Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-10T13:02:48Z No. of bitstreams: 1 2016_RaffaelJunioAraujoCastro.pdf: 2480326 bytes, checksum: 03a83d6a12dfb33f04defc765f6b0fe9 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T11:35:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RaffaelJunioAraujoCastro.pdf: 2480326 bytes, checksum: 03a83d6a12dfb33f04defc765f6b0fe9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T11:35:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RaffaelJunioAraujoCastro.pdf: 2480326 bytes, checksum: 03a83d6a12dfb33f04defc765f6b0fe9 (MD5) / O Fonsecaea pedrosoi é um fungo dimórfico e o principal agente etiológico da cromoblastomicose, infecção crônica da pele e tecidos subcutâneos iniciada pela inoculação transcutânea das formas saprofíticas do fungo. No hospedeiro, essas células transformam-se em células muriformes, tida como a forma parasítica do fungo e grandes produtoras de melanina, considerada um importante fator de virulência. Estudos recentes têm proposto que a cronicidade da cromoblastomicose decorre de falhas, tanto no reconhecimento inato do fungo, levando à baixa produção de citocinas pró-inflamatórias, quanto na montagem de uma resposta imune adequada para a contenção da infecção. Nesse contexto, considerando o inflamassoma como um importante sistema de reconhecimento inato que compõe respostas imunes antifúngicas, este trabalho foi conduzido visando avaliar a ativação do inflamassoma por F. pedrosoi, bem como o seu papel na infecção induzida pelas formas saprofíticas do fungo. Foi observado, inicialmente, que hifas, ao contrário de conídios, induzem a secreção de IL-1 provendo os 2 sinais necessários à ativação do inflamassoma, tanto em BMDMs, quanto em BMDCs. O fornecimento exógeno do primeiro ou segundo sinal não só incrementou a secreção da citocina durante a infecção com hifas, como possibilitou a secreção de IL-1β por BMDCs infectadas com conídios. Utilizando inibidores ou células nocautes, verificou-se que a secreção de IL-1β é dependente do receptor NLRP3, da caspase-1, e influenciada pela caspase-8. Em adição, observamos que a secreção de IL-1 mediada pelo inflamassoma NLRP3 é dependente: da sinalização via NF-κB independente de MyD88; dos mecanismos de efluxo de K+; da liberação de catepsina B; e, de forma não essencial, da geração de espécies reativas de oxigênio. Ademais, foi mostrado que a melanina presente na parede do fungo, mas não a secretada, contribui para a secreção da IL-1. Foi demonstrado, ainda, que a caspase-1, caspase-11 e o receptor NLRP3, não foram capazes de promover a atividade fungicida de macrófagos em ensaios de co-cultura com o fungo. Entretanto, dados dos ensaios de infecções in vivo sugerem que as caspases-1 e -11, assim como o NLRP3, auxiliam na contenção da infecção por propágulos fúngicos de F. pedrosoi. No entanto, eles são dispensáveis na resposta à infecção com o conídio, confirmando o papel desta forma fúngica na persistência do F. pedrosoi no hospedeiro como resultado da ativação inadequada da resposta imune e seus mecanismos efetores. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fonsecaea pedrosoi is a dimorphic fungus, and the main etiologic agent of chromoblastomycosis, a chronic infection of the skin and subcutaneous tissue initiated after transcutaneous inoculation of saprophytic forms of the fungus. Inside the host, these cells turn into muriformes cells, considered the parasitic form, which produce large amount of melanin, an important virulence factor. Recent studies have suggested that the chronicity observed in chromoblastomycosis is due to both, failure in innate recognition of the fungus, leading to low production of pro-inflammatory cytokines, and development of an inappropriate immune response unable to contain the disease. In this context, and considering the inflammasome as an important innate recognition system that comprises antifungal immune responses, this study was conducted to evaluate inflammasome activation by F. pedrosoi, as well as its role in the infection induced by saprophytic forms of the fungus. First, it was observed that, in contrast to conidia, hyphae induced the secretion of IL-1, and provides both first and second signals for inflammasome activation in BMDMs and BMDCs. Exogenous stimulation of the first or second signal not only increased IL-1 secretion during infection with hyphae, but also enabled the secretion of IL-1 by BMDCs infected with conidia. Using inhibitors or knockout cells, it was found that IL-1β secretion is dependent on NLRP3, caspase-1 and influenced by caspase-8. In addition, we observed that IL-1 secretion mediated by NLRP3 inflammasome is dependent: on a NF-kB signaling pathway independent of MyD88; on efflux of K+; on cathepsin B release; and, in an unessential way, on generation of reactive oxygen species. Furthermore, it was demonstrated that melanin present in fungal cell wall, but not the secreted one, contribute to IL-1β secretion. It was further demonstrated that caspase-1, caspase-11 and NLRP3 receptor did not promote in vitro fungicidal activity of macrophages. However, data from in vivo infection studies suggest that caspase-1 and -11, as well as NLRP3, assist in the disease containment caused by infection with fungal propagules of F. pedrosoi. However, they are dispensable in response to infection with conidia, confirming the role of conidia in F. pedrosoi conidial form persistence in the host through the inappropriate activation of the immune response and its effectors mechanisms.

