Las distroglicanopatías (DGPs) constituyen un grupo heterogéneo de distrofias neuromusculares congénitas con herencia autosómica recesiva que afectan al músculo, cerebro y retina, y están originadas por deficiencias en la O-glicosilación del α-distroglicano (α-DG). Esta modificación postraduccional es esencial para el anclaje de las células musculares y nerviosas a la matriz extracelular, así como para la formación de las sinapsis en ‘cinta’ entre los fotorreceptores y las células bipolares y horizontales en la retina. Mutaciones en los genes POMT1, POMT2, POMGnT1, FKTN, FKRP y LARGE están asociadas a DGPs, originando una pérdida de función de las glicosiltransferasas que codifican y causando así una hipoglicosilación del α-DG. En esta Tesis Doctoral se demuestra que los genes POMT1, POMT2, POMGnT1, FKTN, FKRP y LARGE se expresan a nivel de ARNm mediante RT-PCR, y a nivel de proteína mediante Western blotting, en la retina neural ratón adulto y en fotorreceptores 661W en cultivo. Las proteínas codificadas por estos seis genes se localizan tanto en el citoplasma como en el núcleo de esta línea celular. Mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia se ha determinado que POMT1, POMT2 y fukutina se localizan parcialmente en el retículo endoplásmico, mientras que POMGnT1 y FKRP están presentes en el aparato de Golgi de células 661W. En cuanto a LARGE, hemos observado que se encuentra disperso por todo el citoplasma, sin acumulación en ningún orgánulo en particular. Todas las proteínas estudiadas se acumulan en el núcleo de fotorreceptores 661W, aunque únicamente POMT1 y POMT2 se encuentran asociadas a las regiones de eucromatina, colocalizándose entre sí tanto en dicha fracción nuclear como en el citoplasma de estas células. También se ha demostrado en este trabajo mediante Western blotting que el factor de transcripción epigenético p38IP/FAM48A se expresa en la retina neural de ratón adulto y en la línea celular de fotorreceptores 661W, localizándose en la fracción nuclear. Esta proteína posee un dominio funcional denominado Spt20 y múltiples sitios potenciales de glicosilación y fosforilación, los cuales se encuentran muy conservados en todos los vertebrados analizados. En la retina de ratón p38IP/FAM48A se localiza en el núcleo de conos, células horizontales, bipolares, amacrinas y ganglionares, mientras que en el núcleo de las células 661W se localiza en la porción de eucromatina, donde se colocaliza con las proteínas POMT1 y POMT2. Dicho activador transcripcional interacciona físicamente con el heterodímero POMT1-POMT2 mediante su unión a la proteína POMT2. Estos resultados sugieren que dicho heterodímero podría ejercer una función como regulador indirecto de la expresión génica mediante la O-glicosilación de factores de transcripción y/o reguladores epigenéticos como p38IP/FAM48A en fotorreceptores de la línea 661W.

Una de las características de las células bacterianas es la capacidad de adaptarse rápidamente a los frecuentes cambios en las condiciones ambientales del entorno donde se encuentran. En los procariotas la regulación de la expresión génica constituye una herramienta fundamental para dicha adaptación a las condiciones ambientales, posibilitando que tales cambios se vean reflejados en los patrones de expresión génica. La capacidad de modificar el patrón de expresión génica en función de parámetros ambientales es un aspecto crucial en la supervivencia tanto de bacterias que se encuentran en el medio ambiente externo como de bacterias patógenas localizadas en el interior de un organismo hospedador. En este trabajo el primer objetivo fue establecer un modelo de regulación del gen hilA de Salmonella por las proteínas asociadas a cromatina H-NS y Hha, para intentar posteriormente extrapolar este modelo a los reguladores de tipo HilA de la cepa de E. coli 042. Posteriormente, nos planteamos caracterizar el fenotipo resultante de la mutación hha en la cepa de E. coli 042. Los resultados obtenidos revelaron que el gen hilA se induce en fase estacionaria en cultivos crecidos en medio LB a 37ºC. Las proteínas asociadas a cromatina H-NS y Hha reprimen la expresión de hilA bajo un conjunto de condiciones ambientales. En condiciones de baja temperatura, es decir a 25ºC, H-NS posee los papeles mayoritarios en la represión de hilA. Bajo condiciones las cuales simularían la presencia de un hospedador, es decir 37ºC, H-NS deja de actuar y si tiene lugar la inducción