Pour lutter contre les nuisibles des cultures (herbivores et pathogènes), de nouvelles voies ont été explorées et en particulier la lutte biologique. Utilisé la nature et ses organismes pour réguler les populations de pathogènes, tel est le but de la lutte biologique aussi appelé biocontrôle. Parmi les organismes couramment retrouvés dans le biocontrôle se trouve les micro-organismes, que cela soit des champignons ou des bactéries. Ces micro-organismes possèdent des capacités très intéressante pour des agriculteurs et agronomes. En effet, des études ont montré qu’ils étaient capables d’interagir avec les plantes pour permettre une meilleure croissance et santé de celle-ci. Alors, dans cette thèse, nous nous sommes intéressés aux bactéries pour trouver des méthodes de luttes alternatives à Fusarium graminearum, un pathogène des céréales responsables de fortes pertes de rendements, en particulier grâce à la production de mycotoxines qui va rendre les grains impropres à la consommation humaine et animales. Par l’intermédiaire d’une approche original consistant à garder des souches non-inhibitrice in vitro pour des tests in planta, nous avons pu montrer les limites de la sélection in vitro. Grâce à l’exploration métaboliques d’une souche particulièrement efficace, nous avons aussi pu mettre en évidence de potentiels nouvelles molécules antifongiques. Par l’intermédiaire d’une souche modèle, nous avons explorer les mécanismes de la mise en place d’une résistance systémique chez le blé induite par les bactéries. Et enfin, nous avons exploré le potentiel des combinaisons de bactéries dans la protection du blé qui semble représenter un vrai futur dans le monde du biocontrôle. Les travaux effectués s’inscrivent dans les besoins de nouvelles ressources pour limiter l’utilisation des pesticides, mais aussi dans un besoin de mieux comprendre les interactions tripartite entre blé, pathogène et bactéries bénéfiques / To combat pests of crops (herbivores and pathogens) new pathways have been explored, in particular biological control. Used the nature and its organisms to regulate the populations of pathogens, that is the goal of the biological fight also called biocontrol. Among the organisms commonly found in biocontrol are micro-organisms, be they fungi or bacteria. These microorganisms have very interesting capabilities for farmers and agronomists. Indeed, studies have shown that they are able to interact with plants to allow a better growth and health of it.Then, in this thesis, we were interested in bacteria to find alternative methods of struggle with Fusarium graminearum, a pathogen of cereals responsible for high yield losses, especially thanks to the production of mycotoxins that will make the seeds unfit for human and animal consumption.Through an original approach of keeping noninhibitory strains in vitro for in planta tests, we have been able to show the limitations of in vitro selection. Thanks to the metabolic exploration of a particularly efficient strain, we have also been able to highlight potential new antifungal molecules. Through a model strain, we explored the mechanisms of the establishment of systemic resistance in wheat induced by bacteria. And finally, we have explored the potential of bacterial combinations in wheat protection that seems to represent a real future in the world of biocontrol.The work done is in line with the needs of new resources to limit the use of pesticides, but also in a need to better understand the tripartite interactions between wheat, pathogen and beneficial bacteria

Submitted by CASSIANO FORNER null (forner@wln.com.br) on 2016-04-05T01:11:21Z No. of bitstreams: 1 Forner_2016.pdf: 1210475 bytes, checksum: 3679481a5b70ba553b219d69908042c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-08T14:48:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 forner_c_dr_bot.pdf: 1210475 bytes, checksum: 3679481a5b70ba553b219d69908042c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-08T14:48:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 forner_c_dr_bot.pdf: 1210475 bytes, checksum: 3679481a5b70ba553b219d69908042c0 (MD5) Previous issue date: 2016-01-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os resíduos orgânicos e agentes de biocontrole podem constituir em alternativas no controle dos fitopatógenos habitantes do solo. O trabalho teve por objetivo estudar o controle de Fusarium spp. com resíduos orgânicos e agentes de biocontrole. Inicialmente foi avaliado o efeito de hidrolisado e emulsão de peixe, nas concentrações de 0, 10, 20, 30, 40 e 50% do volume de água para atingir a capacidade de campo do solo; e de alga, casca de camarão, concha de marisco e caroço de abacate moídos, nas concentrações de 0, 1, 2, 3, 4 e 5% v/v, na germinação de microconídios de Fusarium oxysporum f. sp. lactucae, em casa de vegetação. Enquanto a emulsão e o hidrolisado de peixe reduziram a germinação de microconídios do patógeno, os demais resíduos não apresentaram efeito. Também foi avaliado o efeito de resíduos de alga, concha de marisco, casca de caranguejo e repolho triturado fresco, nas concentrações de 0, 1, 2 e 4% v/v, sobre a germinação de microconídios de Fusarium circinatum em condições controladas, e associado ou não, a Trichoderma harzianum, no controle da fusariose (F. circinatum) em plantas de Pinus radiata mantidas em casa de vegetação. Nenhum resíduo reduziu a germinação de microconídios de F. circinatum ou a doença em casa de vegetação. No terceiro estudo foi avaliado o efeito de hidrolisado de peixe nas concentrações de 0, 5, 10, 15 e 20% do volume de água necessário para atingir a capacidade de campo, a partir do solo seco, associados ou não a T. harzianum (Iblf 006) e Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis no controle de F. oxysporum f. sp. lycopersici (raça 3) em tomateiro, em casa de vegetação. O hidrolisado de peixe e os agentes de biocontrole não controlaram a doença. / The organic residues and biocontrol agent might be alternative in the control of soilborne plant