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-10-10T13:32:35Z No. of bitstreams: 1 DissTHVM.pdf: 1434911 bytes, checksum: 6bda93b6ed17dc1b87dc6c2a10de38e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T19:45:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissTHVM.pdf: 1434911 bytes, checksum: 6bda93b6ed17dc1b87dc6c2a10de38e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T19:46:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissTHVM.pdf: 1434911 bytes, checksum: 6bda93b6ed17dc1b87dc6c2a10de38e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T19:46:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissTHVM.pdf: 1434911 bytes, checksum: 6bda93b6ed17dc1b87dc6c2a10de38e8 (MD5) Previous issue date: 2016-06-17 / Não recebi financiamento / Alternaria Brown Spot (ABS), caused by Alernaria alternata a fungus which produces a host specific toxin (HST), is a disease of huge importance in mandarin orchards in many producing regions in the world. The selection of varieties resistant to disease is of great economic importance. In this study different hybrids of citrus were evaluated. These hybrids were obtained by directed crosses and preselected by agronomic characteristics that make them potential new varieties of oranges and mandarins, for industry or fresh fruit. The evaluation of these new genotypes is an essential step for the release of new varieties. Seventy-nine hybrids and their parents were subjected to inoculation with an isolated from A. alternaria in detached leaves and plant assays. The severity of disease was measured by the scale described in the literature. The evaluation of Mendelian segregation in hybrids of Murcott tangor and Pera sweet orange, evaluated in greater numbers, allows inference about the genetics of resistance heritability of ABS and to map the genomic region associated with the fungus using an integrated genetic map previously obtained. Different responses were observed after the fungus inoculation. Five hybrids of Willowleaf mandarin like, six hybrids of mandarin like, three hybrids of Murcott like and 21 hybrids of orange like, resistant to ABS, or with few symptoms of the disease were selected. High values of heritability and genetic variability measured indicate that the selection of resistant plants in the progeny can be successful. A resistance gene and molecular markers associated with it were located in the same linkage group 3 of integrated map of Murcott and Pera. The selected genotypes constitute potential material for commercial planting and for the control of disease in the field. / A mancha marrom de alternaria (MMA), causada pelo fungo Alternaria alternata, que produz uma toxina específica ao hospedeiro (Host Specific Toxin, HST) é uma doença de grande importância nos pomares de tangerinas em muitas regiões produtoras no mundo. A seleção de variedades resistentes à doença é de grande importância econômica. Neste trabalho foram avaliados diferentes híbridos de citros, obtidos por cruzamentos dirigidos e pré-selecionados, por apresentarem características agronômicas que os tornam potenciais novas variedades de laranjas e tangerinas, tanto para a citricultura industrial, quanto de mesa. A avaliação destes novos genótipos é uma etapa imprescindível para a liberação de novas variedades. Setenta e nove híbridos juntamente com seus genitores foram submetidos à inoculação com um isolado de A. alternaria em folhas destacadas e em plantas. A severidade da doença foi mensurada através de escala descrita na literatura. A avaliação da segregação mendeliana nos híbridos de tangor Murcott e laranja Pera, avaliados em maior número, permitiu inferir acerca da herdabilidade genética da resistência a MMA e mapear a região genômica associada à resposta das plantas ao fungo em um mapa genético integrado dos genitores previamente obtido. Foram observadas diferentes respostas à inoculação controlada do fungo. Foram selecionados cinco híbridos tipo mexerica, seis híbridos tipo tangerina, três híbridos tipo tangor Murcott e 21 híbridos tipo laranja resistentes a MMA, ou que apresentaram poucos sintomas da doença. Os valores elevados de herdabilidade e variabilidade genotípica mensurados indicam que a seleção de plantas resistentes na progênie pode ser realizada com sucesso. Marcadores ligados à região associada à resposta à infecção com A. alternata foram localizados no grupo de ligação 3 do mapa integrado de tangor Murcott e laranja Pera. Os genótipos selecionados se constituem em materiais potenciais para plantio comercial, visando ao controle da doença no campo.

