Los micoplasmas son bacterias sin pared celular que pertenecen a la clase Mollicutes. Estos microorganismos se caracterizan por su pequeño tamaño y por tener un genoma reducido con un bajo porcentaje de C+G. Muchas especies de mycoplasma actúan como parásitos y patógenos de un amplio rango de huéspedes, causando enfermedades comunes en humanos. Por ejemplo, Mycoplasma genitalium, objeto de esta tesis, es el causante de la uretritis no gonocócica. La secuenciación del genoma de algunos micoplasmas ha favorecido el conocimiento de la fisiología y genética de estos microorganismos, pero algunos mecanismos como la regulación de la expresión génica y la división celular siguen siendo aún un misterio por desvelar. M. genitalium, con tan sólo 525 genes, es considerado un modelo de célula mínima. Posee el genoma más pequeño de entre todas las bacterias que se pueden cultivar axénicamente, siendo así un candidato ideal para el estudio de los procesos biológicos con el mínimo número de genes implicados. El trabajo presentado en esta tesis se divide en tres capítulos independientes. En el primero se estudia la regulación de la expresión génica en M. genitalium y M. pneumoniae. El trabajo con M. pneumoniae fue llevado a cabo durante una estancia en el laboratorio del Prof. J. Stülke (Göttingen, Alemania). Este primer trabajo dio lugar a un artículo publicado en la revista Microbiology. La obtención de un mutante por transposición de M. genitalium que deleccionaba el gen ftsZ, descrito como esencial para la división celular en la mayor parte de bacterias, derivó en el segundo capítulo de esta tesis. En este segundo trabajo se investiga la división celular en micoplasma en ausencia de este gen. Este estudio ha sido publicado recientemente en la revista Molecular Microbiology. Por último, con el objetivo de profundizar en el tema de la división celular en micoplasma, en el tercer capítulo se analiza la funcionalidad del gen mraZ, que junto con mraW, mg223 y ftsZ conforma el operón de división celular de M. genitalium. / Mycoplasmas are the smallest and simplest free-living microorganisms. They are members of the Mollicutes class which is characterized by the absence of cell wall and by having genomes with a low G+C content. Despite this apparent simplicity, some mycoplasma species are parasites and pathogens of a wide range of hosts. For instance, Mycoplasma genitalium, which is the object of this thesis, is the agent of non-gonococcal and non-chlamydial urethritis. Genome sequencing has advanced the knowledge concerning the physiology and genetics of these microorganisms, but some mechanisms such as the regulation of gene expression and the cell division remain unclear. With only 525 genes M. genitalium is considered a model of minimal cell, since it has the smallest genome of any microorganism that can be grown in a pure or axenic culture. It is considered a perfect candidate to study biological processes with the minimal set of genes. This thesis is divided into three independent chapters. In the first one we study the regulation of gene expression in M. genitalium and M. pneumoniae. This work was published in 2007 in the journal "Microbiology". A minitransposon insertion was found in the ftsZ gene of M. genitalium, indicating that this gene was not essential for cell division in this microorganism. In the second chapter of this thesis we investigate the cell division process in M. genitalium in the absence of ftsZ. This work was recently published in the journal "Molecular Microbiology". Finally, to gain insight into the cell division process in mycoplasma, in the third chapter we analyze the function of the mraZ gene, which together with mraW, mg223 and ftsZ comprise the cell division operon of M. genitalium.