de hilA en fase estacionaria. Además de los factores temperatura y osmolaridad que interfieren con la represión de hilA por H-NS se caracterizó la acción antagonista de la proteína IHF sobre la represión mediada por H-NS en el gen hilA utilizando ensayos de transcripción in vitro. En atención a las proteínas tipo HilA encontradas en la cepa de E. coli 042, se pudo caracterizar que ambas proteínas EilA e YgeH son capaces de complementar en trans la mutación hilA en la cepa de Salmonella SV5015. La activación de proteínas efectoras por parte de las proteínas EilA e YgeH en Salmonella parece tener lugar de la misma manera que HilA, a través de la activación del gen invF. Los resultados de regulación transcripcional de los genes eilA e ygeH revelaron una represión por parte de la proteína H-NS, y los ensayos de EMSA apoyan estos resultados. Existe una regulación cruzada entre las islas de patogenicidad ETT2 y eip de la cepa 042. La proteína EilA parece poder activar la expresión de EivF en ausencia de la proteína YgeH. El fenotipo encontrado en el mutante hha de la cepa de E. coli 042 se resume en un aumento de la agregación celular y una deficiencia en la formación de biofilms a 37ºC. El fenotipo es dependiente de temperatura, solamente se observa a 37ºC. Dados de proteómica obtenidos con la construcción AggR::3XFLAG revelaron una sobreexpresión del regulador transcripcional AggR en el mutante hha de la cepa de E. coli 042. Finalmente, la secuenciación masiva de ARN del mutante hha de la cepa de E. coli 042 apoyan estos resultados y revelaron que la transcripción del gen hha envuelve dos patrones diferentes en función de la temperatura. Mientras que a 37ºC la transcripción tiene lugar en la cadena codificante a 25ºC se produce también una importante transcripción en la cadena antisentido, lo que podría interpretarse como que, a baja temperatura se expresa menos el gen hha. / In this work our first goal was to understand and clarify the regulatory role of the nucleoid-associated proteins H-NS and Hha in the regulation of the master regulator of Salmonella pathogenicity island 1 (SPI1), the hilA gene. Due to the presence of HilA orthologous proteins of E. coli 042 strain (EilA and YgeH), we extrapolated the regulation patterns of hilA gene to eilA and ygeH genes. Subsequently, we characterized the phenotype of the hha mutant in the E. coli 042 strain. The results obtained on hilA regulation showed a high induction in the stationary phase of growth when cells were grown in LB medium at 37ºC. The H-NS and Hha proteins repressed the hilA expression under determinate environmental conditions. At low temperature (25ºC) H-NS repressed the hilA gene and Hha enhanced the repression. At high temperature (37ºC) H-NS no longer repressed hilA and the induction of hilA gene took place. Besides temperature and osmolarity factors that interfere with the repression of H-NS in the hilA gene, we characterized an antagonist effect of IHF protein in the H-NS-mediated repression of hilA gene using in vitro transcription assays. In relation to the HilA type proteins found in the strain of E. coli 042, YgeH and EilA, both proteins were able to complement in trans the hilA mutation in Salmonella strain SV5015. The activation of effector proteins by EilA and YgeH proteins in Salmonella seemed to work in the same way than HilA, through invF gene activation. The EMSA assays and the results of transcriptional regulation of genes and ygeH and eilA suggested a repression by H-NS. We also observed a cross-regulation pathway between pathogenicity islands eip and ETT2 in the E. coli 042 strain. EilA protein activated EivF expression in the absence of YgeH proteins. The phenotype found in the hha mutant in the strain of E. coli 042 was both an increase in cell aggregation and a deficiency in biofilm formation. The phenotype was temperature dependent, and it was only observed at 37°C. Proteomics results of the AggR::3xFLAG construction obtained, revealed an overexpression of the transcriptional regulator AggR in the mutant strain hha. Finally, the whole transcriptome shotgun sequencing of the hha mutant of the E. coli 042 supported these findings and revealed that hha gene transcription involved two different patterns depending on the temperature. The transcriptional data suggested that at 37°C the transcription occurred in the coding strand, while at 25°C the transcription occurred in the antisense strand.