Submitted by ANA CAROLINA VIEIRA null (ana_vieira90@hotmail.com) on 2018-02-20T21:30:32Z No. of bitstreams: 1 Ana Vieira_Disserta_final 20.02.18.pdf: 2714120 bytes, checksum: 3e9f8da9450e3d1de4c791ef438cc707 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Lucia Martins Frederico null (mlucia@fca.unesp.br) on 2018-02-21T11:40:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vieira_ac_me_botfca.pdf: 2588229 bytes, checksum: ba2c9df3bc4fe4241d6e066946bc9ebc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-21T11:40:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vieira_ac_me_botfca.pdf: 2588229 bytes, checksum: ba2c9df3bc4fe4241d6e066946bc9ebc (MD5) Previous issue date: 2017-11-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A produção de nanocelulose a partir de materiais renováveis, como as fibras lignocelulósicas, traz além dos benefícios ambientais, produtos de alta qualidade e excelentes propriedades mecânicas e vantagens econômicas. Com isso, nesta dissertação foram estudadas algumas rotas para a produção de nanocelulose utilizando a casca de eucalipto, pois atualmente esse resíduo é gerado em grandes quantidades em indústrias como a de papel e celulose. O intuito desse trabalho foi encontrar alguma metodologia que eficiente, limpa e de baixo custo. Para isso foram utilizados dois tipos de pré-tratamentos, sendo eles alcalinos e biológicos, onde o alcalino foi dividido em duas etapas (NaOH 10%; NaOH 14%) e o biológico em 4 etapas (7 dias; 14 dias; 21 dias; 31 dias). Pela caracterização química foi possível determinar que os pré-tratamentos alcalino 10% e o pré-tratamento biológico são os mais eficientes em relação a remoção da lignina e hemicelulose, e pelas análises TGA, DRX e FTIR, foi possível determinar que o pré-tratamento alcalino 10% apresentou o melhor resultado. A partir da análise de MEV com a amostra que foi submetida ao pré-tratamento alcalino 10 %, não foi possível notar a formação de nanofibras de celulose, ou seja, para pesquisas futuras é necessário aperfeiçoar as metodologias utilizadas. / The production of nanocellulose from renewable materials, such as lignocellulosic fibers, brings environmental benefits, high quality products and excellent mechanical properties and economic advantages. Thus, in this dissertation some routes for the production of nanocellulose using the eucalyptus bark were studied, because at the moment this residue is generated in large quantities in industries such as paper and pulp. The aim of this work was to find some methodology that is efficient, clean and inexpensive. In order to do this, two types of pre-treatments were used: alkaline and biological, where the alkaline was divided into two stages (NaOH 10%, NaOH 14%) and biological in 4 steps (7 days, 14 days, 21 days; 31 days). By the chemical characterization it was possible to determine that the 10% alkaline pre-treatments and the biological pretreatment are the most efficient in relation to the removal of lignin and hemicellulose, and by the TGA, XRD and FTIR analyzes, it was possible to determine that the pretreatment 10% presented the best result. From the analysis of SEM with the sample that was submitted to 10% alkaline pretreatment, it was not possible to detect the formation of cellulose nanofibres, that is, for future research it is necessary to improve the methodologies used.

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Maria Aparecida de Resende Stoianoff / Banca: Juliana Campos Junqueira / Resumo: Histoplasma capsulatum variedade capsulatum é um fungo dimórfico causador da Histoplasmose, uma doença fúngica sistêmica que constitui um importante problema de saúde mundial. A infecção ocorre através da inalação de propágulos infectantes provenientes do meio ambiente. A capacidade de formação de biofilme por esse fungo foi caracterizada recentemente, porém ainda pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos na sua formação. Neste caso, estudos com abordagens proteômicas seriam de fundamental importância para o entendimento da diferença entre a forma planctônica e o biofilme. Os antifúngicos usados na terapia convencional contra biofilmes não são eficientes, além disso, doses elevadas para perfusão destes fármacos nesta forma seriam tóxicas para os pacientes. O presente trabalho teve como objetivo verificar a atividade anti-Histoplasma de 92 compostos derivados de chalcona e do ácido protocatecuico; caracterizar o biofilme do isolado clínico H. capsulatum 317 e pesquisar compostos anti-biofilme buscando um provável mecanismo de ação através da análise proteômica diferencial entre o biofilme tratado e não tratado. Os testes de susceptibilidade foram realizados conforme o documento M27-A3, proposto pelo CLSI (2008). Os biofilmes foram formados em caldo BHI suplementado e a atividade metabólica foi determinada através do ensaio de redução do XTT. Para a caracterização da formação do biofilme e da ação do composto, utilizou-se a microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal, enquanto que a massa do biofilme e a matriz extracelular foram quantificadas pelo cristal violeta e safranina. E como etapa final foi realizada a análise do perfil proteico dos biofilmes com e sem tratamento. Os melhores valores de concentração inibitória mínima (CIM) foram obtidos por seis derivados de chalconas (T50, C3, E2A, F2A, T18A e T46A) e... / Abstract: Histoplasma capsulatum var. capsulatum is a dimorphic fungi that causes Histoplasmosis, a systemical fungal disease that is a