"Origen y función de las espermidina aminopropil transferasas en Arabidopsis thaliana " Las poliaminas son pequeñas moléculas con carga positiva a pH fisiológico. Las más abundantes y más ampliamente distribuidas entre todos los seres vivos son la putrescina y la espermidina con dos y tres grupos amino, respectivamente. La espermidina se forma a partir de la putrescina por adición de un grupo aminopropilo. La espermina, con cuatro grupos amino y presente sólo en eucariotas, se forma a partir de la espermidina por adición de un segundo grupo aminopropilo. Las poliaminas han sido relacionadas con procesos fundamentales para la vida, como son la división, el crecimiento, la diferenciación y la muerte celular, habiéndose demostrado en todos los organismos en los que se han conseguido mutantes deficientes en su síntesis que las poliaminas son esenciales. En plantas se han encontrado múltiples correlaciones entre la variación en la concentración de las poliaminas y procesos tales como la germinación, la embriogénesis, la formación de raíces, la iniciación floral o el desarrollo de flores y frutos. Al inicio de esta tesis se publicó la identificación de la primera putativa espermina sintasa en plantas (ACL5), cuya pérdida de función da lugar a un defecto en la elongación del tallo y alteración del patrón normal de los haces vasculares; sin embargo, nuestro análisis del mutante acl5 nos ha revelado que no había perdido la capacidad de sintetizar espermina. Nuestro rastreo del genoma de Arabidopsis thaliana nos permitió identificar y caracterizar el gen SPM, otra putativa espermina sintasa regulada por ácido abscísico. Los mutantes nulos para este gen no muestran diferencias fenotípicas respecto del silvestre pero el doble mutante spm/acl5 nos ha permitido confirmar que no hay más genes responsables de la síntesis de espermina. No obstante, la sobreexpresión de SPM en el mutante acl5 no ha sido capaz de aliviar su fenotipo. / Gómez Minguet, E. (2008). Origen y función de las espermidina aminopropil transferasas en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8311 / Palancia

En este trabajo de tesis doctoral se ha utilizado el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae para estudiar cómo las células eucariotas responden a nivel molecular y se adaptan eficazmente a cambios en la concentración osmótica del medio. Este hecho suscita gran interés en la industria de las fermentaciones; también en la agricultura, dado el creciente problema de salinidad de los suelos. Los resultados obtenidos a través de la utilización de técnicas bioquímicas y de biología molecular demuestran que en situaciones de estrés, las células de levadura ajustan sus niveles de ergosterol a través de la activación de una compleja cascada de regulación transcripcional. Este descubrimiento ha revelado nuevos datos que ayudan a entender mejor la homeostasis de esteroles. Este proceso es fisiológicamente similar al que ocurre en células de mamíferos, donde es fundamental mantener los lípidos a niveles óptimos, ya que alteraciones en los mismos pueden dar lugar a enfermedades como la obesidad, diabetes tipo 2 o arterioesclerosis. Por otra parte, muchas infecciones fúngicas en individuos inmunodeprimidos se tratan mediante el empleo de drogas que actúan sobre enzimas de la ruta de biosíntesis de ergosterol, lo que sostiene la relevancia del estudio de la regulación de la síntesis de este lípido de membrana. Por último, el análisis genómico mediante ensayos ChIP-Chip y ChIP-Seq de algunos de los principales reguladores implicados en la compleja respuesta a estrés osmótico, aporta nueva información para comprender cómo los organismos, a través de la evolución, han organizado diferentes -pero estrechamente vinculados- módulos de regulación para hacer frente rápidamente a situaciones de estrés. / Martínez Montañés, FV. (2010). Adaptación a estrés osmótico en Saccharomyces cerevisiae: Caracterización genómica de factores de transcripción involucrados y represión de la biosíntesis de ergosterol [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/9311 / Palancia