El Ad es el vector más utilizado en ensayos clínicos con humanos. Para evitar la respuesta inmune celular inducida por los Ad de 1ª y 2ª generación, se han generado los vectores de 3ª generación, también llamados gutless o helper dependientes. Para producir estos vectores se necesitan tres elementos fundamentales: un Ad gutless con un gen terapéutico o marcador de interés; un Ad helper que aporte las proteínas virales necesarias in trans y; una línea celular permisiva para la producción de Ad. Los Ad gutless, al no contener ninguna región viral codificante, no generan respuesta inmune celular y tienen una capacidad de hasta 36 Kpb. Se ha demostrado que la expresión de los genes que incorporan puede durar toda la vida del organismo. Sin embargo, si bien presentan grandes ventajas, su uso en ensayos clínicos con humanos todavía no ha sido viable debido a dos grandes inconvenientes: la contaminación por Ad helper y su producción a gran escala. Para solventar el problema de la contaminación por Ad helper, en este trabajo se propone un nuevo sistema de generación de Ad gutless basado en la recombinasa ?C31-attB/attP. Los Ad helper generados llevan flanqueada su señal ? por las secuencias attB/attP. ?C31 es una recombinasa unidireccional con lo que una vez realizada su función, al escindir la señal de empaquetamiento, evita la reacción inversa. Esta característica supone una ventaja frente a otras recombinasas como Cre ó FLPe. Sorprendentemente, al incorporar la secuencia attB entre el extremo ITR del Ad y su señal de empaquetamiento, los Ad helper generados alargan su ciclo viral hasta las 56-60 horas, sin embargo, ello no afecta la replicación eficiente del genoma viral y la producción de proteínas virales. Asimismo, se ha demostrado que tanto el proceso de empaquetamiento como el de la maduración de la partícula viral están afectados. Se ha observado que la clonación de una segunda señal de empaquetamiento en el extremo 3' normaliza los niveles de producción de los Ad controles, confirmando así que el genoma no queda retenido en ninguna región nuclear. Ensayos de EMSA han mostrado que diferentes proteínas celulares se unen a la secuencia attB y probablemente la unión de una de ellas impida el correcto empaquetamiento del genoma adenoviral. Por todo ello, el empaquetamiento diferencial por tiempo de los Ad helper-attB/attP generados ha sido aprovechado para la producción de Ad gutless acotando su producción a las 36 horas (tiempo en el que un Ad control completa su ciclo viral). Sin embargo, en las producciones de Ad gutless, los niveles de contaminación por Ad helper fueron elevados y éstos aumentaban significativamente en los sucesivos pasos de amplificación. El análisis del extremo 5' del Ad helper confirmó que éste recombinaba con el Ad gutless por la señal de empaquetamiento perdiendo las secuencias de recombinación y así su capacidad de empaquetarse más lentamente. Sin embargo, la inversión de la señal de empaquetamiento supuso la demostración de que este efecto es fácilmente evitable lo que convierte al Ad helper Ad5/FC31.Cre.?R en una buena herramienta para la producción de Ad gutless. / Adenovirus is the most used vector in human clinical trials. In order to overcome cellular inmune response evoked by first and second generation adenovirus, third generation, also called gutless or helper-dependent adenovirus have been generated. Gutless adenovirus production needs three basic elements: a gutless adenovirus with a therapeutic or marker gene; a helper adenovirus which provide all viral proteins in trans and; a permisive cell line to produce adenovirus. Gutless adenovirus, without any codificant viral region, don't evoke cellular inmune response and can incorporate DNA inserts up to 36 Kb. It has been reported that the expresion of incorporated genes can last the whole life of the organism. Nevertheless, its use in human clinial trials is not suitable due two important inconvenients: helper adenovirus contamination and up-scale processes. To solve helper adenovirus contamination problem, this present work propose a new adenovirus gutless generation system based on ?C31-attB/attP recombinase. Helper adenovirus generated have flanked its packaging signal (?) by attB/attP sequences. ?C31 is an unidirectional recombinase which avoid reverse reaction. This characteristic is an important advantage in front of other recombinases such as Cre or FLPe. Surprisingly, attB sequence incorporated between Ad-ITR and ? lengthens adenovirus cycle up to 56-60 hours, However, this effect don't affect efficient genome replication or protein shyntesis. Moreover, it has been shown that packaging and maturation processes are affected. It has been observed that the cloning of a second ? in the 3'-ITR normalize production levels in comparison to control adenvovirus, proving adenovirus genome is not trapped in any nuclear region. EMSA assays have shown different cellular proteins interact with attB sequence and likely the interaction of one of this cellular proteins impairs the correct packaging of adenovirus genome. For this reason, differential packaging in time of attB/attP-helper adenovirus generated have been used to produce gutless adenovirus limiting production times at 36 hours (time when control adenovirus finish its viral cycle) . However, in gutless adenovirus productions, helper adenovirus contamination levels were high and they increase significantly in the successive amplification steps. The 5' extreme analysis showed helper and gutless adenovirus recombine by their ? loosing recombination sequences and, in this way, helper adenovirus slow packaging capacity. Nevertheless, the inversion of ? showed this effect can be easily avoided which make Ad5/FC31.Cre.?R helper adenovirus a good tool for gutless adenovirus production.