major health problem worldwide. Infection occurs by inhalation of infective propagules from the environment. The biofilm formation by this fungi was characterized recently, however little is known about the mechanisms involved in their formation. In this case, studies with proteomic approaches would be of fundamental importance for understanding the difference between the planktonic and biofilm forms. The antifungal agents used in conventional therapy are not effective against biofilms, in addition, high doses of these drugs can be toxic to patients. This study aimed to verify the anti-Histoplasma activity of 93 compounds derived from chalcones and protocatechuic acid; characterize the biofilm formation by the clinical isolate H. capsulatum 317 and discover new anti-biofilm compounds searching for a mechanism of action by differential proteomics analysis, comparing the treated and untreated biofilms. Susceptibility tests were performed according to the document M27- A3, proposed by the CLSI (2008). The biofilms were formed in BHI broth supplemented and metabolic activity was determined by the XTT reduction assay. For the characterization of biofilm formation and action of the compound, was used the scanning electron microscopy (SEM) and confocal microscopy, while the mass of the biofilm and the extracellular matrix were quantified by crystal violet and safranin. Lastly was performed the analysis of the protein profile of biofilms with and without treatment. The best minimum inhibitory concentration values (MIC) were obtained for six derivatives of chalcones (T50, C3, E2A, F2A, T18A and T46A) and nonyl protocatechuate (MIC = 3.9 mg/L). The clinical isolate H. capsulatum EH317 was able to form biofilms in vitro after 96 hours. After 96 hours, the biofilm ... / Mestre

Leandria momordic 3 é um importante patógeno de cucurbitáceas. No entanto, além da baixa eficiência dos agroquímicos usados no seu controle, pouco se sabe sobre a sobrevivência, hospedeiros, variabilidade genética, fontes de resistência, virulência e comportamento in vitro deste fungo, além das desencontradas informações sobre a epidemiologia e o desenvolvimento da infecção em plantas no campo e em estufa. Pesquisou-se, então, em áreas de produção de pepinos no litoral de Santa Catarina e nos laboratórios da Epagri, em Itajaí, SC e da Faculdade de Agronomia da UFRGS, Porto Alegre, RS, controle químico; sobrevivência em hospedeiros, no solo e in vitro; preservação de restos culturais no campo; esporulação e infecção; gama de hospedeiros e de resistência; epidemiologia em campo e em estufa; variabilidade, através de polimorfismo de DNA, via AFLP e plasticidade morfológica. O fungo pode sobreviver no solo, em seus hospedeiros e in vitro, congelado ou em água destilada; apresenta anastomose e variabilidade genética entre isolados de hospedeiros distintos. A doença, cuja sintomatologia varia com a temperatura e umidade, é mais severa sob chuva e temperatura entre 18 a 25 °C. O micélio pode infectar, mesmo sob condições impróprias ao conídio. Cayaponia tayuya, Melothria pendula e Cucurbita maxima foram imunes ao fungo, e Cucurbita pepo, Bryonia cretica, Sicana odorifera, Cucumis metuliferus e Cucurbita pepo var. melopepo também são seus hospedeiros. A esporulação depende de luz, temperatura e meio de cultura e a luminosidade não interfere no crescimento. Colônias, após imersão em água, produzem mais esporos. A doença pode ser controlada pelo efeito guarda-chuva das estufas e por certos agroquímicos e o efeito biocida de Citrobio in vitro não se reproduz, necessariamente, no campo. / Leandria momordicE is an important pathogen of cucurbitaceee plants. However, the efficiency of pesticides used for its control — is poor and the existing knowledge on its survival, hosts, genetic variability, resistance sources, infection potential and in vitro behavior — is very reduced. Besides, the information available on the conditions that favor the development of infection and disease under field and greenhouse situations — is quite contradictory. Therefore, the following research studies were carried out in the main Santa Catarina cucumberproducing areas, Brazil, over latitude 28° S and longitude 48° W, at EPAGRI laboratories, and at Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul: chemical control, survival in hosts, soil an in vitro, maintenance of crop residues en field, sporulation and infection, scope of hosts and resistance, epidemiology in field and greenhouse, anastomosis, variability through DNA polymorphism and morphological plasticity. The fungus may survive in the soil, in hosts and in vitro (frozen or distilled water) and presents anastomosis and genetic variability between different host isolates. The disease, whose symptomatology varies according to temperature and moisture, gets more severe under temperature from18-25 °C and rainy conditions. The mycelium can infect even under unfavorable conditions to conidium. Cayaponia tayuya, Melothria pendula and Cucurbita maxima proved immune to the fungus, and Cucurbita pepo, Bryonia cretica, Sícana odorífera, Cucumis metuliferus and Cucurbita pepo var. melopepo also represent hosts. Sporulation depends on sunlight, temperature and culture mean; the sunlight does not interfere with the fungai growth. lmmersion the colonies in water may increased sporulation. The disease can be controlled by using greenhouse and certain pesticides; the effect of Citrobio, in vitro and under field conditions, is not necessarily alike.