pathogens. This work aimed to study the control of Fusarium species with organic residues and biocontrol agents. First, the effect of fish hydrolyzed and fish emulsion was evaluated, at concentrations of 0, 10, 20, 30, 40 and 50% of volume of water required to reach the water retention capacity of the soil; and the seaweed, shrimp shells, clamshell and grounded avocado seeds at concentration of 0, 1, 2, 3, 4 and 5% v/v in the microconidia germination of Fusarium oxysporum f. sp. lactucae in greenhouse. Fish emulsion and fish hydrolyzed reduced the microconidia germination and none of the other residues presented effect. Also, it was evaluated the effect of seaweed, clamshell, crab shell and fresh triturated cabbage, at concentrations of 0, 1, 2 and 4% v/v, in the germination of Fusarium circinatum microconidia under controlled conditions and associated or not with Trichoderma harzianum in Pinus radiata to control the disease caused by F. circinatum in greenhouse. Neither residue reduced the F. circinatum microconidia germination or the disease in greenhouse. In the third study the effect of fish hydrolyzed was evaluated at concentration of 0, 5, 10, 15 and 20% of volume of water to required to reach the water retention capacity of the soil, from dry soil, associated or not with T. harzianum (Iblf 006) and Bacillus subtilis + Bacillus licheniformis in the control of F. oxysporum f. sp. lycopersici (race 3) in tomato plants in the greenhouse. Neither residue or biocontrol agents controlled the disease. / CNPq: 140309/2012-8 / CAPES: 99999.005706/2014-09

La lutte biologique par utilisation de micro-organismes a indéniablement un potentiel de développement considérable. Dans un contexte multidisciplinaire et fondamental de physio-phytopathologie moléculaire et répondant à d’éminents enjeux appliqués et attendus par les acteurs de la profession oléicole et les consommateurs, nous nous sommes projetés dans l’étude des propriétés intrinsèques d’un agent de biocontrôle fongique, Trichoderma harzianum (souche Ths97) contre l’agent de la fusariose Fusarium solani (souche Fso14), qui sévit sévèrement sur une culture pérenne majeure pour la Tunisie, l’oléiculture. Deux axes de recherche ont été menés. Dans le premier axe, nous avons démontré que Ths97 est un agent de biocontrôle efficace contre la virulence de F. solani Fso14. Cette capacité s’accompagne d’une accumulation des défenses chez le partenaire végétal, des accumulations qui sont d’autant plus fortes quand l’agent bénéfique est en présence du pathogène (événements de priming). De même, des tests in vitro montrent que Ths97développe des activités mycoparasites envers F. solani Fso14, en émettant des structures d’infection classiques tels des enroulements et accolements d’hyphes, des appressoria et des papilles. Quant au second axe d’étude, nous avons étudié la superfamille des perméases Major Intrinsic Proteins (MIP) dans le genre Trichoderma. Cette famille multigénique n’a jamais été étudiée chez un agent fongique hyperparasite. Sept membres MIP sont présents chez T. harzianum, et se classent en 3 sous-groupes, les AQP, les AQGP et les XIP. La modélisation des structures tridimensionnelles et les fonctions putatives de transport pour l’eau et quelques polyols ont été étudiées. Enfin, leurs patrons transcriptionnels ont été suivis chez Ths97 in planta en situation d’antagonisme et in vitro en situation de parasitisme vis-à-vis de Fso14, et montrent que 4 MIP sont exprimées et régulées différentiellement selon que Ths97 est au contact de Fso14 ou pas. Nos travaux ont donc mis en lumière que Ths97 doit être considéré comme un agent biofongicide et biostimulateur de défenses végétales, puis que les MIP seraient impliqués dans les relations trophiques que met en place T. harzianum avec son environnement. Ces données devraient intégrer le développement de procédés plus efficaces et/ou plus durables pour la protection des cultures d’oliviers en Tunisie ainsi qu’à travers le monde. / Biological disease control through the use of microorganisms has a great potential for future use in integrated pest management. In a multidisciplinary and fundamental context of molecular physio-phytopathology and to provide solutions for the actors in the olive profession and the consumers, we have been studying the activity of a fungal biocontrol agent, Trichoderma harzianum (strain Ths97) against the olive tree pathogen Fusarium solani (strain Fso14), which causes major problems for olive production in Tunisia and elsewhere. The project consists of two parts. In the first part, we have demonstrated that Ths97 is a biocontrol agent effective against the F. solani Fso14 pathogen. Induction of plant defence responses by Ths97 was shown to be partly responsible for the biocontrol effect. In vitro tests further showed that Ths97 develops mycoparasitic activities towards F. solani Fso14, by forming infection structures such as hyphae windings and wedges, appressoria and papillae. In the second part of the study, we investigated the Major Intrinsic Proteins (MIP) superfamily in the Trichoderma genus. This multigenic family has never been investigated in a hyperparasitic fungal species. Seven MIP members are present in T. harzianum, and are classified into 3 subgroups: AQP, AQGP and XIP. Their three-dimensional structures and their putative involvement in transport of water and certain polyols have been examined. Finally, their transcription profiles were monitored in Ths97 in planta in antagonistic situations and in vitro in a parasitic situation with Fso14 and show that 4 MIP are expressed and regulated differentially during the interaction. Our work has shown that Ths97 must be considered as a biological control agent and biostimulator of plant defences, and that MIPs are involved in the trophic relationships between T. harzianum and the environment. These data contributes to the further development of T. harzianum as an efficient biocontrol agent for sustainable protection of olive trees in Tunisia and around the world.