El circovirus porcino tipo 2 (PCV2) genera en el ganado porcino diversas enfermedades que se conocen con el nombre de enfermedades asociadas a PCV2 (EACP). Dentro de estas EACP encontramos la infección sistémica (donde se incluyen los casos diagnosticados en el pasado como PMWS), neumonías asociadas a PCV2, enteritis asociadas a PCV2, PDNS asociado a PCV2 y fallo reproductivo asociado a PCV2. La infección sistémica provoca graves consecuencias sanitarias que llevan a pérdidas económicas importantes en las explotaciones porcinas. En nuestro estudio hemos valorado la expresión génica de las interleucinas (IL) de respuesta TH2 (IL4, IL5 e IL13) en animales vacunados y no vacunados frente a PCV2, para comprender mejor las respuestas inmunológicas TH2 desarrolladas tras la vacunación, así como estudiar la variabilidad individual en la respuesta inmune TH2 generada. Para ello, se realizaron dos estudios, en el primero de ellos se emplearon 10 cerdos de 10 semanas de edad vacunados y revacunados frente a PCV2 de los que se obtuvieron células mononucleares periféricas de la sangre (PBMC) los días 0, 21 y 28 tras la primera vacunación y de los nódulos linfáticos el día 29 tras la primera vacunación. En el segundo estudio se emplearon PBMC de 15 lechones de 4 semanas de edad distribuidos en tres grupos: lechones vacunados nacidos de madres vacunadas, lechones no vacunados nacidos de madres vacunadas y lechones no vacunados procedentes de madres no vacunadas. Las células mononucleares de los animales de ambos estudios se cultivaron en presencia de péptidos antigénicos del ORF2 de PCV2, péptidos del gen temprano inmediato del Herpes Virus Equino (EHV) y en presencia sólo de medio de cultivo como control negativo. Se realizó una cinética de expresión extrayendo el ARN a diferentes puntos de tiempo: 0, 2, 12, 24 y 48 horas tras la estimulación con los antígenos. La expresión génica fue calculada mediante cuantificación relativa empleando PCR a tiempo real con el método 2-ΔΔCt y utilizando como gen endógeno la ciclofilina. Nuestros resultados mostraron que en el genoma de la especie porcina existen seudogenes de ciclofilina e IL4 que podrían interferir en la cuantificación de su expresión a nivel del ARNm. Se observó que la IL4 y la IL13 presentan mayores niveles de cambio de expresión génica que la IL5, teniendo su pico de expresión de ARNm entre las 12 y 24 horas postestimulación para las IL4 e IL5 y entre las 24 y 48 horas para la IL13. En las PBMC porcinas se detectaron mayores niveles de cambios postestimulación en la transcripción de IL13 que en las células de mononucleares de los nódulos linfáticos, dándose el fenómeno contrario para la IL4 e IL5. Los datos de expresión génica mostraron que a pesar de que en ocasiones las células mononucleares porcinas tengan correlaciones significativas en la transcripción de IL4, IL5 e IL13, deben existir otros mecanismos que regulen independientemente la transcripción de cada una de ellas. Respecto a los efectos de la vacunación, nuestros resultados m ostraron que las PBMC de los cerdos vacunados y revacunados frente a PCV2 expresaron mayores niveles de IL4 que las PBMC de los animales no vacunados en todas las condiciones de cultivo ensayadas. Asimismo, las PBMC de los cerdos vacunados y revacunados frente a PCV2 expresaron mayores niveles de IL13 que las PBMC de los animales no vacunados cuando fueron reestimuladas con péptidos antigénicos del ORF2 de PCV2. Las PBMC de los lechones vacunados nacidos de madres vacunadas presentaron mayores niveles de IL4 e IL13 que el resto de lechones de los otros dos grupos en todas las situaciones de cultivo probadas. Podemos concluir tras este estudio que la vacunación y revacunación de cerdos frente a PCV2 y la vacunación frente a PCV2 de lechones nacidos y encalostrados de cerdas vacunadas frente a PCV2 potenciaría la síntesis de interleucinas TH2, que al contribuir en el establecimiento de la respuesta inmune, favorecería el estado sanitario de los animales.

Muchos productos hortofrutícolas desarrollan 'daños de frío' durante la conservación a temperaturas inferiores a 12-15 ºC. El tratamiento de 'curado' (3 días 37 ºC) previene la aparición de esta alteración en los frutos cítricos cuando se conservan a 2 ºC. En la mandarina 'Fortune', muy susceptible al frío, los daños se manifiestan como un picado y áreas de color pardo en la parte más externa de la corteza (flavedo). Otra de las alteraciones frecuentes en la postcosecha de los frutos cítricos es el 'colapso de la corteza', que se produce a temperaturas superiores a las que causan 'daños de frío' y cuyos síntomas se caracterizan por la aparición de depresiones en la piel. El acondicionamiento de frutos de 'Navelate' durante 4 días con 10 ?L L-1 de etileno a 22 ºC y 90-95% de humedad relativa (HR) redujo notablemente la incidencia de esta alteración, mientras que la aplicación de 1 ?L L-1 de 1-metilciclopropeno (1-MCP), un inhibidor de la percepción de etileno, la potenció. Para entender los mecanismos asociados al efecto beneficioso del curado reduciendo el 'daño de frío' y del etileno frente al 'colapso de la corteza', se han evaluado cambios globales en la expresión génica en el flavedo de frutos de mandarina 'Fortune' almacenados a 2 ºC, directamente o después del curado, y en el flavedo y albedo de frutos de naranja 'Navelate' almacenados a 22 ºC y 90-95% de HR después de ser tratados con etileno o 1-MCP. Para ello se han empleado dos micromatrices de cDNA generadas en el Consorcio de Genómica Funcional de Cítricos (CFGP). La eficacia del curado reduciendo la incidencia de 'daños de frío' parece estar más relacionada con su efecto evitando la inducción de genes implicados en la degradación de lípidos durante el almacenamiento en frío, que con cambios en la expresión de genes del metabolismo de ácidos grasos que afectan al grado de insaturación de los mismos o a la síntesis de ceras. Además, la expresión de genes del metabolismo de fenilpropanoides, y de otros que / Establés Ortiz, BA. (2008). Estudio transcriptómico de los mecanismos implicados en la tolerancia inducida por el curado al daño de frío y por el etileno al colapso de la corteza en los frutos cítricos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/3782 / Palancia