A degradação de quitina é importante para o remodelamento da parede celular em fungos filamentosos e crucial para o rompimento da cutícula de hospedeiros artrópodes durante a infecção de fungos entomopatogênicos. Além disso a quitina é uma importante fonte nutricional. Para que a quitina possa ser eficientemente utilizada, a atividade de b-Nacetilglicosaminidases (NAGases) deve estar presente. Após a ação de quitinases sobre a quitina, gerando dímeros de N-acetilglicosamina (GlcNAc)2, NAGases hidrolisam suas ligações β-1-4 produzindo GlcNAc livre. Fungos filamentosos possuem, em média, 15 a 25 quitinases, mas somente duas NAGases, o que leva a questões sobre a real importância destas enzimas. Em escala genômica, foram identificadas no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae duas NAGases da família GH20 (MaNAG1 e MaNAG2) e duas NAGases da família GH3 (MaNAG3 e MaNAG4) das glicosil hidrolases. Análises filogenéticas sugerem subsequentes duplicações ocorrendo principalmente no clado de MaNAG2, resultando na presença de ortólogos em um amplo espectro de ascomicetos com diferentes estilos de vida. MaNAG1 agrupou majoritariamente com espécies entomopatogênicas. MaNAG3 e MaNAG4 apresentaram alta similaridade de sequências e conservação de domínios com NAGases GH3 de bactérias O perfil transcricional dos genes das NAGases GH20 e GH3 foi avaliado por qPCR, em oito diferentes condições de cultivo, representando diferentes estágios de desenvolvimento ou diferentes estados nutricionais. As NAGases apresentaram perfis de transcrição diferenciais em resposta às diferentes condições, indicando a ausência de um padrão de regulação gênica em comum. Os perfis de expressão variáveis também sugerem que elas não devem possuir funções totalmente redundantes. Ensaios de transcrição relativa mostraram a indução da expressão de MaNAG1, MaNAG2 e MaNAG4 por quitina 1%, enquanto MaNAG3 foi induzida em meio suplementado com GlcNAc 0,25%. As relações evolutivas de MaNAG3 e MaNAG4 e a regulação de suas expressões por substratos quitinosos são a primeira evidência do envolvimento de NAGases GH3 em processos celulares fisiológicos em ascomicetos, apontando para sua potencial relevância na diferenciação celular durante o ciclo de vida de M. anisopliae. Com o objetivo de avançar no estudo funcional das NAGases de M. anisopliae, foram gerados vetores para a construção de mutantes nulos para os quatro genes de NAGases e linhagens transformantes foram obtidas utilizando-se a metodologia de transformação de fungos mediada por Agrobacterium tumefaciens. / Chitin degradation is important for filamentous fungi cell wall remodeling and, in entomopathogenic fungi, this process is pivotal for breaching the arthropod host cuticles during infection. Chitin is an important nutrient and to be efficiently used, β-Nacetylglucosaminidases (NAGases) activity must be present. After chitinase action on chitin generating N-acetylglucosamine dimers (GlcNAc)2, NAGases hydrolyze theirs β-1-4 linkages producing free GlcNAc. Filamentous fungi have between 15 to 25 chitinases, but only two NAGases; then, questions arise about the actual importance of these enzymes. On a genomic scale, were identified in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae two GH20 NAGases (MaNAG1 and MaNAG2) and two GH3 NAGases (MaNAG3 and MaNAG4) from glycoside hydrolases. Phylogenetic analysis suggested subsequent duplications occurring mainly in MaNAG2 clade, resulting in ortholog clusters in several ascomycetes with a broad range life style. MaNAG1 clusters mostly with entomopathogenic species clades. MaNAG3 and MaNAG4 showed high sequence similarity and domain conservation with bacterial GH3 NAGases Transcriptional profiles of GH20 and GH3 NAGase genes were evaluated by qPCR from eight culture conditions, representing different stages of development and different nutritional states. NAGases showed differential transcript profiles in response to different conditions, indicating an absence of a common gene regulation pattern. The variable expression profiles also suggest they may not have totally redundant roles. Relative transcription assays showed MaNAG1, MaNAG2 and MaNAG4 expression induction by chitin 1%, while MaNAG3 was induced in medium supplemented with GlcNAc 0.25%. Evolutionary relationships of MaNAG3 and MaNAG4 and their expression regulated by chitinous substrates are the first evidence of GH3 NAGases involvement in physiological cell process in entomopathogenic fungi, therefore, pointing to potential relevance on cell differentiation during M. anisopliae life cycle. In order to proceed on functional studies of M. anisopliae NAGases, vectors were constructed to produce knockout mutants for four NAGases genes and transformant strains were obtained by using fungi transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens.