Trichoderma spp. is at the present time, one of the fungi most studied as biocontrol agent, being antagonistic to several pathogens in different crops, besides promoting vegetable growth. The pathogen Fusarium oxysporum causes the fusarial wilt and is difficult to control mainly because of its capacity to remain in the soil for long periods, even without the presence of the host. Studies of the population dynamics of Trichoderma spp., Fusarium spp. and native microorganisms are necessary, mainly to observe the impact of the biocontrol agent addition to the soil. Vegetables as cucumber and tomato are commonly cultivated in South Brazil and are sensitive to a variety of diseases, as the fusarial wilt which is one of, their main diseases, specially in protected environment. For the biological control of the fusarial wilt in the cultivation of tomato and cucumber by Trichoderma and to study the population dynamics of the biocontrol agent when added to the soil, the following objectives were proposed: to study the space distribution of both Trichoderma and Fusarium in rhizosphere and bulk soil, in the cultivation of cucumber and tomato, in vegetable garden and greenhouse; to find a method for the mass selection of fungi isolates antagonistic to Fusarium solani and Fusarium oxysporum in microenvironment, and to identify the more effective ones; to verify the action of Trichoderma harzianum isolates in the development and protection of seedlings against the fusarial wilt of tomato and cucumer, identifying the best form of the biocontrol agent application in the control of the fusarial wilt; to analyze the population dynamics of Trichoderma and Fusarium, and of part of the microorganisms of the soil, with the addition of the biocontrol agents, in the cultivation of the tomato and cucumber, in greenhouse and vegetable garden. Both Trichoderma and Fusarium were found in the rhizosphere and bulk soil and the rhizosphere soil had the greater frequence of Trichoderma specially in greenhouse. The method of mass selection, in substrat, of fungi isolates antagonistic to the pathogens F. solani and F. oxysporum was efficient, since the three isolates of Trichoderma harzianum selected, besides reducing the population of the pathogens in substrate were also effective against the fusarial wilt of tomato and cucumber when applied as seed or substrate treatment. A population flutuation of Trichoderma spp. ocurred when isolates of T. harzianum were added to the soil in the cultivation of tomato and cucumber, in vegetable garden and greenhouse. There was a tendency of the population of Trichoderma spp. to return to the initial parameters, i.e. before the biocontrole agent was added to the soil. The population of bacteria, Fusarium spp. and general fungi did not show great alterations with the presence of the isolates of the biocontrol agent. / Trichoderma spp. é um dos fungos mais pesquisados na atualidade como agente de biocontrole, sendo antagonista a vários fitopatógenos em diferentes culturas, além de auxiliar no desenvolvimento vegetal. O patógeno Fusarium oxysporum causador da murcha de fusário ou fusariose é difícil de ser controlado, principalmente pela sua capacidade em manter-se no solo por longos períodos, mesmo sem a presença do hospedeiro. Estudos da dinâmica populacional de Trichoderma spp., Fusarium spp. e microbiota nativa são necessários, principalmente para observar-se o impacto da adição do agente de biocontrole no ambiente solo. Olerícolas, como pepineiro e tomateiro, são comumente cultivadas na Região Sul, porém são sensíveis a uma gama de doenças, dentre as quais, a fusariose, que figura como principal doença, principalmente em ambiente protegido. Para buscar o controle biológico da fusariose no cultivo do tomateiro e pepineiro por Trichoderma e estudar a dinâmica populacional desse agente de biocontrole quando adicionado ao solo, foram propostos os seguintes objetivos: estudar a distribuição espacial dos gêneros Trichoderma e Fusarium em solo rizosférico e não rizosférico, no cultivo do pepineiro e tomateiro, em horta e estufa; utilizar micro-ambiente para realizar a seleção massal de isolados fúngicos antagônicos a Fusarium solani e Fusarium oxysporum e identificar, em nível de espécie, os isolados fúngicos mais efetivos; verificar a ação de isolados de Trichoderma harzianum no desenvolvimento e na proteção de mudas contra a murcha de fusário do tomateiro e do pepineiro, identificando a melhor forma de aplicação do agente de biocontrole no controle da fusariose; analisar a dinâmica populacional dos gêneros Trichoderma e Fusarium e de parte da microbiota do solo, com a adição de agente de biocontrole, no cultivo do tomateiro e pepineiro, em estufa e horta. Tanto Trichoderma quanto Fusarium foram encontrados em solo rizosférico e não rizosférico de horta e estufa, sendo que Trichoderma foi encontrado em maior número de coletas em solo rizosférico de estufa. O método de seleção massal, em substrato, de isolados fúngicos antagônicos aos patógenos F. solani e F. oxysporum foi eficiente, pois os três isolados de Trichoderma harzianum selecionados, além de reduzirem a população dos patógenos em substrato, foram efetivos contra a fusariose do tomateiro e pepineiro, em tratamento de semente ou de substrato. Ocorreu flutuação populacional de Trichoderma spp. quando isolados de T. harzianum foram adicionados ao solo no cultivo do tomateiro e pepineiro, em horta e estufa. Observou-se uma tendência da população de Trichoderma spp. voltar aos parâmetros iniciais, ou seja, antes do agente de biocontrole ser adicionado ao ambiente solo. A população de bactérias, Fusarium spp. e fungos gerais não apresentou grandes alterações pela presença dos isolados do agente de biocontrole.