[ES] La abscisión es un proceso de separación celular activo, organizado y altamente coordinado que permite el desprendimiento de órganos vegetativos y reproductivos completos, mediante la modificación de la adhesión celular y la desintegración de las paredes celulares en lugares específicos del cuerpo de la planta conocidos como zonas de abscisión. En Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), la abscisión de órganos florales y hojas caulinares está regulada por la interacción entre el péptido hormonal (IDA), un par de proteínas quinasas de tipo receptor redundantes, (HAE y HSL2), y correceptores de la familia SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE. El conocimiento sobre la maquinaria molecular que regula la abscisión en especies de plantas de importancia económica de la familia de las solanáceas es en la actualidad escaso. En esta investigación de doctorado, se realizó un análisis funcional de los componentes del módulo de señalización de abscisión IDA-HAE en N. benthamiana. En la primera sección de este trabajo, se estudió el grado de conservación y la filogenia de las familias de genes IDA-like y HAE-like en especies relevantes del género Solanum, Capsicum y Nicotiana. Se analizó la expresión de estos genes en el alopoliploide N. benthamiana, con el fin de identificar miembros implicados en la abscisión y en la respuesta a condiciones de estrés abiótico como la sequía. En la segunda sección, se evaluó el efecto del silenciamiento y la sobreexpresión de NbenIDA1A y NbenIDA1B, dos homeólogos IDA-like de N. benthamiana que se asociaron con la abscisión de la corola en la sección anterior. Además, también se determinó el efecto sobre la abscisión de la corola del silenciamiento de NbenHAE.1. Las relaciones filogenéticas entre los miembros IDA-like de las solanáceas estudiadas, agruparon los dos pares de homeólogos de proteínas NbenIDA1 y NbenIDA2 con los prepropéptidos de Arabidopsis relacionados con la abscisión. El análisis de las regiones promotoras en busca de elementos reguladores reveló que estos dos pares de homeólogos contenían elementos de respuesta tanto hormonales como de respuesta a la sequía, aunque NbenIDA2A carecía de los elementos reguladores hormonales. Los análisis de expresión génica también indican que el par de homeólogos NbenIDA1 se regulan positivamente durante la abscisión de la corola. Los pares NbenIDA1 y NbenIDA2 mostraron una expresión diferencial tisular en condiciones de estrés hídrico, ya que los homeólogos NbenIDA1 se indujeron en hojas estresadas, mientras que los homeólogos NbenIDA2, especialmente NbenIDA2B, se indujeron en raíces estresadas. En las plantas con crecimiento activo no estresadas, los nudos y los entrenudos fueron los tejidos con los niveles de expresión más altos de todos los miembros de la familia IDA-like y sus receptores HAE-like putativos. El silenciamiento basado en VIGS del par de homeólogos NibenIDA1 y NbenHAE.1 suprimió la abscisión de la corola en flores de N. benthamiana, lo que fue causado por un bloqueo en la desintegración de la pared celular en la base de la corola, probablemente debido a la falta de inducción de las enzimas hidrolíticas relacionadas con la abscisión. La sobreexpresión ectópica del homeólogo NbenIDA1A adelantó la senescencia y la abscisión de la corola y afectó negativamente al crecimiento de las plantas de N. benthamiana. Los resultados obtenidos utilizando la aproximación VIGS mostraron que el par de homeólogos NbenIDA1 y el receptor NbenHAE.1, posiblemente actuando como un módulo de señalización similar al descrito en Arabidopsis, regulan la abscisión de la corola en las flores de N. benthamiana. Este es, por tanto, el primer ejemplo en una especie vegetal distinta de Arabidopsis thaliana que indica que el módulo de señalización de abscisión IDA-HAE/HSL2 se conserva en las angiospermas. / [CA] L'abscisió és un procés de separació cel·lular actiu, organitzat i altament coordinat que permet el despreniment d'òrgans vegetatius i reproductius complets, mitjançant la modificació de l'adhesió cel·lular i la desintegració de les parets cel·lulars en llocs específics del cos de la planta coneguts com a zones d'abscisió. En Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), l'abscisió d'òrgans florals i fulles caulinars està regulada per la interacció entre el pèptid hormonal (IDA), un parell de proteïnes cinases de tipus receptor redundants, (HAE i HSL2), i coreceptors de la família SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE. El coneixement sobre la maquinària molecular que regula l'abscisió en espècies de plantes d'importància econòmica de la família de les solanàcies és en l'actualitat escàs. En aquesta recerca de doctorat, es va realitzar una anàlisi funcional dels components del mòdul de senyalització d'abscisió IDA-HAE en N. benthamiana. A la primera secció d'aquest treball, es va estudiar el grau de conservació i la filogènia de les famílies de gens IDA-like i HAE-like en espècies rellevants de l'gènere Solanum, Capsicum i Nicotiana. Es va analitzar l'expressió d'aquests gens en l'al·lopoliploide N. benthamiana, per tal d'identificar membres implicats en l'abscisió i en la resposta a condicions d'estrès abiòtic, com la sequera. A la segona secció, es va avaluar l'efecte del silenciament i la sobreexpressió de NbenIDA1A i NbenIDA1B, dos homeòlegs IDA-like de N. benthamiana, que es van associar amb l'abscisió de la corol·la en la secció anterior. A més, també es va determinar l'efecte sobre l'abscisió de la corol·la del silenciament de NbenHAE.1. Les relacions filogenètiques entre els membres IDA-like de les solanàcies estudiades, van agrupar els dos parells d'homeòlegs de proteïnes NbenIDA1 i NbenIDA2 amb els prepropèptids d'Arabidopsis relacionats amb l'abscisió. L'anàlisi de les regions promotores a la recerca d'elements reguladors va revelar que aquests dos parells d'homeòlegs contenien elements de resposta tant hormonals com de resposta a la sequera, encara que NbenIDA2A mancava dels elements reguladors hormonals. Les anàlisis d'expressió gènica també indiquen que el parell d'homeòlegs NbenIDA1 es regulen positivament durant l'abscisió de la corol·la. Els parells NbenIDA1 i NbenIDA2 van mostrar una expressió diferencial tissular en condicions d'estrès hídric, ja que els homeòlegs NbenIDA1 es van induir en fulls estressades, mentre que els homeòlegs NbenIDA2, especialment NbenIDA2B, es van induir en arrels estressades. A les plantes amb creixement actiu no estressades, els nusos i els entrenusos van ser els teixits amb els nivells d'expressió més alts de tots els membres de la família IDA-like i els seus receptors HAE-like putatius. El silenciament basat en VIGS del parell d'homeòlegs NibenIDA1 i NbenHAE.1 va suprimir l'abscisió de la corol·la en flors de N. benthamiana, lo qual va ser causat per un bloqueig en la desintegració de la paret cel·lular a la base de la corol·la, probablement degut a la manca d'inducció dels enzims hidrolítics relacionades amb l'abscisió. La sobreexpressió ectòpica de l'homeòleg NbenIDA1A va avançar la senescència i l'abscisió de la corol·la i va afectar negativament el creixement de les plantes de N. benthamiana. Els resultats obtinguts utilitzant l'aproximació VIGS van mostrar que el parell d'homeòlegs NbenIDA1 i el receptor NbenHAE.1, possiblement actuant com un mòdul de senyalització similar al descrit en Arabidopsis, regulen l'abscisió de la corol·la en les flors de N. benthamiana. Aquest és, per tant, el primer exemple en una espècie vegetal diferent d'Arabidopsis thaliana que indica que el mòdul de senyalització d'abscisió IDA-HAE/HSL2 es conserva en les angiospermes. / [EN] Abscission is an active, organized and highly coordinated cell separation process that enables the detachment of entire vegetative and reproductive organs, through the modification of cell-to-cell adhesion and breakdown of cell walls at specific sites on the plant body, known as abscission zones. In Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), abscission of floral organs and cauline leaves is regulated by the interaction of the hormonal peptide (IDA), a pair of redundant receptorlike protein kinases, (HAE and HSL2), and SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE co-receptors. Knowledge about the molecular machinery regulating abscission in economically important plant species of the Solanaceae family is currently scarce. In this PhD research, a functional analysis of the components of the abscission signaling module IDA-HAE in N. benthamiana was carried out. In the first section of this work, the degree of conservation and the phylogeny of the IDA-like and HAE-like gene families in relevant species of the genus Solanum, Capsicumand Nicotiana were determined. The expression of these genes in the allopolyploid N. benthamiana was analyzed, in order to identify members involved in abscission and in the response to abiotic stress conditions, such as drought. In the second section, the effect of the silencing and overexpression of NbenIDA1A and NbenIDA1B, two N. benthamiana IDA-like homeologs, which were associated with corolla abscission in the previous section, was evaluated. Furthermore, the effect on corolla abscission of the silencing of NbenHAE.1 was also determined. The phylogenetic relationships among the IDA-like members of the Solanaceae studied, grouped the two pairs of NbenIDA1 and NbenIDA2 protein homeologs with the Arabidopsis prepropeptides related to abscission. Analysis of promoter regions searching for regulatory elements showed that these two pairs of homeologs contained both hormonal and drought response elements, although NbenIDA2A lacked the hormonal regulatory elements. Gene expression analyses also indicate that the pair of NbenIDA1 homeologs are upregulated during corolla abscission. NbenIDA1 and NbenIDA2 pairs showed tissue differential expression under water stress conditions, since NbenIDA1 homeologs were highly expressed in stressed leaves, while NbenIDA2 homeologs, especially NbenIDA2B, were highly expressed in stressed roots. In non-stressed active growing plants, nodes and internodes were the tissues with the highest expression levels of all members of the IDA-like family and their putative HAE-like receptors. VIGS-based silencing of the pair of NibenIDA1 homeologs and NbenHAE.1 suppressed corolla abscission in flowers of N. benthamiana, which was supported by a blockage in cell wall disassembly at the corolla base, probably due to the lack of upregulation of abscission-related hydrolytic enzymes. Ectopic over-expression of the homeolog NbenIDA1A advanced the timing of both corolla senescence and abscission and negatively affected the growth of N. benthamiana plants. The results obtained using the VIGS approach showed that the pair of NbenIDA1 homeologs and the NbenHAE.1 receptor, possibly acting as a signaling module similar to that described in Arabidopsis, regulate corolla abscission in N. benthamiana flowers. This is therefore the first example in a plant species other than Arabidopsis thaliana that indicates that the IDA-HAE/HSL2 abscission signaling module is conserved in angiosperms. / Ventimilla Llora, D. (2021). The abscission regulatory module INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION (IDA) / HAESA (HAE)-like receptor kinases in Solanaceae species: Functional analysis in Nicotiana benthamiana [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167777 / TESIS

[ES] La leucemia mieloide aguda (LMA) se trata de un grupo heterogéneo de desórdenes hematológicos producidos por alteraciones genéticas en las células precursoras mieloides. Las mutaciones en la enzima Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son unas de estas alteraciones. Las mutaciones más frecuentes en esta proteína afectan a las posiciones R140 y R172, provocando una ganancia de función con la producción del oncometabolito D-2-hidroxiglutarato (2-HG). A pesar de que ambas inducen la producción de 2-HG, la mutación R172 produce mayor cantidad de oncometabolito, presenta menos concurrencias con otras alteraciones genéticas y se asocia a una peor respuesta a la quimioterapia y un mayor riesgo de recaída. Los modelos de investigación han permitido conocer el papel de las mutaciones genéticas en el desarrollo de la enfermedad. A pesar de ello, es necesario desarrollar nuevos modelos que expresen de forma endógena estas mutaciones para