Para infectar seus hospedeiros artrópodes, Metarhizium anisopliae produz uma série de enzimas hidrolíticas e diversas alterações morfológicas como a formação de estruturas denominadas de apressórios e blastosporos. Estas estruturas de infecção representam estágios cruciais de penetração e disseminação no inseto hospedeiro, respectivamente. Além disso, o apressório é uma estrutura conservada entre fungos entomopatogênicos e fitopatogênicos. O gene emp1 (codifica uma proteína de matriz extracelular de Magnaporthe grisea) parece ter um papel importante na diferenciação do apressório, bem como na patogenicidade e virulência. Um dos nossos objetivos foi avaliar a possível função de um ortólogo do gene emp1 em M. anisopliae pela análise do perfil transcricional e construção de mutantes funcionais por mutagênese insercional utilizando agrotransformação. Foram geradas linhagens transformantes contendo o cassete de inativação do gene emp1 (pPZP::bar::emp1), sendo este construído pela subclonagem das regiões flanqueadoras 5’ (1.515pb) e 3’ (1.513pb), fusionadas a um cassete de expressão do gene bar (3.500pb) que confere resistência a glifosinato de amônia. A freqüência de transformação observada nesta etapa de transformação foi superior a 60%, porém em apenas 1,5% dos transformantes há indícios de recombinação homóloga. Também foi analisado o perfil transcricional de emp1, sob três condições anteriormente padronizadas: células diferenciadas em apressório, hifas (crescimento vegetativo), e blastosporos, sendo observada a presença de transcritos deste gene em todas as condições testadas. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi avaliado o perfil transcricional de quitinases putativas de M. anisopliae nos estágios de diferenciação celular de apressório, hifas e blastosporos. Esta classe de proteínas está diretamente envolvida no remodelamento da parede celular fúngica durante a diferenciação celular, como também na degradação da quitina da cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. Originalmente foram caracterizados três genes para quitinases (chit1, chi2 e chi3), e a análise in silico do genoma revelou outras 20 quitinases putativas de Metarhizium. Essa diversidade pode ser responsável pelas diferentes funções que o conjunto de enzimas quitinolíticas tem na degradação de quitina durante o ciclo de vida e de infecção do fungo. É, portanto importante: (i) validar transcricionalmente as quitinases putativas e (ii) tentar atribuir função a cada uma delas. Para isso, procedemos a análise dos transcritos de cada uma das 23 quitinases putativas sendo sintetizados cDNAs a partir das três condições de diferenciação celular (apressório, hifas e blastosporos). Na condição de diferenciação a apressório dez espécies de transcritos foram detectadas sendo seis do subgrupo A, três do subgrupo B, uma do subgrupo D. Nenhum transcrito de quitinases do subgrupo C foi detectado nas condições testadas. Tanto em crescimento vegetativo quanto em blastosporos foram detectadas sete espécies de transcritos de quitinases do subgrupo A, e uma do subgrupo D. As quitinases do subgrupo B diferiram quanto a sua distribuição nas condições testadas: três espécies de transcritos foram detectadas durante o crescimento vegetativo e seis em blastosporos. O estudo envolvendo os diferentes genes putativos (emp1 e de quitinases) de M. anisopliae, sob as diversas abordagens, representa um importante precursor para nos fornecer indicativos sobre as funções destes genes no ciclo de vida e de infecção de Metarhizium. / To infect their arthropod hosts, Metarhizium anisopliae produces a series of hydrolytic enzymes and several morphological changes, including the formation of structures called appressoria and blastospores. These infective structures represent crucial stages of penetration and dissemination in the insect host, repectively. In addition, the appressorium is a structure conserved among phytopathogenic and entomopathogenic fungi. The emp1 gene (encodes an extracellular matrix protein) from Magnaporthe grisea showed an important role in appressorium differentiation, as well as pathogenicity and virulence. Our goal was evaluate the possible role of an ortholog gene emp1 in M. anisopliae by transcriptional analysis and construction of functional mutants by insertional mutagenesis mediated by agrotransformation. We generated transformants strains containing the gene inactivation cassette of emp1 (pPZP::bar::emp1), which was constructed by subcloning of flanking portions 5’ (1.515bp) and 3’ (1.513bp) fused in a expression cassette of bar gene (resistance to glufosinate ammonium). The frequency of transformation observed in this round was higher than 60%, but only 1,5% of the transformants there is evidence of homologous recombination. We also analysed the transcriptional profile of emp1 under three conditions previously standardized, such as differentiated cells in appressorium, hyphae (vegetative growth) and blastospores. Accordingly, we observed the presence of transcripts of this gene in all growth condition tested. In a second step of this work, we evaluated the transcriptional profile of putative chitinases of the M. anisopliae in those different stages of cellular diferentiation. This class of proteins is directly involved in fungal cell wall remodeling during cellular diferentiation, as well as degradation of chitin in the host cuticle during the penetration stage. Originally we characterized three genes of chitinases (chit1, chi2 and chi3), but apart from these, the in silico analysis of the genome revealed 20 putative chitinases. This diversity may be reponsible for differents functions that the set of chitinases enzymes have in the chitin degradation during the life and infection cycle of the fungus. It is therefore important: (i) validate transcriptionally the putative chitinases and (ii) attemping to assign function to each one of them. Chitinases transcript survey was performed using cDNAs from three cell types: appressorium, vegetative growth and blastospores. In the appressorium condition ten species of transcripts were detected being six from the subgroup A chitinases, three from group B and one from group D. No transcripts of subgroup C chitinases were detected. Both in vegetative growth and blastospores seven species of transcripts of the subgroup A, and one from group D were detected. Chitinases from subgroup B differed - three species of transcripts were detected during vegetative growth and six were detected in blastospores. This study of several putative genes (as emp1 and chitinases) of M. anisopliae, under different approaches, may represent an important preliminary outcome to shed a light in the functions of these genes during life cycle and infection of Metarhizium.