O presente trabalho teve como objetivos avaliar a micobiota e a ocorrência de micotoxinas em grãos de milho provenientes de quatro regiões do Brasil; identificar os isolados de A. flavus pela técnica de AFLP (Amplified Fragment Length Plymorphism) e de Fusarium verticillioides, utilizando as técnicas de AFLP e sequenciamento parcial do gene do fator de elongação 1-α comparar o potencial toxigênico das cepas com a expressão dos genes aflR e aflP (A. flavus) e FUM1 e FUM19 (F. verticillioides), através da técnica de real time RT-PCR. Demonstrou-se prevalência de Fusarium verticillioides e de fumonisinas nos grãos. Do total de isolados, 96 % foram identificados como F. verticillioides. A similaridade dos isolados de A. flavus com a cepa padrão variou de 79 % a 100 %, e não foi observado agrupamento origem geográfica específico entre os isolados de A. flavus e F. verticillioides. Observou-se elevada correlação positiva entre a expressão de FUM1 e FUM19 e a produção de toxinas por F. verticillioides, e baixa correlação positiva entre os transcritos de aflR e aflP em relação ao perfil de produção de aflatoxinas por A. flavus, demonstrando necessidade de estudos referentes a expressão de genes relacionados à produção de micotoxinas. / The present study aimed to verify the mycoflora and occurrence of mycotoxins in freshly harvested corn samples in four regions of Brazil; to identify Aspergillus flavus strains by AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) technique and Fusarium verticillioides by AFLP and by the translation elongation factor 1-&#945 partial gene sequencing (TEF-1-&#945); to compare the toxigenic potential of the strains in relation to aflR and aflP gene expression (A. flavus) and FUM1 and FUM19 (F. verticillioides), using Real Time RT-PCR technique. Our data showed predominance of F. verticillioides and fumonisins in the corn samples. Of the total strains, 96 % were identified as F. verticillioides. The similarity of A. flavus isolates with the standard strain ranged from 79 % to 100 %, and the results of AFLP, demonstrated a lack of relationship between the groups of the phylogenetic tree and the different geographic origins, for both A. flavus and F. verticillioides. A high positive correlation was observed between the expression of FUM1 and FUM19 genes and fumonisin production, and a low positive correlation was observed between the expression of aflR and aflP genes and aflatoxin production. These data demonstrate the need for studies concerning gene expression related to mycotoxins production.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:44:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGPV07MA023.pdf: 3345243 bytes, checksum: 4a8cf32319e030bf77cdd4320f251d27 (MD5) Previous issue date: 2007-06-22 / The fungi Fusarium graminearum (teleomorph Gibberella zeae) is the etiological agent of scab wheat, one of the most important cereal s winter diseases in Brazil. Outbreaks are generally sporadic but in the last few years is frequently reported an increase in disease intensity in almost all the wheat producing areas around the world. Some studies demonstrate a high genetic diversity in F. graminearum from different geographic areas, as well as in isolates at the same locality. In filamentous fungi, as the F. graminearum, one of the main mutation s causes is the transposable elements or transposons which are capable to generate different types of mutations. In some cases, these mutations are involved with the resistance break, an important phenomenon for the occurrence of epidemics. The objectives of this study were to detect putative transposable elements sequences in the F. graminearum genome, as well as to develop and to analyze adequate procedures for co-transformation of brazilin isolates of this fungi with the vectors pNI160, which carry the transposon impala and pAN7.1, which code to hygromycin B resistance. To detect putative sequences of transposable elements in the F. graminearum genome, specifics oligonucleotides were constructed and 14 isolates, originated from the States of Rio Grande do Sul, Paraná and São Paulo were used. A total of 10 oligonucleotides pairs were constructed (6 oligonucleotides pairs were specific to transposase, 3 to transcriptase reverse and 1 to gene that code for GAG protein). Considering these 10 oligonucleotides pairs, the one that would amplify a transcriptase reverse region similar to a Magnaporthe grisea reverse transcriptase did not amplify any fragment in the isolates total DNA, and the pair that would amplify a transposase region similar to Metarhizium anisopliae originated many fragments of different sizes that do not show relation with 683 bp expected size fragment. Considering the eight oligonucleotides pairs remained, five of them amplified the expected fragments for transposase (715 bp region similar to F. oxysporum f. sp. ciceris transposase, 306 bp similar to Aspergillus awamori transposase, 556 bp similar to A. niger tansposase, 339 bp similar to Arabdopsis thaliana transposase and 554 bp similar to Cochliobolus carbonum transposase), two of them amplified the transcriptase reverse fragments (161 bp similar to A. thaliana reverse transcriptase and the 752 bp similar to Caenorhabditis elegans reverse transcriptase) and one oligonucleotide pair amplified an 581 bp expected size fragment similar to F. oxysporum gag gene. The amplification occurred, even for different oligonucleotides pairs, in all 14 analyzed isolates confirming the presence of transposable elements putative sequences in Brazilian isolates of F. graminearum. This also shows a diversity of groups of these putative elements, considering that some of the sequence amplified is characteristic of a transposable element specific group. To develop the genic inactivation protocol, we select the isolates F02 and F12 which are pathogenic for BR18-Terena cultivar. To evaluate the better medium