Las Repeticiones Cortas en Tandem (STR) son marcadores genéticos distribuidos en todo el genoma, se han venido utilizando en estudios de ligamiento genético de enfermedades, identificación humana y genética de poblaciones debido a su alto grado de polimorfismo. En este trabajo se presentan los resultados obtenidos en una muestra de 35 individuos no emparentados de la población de Yungay (Ancash-Perú), mediante la determinación de los alelos de los STRs: HumTH01 (Tirosina hidroxilasa) y HumTPOX (Tiroidea peroxidasa) con la técnica de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), electroforesis en geles de poliacrilamida al 6% 7M urea y visualizados con la tinción con nitrato de plata. En la población de Yungay se detectaron los alelos 6, 7 y 9.3 para el marcador HumTH01 con un valor de heterocigosidad de 0.5429 y de homocigosidad de 0.4571. Mientras para el marcador TPOX se detectaron los alelos 8, 9, 11 y 12 con un valor de heterocigosidad de 0.3429 y de homocigosidad de 0.6571. La distribución de frecuencias para el marcador HumTH01 para el alelo 6 igual a 0.3286, alelo 7 igual a 0.5143 y alelo 9.3 igual a 0.1571; y para el marcador TPOX para el alelo 8 igual a 0.7571, alelo 9 igual a 0.0143, alelo 11 igual a 0.2143 y alelo 12 igual a 0.0143. La población se encontró en equilibrio de Hardy-Weinberg para ambos marcadores y, además, no existe diferencia significativa entre las frecuencias alélicas de ambos marcadores de la población de Yungay y la hispanoamericana reportadas por Steven et al. (1998). / Short tandem repeats (STRs) are genetic markers distributed throught the whole genome. Over the last years, they have been used to study the genetic linkage of diseases, human identification and populations genetic due to its high degree of polymorphism. In this work, the results presented were obtained in the allele determination with the STRs: HumTH01(Human tyrosine hydroxylase gene) and HumTPOX (Human thyrid peroxidase gene) in the population sample constituted by 35 non-related individuals from Yungay (Ancash-Peru). The technique used were PCR, 7M urea 6% poliacrylamide gel electroforesis and visualized with silver nitrate staining. In Yungay's population, we found 3 alleles 6, 7 and 9.3 for HumTH01 with a value of heterozigocity of 0.5429 and homocigocity of 0.4571, and for marker HumTPOX 4 alleles 8, 9, 11 and 12with a value of heterozigocity of 0.3429 and homocigocity of 0.6571. The frequency distribution for marker HumTH01 for allele 6 equal to 0.3286, allele 7 equal to 0.5143 and allele 9.3 equal to 0.1571; and for marker TPOX for allele 8 equal to 0.7571, allele 9 equal to 0.0143, allele 11 equal to 0.2143 and allele 12 equal to 0.0143. The population is found in Hardy-Weinberg equilibrium, and there are no significant differences between the allelic frequencies of both markers between Yungay's population and the Hispano-American reported by Steven et al. (1998)

El análisis de la expresión global y de número de copias de DNA en tumores primarios y líneas celulares de cáncer de pulmón reveló la presencia de amplificación génica en los cromosomas 11q12, 13q34 y 6p22. En los cromosomas 11q12 y 13q34 se identificaron ocho y tres genes sobre‐expresados, respectivamente; globalmente, la expresión de los transcritos del amplicón 13q34 era bastante superior a la del amplicón 11q12. Debido a su función biológica y a su relevancia en otros tipos de cáncer se seleccionaron los genes CTNND1 y TFDP1, en los cromosomas 11q12 y 13q34 respectivamente, para estudios posteriores. Estudiamos los niveles de expresión de CTNND1 y TFDP1 mediante inmunohistoquímica