O cultivo de pessegueiros é uma atividade de grande importância econômica no Sul do Brasil, onde se destaca o Estado do Rio Grande do Sul (RS) como maior produtor brasileiro. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos dos sistemas de Produção Convencional (PC) e Integrada (PI) de pessegueiro sobre a flutuação populacional de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) e o potencial de uso de isolados destes fungos oriundos de pomares de pessegueiro e de parreirais da serra Gaúcha na produção de mudas de qualidade e no aproveitamento de áreas de replantio. Foram coletadas amostras de solo e raízes em pomares comerciais manejados sob PI e PC em propriedade no município de Charqueadas, São Jerônimo e Pelotas, durante as quatro estações do ano. Foram identificadas 21 espécies de FMA nas amostras, cuja caracterização morfológica dos esporos foi realizada através do uso de microscopia óptica. Os isolados de parreirais já tinham sido multiplicados previamente. Testaram-se quatro espécies isoladas de parreirais (Acaulospora sp., Glomus clarum, Glomus etunicatum e Scutellospora heterogama) e três isoladas de pomares de pessegueiro (Gigaspora margarita, Glomus clarum e Glomus etunicatum) sobre a produção de mudas da cv. Maciel enxertada sobre as cultivares Aldrighi e Okinawa, em viveiro, em área virgem e de replantio. Os FMA foram eficientes em proporcionar incremento de desenvolvimento vegetativo em todas as fases de produção da muda, permitindo a reutilização de antigas áreas de plantio, apesar de haver variação na eficiência da simbiose conforme o fungo e a cultivar de porta-enxerto envolvidos. / The cultivation of peach trees is an activity of great economical importance in the South of Brazil, where he stands out the State of Rio Grande do Sul (RS) as greater Brazilian producer. The objectives of this work went to evaluate the effects of the systems of Conventional Production (CP) and Integrated (IP) of peach tree about the population flotation of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and the use potential isolated of these fungus originating from of peach and grapevine tree orchards of the mountain Gaucha in the production of quality seedlings and in the use of replant areas. Soil samples and roots were collected at commercial orchards handled under IP and CP in property in the municipal district of Charqueadas, São Jerônimo and Pelotas, during the four seasons. They were identified 21 species of AMF in the samples, whose morphologic characterization of the spores was accomplished through the use of optical microscopia. The isolated of parreirais had already been multiplied previously. Four isolated species of parreirais were tested (Acaulospora sp., Glomus clarum, Glomus etunicatum and Scutellospora heterogama) and three isolated of peach tree orchards (Gigaspora margarita, Glomus clarum and Glomus etunicatum) about the production of seedlings of the cv. Maciel grafted on them cultivate Aldrighi and Okinawa, in nursery, in virgin area and of replantio. FMA were efficient in providing increment of vegetative development in all of the phases of production of the seedling, allowing the reuse of old planting areas, in spite of there being variation in the efficiency of the symbiosis according to the mushroom and to cultivate of door-graft involved.

O Rio Grande do Sul é o principal produtor nacional de pêssegos. No entanto, a maioria dos produtores gaúchos não utiliza mudas certificadas. Assim, o uso de mudas certificadas e inoculadas com fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) promovem um maior desenvolvimento, além de diminuir a alelopatia. Sendo assim, o presente trabalho avaliou o comportamento de plantas pré inoculadas com diferentes espécies de FMAs, enxertadas sobre diferentes porta-enxertos e cultivadas em áreas nova e de replantio após três anos de implantação. Os experimentos realizaram-se na Estação Experimental Agronômica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (EEA-UFRGS), em Eldorado do Sul, RS, sendo que as mudas da cv. Okinawa foram inoculadas com Glomus clarum, Glomus etunicatum, Acaulospora sp., além da testemunha (sem inoculação), enquanto que a cv. Aldrighi recebeu os mesmos tratamentos mais Scutellospora heterogama. A cada estação coletaram-se raízes para avaliar os FMAs, e para avaliação do desenvolvimento vegetativo mediram-se diâmetro de tronco e pernadas, comprimento destas e produção de frutos. A colonização por FMAs foi superior a 97% em todos os tratamentos e ambos porta-enxertos desenvolvem-se satisfatoriamente em área de replantio. Ocorreu a colonização de FMAs autóctones em todos os tratamentos, e após 3 anos do plantio as plantas testemunha estão plenamente colonizadas com endomicorrizas, havendo equiparação com as plantas pré-inoculadas em viveiro e a produção foi superior para área nova em porta-enxerto “Okinawa”, na safra 2008, e semelhante para ambos os porta-enxertos e áreas em 2009. / Rio Grande do Sul is the leading producer of peaches. However, most producers do not use certified seedlings gauchos. Thus, the use of certified seedlings inoculated with mycorrhizal fungi (AMF) promote the further development, and also decrease the allelopathy. Therefore, this study evaluated the behavior from plants inoculated with different AMF species, grafted on different rootstocks and grown in new areas and replanting after three years of implantation. The experiments were carried out at the Agronomic Experimental Station of the Federal University of Rio Grande do Sul (EEA-UFRGS), in Eldorado do Sul, the seedlings of cv. Okinawa were inoculated with Glomus clarum, Glomus etunicatum, Acaulospora sp., and the control (without inoculation), while cv. Aldrighi received the same treatments more Scutellospora heterogama. At each station were collected roots for assessing the AMF, and assessment of vegetative growth were measured diameter of the trunk and limbs, these length and fruit production. Colonization by AMF was higher than 97% in all treatments and both rootstocks developed satisfactorily in the area for replanting. There was the colonization of indigenous AMF in all treatments, and after three years of planting the plants are fully colonized with witness endomycorrhizae occurring assimilation with plants pre-inoculated in the nursery and production was higher for the new area on the rootstock 'Okinawa', in the 2008 crop, and similar for both rootstocks and areas in 2009.