for selection of chlorate resistant mutants, it was analyzed two different medium. This analysis showed that medium describe by Cove (1979) is more indicate for selected the chlorate resistant mutants. A total of 15 9 chorate resistant mutants were obtained, being five identified as nitrate reductase mutants (niaD), eight specific regulator mutants (nirA) and two permease mutants. Differences related to the number of mutants obtained and number inoculated plates, number of nitrate reductase mutants and macroconides production indicate that the choice of the isolate can influence the isolation of mutants and in protoplast production. Analysis with different hygromycin B concentrations revealed that doses up to 30 μg.mL-1 were enough to control the fungal growth. Two nitrate reductase mutants (M01 and M194) were select to protoplastization and co-transformation, once these two mutants in relation to others produce lower concentration of residual mycelium. Only one transformant were obtained and it was denominated T3, what shows that the transformation protocol needs to be modified to increase the number of transformants. If hybridization experiments confirm the transformation of T3 with only one copy of the impala element, it will be confirmed the transposition ability of impala in F. graminearum, and it will be useful in genetic inactivation studies, especially to genes involved in pathogenicity process / O fungo Fusarium graminearum (teleomorfo Gibberella zeae) é o agente etiológico da giberela do trigo, atualmente uma das principais doenças de inverno no Brasil. Epidemias ocorrem esporadicamente, embora nos últimos anos, registraram-se incrementos na intensidade da doença em quase todas as áreas produtoras de trigo no mundo. Vários estudos demonstram uma grande diversidade genética em isolados de F. graminearum de diferentes áreas geográficas, como também em isolados de uma mesma localidade. Em fungos filamentosos como o F. graminearum, uma das principais fontes de mutações capaz de gerar alta variabilidade genética são os elementos transponíveis ou transposons. Essas mutações algumas vezes estão envolvidas com a quebra de resistência, fenômeno importante para o surgimento de epidemias. Os objetivos deste trabalho foram de detectar putativas seqüências de elementos transponíveis no genoma deste fungo, bem como, desenvolver e analisar procedimentos e métodos adequados para a co-transformação de isolados brasileiros deste fungo com o plasmídio pNI160, o qual carrega o transposon impala, e o plasmídio pAN7.1, no qual esta inserido o gene de resistência a higromicina B. Para detectar putativas seqüências de elementos transponíveis no genoma deste patógeno foram construídos oligonucleotídeos específicos para amplificação, via PCR de seqüências características destes elementos transponíveis. Foram utilizados 14 isolados de F. graminearum, provenientes dos Estados do Rio Grande do Sul, Paraná e São Paulo e um total de 10 pares de oligonucleotídeos foram construídos (6 pares para genes que codificam a enzima transposase, 3 pares para genes que codificam a enzima transcriptase reversa e 1 par um gene que codifica a proteína GAG). Dos 10 pares de oligonucleotídeos utilizados, o par que amplificaria uma região de transcriptase reversa similar ao mesmo gene de Magnaporthe grisea não amplificou nenhum fragmento nos isolados utilizados, e o par que amplificaria uma região de transposase similar ao mesmo gene de Metarhizium anisopliae originou muitos fragmentos de diferentes tamanhos não condizentes com o tamanho esperado de 683 pb. Dos oito pares de oligonucleotídeos restantes, cinco amplificaram as regiões esperadas para a transposase (regiões de 715 pb similar a uma transposase de F. oxysporum f. sp. ciceris, 306 pb similar a uma transposase de Aspergillus awamori, 556 pb similar a uma transposase de A. niger, 339 pb similar a uma transposase de Arabidopsis thaliana e 554 pb similar a uma transposase de Cochliobolus carbonum), dois amplificaram as regiões de transcriptase reversa (regiões de 161 pb similar a uma transcriptase reversa de A. thaliana e 752 pb similar a uma transcriptase reversa de Caenorhabditis elegans) e um amplificou um fragmento de tamanho esperado de 581 pb similar ao gene gag de F. oxysporum. A amplificação ocorreu, mesmo que para diferentes pares de oligonucleotídeos, em todos os 14 isolados analisados, confirmando a presença de seqüências putativas de elementos transponíveis em isolados de F. graminearum provenientes de diferentes regiões do Brasil, além de demonstrar uma diversidade de classes de putativos elementos, uma vez que cada seqüência é característica de um determinado grupo de elementos transponíveis. Para o desenvolvimento do protocolo de inativação gênica foram 7 selecionados os solados F02 e F12 patogênicos a cultivar BR18-Terena. Um teste para avaliação do meio de cultura para seleção dos mutantes resistentes ao clorato demonstrou que o meio descrito por Cove (1979) é o mais indicado para os isolados selecionados. Um total de 15 isolados mutantes resistentes ao clorato foi obtido, dos quais 5 foram identificados como mutantes para o gene nitrato redutase (niaD), 8 mutantes para um regulador específico (nirA) e 2 mutantes para permease. Diferenças quanto ao número de mutantes selecionados pelo número de placas inoculadas, número de mutantes nitrato redutase e produção de esporos assexuais, indicam que a escolha do isolado pode influenciar na obtenção de mutantes e na produção de protoplastos. Testes com diferentes concentrações de higromicina revelaram que doses acima de 30 μg. mL-1 são suficientes para o controle do crescimento do fungo. Dois mutantes nitrato redutase (M01 e M194) foram selecionados para a protoplastização e cotransformação, com base na menor produção de micélio residual em relação aos demais. Apenas um transformante foi obtido sendo denominado T3, mostrando a viabilidade do protocolo, mas também, que mais estudos devem ser realizados para se aumentar o número de transformantes. Se confirmada, através de hibridização, a transformação de T3 com uma única cópia do elemento impala, este poderá além de confirmar a capacidade de transposição deste elemento em F. graminearum, também servir em estudos de expressão gênica, principalmente àqueles genes envolvidos no processo de patogenicidade