En la presente tesis se han estudiado los distintos mecanismos de toxicidad de las micotoxinas citrinina y ocratoxina A y la respuesta adaptativa a xenobióticos en el modelo de levadura Saccharomyces cerevisiae, concretamente la regulación de los transportadores multidrogas del sistema PDR y sus factores de transcripción. La respuesta a xenobióticos permite a las células eucariotas adaptarse y sobrevivir a la exposición de gran variedad de compuestos exógenos, como toxinas o fármacos. En esta respuesta participan distintos tipos de proteínas, principalmente transportadores de membrana y factores de transcripción. Para estudiar esta respuesta adaptativa sometimos las células de levadura a distintos tratamientos con las micotoxinas citrinina (CIT) y ocratoxina A (OTA), y los oxidantes menadiona (MEN), y peróxido de hidrógeno (H2O2). Las micotoxinas CIT y OTA son metabolitos secundarios producidos por hongos filamentosos que contaminan alimentos básicos y que son tóxicas para el ser humano. Aquí, estudiamos sus mecanismos de toxicidad a través de experimentos de expresión génica con reporteros luciferasa, ensayos transcriptómicos, y ensayos fenotípicos con mutantes de pérdida de función para determinadas proteínas involucradas en la defensa antioxidante y de transporte multidroga. Los resultados muestran diferencia de los mecanismos de toxicidad entre ambas micotoxinas. CIT induce la expresión de genes involucrados en el transporte de drogas y la respuesta a estrés oxidativo, mientras que OTA activa, principalmente, la expresión de genes implicados en el desarrollo, como meiosis o esporulación, y en menor medida, genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo y al transporte multidroga. En levadura, los transportadores multidroga de la membrana plasmática que eliminan compuestos tóxicos de la célula forman parte del sistema PDR (pleiotropic drug resistance). Este sistema está compuesto por proteínas conservadas de bacterias a humanos, como transportadores multidroga y factores de transcripción. Cuando estos transportadores son sobreexpresados, da lugar al fenómeno de resistencia pleiotrópica a drogas (PDR) o resistencia a múltiples drogas (MDR). Este proceso de resistencia es de gran importancia en diversos tratamientos médicos, como quimioterapia en cáncer, o antifúngicos, ya que disminuyen su eficiencia. Aquí, hemos estudiado el funcionamiento del sistema PDR en levadura de varios transportadores multidroga (Pdr5, Pdr15, Snq2, y Yor1) y factores de transcripción (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, y Stb5) mediante cuantificación de expresión luciferasa. Los resultados muestran que, de entre los transportadores estudiados, Pdr5 y Snq2 son los principales en la respuesta de adaptación frente a CIT, OTA y MEN, mientras que Pdr15 parece actuar como un transportador secundario. Además, la regulación de estos tres transportadores ante la exposición de CIT está dirigida por el factor de transcripción Pdr1. SNQ2 es el único de los cuatro transportadores que se induce al tratar las células con H2O2. Pdr1 activa la transcripción de genes en respuesta a CIT y OTA a través de los sitios específicos PDRE, mientras que Pdr8 e Yrm1, parecen actuar como reguladores negativos en respuesta a CIT. Por último, desarrollamos un sistema binario de plásmidos que nos permite definir las distintas sensibilidades y especificidad a drogas por parte de los factores de transcripción de forma individual. Pdr1 es capaz de reconocer e inducir la activación de la expresión génica en todos los tratamientos, aunque levemente con H2O2. Yrr1 presenta inducción de la expresión génica ante CIT y, especialmente, OTA, indicando su capacidad de discriminación entre estas moléculas. Por último, Stb5 reconoce e induce la expresión génica en el tratamiento con H2O2 en mayor nivel que Pdr1. Los resultados muestran un alto nivel de regulación del sistema PDR, con Pdr1 como factor de transcripción pr / In the present thesis, we have studied the different toxicity mechanisms of the mycotoxins citrinin and ochratoxin A and the adaptive response to xenobiotics in the yeast model of Saccharomyces cerevisiae, specifically the regulation of the multidrug transporters of the PDR network and its transcription factors. The response to xenobiotics allows eukaryotic cells to adapt and survive the exposure to a wide variety of exogenous compounds, such as toxins or drugs. Different types of proteins participate in this response, mainly membrane transporters and transcription factors. To study this adaptive response we subjected the yeast cells to different treatments with the mycotoxins citrinin (CIT) and ochratoxin A (OTA), and oxidants menadione (MEN), and hydrogen peroxide (H2O2). The mycotoxins CIT and OTA are secondary metabolites produced by several filamentous fungi, which contaminate staple foods and which are toxic to humans. Here, we studied their toxicity mechanisms through gene expression experiments with luciferase reporters, transcriptomic assays, and phenotypic assays with loss-of-function mutants for certain proteins involved in antioxidant defense and multidrug transport. The results show differences in the mechanisms of toxicity between both mycotoxins. CIT induces the expression of genes involved in drug transport and the response to oxidative stress, whereas OTA activates, mainly, the expression of genes involved in development, such as meiosis or sporulation, and to a lesser extent, genes related to response to oxidative stress and multidrug transport. In yeast, multidrug transporters of the plasma membrane that remove toxic compounds from the cell are part of the PDR (pleiotropic drug resistance) network. This system is composed of proteins conserved from bacteria to humans, such as multidrug transporters and transcription factors. When these transporters are overexpressed, it leads to a phenomenon known as pleiotropic drug resistance (PDR) or multidrug resistance (MDR). This resistance process is very important in various medical treatments, such as chemotherapy in cancer, or antifungals, since they reduce their efficiency. Here, we have studied the function of the PDR multidrug transporters (Pdr5, Pdr15, Snq2, and Yor1) and transcription factors (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, and Stb5) by quantifying luciferase expression in promoters or specific recognition sites. The results show that, among the studied transporters, Pdr5 and Snq2 have major roles in the adaptation response to CIT, OTA and MEN, while Pdr15 seems to act as a secondary transporter. Moreover, the regulation of these three transporters upon exposure to CIT is directed by the transcription factor Pdr1. SNQ2 is the only one of the four transporters that is induced by treating cells with H2O2. Pdr1 activates the transcription of genes in response to CIT and OTA through specific PDRE sites, while Pdr8 and Yrm1, appear to act as negative regulators in response to CIT. Finally, we developed a binary plasmid system that allows us to define the different sensitivities and specificity to drugs by the transcription factors individually. Pdr1 is able to recognize and induce the activation of gene expression in all treatments, albeit very slightly with H2O2. Yrr1 shows induction of gene expression with CIT and, especially, OTA, indicating its ability to discriminate between these molecules. Finally, Stb5 recognizes and induces gene expression in H2O2 treatment at a higher level than Pdr1. These results show an important level of regulation of the PDR network, with Pdr1 as the main transcription factor, but with the cooperation of more specific regulators. / En la present tesi s'han estudiat els diferents mecanismes de toxicitat de les micotoxines citrinina i ocratoxina A i la resposta adaptativa a xenobiòtics en el model de llevat Saccharomyces cerevisiae, concretament la regulació dels transportadors multidroga del sistema PDR i els seus factors de transcripció. La resposta a xenobiòtics permet a les cèl·lules eucariotes adaptar-se i sobreviure a l'exposició de gran varietat de compostos exògens, com toxines o fàrmacs. En aquesta resposta participen diferents tipus de proteïnes, principalment transportadors de membrana i factors de transcripció. Per estudiar aquesta resposta adaptativa vam sotmetre les cèl·lules de llevat a diferents tractaments amb les micotoxines citrinina (CIT) i ocratoxina A (OTA), i els oxidants menadiona (MEN), i peròxid d'hidrogen (H2O2). Les micotoxines CIT i OTA són metabòlits secundaris produïts per diversos fongs filamentosos que contaminen aliments bàsics i que són tòxiques per a l'ésser humà. Ací, estudiem els seus mecanismes de toxicitat a través d'experiments d'expressió gènica amb reporters luciferasa, assaigs transcriptòmics, i assajos fenotípics amb mutants de pèrdua de funció per a determinades proteïnes involucrades en la defensa antioxidant i de transport multidroga. Els resultats mostren diferència dels mecanismes de toxicitat entre les dues micotoxines. CIT indueix l'expressió de gens involucrats en el transport de drogues i la resposta a estrès oxidatiu, mentre que OTA activa, principalment, l'expressió de gens implicats en el desenvolupament, com meiosi o esporulació, i en menor mesura, gens relacionats amb la resposta a estrès oxidatiu i al transport multidroga. En llevat, els transportadors multidroga de la membrana plasmàtica que eliminen compostos tòxics de la cèl·lula formen part del sistema PDR (pleiotropic drug resistance). Aquest sistema està compost per proteïnes conservades de bacteria a humans, com transportadors multidroga i factors de transcripció. Quan aquests transportadors es troben sobreexpressats, dóna lloc al fenomen de resistència pleiotrópica a drogues (PDR) o resistència a múltiples drogues (MDR). Aquest procés de resistència és de gran importància en diversos tractaments mèdics, com quimioteràpia en càncer, o antifúngics, ja que disminueixen la seua eficiència. Ací hem estudiat el funcionament del sistema PDR en llevat de diversos transportadors multidroga (Pdr5, Pdr15, Snq2, i Yor1) i factors de transcripció (Pdr1, Pdr3, Pdr8, Yrm1, Yrr1, i Stb5) mitjançant quantificació d'expressió luciferasa. Els resultats mostren que, d'entre els transportadors estudiats, Pdr5 i Snq2 són els principals en la resposta d'adaptació davant de CIT, OTA i MEN, mentre que Pdr15 sembla actuar com un transportador secundari. A més d'això, la regulació d'aquests tres transportadors davant l'exposició de CIT està dirigida pel factor de transcripció Pdr1. SNQ2 és l'únic dels quatre transportadors que s'indueix en tractar les cèl·lules amb H2O2. Pdr1 activa la transcripció de gens en resposta a CIT i OTA a través dels llocs específics PDRE, mentre que Pdr8 i Yrm1, semblen actuar com a reguladors negatius en resposta a CIT. Finalment, vam desenvolupar un sistema binari de plasmidis que enspermet definir les diferents sensibilitats i especificitat a drogues per part dels factors de transcripció de forma individual. Pdr1 és capaç de reconèixer i induir l'activació de l'expressió gènica en tots els tractaments, encara que lleument amb H2O2. Yrr1 presenta inducció de l'expressió gènica davant CIT i, especialment, OTA, indicant la seua capacitat de discriminació entre aquestes molècules. Finalment, Stb5 reconeix i indueix l'expressió gènica en el tractament amb H2O2 en major nivell que Pdr1. Els resultats mostren un important nivell de regulació del sistema PDR, amb Pdr1 com a factor de transcripció principal, però amb la cooperació d'altres regulador / Vanacloig Pedrós, ME. (2018). Estrategias de defensa a estrés químico en Saccharomyces cerevisiae: regulación genética del transporte multidroga y mecanismos de detoxificación [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111949 / TESIS

Menciona que Leishmania braziliensis es un protozoario causante de la leishmaniasis o uta, enfermedad endémica crónica de baja patogenicidad, alta morbilidad, metaxénica y zoonótica que compromete piel, mucosas y vísceras. Es transmitida por un díptero del género Lutzomyia, afecta alrededor de 12 millones de personas alrededor del mundo y a 12 departamentos en el Perú. Leishmania braziliensis tiene patrones moleculares de membrana asociadas a patógenos que son reconocidos por los receptores tipo toll (TLR) presentes en el hospedero, tanto en la superficie celular como a nivel intracelular. Los TLRs están conformados por una familia de 23 tipos que van a reconocer ligandos presentes en patógenos en común. Cuando se da la unión del ligando con un TLR desencadenará una secuencia de señales activando la expresión de moléculas coestimuladoras y citoquinas promoviendo una inflamación y activando la respuesta adaptativa. El presente trabajo tiene como objetivos caracterizar a la cepa C234 de Leishmania braziliensis mediante secuenciamiento y detectar y cuantificar los niveles de expresión de mRNA de los genes TLR-3, TLR-4 y TLR-9 y de las citoquinas IL-12 y TNF-α en macrófagos murinos enfrentados a la cepa C234 de Leishmania braziliensis, endémica del Perú. Se infectó macrófagos peritoneales de ratones Balb/c con promastigotes de Leishmania braziliensis y se cultivaron por 24 horas, se midió los niveles de óxido nítrico (ON), se extrajo mRNA de los macrófagos y se detectó y cuantificó los niveles de expresión en los genes de TLR-3, TLR- 4 y TLR-9, y de las citoquinas proinflamatorias IL-12 y TNF-α, a través de la técnica de retrotranscripción mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Los resultados indicaron que el estudio filogenético de la cepa C234 mostró alta homología (96%) para Leishmania braziliensis. Además, los macrófagos infectados con Leishmania braziliensis presentaron mayor producción de ON sólo en las primeras horas de infección, descendiendo a las 24 y 48 horas; y se detectó expresión de mRNA para los genes TLR-3, TLR-4 y TLR-9 y de las citoquinas IL-12 y TNF-α. Se concluye que la cepa nativa C234 pertenece a la especie Leishmania braziliensis y que la disminución de la producción de ON está relacionada al mayor tiempo de infección y bajos niveles de expresión del gen TLR-4, así mismo, el incremento del nivel de expresión de mRNA de los genes TLR-3 y TLR-9 podrían estar implicados en la activación de la expresión génica de la citoquina IL-12 en macrófagos peritoneales murinos infectados con Leishmania braziliensis. / Tesis

La enfermedad de Parkinson es el segundo trastorno neurodegenerativo más común de nuestra sociedad tras el de Alzheimer. Se caracteriza por una disminución de los niveles del neurotransmisor dopamina asociada a la muerte de las neuronas dopaminérgicas en la substantia nigra del mesencéfalo, proceso que sucede de forma análoga en las células dopaminérgicas de la retina, el subtipo de células amacrinas A18. En consecuencia, además de las múltiples deficiencias motoras y cognitivas que conlleva esta enfermedad, también se han observado alteraciones, a nivel morfológico y fisiológico, en la retina de enfermos de Parkinson y animales modelo de esta enfermedad. Dichas alteraciones incluyen deficiencias en la agudeza visual, sensibilidad al contraste, percepción del color y adaptación a la oscuridad, así como en la detección del movimiento. Sin embargo, se hace necesario esclarecer los mecanismos moleculares subyacentes a esta patología en la retina con el fin de facilitar el diagnóstico molecular y la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas. En esta Tesis Doctoral se ha analizado la expresión génica y el patrón de distribución en la retina de distintos mamíferos, desde roedores hasta la especie humana, de dos proteínas de elevada relevancia en la enfermedad de Parkinson, denominadas parkina y UCH-L1, dos importantes componentes del sistema ubicuitina-proteasoma, implicado en la