en tumores primarios de cáncer de pulmón no microcítico. El 1,4% y 2,7% de los tumores, todos de tipo escamoso, presentaron los niveles más altos de expresión de p120ctn y DP1 codificadas, por los genes CTNND1 y TFDP1 respectivamente. El 10% de los tumores tenían una localización citosólica aberrante de p120ctn. Por otra parte, el gen CTNND1 codifica diferentes isoformas de p120ctn por splicing alternativo. En general, los tumores están enriquecidos en la isoforma 3 de p120ctn. Se interfirió la expresión de DP1 mediante siRNA y se midió la proliferación celular mediante ensayos de MTT. Se observó que la inhibición de la expresión de DP1 reduce alrededor de un 50% la viabilidad de células con amplificación de TFDP1 mientras que no afecta a las células sin DP1 sobre‐expresado. El gen SOX4 fue el único sobre‐expresado respecto a tejido pulmonar normal en la línea celular con amplificación en 6p22. El 3,5% de las líneas celulares y el 6% de los tumores primarios tenían sobre‐expresión de SOX4. Se encontró que tanto SOX4 como SOX2 y SOX11 estaban sobre‐expresados específicamente en células de cáncer de pulmón microcítico. Dentro de los tumores de cáncer de pulmón no microcítico, SOX2 y SOX9 estaban sobre‐expresado en carcinomas escamosos respecto a adenocarcinomas y SOX4 presentaba un patrón contrario. El análisis de mutaciones de SOX4 en cáncer de pulmón reveló dos variantes germinales en tumores primarios de pulmón, una de ellas se trataba de un polimorfismo presente en la población española y una mutación somática que codifica para una proteína truncada. En las líneas celulares se encontraron dos variantes de cambio de aminoácido y una deleción en pauta. La capacidad de transactivación de SOX4 no cambió en las formas no truncadas respecto a la forma salvaje, mientras que la forma truncada estaba incapacitada para activar la transcripción. Mediante un ensayo de cooperación oncogénica con RHOA‐Q63L y HRAS‐G12V se observó que la expresión creciente de la forma salvaje y las formas no truncadas de SOX4 incrementaban significativamente la habilidad oncogénica de RHOA‐Q63L y no afectaba la capacidad transformante de HRAS‐G12V mientras que la forma truncada reducía el número de focos transformantes originados por HRAS‐G12V. Mediante la depleción de SOX4 se identificaron nuevos genes regulados directa o indirectamente por este factor de transcripción, muchos de ellos relacionados con el desarrollo neural. A su vez, estos genes se sobre‐expresaban tras la expresión ectópica de SOX4 en líneas celulares y en tumores primarios de pulmón con altos niveles de SOX4. Por otro lado, estos genes tenían una expresión reducida en fibroblastos embrionarios de ratones Sox4/. Finalmente, se demostró el reclutamiento de SOX4 en los promotores de los genes MYB, VASH2, TEAD2 y TUBB3 y en la región de control del cluster de PCDHBs. La firma de expresión génica de SOX4 resultó compartir muchas similitudes con la de cáncer de pulmón microcítico, de origen neuroendocrino, por lo que hay una alta implicación de SOX4 en el desarrollo de este tipo de cáncer. / The search for novel oncogenes is important because they could be the target of future specific anticancer therapies. To screen for amplicons, we aligned the gene expression data according to the position of transcripts and searched for clusters of over‐expressed genes. We confirmed the presence of two amplicons, at chromosomes 11q12 and 13q34. The p120ctn and DP1 proteins, encoded by two candidate oncogenes, CTNND1 and TFDP1, at 11q12 and 13q34 amplicons, respectively, showed very strong immunostaining in lung tumours with