Orientador: Carlos Frederico Wilcken / Banca: Everton Pires Soliman / Banca: Antonio Batista Filho / Resumo: O percevejo bronzeado Thaumastocoris peregrinus Carpintero & Dellapé, 2006 (Hemiptera: Thaumastocoridae), praga exótica de Eucalyptus spp., foi relatado em 2008 no Brasil e está distribuído em vários estados brasileiros. Os danos causados, por esse inseto, são o prateamento, evoluindo para o bronzeamento das folhas e, em altas infestações, pode ocorrer desfolha. A alternativa de controle de T. peregrinus é o parasitoide de ovos Cleruchoides noackae Lin & Huber, 2007 (Hymenoptera: Mymaridae) e fungos entomopatogênicos. Esses microrganismos apresentam vantagens como infecção por via oral, traqueal ou tegumento, variabilidade genética e permanência no ambiente. Os objetivos desta dissertação foram: identificar e caracterizar fungos entomopatogênicos coletados em epizootias em campo, realizar testes de patogenicidade; identificação molecular dos fungos isolados a partir do sequenciamento de três regiões do genoma (ITS-5.8S rDNA, β-Tubulina, α-elongase); realizar caracterizações culturais e morfológicas dos isolados obtidos; acompanhar a colonização (externamente) dos fungos isolados quando inoculados no percevejo bronzeado (tempos pré-determinados: 24, 48, 72 e 96 horas após a inoculação), através de técnica de microscopia de varredura e microscopia óptica de luz; verificar a sensibilidade in vitro aos fungicidas usados comumente utilizados em plantios de Eucalyptus e analisar a fitopatogenicidade dos isolados a diferentes culturas de tomateiro, cana de açúcar e mudas clonais de Eucalyptus spp. com importância econômica. As espécies obtidas na identificação molecular foram: Fusarium proliferatum, Fusarium tricinctum e Fusarium equiseti. O teste de patogenicidade comprovou que os isolados podem matar o percevejo bronzeado, sendo F. proliferatum (ISO-DPV-LCBPF004) e F. equiseti (ISO-DPV-LCBPF009) os mais virulentos e, portanto, escolhidos para os demais experimentos. / Abstract: The bronze bug Thaumastocoris peregrinus Carpintero & Dellapé, 2006 (Hemiptera: Thaumastocoridae), invasive pest of Eucalyptus spp. (Myrtaceae) was reported in 2008 in Brazil. The symptoms caused by this pest are leaf silvering, leaf bronzing and defoliation in susceptible Eucalyptus species or clones. The main control strategies for T. peregrinus involve biological control with an egg parasitoid Cleruchoides noackae Lin & Huber, 2007 (Hymenoptera: Mymaridae), introduced from Australia and entomopathogenic fungi. These microorganisms show advantages such as via oral, traqueal or tegument infection, great genetic variability and remaining in the environment. The objective of this study were: identifying and characterizing entomopathogenic fungi collected from field epiziooties; running pathogenicity tests; molecular identification of fungi from sequencing of three regions in the genome (ITS-5.8S rDNA, β-Tubuline, α-elongase); cultural and morphological characterization of the isolates obtained; following up the colonization (externally) of fungi isolates when inoculated on the bronze bug with scanning and optical microscopy; verifying in vitro sensibility to fungicides normally used in eucalyptus plantations; analysing the phytopathogenicity of isolates to diferent plant species (tomato, sugarcane and Eucalyptus). The species obtained by molecular identification were: Fusarium proliferatum, F. tricinctum and F. equiseti. Pathogenicity test has proved that the isolates are letal to the bronze bug, being F. proliferatum (ISO-DPV-LCBPF004) e F. equiseti (ISO-DPV-LCBPF009) the most virulent ones and therefore selected for the other experiments. Fungicides Azoxystrobin + Cyproconazol (Priori Xtra®), Trifloxystrobin + Tebuconazole (Nativo®) and Pyraclostrobin (Comet®) were tested to verify sensibility. Isolates ISO-DPV-LCBPF004 e ISO-DPV-LCBPF009 of Fusarium spp. showed greater... / Mestre

A incidência de ceratite infecciosa relacionada a lentes de contato ocasionada por espécies de Acanthamoeba e Fusarium tem aumentado nos últimos anos. Esses organimos compartilham vários ambientes e casos de coinfecção foram relatados. Interações entre amebas e outros micro-organismos podem resultar em mudanças significativas para ambos, como o aumento da virulência em hospedeiros mamíferos. Neste estudo, foi avaliada a interação das cepas Neff, T4 e T4 pulmão de Acanthamoeba castellanii com Fusarium solani, bem como as possíveis implicações no desenvolvimento de ceratite. A. castellanii foi capaz de fagocitar F. solani e os conídios foram capazes de germinar dentro da ameba. A cocultura com ameba viva, bem como o sobrenadante da cultura e o lisado amebiano aumentaram significativamente o crescimento do fungo. Além disso, F. solani vivo e o seu sobrenadante de cultura aumentaram a sobrevivência da ameba, mas de forma diferente em cada cepa amebiana. A presença do fungo resultou em aumento de encistamento das cepas amebianas T4 pulmão e T4, bem como aumentou a resistência da cepa Neff à clorexidina. Curiosamente, a passagem pela ameba aumentou o efeito citopático de F. solani em células de mamíferos. Esses resultados mostram que A. castellanii e F. solani têm uma relação de protocooperação, com benefícios para ambos, e especialmente, indicam um possível efeito sobre as características de virulência de ambos os organismos. Assim a interação entre A. castellanii e F. solani pode resultar em impactos graves nos casos de ceratite. / The incidence of Acanthamoeba and