homeostasis proteica celular. En este contexto, se han revisado en profundidad los componentes que integran este sistema en la retina, junto a su papel en el desarrollo y función de este tejido en condiciones fisiológicas y sus alteraciones en condiciones patológicas. Por otra parte, se ha estudiado el patrón de procesamiento ('splicing') alternativo del ARNm del gen PARK2, el cual codifica la proteína parkina, en la retina de mamíferos en condiciones fisiológicas, proceso cuya desregulación está implicada en el desarrollo y progresión de diversas patologías que afectan a la retina, incluida la enfermedad de Parkinson. Adicionalmente, se han investigado las alteraciones a nivel proteico en la retina de monos parkinsonianos tratados con el compuesto neurotóxico MPTP, mediante técnicas de proteómica. Finalmente, se han catalogado y cuantificado todos los genes expresados en la retina adulta humana mediante secuenciación masiva del transcriptoma (RNA-Seq), con especial énfasis en aquellos relacionados con enfermedades neurodegenerativas que afectan a la retina. En conclusión, en esta Tesis Doctoral se ha abordado mediante diferentes aproximaciones experimentales en la retina de mamíferos el estudio de la expresión de los genes y proteínas relacionados con enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central que cursan con alteraciones en la estructura y función de la retina.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joicematosbiselli_tese.pdf: 4248277 bytes, checksum: 46a8e90eea3be6a03251e5b3d7d8b0e5 (MD5) Previous issue date: 2011-11-28 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo / Trisomy 21 is the genetic basis of Down syndrome (DS), the most common human chromosomal disorder. DS phenotype may include several dysmorphic features, intellectual disability, immunological alteration, congenital heart disease, high risk for specific types of leukemia and neurological alterations. There are basically two hypotheses to explain how the presence of three copies of chromosome 21 results in DS phenotype. The gene dosage effect hypothesis states that over-expression in about 50% of a specific gene or a group of genes located on chromosome 21 present in triplicate in DS individuals is directly responsible for DS features. The second hypothesis suggests the existence of secondary effects of trissomic genes that affect multiple metabolic pathways, resulting in cellular dysfunction. Recent studies show that trisomy 21 results in the over-expression of microRNAs, small molecules of noncoding RNA involved in post-transcriptional gene regulation, which could result in low expression of specific proteins and contribute to DS phenotype. Objective: To identify differentially expressed microRNAs in peripheral blood mononuclear cells of DS and non-DS children and to identify biological processes relevant to DS pathogenesis associated with predicted gene targets of microRNAs differentially expressed in DS children. Casuistic and Methods: Six children with free trisomy 21 and six control children were included in the study. Mature microRNAs were quantified using TaqMan® Low Density Arrays (Applied Biosystems), which enable the quantification of 754 mature microRNAs by real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) using fluorescent probes. The target prediction was performed using the software TargetScanHuman v. 5.2. Information about gene targets was obtained using the software Bioprocess, a database that obtains data from the National Center for Abstract xvi Biotechnology Information (NCBI). Results: Of the 490 mature microRNAs expressed in this cell type, 49 are low-expressed in DS group. The microRNAs located in chromosome 21 did not present differential expression between the groups. Bioinformatics analysis showed that genes involved in several relevant biological process to DS, including apoptosis, reactive oxygen species metabolism, mitochondrial metabolism, immune system, cell aging, cycle and division and control of gene expression, are predicted targets of microRNAs differentially expressed in DS children. Conclusion: DS children present low expression of microRNAs not located on chromosome 21 in peripheral blood mononuclear cells, as compared to children without DS. Biological processes relevant to DS pathogenesis are associated with predicted gene targets of microRNAs differentially expressed in DS children. / A trissomia do cromossomo 21 é a base genética da síndrome de Down (SD), a cromossomopatia humana mais frequente. O fenótipo da SD pode incluir várias características dismórficas, deficiência intelectual, alterações imunológicas, cardiopatias congênitas, risco aumentado para leucemias específicas, alterações neurológicas, entre outras. Existem basicamente duas hipóteses que tentam explicar como a presença de três cópias do cromossomo 21 resulta no fenótipo Down. De acordo com a hipótese do efeito da dosagem gênica , a expressão elevada em cerca de 50% de um gene específico ou de um grupo de genes do cromossomo 21 presente em triplicata em indivíduos com SD seria diretamente responsável pela manifestação de características da síndrome. A segunda hipótese sugere a existência de efeitos secundários de genes trissômicos, que afetariam múltiplas vias metabólicas, resultando em disfunção celular. Estudos recentes mostram que a trissomia do cromossomo 21 resulta na expressão elevada de microRNAs, pequenas moléculas de RNAs nãocodificantes envolvidos na regulação gênica pós-transcricional, o que pode levar à redução da expressão de proteínas específicas e contribuir para o fenótipo da SD. Objetivo: Identificar microRNAs diferencialmente expressos em células mononucleares do sangue periférico de crianças com SD em relação a crianças sem a síndrome e identificar processos biológicos relevantes para a patogênese da SD associados a genes-alvo preditos de microRNAs diferencialmente expressos em crianças com SD. Casuística e Métodos: Foram incluídas no estudo seis crianças com trissomia livre do cromossomo 21 e seis crianças sem a síndrome. A quantificação de microRNAs maduros foi realizada utilizando-se TaqMan® Low Density Arrays (Applied Biosystems), que possibilita a investigação da expressão de 754 microRNAs maduros Resumo xiv pelo método de reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq) fluorescente em tempo real. A predição de genes-alvo dos microRNAs foi realizada utilizando-se o programa TargetScanHuman v. 5.2. Para obtenção de informações sobre os genes-alvo preditos foi utilizada a ferramenta Bioprocess, um banco de dados alimentado com informações do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Resultados: Dos 490 microRNAs maduros expressos no tipo celular investigado, 49 apresentaram expressão reduzida no grupo de crianças com SD. Os microRNAs localizados no cromossomo 21 não apresentaram expressão diferencial entre os grupos. A análise de Bionformática revelou que genes envolvidos em diversos processos biológicos relevantes para a SD, tais como apoptose, metabolismo de espécies reativas de oxigênio, metabolismo mitocondrial, sistema imunológico, envelhecimento, ciclo e divisão celular e controle da expressão gênica, são alvos preditos de microRNAs diferencialmente expressos em crianças com SD. Conclusão: Crianças com SD apresentam expressão reduzida de microRNAs não localizados no cromossomo 21 em células mononucleares do sangue periférico, em relação a crianças sem a síndrome. Processos biológicos relevantes para a patogênese da SD estão associados a genes-alvo preditos de microRNAs diferencialmente expressos em crianças com SD.

En las especies bovina y porcina se ha comunicado la presencia de glicosidasas ligadas a los espermatozoides (Hayashi et al., 2004). Otros autores han propuesto diferentes glicosidasas espermáticas que interactúan con carbohidratos específicos en la ZP en otras especies animales incluyendo al hombre (Tulsiani et al., 1989, 1990; Avilés et al., 1996; Song et al., 2000; Venditti et al., 2007, 2010).En el presente trabajo se llevó a cabo un estudio de las principales glicosidasas espermáticas para establecer su ubicación en el espermatozoide, el origen de su síntesis, la expresión génica y mediante FIV porcina valorar el papel de aquellas glicosidasas con mayor actividad enzimática (AE) en el reconocimiento de gametos, fecundación y desarrollo embrionario temprano. / In bovine and porcine species, the presence of sperm bound glycosidases has been reported (Hayashi et al., 2004). Others studies have proposed different sperm glycosidases that interact with specific ZP carbohydrates in other species, including men (Tulsiani et al., 1989, 1990; Avilés et al., 1996; Song et al., 2000; Venditti et al., 2007, 2010). In the present work, the major sperm glycosidases were studied to establish their localization in the spermatozoon, the origin of their synthesis, their gene expression and through porcine IVF; we sought to define the role of the glycosidases with greater activity during gamete interaction, fertilization and early embryo development.

En la levadura S. cerevisiae, un incremento de la osmolaridad extracelular activa la vía de Hog1, lo que produce una compleja respuesta adaptativa. Entre las respuestas adaptativas que Hog1 coordina, está un importante cambio en el partón de expresión génica. La tesis presentada se centra en la respuesta a nivel de regulación génica, y en ella se ponen de manifiesto nuevos mecanismos por los cuales Hog1 regula la transcripción para inducir genes necesarios para la adaptación celular en respuesta a estrés osmótico. Este trabajo demuestra que Hog1 controla la iniciación y la elongación de la transcripción, interacciona con la RNA polimerasa elongando, y es reclutado en toda la región codificante de los genes que se inducen por estrés osmótico a traves del 3'UTR. Asimismo, Hog1 recluta el complejo remodelador de cromatina RSC para promover un dramático cambio en el posicionamiento de nucleosomas, permitiendo una correcta inducción de la expresión génica. / In the yeast S.cerevisiae, an increase in extra cellular osmolarity activates the Hog1 Pathway, which produces a very complex adaptive response. Among these adaptive responses coordinated by Hog1, there is an important change in the gene expression pattern. The presented Thesis focuses on the response triggered at the genomic level, showing novel mechanisms by which Hog1 regulates transcription to efficiently and properly induce a subset of genes critical for the cellular adaptation to osmotic stress. This work demonstrates that Hog1 promotes and regulates transcription not only at the initiation level, as was previously described, but it also interacts with the RNA Polymerase while elongating, and travels along the coding regions of genes induced upon osmotic stress through recognition of the 3'UTR. Furthermore, Hog1 recruits a chromatin-remodeling complex known as RSC to promote a dramatic change in nucleosome positioning of target genes, allowing a proper induction of the transcription