gene amplification. Depletion of TFDP1 expression by small interference RNA in a lung cancer cell line with TFDP1 amplification and protein over‐expression reduced cell viability by 50%. Then, we analyzed DNA copy number and mRNA expression levels in lung cancer cell lines and identified the 6p22.3 amplicon. The SOX4 gene was overexpressed in cells with amplification relative to normal cells. SOX4 expression was also stronger in a fraction of lung primary tumours and lung cancer cell lines. We also found variants of SOX4 in lung primary tumours and cancer cell lines, including a somatic mutation that introduced a premature stop codon. Overexpression of the wildtype and of the non‐truncated variants in NIH3T3 cells significantly increased the transforming ability of the weakly oncogenic RHOA‐Q63L. Ablating SOX4 expression in SOX4‐amplified lung cancer cells revealed a gene expression signature that included genes involved in neuronal development such as PCDHB, MYB, RBP1 and TEAD2. Interestingly, we found that small cell lung cancer was generally characterized by high levels of SOX2, SOX4 and SOX11 along with the SOX4‐specific gene expression signature identified. In conclusion, we report the identification of three novel amplicons, at 13q34, 11q12 and 6p22.3. TFDP1 is a candidate oncogene at 13q34. Within the 6p22 amplicon, SOX4 is overexpressed in lung cancer and we provide evidence of its oncogenic properties. We also identify a functional role for SOX genes and several SOX4 novel targets in SCLC.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La regulación epigenética es un proceso clave en la expresión génica, participando en silenciamiento y activación de genes durante la diferenciación multilinaje de células madre mesenquimales (CMM). El objetivo del presente estudio fue cuantificar la expresión de enzimas de metilación del ADN (DNMT1, DNMT3A y DNMT3B), metilación de histonas (EZH2) y demetilación de histonas (KDM6A) en CMM fetales bovinas durante la diferenciación in vitro osteogénica, condrogénica y adipogénica. Las CMM fueron aisladas desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=3) y cultivadas en presencia de factores de diferenciación. La expresión génica fue cuantificada mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). En la diferenciación osteogénica, se detectó al día 24 un aumento (P<0,05) en la expresión de KDM6A comparado al día 0. La expresión de DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, EZH2 y KDM6A fue menor (P<0,05) en CMM diferenciadas el día 7 de cultivo condrogénico en relación al día 0 y al control. Se detectó una disminución (P<0,05) en la expresión de DNMT1 en CMM diferenciadas al día 6 de cultivo adipogénico comparado al día 0. Adicionalmente, durante este cultivo se detectó un aumento (P<0,05) en la expresión de DNMT3A, DNMT3A y EZH2 en CMM diferenciadas los días 12 y 18 de diferenciación, en comparación al día 0. En conclusión, se detectó un aumento de KDM6 durante la diferenciación osteogénica, y un aumento de todas las enzimas evaluadas durante la diferenciación adipogénica. En contraste, no se detectó aumento de enzimas durante la diferenciación condrogénic / Proyecto FONDECYT 11100205