Fusarium species has increased in contact lens-related infectious keratitis. They share several environments and cases of co-infection have been reported. The interaction between the amoeba and other microorganisms may result in significant changes for both, like increased virulence in mammalian hosts. In this study, we evaluated the interaction of Neff, T4 and T4 lung strains of Acanthamoeba castellanii with Fusarium solani and the implications in keratitis. A. castellanii phagocyted the fungi, and conidia were able to germinate inside the amoeba. The co-culture with live amoeba as well as the amebic culture supernatant and lysate significantly increased fungal growth. Moreover, live F. solani and the its culture supernatant enhanced the survival of amoeba, but differently in each A. castellanii strain. The presence of fungi resulted in increased amoebal encystment of T4 and T4 lung strains, end increased the resistence of Neff strain to chlorhexidine. The encystment of T4 and T4 lung strains was increased by the fungi. Interestingly, the passage by Neff amoeba increased the cytophatic effect of F. solani on mammalian cells linage. These results show that A. castellanii and F. solani have a protocooperation relationship, with benefits for both, and especially indicate a possible effect on virulence characteristics of both organisms. These data suggest that the A. castellanii-F. solani interaction may cause severe impacts in keratitis.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2017-07-26T14:00:45Z No. of bitstreams: 1 PDF - Nadja Gláucia de Melo Souza.pdf: 13497516 bytes, checksum: 9022b8a01973d688cc5a2d32ec30a609 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2017-08-29T15:30:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Nadja Gláucia de Melo Souza.pdf: 13497516 bytes, checksum: 9022b8a01973d688cc5a2d32ec30a609 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T15:30:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Nadja Gláucia de Melo Souza.pdf: 13497516 bytes, checksum: 9022b8a01973d688cc5a2d32ec30a609 (MD5) Previous issue date: 2017-03-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Maize seeds are susceptible to Fusarium spp., which cause rotting, damping off and corn kernel contamination by mycotoxins. Plants produce antimicrobial compounds that can be extracted and used as an alternative method in the management of diseases. The objective of this work was to obtain an alternative product, through the use of vegetal extracts associated with powders (rock powder, kaolin and ash) for the control of Fusarium spp. associated with maize seeds. For this, were evaluated the fungitoxicity of extracts of fruits of chilli pepper, eucalyptus leaves, black pepper fruits and neem leaves to Fusarium spp.; and the effect of the extracts on the germination of maize seeds. The tested plant extracts are fungitoxic to Fusarium spp. causing total inhibition of the growth of the pathogens from the concentration of 5%. The treatment of the seeds with the extracts (20%) did not cause decrease in germination, and the extract of chilli pepper promoted the germination of the seeds. The black pepper extract (10%) had fungitoxic effect to F. verticillioides (F159 and F311) in maize cv. Sertanejo. The extracts tested (10% and 20%) did not inhibit F. oxysporum (F01) in maize cv. Sertanejo. Black pepper extract + rock powder, solvent + rock powder and solvent + kaolin accelerated the germination of maize cv. Sertanejo. All formulations tested decreased the incidence of F. verticillioides F311 in maize var. Sertanejo. Extract of black pepper + rock powder and black pepper extract had a positive effect on the control of damping off caused by Fusarium spp., and ind in the seedling development. It is concluded that the alternative product formulated with black pepper extract + rock powder and the black pepper extract have potentiality to be used in the alternative control of Fusarium spp. in maize seeds. / Sementes de milho são suscetíveis a Fusarium spp., que causam o apodrecimento, tombamento das plântulas e a contaminação dos grãos por micotoxinas. Plantas produzem compostos antimicrobianos que podem ser extraídos e utilizados como método alternativo no manejo de doenças. O objetivo do trabalho foi obter um produto alternativo, por meio da utilização de extratos vegetais associados a pós (pó de rocha, caulim e cinza) para o controle de Fusarium spp. associados às sementes de milho. Para tanto, foi avaliada a fungitoxicidade de extratos de frutos de pimenta malagueta, folhas de eucalipto, frutos de pimenta do reino e folhas de neem a Fusarium spp.; e o efeito dos extratos na germinação de sementes de milho. Os extratos vegetais testados são fungitóxicos a Fusarium spp., causando inibição total do crescimento dos patógenos a partir da concentração de 5%. O tratamento das sementes com os extratos (20%) não causou diminuição da germinação, sendo que o extrato de pimenta malagueta promoveu a germinação das sementes. O extrato de pimenta do reino (10%) teve efeito fungitóxico a F. verticillioides (F159 e F311) em sementes de milho cv. Sertanejo. Os extratos testados (10% e 20%) não inibiram F. oxysporum (F01) nas sementes de milho cv. Sertanejo. Extrato de pimenta do reino + pó de rocha, solvente + pó de rocha e solvente + caulim aceleraram a germinação das sementes de milho cv. Sertanejo. Todas as formulações testadas diminuíram a incidência de F. verticillioides F311 nas sementes de milho var. Sertanejo. Extrato de pimenta do reino + pó de rocha e extrato de pimenta do reino tiveram efeito positivo no controle do tombamento causado por Fusarium spp.; e na promoção de desenvolvimento das plântulas. Conclui-se que o produto alternativo formulado com extrato de pimenta do reino + pó de rocha e o extrato de pimenta do reino têm potencialidade para serem utilizados no controle alternativo de Fusarium spp. em sementes de milho.