Espécies de Trichoderma são bastante estudadas atualmente para o controle biológico de fitopatógenos habitantes do solo e para a promoção de crescimento de plantas. Entretanto, cada vez mais se busca conhecer o comportamento deste antagonista em diferentes ambientes e os possíveis mecanismos envolvidos na sua interação com as plantas e os fitopatógenos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento de isolados de Trichoderma spp. em ambiente alagado, cultivado com diferentes cultivares de arroz e os possíveis mecanismos que podem estar envolvidos nesta interação. Em todo o trabalho foram utilizados seis isolados de Trichoderma spp. e sete cultivares de arroz. Foram analisadas a sobrevivência em solo sob inundação, emergência, massa seca e altura de plantas de diferentes cultivares de arroz, além da produção de protease, AIA e sideróforos. Verificou-se que os isolados de Trichoderma spp. testados sobreviveram em solo sob inundação e ainda aumentaram a sua população nestas condições. Os isolados THAR e TSP2 proporcionaram efeito negativo na emergência das plantas das cultivares 416 e 418. Quanto à altura somente o isolado TSP2 foi superior a testemunha na cultivar 421. Entretanto, houve diferença significativa entre os isolados nas cultivares 418 e 420. Na variável peso seco houve diferença entre os isolados, mas nenhum foi superior a testemunha na cultivar 416. Na comparação das cultivares quando tratadas com o mesmo isolado, observou-se que na emergência de plantas, houve diferença na testemunha e no isolado TSP2. Para altura de plantas houve diferença das cultivares dentro dos tratamentos e também na testemunha. Para peso seco somente houve diferença na testemunha. Todos os isolados produziram sideróforos, com a mesma intensidade de cor. Quanto à produção de AIA, três dos cinco isolados testados produziram este composto, com destaque para o isolado TARV. Todos os isolados testados produziram proteases, porém houve diferença entre isolados no diâmetro da colônia. Conclui-se que Trichoderma spp. é capaz de sobreviver em solo sob inundação e também apresenta um comportamento diferenciado com cultivares de arroz. Além disto, os isolados testados produzem compostos que podem estar envolvidos nos mecanismos de controle de fitopatógenos e promoção de crescimento de plantas de arroz. / Trichoderma spp. are extensively studied for the biological control of soil borne plant pathogens and to promote growth of plants. However, it is necessary to keep studying the behavior of the antagonist in different environments and the possible mechanisms involved in its interaction with plants and plant pathogens. The purpose of this study was to evaluate the survival ability of isolates of Trichoderma spp. in an flooded environment with different rice varieties and the possible mechanisms that acting in this interaction. Six Trichoderma spp. isolates and seven rice cultivars were used in this experiments. The survival in paddy soil, plant emergency, dry weight and height of different rice cultivars of rice in addition to the production of protease, IIA and siderophores by the strains were evaluated. We observed that the isolates of Trichoderma spp. tested survived in paddy soil and also increased the population in these conditions. The isolates THAR and TSP2 caused negative effect on the emergence of the plants of cultivars 416 and 418. As for the height alone the isolate TSP2 was higher than control in cultivar 421. However, there was a significant difference between the isolates in the cultivars 418 and 420. In variable dry weight there was difference only between isolates, but none was higher than the control in cultivar 416. In the comparison of cultivars when treated with the same isolate, it was observed that in emergence of plants there was a difference in the control and in isolate TSP2. For height of plants there was a difference of cultivars within the treatments and also in control. For dry weight only difference was alone in control. All isolates produced siderophores, with the same intensity of color. As for the production of IIA, three of the five isolates tested produced this compound, with an emphasis on the isolate TARV. All isolates produced proteases, but there was difference between isolates in colony diameter. So it appears that Trichoderma spp. is able to survive in paddy soil and also presents a different behavior with cultivars of rice. In addition, it isolates the producing compounds that may be involved in the mechanisms of control of plant pathogens and promote growth of rice plants.