Las leguminosas son el segundo grupo de plantas en importancia agronómica. Sin embargo, se conoce poco sobre sus procesos de floración, a pesar de la importancia que tienen en los sistemas de producción de las mismas. En el presente trabajo, se utilizó como sistema modelo la leguminosa Medicago truncatula para estudiar la floración en este grupo de plantas. Se pretendía aislar y caracterizar genes de la familia MADS-box en esta especie, los cuales están involucrados en el desarrollo floral y la transducción de señales. Se estudiaron 11 genes MADS-box: dos genes de clase B (MtTM6 y MtNMH7), tres genes de clase C (MtSHP, MtAGa y MtAGb), un gen de clase E (MtSEP) y cinco genes que no forman parte del modelo ABC(DE) (MtAGL6, MtAGL6-like, MtSOC1a, MtSOC1b y MtSOC1-like). Los patrones de expresión de estos genes se analizaron mediante Northern blot e hibridación in situ, observando que todos se expresan en diferentes tejidos florales y/o diferentes estadios de desarrollo floral. Se prestó especial atención a la caracterización funcional de los genes de clase C, debido a su importancia en los procesos reproductivos de las plantas, por lo que se estudiaron los genes MtAGa y MtAGb, homólogos al gen de clase C AGAMOUS. Se analizaron plantas transgénicas con construcciones de RNA interferente y un mutante de pérdida de función C etiquetado por el retrotransposón Tnt1. Además, utilizando la tecnología VIGS se obtuvieron plantas de M. truncatula y de Pisum sativum (leguminosa filogenéticamente cercana) con pérdida de función de los genes MtAGa/MtAGb y PsAGa/PsAGb, respectivamente. También se realizaron experimentos de ganancia de función mediante la expresión constitutiva en el sistema heterólogo Arabidopsis thaliana. Los resultados obtenidos indican que MtAGa y MtAGb son genes de clase C que además de ser funcionalmente redundantes, se han subfuncionalizado, distribuyendo la función C ancestral entre ambos parálogos, de tal manera que MtAGa tiene un papel prioritario en la determinación del meristemo floral, mientras que MtAGb juega un papel clave en la especificación de la identidad de los órganos reproductores florales. / Serwatowska, J. (2012). Aislamiento y caracterización de genes MADS-box en Medicago truncatula: duplicaciones génicas y subfuncionalización en el linaje euAGAMOUS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/15077 / Palancia

Menciona que la enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruzi, es endémica de Latinoamérica y afecta entre 16 y 18 millones de personas. Su tratamiento requiere de drogas más efectivas y menos tóxicas. Con el propósito de contar con un método de screening de drogas más sensible y rápido que facilite la selección de compuestos tripanosomicidas candidatos, se planteó como objetivo desarrollar parásitos de T. cruzi que expresen el gen reportero de la luciferasa (luc) de la luciérnaga Photinus pyralis en forma estable. Para la obtención de parásitos luc- transfectantes se construyeron dos plásmidos conteniendo el ORF de luc: el pBS-Neo-Luc y el pR-Luc-Neo. Epimastigotes de la cepa boliviana DH29 fueron electroporados con el DNA circular de estos plásmidos. Los clones fueron obtenidos por diluciones limitantes de los parásitos transfectantes resistentes al antibiótico G418. La inserción del gen luc y su expresión fue demostrada por PCR y western blot, respectivamente. La actividad de la luciferasa fue medida con un luminómetro manual. Los clones que expresaron la luciferasa, medida por su actividad, fueron estables por más de seis meses en ausencia del antibiótico de selección y en los tres estadios de T. cruzi. La correlación entre la actividad de la luciferasa y el número de parásitos fue muy alta (r2= 0,999). La prueba de detección de la luciferasa fue altamente sensible, detectándose desde 102 parásitos ml-1. Por tanto, los parásitos con expresión estable de luciferasa podrán ser usados para el screening de drogas tripanosomicidas. / Tesis

La O-manosilación de proteínas es una modificación postraduccional de gran relevancia en eucariotas. El α−distroglicano (α-DG), componente principal del complejo distrofina-glicoproteína en el músculo y células nerviosas, se encuentra altamente O-manosilado. Existe un grupo de distrofias neuromusculares hereditarias cuya base molecular subyacente es un déficit en la glicosilación del α−DG. Son las llamadas distroglicanopatias (DGPs), las cuales ofrecen a los pacientes una corta esperanza de vida y cuyos síntomas se extienden al cerebro, al músculo y a la retina. Estas enfermedades engloban, de mayor a menor gravedad, el síndrome de Walker-Warburg (WWS), la enfermedad de músculo-ojo-cerebro (MEB) y la distrofia muscular congénita de Fukuyama (FCMD), además de las distrofias musculares congénitas moderadas (MDC) y las distrofias musculares de cinturas (LGMD). Se conocen actualmente 18 genes asociados a DGPs, la mayoría de los cuales codifican el DG y enzimas implicadas directa o indirectamente en su O-glicosilación. En esta tesis doctoral se ha tratado de mejorar nuestra comprensión acerca de los genes y proteínas asociados a las DGPs mediante el abordaje de su expresión y función en un tejido frecuentemente afectado en estas enfermedades: la retina. En el capítulo 1 se resumen el estado actual del conocimiento acerca de estas enfermedades, la glicosilación del α−DG, y su papel en la estructura de la retina. Los capítulos siguientes comienzan cada uno con un breve resumen, y se desglosan individualmente en Introducción, Materiales y Métodos, Resultados y Discusión. El capítulo 2, titulado “Expresión de genes y proteínas asociados a distroglicanopatías en la retina de mamíferos” se centra en la detección de la expresión de los genes POMT1, POMT2, POMGNT1, FKTN, FKRP y LARGE, tanto a nivel de ARNm como de proteína en la retina neural de distintas especies de mamíferos utilizando técnicas de RT-PCR y Western blotting, y su perfil de distribución mediante técnicas de inmunohistoquímica. En el capítulo 3, titulado “POMGnT1 y POMGnT2: Dos N-acetilglucosaminil-transferasas de proteínas que actúan sobre un mismo substrato, el α-distroglicano”, se presenta una revisión de la información obtenida a partir de la literatura y bases de datos públicas, así como de análisis bioinformáticos realizados en este trabajo, sobre las proteínas POMGnT1 y POMGnT2. El conjunto de datos obtenido revela la existencia de una elevada homología entre las secuencias de aminoácidos de las proteínas humanas y sus ortólogas en las distintas especies del filo Cordados. Los integrantes de este taxón constituyen, así, un grupo monofilético para ambas proteínas, cada una de las cuales presumiblemente posee un ancestro común separado. En el capítulo 4, titulado “Alteraciones estructurales en la retina de un ratón KO condicional en el gen Pomt1, modelo de distroglicanopatías”, se exponen los resultados de un trabajo multidisciplinar realizado en estrecha colaboración con grupos de la Universidad Autónoma de Madrid y la Universidad de Alcalá. En nuestro grupo se han estudiado los cambios morfológicos y estructurales que tienen lugar en la retina de un ratón modelo de DGPs en el que el gen Pomt1 ha sido “noqueado” de forma condicional en este tejido. Los análisis llevados a cabo revelaron importantes alteraciones en la organización de la retina externa, incluidas las sinapsis establecidas entre los fotorreceptores y sus células postsinápticas, así como una reactividad aumentada de las células gliales en la retina interna. Finalmente, en el último capítulo se presentan a modo de sumario las conclusiones obtenidas del trabajo desarrollado en esta tesis doctoral.