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T02:54:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fraga_LairaPriscila_M.pdf: 554432 bytes, checksum: 56119a190bf37124ca4c590d3059597c (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Cutinases são enzimas amplamente encontradas na natureza, podendo ser obtidas de fontes vegetais ou microorganismos. Trata-se de uma esterase que atua tanto como esterase quanto como lipase, capaz de hidrolisar uma ampla variedade de ésteres sintéticos e triglicerídeos. Este perfil de atividade oferece-lhe um número de aplicações importantes nas indústrias como detergentes de roupas e louças, alimentos, fármacos, agroquímicos e cosméticos. Utilizando a fermentação em estado sólido (FES) é possível a produção de uma enzima com características interessantes de catálise, com baixo custo de produção e bom rendimento, e que possa ser empregada na indústria de modo geral. Este trabalho utilizou FES para produção de cutinase por Fusarium oxysporum utilizando sub-produtos agrícolas visando à seleção dos melhores meios e indutores para produção da enzima (utilizando fontes de carbono e minerais), otimização das condições de cultivo (avaliando os parâmetros temperatura e quantidade de água do meio além do estudo do inóculo), produção de cutinases utilizando diferentes substratos (farelo de trigo, casca de soja, farelo de arroz e produzida por meio líquido) e comparação entre eles, além da aplicação das enzimas em reações de esterificação para separação enantiomérica de substâncias racêmicas como o 2-octanol e o Ibuprofeno. De um modo geral o trabalho mostrou a produção de enzima de grande interesse comercial usando substratos diferentes e seu comportamento frente a reações de esterificação. Três meios sólidos foram selecionados (farelo de trigo, casca de soja e farelo de arroz) e suas condições de cultivo otimizadas (temperatura 28ºC e quantidade de água do meio 100%). Nos testes de aplicação das cutinases, para resolução enantiomérica do 2-octanol todas as cutinases tiveram bons valores de esterificação e enantioseletividade com destaque para farelo de trigo (76,4% de esterificação após 200 horas) e casca de soja (71,9% de esterificação após 200 horas). Para resolução do fármaco racêmico Ibuprofeno as cutinases mais efetivas foram as produzidas por farelo de arroz (5,1% de conversão após 200 horas) e meio líquido (2,9% de conversão após 200 horas). Esses resultados mostraram a diferença entre o comportamento de cutinases, do mesmo microorganismo, produzidas em diferentes meios, e a grande possibilidade de utilização de cutinases para processos de interesse industrial / Abstract: Cutinases enzymes are often found in nature and may be obtained from plant sources or microorganisms. This is an enzyme that acts both as esterases and as lipases, capable of hydrolyzed a several variety of synthetic esters and triglycerides. This activity profile gives a number of important applications in industries such detergents, clothes and dishes, foods, drugs, chemicals and cosmetics. Using solid state fermentation SSF it is possible production of an enzyme interesting of catalysis with low production cost and good yields, and it can be employed in the industries. This work used SSF for the cutinase production by Fusarium oxysporum using agro-industrial sub-products to find selection of the best media and inducer to enzyme production (using sources of carbon and minerals), optimization of fermentation conditions (modifying the parameters temperature and water amount and after the inoculum study), cutinases production using different substrates (wheat bran, soy rind, rice bran and produced by liquid medium), comparison among them and enzymes application in esterification reactions to enantiomeric separation of racemic substances such 2-octanol and drug Ibuprofen. In general the work showed enzyme production of great commercial interest using various substrates and their behavior in esterification reactions. Three solid media were selected (wheat bran, soy rind, and rice bran) and their fermentation conditions optimized (temperature 28ºC and water amount 100%). In tests of cutinases application for enantiomeric resolution of 2-octanol all cutinases had good values to esterification and enantioselectivity and the best results was using wheat bran (76.4% of esterification after 200 hours) and soy rind (71.9% of esterification after 200 hours). The test using racemic drug Ibuprofen the more effective resolution was found with cutinase produced by rice bran (5.1% of esterification after 200 hours) and liquid medium (2.9% of esterification after 200 hours). These results showed the difference among behavior of cutinases using same strain, produced by different media, and the great possibility of cutinases with interesting catalysis characteristics and it can be employed in the industry / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos