motilidade dos zoósporos. Um modelo para a via de sinalização da fototaxia em B.emersonii foi proposto e comparado com a sinalização presente na visão de mamíferos, destacando a existência de cGMP e rodopsina em ambos os processos e sugerindo uma possível origem comum. Portanto, os resultados obtidos suportam a existência da sinalização por cGMP em B. emersonii, além de indicar o papel dessa sinalização na fototaxia dos zoósporos, sendo esta a primeira via de sinalização por cGMP caracterizada em fungos. / The second messenger cyclic GMP is involved in a wide array of cellular processes including vision in mammals. Although previous studies demonstrated changes in cGMP levels during the life cycle of Blastocladiela emersonii and evidences of specific enzymes involved in its synthesis (guanylyl cyclase) and hydrolysis (cGMP-phosphodiesterase), no fungal genome published so far shows the presence of genes encoding these enzymes. Evolutionists attribute the absence of cGMP signaling pathways in higher fungi to the sedentary life style of these organisms, since cGMP is primarily associated with ciliated cells. However, blastocladiomycetes like Blastocladiella, have motile cells in at least one stage of their life cycle, which could explain the existence of this pathway in these primitive fungi. Inspection of B. emersonii EST data bank, revealed cDNAs encoding part of three putative guanylyl cyclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) and one possible cGMP phosphodiesterase (BePDE). Thus, the purpose of this study was to confirm the existence of these enzymes and characterize the cGMP signaling pathway in this model. The recombinant protein containing the wild type catalytic domain of BePDE presented activity towards hydrolysis of cGMP and the E389A mutation of this domain changed the cGMP specificity of this enzyme. The complete nucleotide sequence of the guanylyl cyclases were obtained by sequencing of B. emersonii genome. In BeGC2 we were unable identify the ligand responsible for its activation, but in BeGC3, the presence of a Heme-Pas domain suggested its activation by nitric oxide. The presence of a rhodopsin domain in BeGC1 suggested its activation by light. Immunofluorescence microscopy localized BeGC1 in the \"eyespot\" structure, BeGC2 in the nuclear cap and BeGC3 in the cytoplasm of zoospores of B. emersonii. We found that Blastocladiella zoospores performed phototaxis toward green light and photobleaching of rhodopsin function using hydroxylamine prevented both phototaxis and the increased cGMP levels observed when zoospores were exposed to green light. The same effect was observed using the guanylyl cyclase inhibitor LY83583. Inhibition of retinal synthesis using Norflurazon prevented the phototaxis response, which could be restored by zoospore complementation with retinalA1. The BeGC1 gene is the only rhodopsin found in the draft assembly of B. emersonii genome, which indicates that BeGC1 is responsible for phototaxis observed in zoospores. We also found in the genome a possible cGMP-activated potassium channel (BeCNG1), localized in the plasma membrane of the zoospores, which is similar to the cGMP-activated channel involved in human vision. In addition, microfluorimetry assays revealed the presence of a cGMP-activated potassium channel involved in potassium influx and zoospore motility. The signaling model of B. emersonii phototaxis was proposed and compared with the mammalian vision system, with cGMP and rhodopsin acting in both signaling pathways, suggesting a common origin. Altogether our data indicate that Blastocladiella emersonii has a cGMP signaling system involved in phototaxis, being the first cGMP signaling pathway characterized in fungi.

Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global do fungo aquático Blastocladiella emersonii submetido ao estresse de carência de oxigênio (hipóxia), utilizando a técnica de microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3773 genes distintos. Nos experimentos de hipóxia gradual (diminuição gradual da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) e hipóxia direta (diminuição direta da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) observamos que 650 genes foram diferencialmente expressos em pelo menos uma das condições de estresse e que 534 deles mostraram-se afetados (direta ou indiretamente) pela disponibilidade de oxigênio, uma vez que apresentaram recuperação (ou tendência à recuperação) da sua expressão aos níveis normais, quando as células foram reoxigenadas. Além de modular a expressão de diversos genes sem função conhecida, B. emersonii responde à hipóxia reajustando a expressão de genes responsáveis pela produção e consumo de energia. Pelo menos transcricionalmente, este fungo favorece o metabolismo anaeróbico, através da indução de genes que codificam enzimas da via glicolítica e lactato desidrogenase, ao passo que no ciclo do ácido cítrico, a maioria dos genes encontram-se reprimidos ou não sofrem alteração na expressão. Processos dispendiosos em energia como síntese protéica, metabolismo de aminoácidos, enovelamento de proteínas e transporte por membrana apresentaram perfis predominantemente de repressão gênica quando em carência de oxigênio. Ainda utilizando a técnica de microarranjos, mostramos semelhanças entre os perfis transcricionais nos experimentos hipóxia e de carência de Fe2+ (tratamento com quelante de Fe2+ 2,2´-dipyridyl) sugerem que estes estresses estão de alguma forma relacionados, fornecendo bons indícios de que o íon Fe2+ possa ter um papel importante no mecanismo sensor de oxigênio e/ou de resposta a hipóxia em B. emersonii. Além disso, o tratamento prévio de células submetidas à hipóxia com o antibiótico geldanamicina, um conhecido inibidor da proteína de choque térmico HSP90, levou à diminuição da indução de certos genes de hipóxia, indicando que este fungo pode possuir algum mecanismo semelhante ao do fator de transcrição de hipóxia HIF1-α de mamíferos, uma vez que este fator também é afetado por geldanamicina. Adicionalmente, desenvolvemos um protocolo para transformação de B. emersonii mediada por Agrobacterium tumefasciens que se mostrou promissor. A transferência do T-DNA contendo um gene de resistência a higromicina B, presente no vetor binário pBINPLUS-Hph, foi evidenciada pelo crescimento normal e esporulação das células transformadas, na presença do antibiótico e pela amplificação do gene de resistência no DNA genômico de células transformadas. / In this work we analyzed global gene expression changes in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii submitted to oxygen deprivation (hypoxia), using cDNA microarrays containing 3,773 distinct genes. In gradual hypoxia (gradual decrease in dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) and direct hypoxia (direct decrease of dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) we observed 650 differentially expressed genes in at least one of the stress conditions tested, 534 of them being affected (directly or indirectly) by oxygen availability, since they showed recovery of normal expression levels or a tendency to recover, when cells were reoxygenated. Besides modulating many genes with no previously assigned function, B. emersonii responds to hypoxia by readjusting the expression levels of genes responsible for energy production and consumption. At least transcriptionally, this fungus seems to favour anaerobic metabolism through the induction of genes encoding glycolytic enzymes and lactate dehydrogenase, while in the TCA-cycle, most genes were repressed or unchanged. Energy-costly processes like protein synthesis, amino acid metabolism, protein folding and transport had their gene expression profiles predominantly repressed during oxygen deprivation. Microarray experiments also showed similarities between the transcriptional profile of genes in hypoxia and iron (II) deprivation (treatment with the iron (II) chelator 2,2\'-dipyridyl), suggesting that these stresses are somehow related, giving good evidence that Fe2+ ion could have a role in the mechanism of oxygen sensing and/or response to hypoxia in B. emersonii. Furthermore, pretreatment of cells subjected to hypoxia with the antibiotic geldanamycin, a known inhibitor of the heat shock protein HSP90, caused a significant decrease in the induction of certain hypoxic genes, indicating that this fungus could have a mechanism similar to that of the mammalian hypoxia transcription factor HIF-1α, which is also affected by geldanamycin. Additionally, we developed an Agrobacterium tumefasciens-mediated protocol for transformation of B. emersonii that has shown to be promising. The capacity to transfer the T-DNA containing a hygromycin B resistance gene, present in the pBINPLUSHph binary vector, was evidenced by the normal growth and sporulation of the transformed cells in the presence of antibiotic and by amplification of the resistance gene from the genomic DNA of transformed cells

O inseto vetor Diaphorina citri Kuwayama 1907 (Hemiptera: Liviidae) é considerado a principal praga da citricultura mundial. O controle desta praga é feito quase exclusivamente com inseticidas químicos, existindo a demanda por alternativas mais sustentáveis de controle. O desenvolvimento de um bioproduto a base de fungo entomopatogênico pode ser uma alternativa promissora para o manejo integrado de D. citri em pomares comerciais de citros. Assim, esse estudo teve como objetivo viabilizar a utilização do fungo entomopatogênico Isaria fumosorosea ESALQ-1296 para o controle de D. citri, avaliando: 1- a ação de adjuvantes na adesão e germinação de I. fumosorosea em ninfas e adultos de D. citri; 2- a relação entre a viabilidade dos conídios e a mortalidade de D. citri; 3- o efeito da umidade relativa do ar e da radiação ultravioleta na eficácia de I. fumosorosea em condições de laboratório; 4- o período entre a aplicação de fungicidas químicos e I. fumosorosea em campo; 5- a seletividade de I. fumosorosea aos inimigos naturais Tamarixia radiata e Ceraeochrysa cincta em condições de laboratório; 6- o volume de calda adequado para as aplicações de I. fumosorosea para o controle de D. citri em pomares comerciais; 7- a eficiência de I. fumosorosea no manejo de D. citri e seu efeito em outras espécies de artrópodes em dois sistemas de produção de citros. Análises por microscopia eletrônica de varredura revelaram que a adição dos adjuvantes KBRAdj e Silwet L-77 acelerou o desenvolvimento dos conídios de I. fumosorosea na cutícula de todos os estágios do inseto em comparação com o Tween 80. As formulações de I. fumosorosea com KBRAdj 0,075% apresentaram melhor desempenho no controle de D. citri em todos os níveis de umidade, mas especialmente em períodos de baixa umidade relativas (≤50%) e sob exposição à radiação UV-B (> 2 horas) em relação a aplicação com Tween. Os fungicidas Kumus® DF, Kocide® WDG, Nativo®, Flint 500® WG não influenciaram no desempenho do entomopatógeno quando esses foram pulverizados um dia antes ou após a aplicação do fungo sobre os adultos de D. citri. Nos estudos de seletividade foi demonstrado que a maioria das misturas de I. fumosorosea com os adjuvantes foi inócua para os adultos de T. radiata e as larvas neonatas de C. cincta. Em pomares comerciais, foi demostrado que as aplicações de I. fumosorosea foram mais eficientes no volume de 60 mL.m-3 de área de copa. Na área com produção orgânica de citros foi verificado que as aplicações de I. fumosorosea reduziram significativamente a população natural de D. citri e do ácaro da leprose (Brevipalpus spp.). Já na área com produção convencional de citros foi observado que as pulverizações de I. fumosorosea reduziram significativamente a população do ácaro da falsa ferrugem (Phyllocoptruta oleivora) e a população de D. citri foi extremamente baixa em todos os tratamentos. As aplicações de I. fumosorosea não apresentaram efeitos negativos nas populações dos predadores joaninhas, crisopídeos e hemerobídeos. Portanto, conclui-se que a utilização do fungo I. fumosorosea no manejo de D. citri pode ser uma tática sustentável para minimizar as aplicações sistemáticas de pesticidas, diminuindo seus impactos no agroecossistema. / The insect vector Diaphorina citri Kuwayama 1907 (Hemiptera: Liviidae) is the main citrus pest in the world. The control of this pest is done almost exclusively with chemical insecticides, and there is a demand for more sustainable control alternatives. The development of a bioproduct based on entomopathogenic fungi may be a promising alternative for the integrated management of D. citri in commercial citrus orchards. The objective of this study was to evaluate important parameters to increase efficiency of applications of the entomopathogenic fungus Isaria fumosorosea ESALQ-1296 for the control of D. citri. The following studies have been developed: 1- the action of adjuvants on adhesion and germination of I. fumosorosea on nymphs and adults of D. citri; 2- the relationship between the conidia viability and the mortality of D. citri; 3- the effect of relative air humidity and ultraviolet radiation on the efficacy of I. fumosorosea under laboratory conditions; 4 - the period between the application of chemical fungicides and I. fumosorosea in field; 5- the selectivity of I. fumosorosea to the natural enemies Tamarixia radiata and Ceraeochrysa cincta under laboratory conditions; 6 - the volume of syrup suitable for I. fumosorosea applications for the control of D. citri in commercial orchards; 7- the efficiency of I. fumosorosea to management of D. citri and its effect against other species of arthropods in two systems of citrus production. Scanning electron microscopy analysis revealed that the addition of the adjuvants KBRAdj and Silwet L-77 accelerated the development of I. fumosorosea conidia on the cuticle of all stages of the insect compared to Tween 80. The formulations of I. fumosorosea with KBRAdj 0.075% showed better performance in controling D. citri at all moisture levels, but especially in periods of low relative humidity (≤50%) and exposure to UV-B radiation (> 2 hours) compared to Tween application. The fungicides Kumus® DF, Kocide® WDG, Nativo®, Flint 500® WG did not influence the performance of the entomopathogen when they were sprayed the day before or after application of the fungus on D. citri adults. In the selectivity studies, it was shown that most of the mixtures of I. fumosorosea with the adjuvants were innocuous for the adults of T. radiata and the neonates of C. cincta. In commercial orchards, it was demonstrated that I. fumosorosea applications were more efficient in the volume of 60 mL.m-3 of leaves. In the area with organic citrus production it was verified that I. fumosorosea applications significantly reduced the natural population of D. citri and the false spider mite (Brevipalpus spp.). In the area with conventional citrus production it was observed that sprays of I. fumosorosea significantly reduced the population of the false rust mite (Phyllocoptruta oleivora) and D. citri population was extremely low in all treatments. The applications of I. fumosorosea did not present negative effects in the populations of the ladybirds, lacewings and hemerobide predators. Therefore, it is concluded that the use of I. fumosorosea fungus in the management of D. citri can be a sustainable tactic to minimize the systematic applications of pesticides, reducing their impacts on the agroecosystem.

Estudos em nosso laboratório caracterizaram camundongos B10.A e A/J, respectivamente, como susceptíveis e resistentes à infecção pulmonar pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis. A imunidade inata desempenha papel fundamental no controle inicial dos patógenos e na regulação da resposta imune adquirida. Como os macrófagos alveolares são as primeiras células do hospedeiro a interagir com o fungo, propusemo-nos a estudar a capacidade fungicida e secretora dos macrófagos alveolares de camundongos susceptíveis e resistentes ao P. brasiliensis para melhor compreender a PCM pulmonar. Camundongos B10.A e A/J normais (n: 10-15) foram submetidos a lavagem bronco-alveolar (LBA) e a suspensão celular obtida (2x105 células/poço) foi pré-ativada durante a noite com IFN-γ, IL-12 ou a combinação destas duas citocinas (50.000, 10.000 e 2.000 pg/rnL) e desafiados in vitro com leveduras viáveis de P. brasiliensis (relação fungo-macrófagos de 1:50). Após 72h de incubação a atividade fungicida dos macrófagos foi avaliada através da contagem do número de fungos viáveis pelo método de unidades formadoras de colônias (UFC). A produção de nitrito e de citocinas foi avaliada no sobrenadante de cultivo através da reação de Griess e ELISA, respectivamente. Os dados foram expressos como média ± EP e analisados pelo teste T -Student. Nossos resultados mostraram que os macrófagos de camundongos B 10.A pré-ativados com IFN-γ, IL-12 ou ambas as citocinas nas diferentes concentrações ensaiadas apresentaram elevada capacidade fungicida (51-97%) acompanhada de produção aumentada de NO, IL-12 e MCP-l e baixa síntese de IL-10 e GM-CSF. Por outro lado, somente o tratamento com a mais alta concentração de IFN-γ foi capaz de induzir atividade fungicida em macrófagos alveolares de animais A/J. A síntese de NO ocorreu sempre em baixos níveis e nos sobrenadantes dos co-cultivos observamos altos níveis de IL-10 e GM-CSF associados a baixas concentrações de IL-12 e MCP-l. A inibição da síntese de NO por aminoguanidina demonstrou que a atividade fungicida dos macrófagos de animais B10.A, mas não de A/J, era mediada por este composto tratamento dos macrófagos com anticorpo monoclonal anti-IL-10 não alterou a capacidade fungicida dos macrófagos de ambas as linhagens, entretanto induziu franca produção de NO que, para animais A/J, não se traduziu em atividade microbicida aparente. Por outro lado. a neutralização de TGF-β induziu alta capacidade fungicida das células de animais A/J níveis aumentados de NO e TNF-α aliados a níveis reduzidos de IL-10. O mesmo tratamento não alterou a já elevada capacidade fungicida dos macrófagos alveolares de animais B10.A mas aumentou a produção de NO, IL-12 e TNF-α. Em conclusão, os macrófagos alveolares de camundongos B10.A são facilmente ativáveis por 1FN-γ e IL-12, apresentam elevada capacidade fungicida, NO-dependente, sobre leveduras do P. brasiliensis associada com a síntese de níveis elevados de NO e IL-12. Por outro lado, os macrófagos de camundongos A/J são pobremente ativados por 1FN-γ e IL-12, produzem baixos níveis de NO, a sua capacidade fungicida, que parece ser NO-independente, pode ser aumentada pela neutralização do TGF-β endógeno, mas não pelo tratamento com anti-IL-10. / Previous studies in our laboratory characterized B10.A and A/J mice as susceptible and resistant strains to pulmonary Paracoccidioides brasiliensis infection. Innate immunity plays a fundamental role on the control of the initial growth of pathogens as well as in the acquired immunity that subsequently develops. As alveolar macrophages are the first host cells to interact with P. brasiliensis we decided to study the fungicidal and secretory ability of alveolar macrophages from resistant and susceptible mice to P. brasiliensis to better understand the pulmonary model of paracoccidioidomycosis. Normal B10.A and A/J mice (n=10-15) were submitted to bronchoalveolar lavage (BAL) and cell suspensions (2x105 cells/well) were pre-activated ovemight with IFN-γ, IL-12 or the combination of these two cytokines (50,000, 10,000 and 2,000 pg/rnL). After that, macrophages were in vitro challenged with P. brasiliensis yeasts (1:50 fungus: macrophage ratio) and 72h later fungicidal activity was determined by colony forming units counts (CFU). Nitrite and cytokines production were determined in culture supematants by Griess reaction and ELISA, respectively. Data were expressed as means ± SE and analyzed by Student\'s t test. Our results showed that B10.A macrophages pre-activated with the different assayed concentrations of IFNγ, IL-12 or both cytokines presented elevated fungicidal ability (51¬-97%) concomitant with the presence of high levels of NO, IL-12 and MCP-l and low amounts of IL-10 and GM-CSF. NO synthesis occurred in low levels but high concentrations of IL-10 and GM-CSF associated to low amounts of IL-12 and MCP-1 were detected in the co-cultures supematants. NO synthesis inhibition by aminoguanidine clearly showed that the fungicidal ability of B10.A but not of A/J macrophages was NO¬ dependent. Treatment with anti-IL-10 monoclonal antibodies did not alter the fungicidal ability of macrophages from both mouse strains but enhanced NO synthesis which, however, did not alter the absent microbicidal ability of A/J macrophages. On the contrary, anti-TGF-β treatment induced an increased fungicidal ability of A/J cells associated with enhanced levels of NO and TNF-α besides diminished amounts of IL-10. The same treatment did not alter the high fungicidal ability of B10.A alveolar macrophages but increased NO, IL-12 and TNF-α production. In conclusion, alveolar macrophages from susceptible mice are easily activated by IFNγ and IL-12, present a high and NO-dependent ability to kill P. brasiliensis yeasts and secrete elevated levels of NO and IL-12. In contrast, alveolar macrophages from resistant mice are poorly activated by IFNγ and IL¬12, secrete low amounts of NO and high of IL-10. Their fungicidal ability which appears to be NO-independent can be restored by neutralization of endogenous TGF-β but not by anti-IL-10 treatment.