La variabilidad genética en una muestra poblacional de 49 individuos no emparentados de la provincia de Andahuaylas, fue analizada con los marcadores microsatélites TPOX y TH01 mediante la técnica de PCR múltiplex. Los amplificados fueron separados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y visualizados por tinción con nitrato de plata. Ambos loci resultaron polimórficos, con 5 alelos en cada loci, y se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg. La heterocigosidad de los loci TPOX y TH01 presentaron valores bajos en comparación con lo reportado en otras poblaciones mundiales; lo cual determinó que la variabilidad genética de la población estudiada, medida por la heterocigosidad promedio por locus, resultara baja. Se estimaron valores de FST como medida de subdivisión poblacional en ambos loci, entre la muestra poblacional de Andahuaylas y poblaciones caucásicas, asiáticas, africanas, oceánicas y algunas relacionadas, en cuanto su origen, a la muestra poblacional estudiada. No se encontró subdivisión genética con la muestra poblacional peruana de Mesa Redonda (Tito y col., 2004) en los loci TPOX y TH01, ni con una muestra poblacional de hispanos residentes en Estados Unidos reportada por Budowle y col. (1999) y la población Mapuche de Argentina (Tourret y col., 1999) en el locus TPOX. Se corroboró una fuerte correlación genética con la población de Mesa Redonda mediante el análisis de las distancias genéticas de Reynolds representadas en un árbol filogenético neighbor-joining. / ---A population study in a sample of 49 unrelated individuals from the Province of Andahuaylas (Southern Peru) was carried out using the TPOX and TH01 STRs markers, in order to estimate their level of genetic variability. The two loci were typified by PCR multiplex. The PCR products were separated by electrophoresis on gel polyacrylamide and visualized by silver staining. Both loci were polymorphic, with 5 alleles each one, and met Hardy-Weinberg expectations. In both loci, the heterozygosity showed values that were low in comparison with world populations. The genetic variability of the Andahuaylas population, measured as the average heterozygosity per locus, was low. FST were calculated as a measure of population subdivision, between the Andahuaylas population and others world populations, in both loci. No appreciable genetic subdivision was found with the Peruvian Mesa Redonda Lima population (Tito et al., 2004) in both loci, and in the TPOX locus with a sample of Hispanic population from United States reported by Budowle et al. (1999) and The Mapuche population from Argentina (Tourret et al., 1999). The Reynolds’ distances represented in a neighbor-joining tree confirmed the great genetic correlation with Mesa Redonda Lima population.

En el presente trabajo se estudió una muestra poblacional de ascendencia puneña, detectando su variabilidad genética a través de los marcadores microsatélites STR del Cromosoma Y: DYS390, DYS391 y DYS392 utilizando la técnica de amplificación Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Al comparar las frecuencias alélicas obtenidas con lo publicado a nivel mundial para la Población Amerindia, se encontraron diferencias significativas para el STR DYS392. Utilizando los datos publicados en la literatura se diseñaron dos cuadros de frecuencias haplotípicas poblacionales, uno a nivel de ocho poblaciones sudamericanas y otro de poblaciones a nivel mundial (tabla 16); mediante estos cuadros se ha encontrado que de las poblaciones sudamericanas la población de Puno estaría ubicada con las otras dos poblaciones peruanas, una de Arequipa y la segunda de Tayacaja trabajadas en la referencia, manteniéndose en nuestras poblaciones una distinción a nivel de Sudamérica. En el análisis con las diferentes poblaciones mundiales, la población puneña tendría mayor similitud genética con las poblaciones asiáticas, dándonos una muy buena correlación con la teoría acerca de la migración de los primeros hombres al continente americano así como de la conservación de caracteres genéticos de esta población. / --- In this work one Puno population sample was studied by the PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification technique to detect the genetic variability of Y Chromosome STRs Markers DYS390, DYS391 and DYS392. These were compared with alleles frequencies with closest populations reported (Amerindian Population), the results show significant differences for the DYS392 STR. In addition two tables of population haplotype frequencies were constructed to compare South American populations with our Puno population and the other to compare with world-wide populations. The Puno population fits with the other peruvian populations studied (Arequipa and Tayacaja) keeping its distinction in South America. When compared with world-wide populations, the Puno population is similar with the Asiatic populations showing good correlation with the theories of human migration for peopling of the Americas as well as the conservation of genetic characters in this population.