estudiar en profundidad las vías moleculares afectadas. Por todo ello, en esta Tesis se han desarrollado nuevas estrategias de edición génica mediante el sistema CRISPR/Cas9 con el objetivo de desarrollar nuevos modelos in vitro e in vivo de mutaciones implicadas en LMA. Debido a la baja eficiencia de transfección de los plásmidos CRISPR en las líneas celulares leucémicas, el método más empleado para introducir los elementos CRISPR han sido principalmente vectores lentivirales. Para evitar los inconvenientes de este tipo de vectores, en esta Tesis se ha desarrollado una estrategia alternativa para la introducción de la nucleasa Cas9 y los guías CRISPR. El gen codificante de la Cas9 se introdujo en el genoma de células NB4 mediante transducción con lentivirus, generando una línea celular con expresión constitutiva de la nucleasa. Por otro lado, se desarrolló un sistema sencillo de producción de los guías CRISPR mediante PCR con los elementos esenciales para su expresión y la expresión del reportero GFP de forma opcional. Con el objetivo de optimizar la técnica y probar su eficiencia en distintas dianas se modificaron dos genes implicados en LMA. Estos fueron el gen IDH2, en el cuál se buscó introducir la mutación R172, y el gen MYBL2. Finalmente, las eficiencias de edición obtenidas se compararon con el uso de complejos de ribonucleoproteínas CRISPR, muy utilizados por su alta eficiencia. Mientras que los complejos de ribonucleoproteínas presentaron una mayor eficiencia de corte, la eficiencia de edición de la mutación R172 fue similar en ambas estrategias. Mediante secuenciación masiva se confirmó y caracterizó esta edición y se comprobó que la maquinaria de edición no había producido cortes inespecíficos en regiones similares del genoma. Por tanto, la nueva metodología desarrollada permitió editar de forma precisa líneas celulares leucémicas con eficiencias similares a otras técnicas CRISPR más extendidas y sin producir efectos inespecíficos no deseados. Por otro lado, gracias a la gran conservación evolutiva del gen IDH2, los residuos R140 y R172 se encuentran conservados en la proteína idh-2 de Caenorhabditis elegans. Se empleó la estrategia co-CRISPR para desarrollar y seleccionar cepas mutantes con las mutaciones ortólogas a R140 y R172, y una cepa con ambas mutaciones. A pesar de la conservación, no se observó el aumento del oncometabolito 2-HG esperado en las cepas mutantes en comparación con la cepa salvaje control N2. Un estudio exhaustivo de las vías implicadas nos serviría para desarrollar modelos de investigación con las alteraciones moleculares observadas en los pacientes. Para concluir, la estrategia desarrollada de introducción de elementos CRISPR en líneas celulares, junto a los modelos producidos en C. elegans, permitirán en futuros estudios investigar en detalle los efectos moleculares de mutaciones detectadas en pacientes de LMA, su implicación en el desarrollo y pronóstico de la LMA y comprender su papel en la estratificación de los pacientes. / [CA] La leucèmia mieloide aguda (LMA) es tracta d'un grup heterogeni de desordres hematològics produïts per alteracions genètiques en les cèl·lules precursores mieloides. Les mutacions en l'enzim Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son d'aquestes alteracions. Les mutacions més freqüents en aquesta proteïna afecten a les posicions R1240 i R172, produint un guany de funció amb la producció de l'oncometabolit D-2-hidroxiglutarat (2-HG). A pesar que ambdues indueixen la producció de 2-HG, la mutació R172 produeix mes quantitat de oncometabolit, presenta menys co ocurrències con altres alteracions genètiques i s'associa a una pitjor resposta a la quimioteràpia i un major risc de recaiguda. Els models d'investigació han permés conéixer el paper de les mutacions genètiques en el desenvolupament de la malaltia. Malgrat això, és necessari desenvolupar nous models que expressen de manera endògena aquestes mutacions per a estudiar en profunditat les vies moleculars afectades. Per tot això, en aquesta Tesis s'han desenvolupat noves estratègies d'edició gènica mitjançant el sistema CRISPR/Cas9 amb l'objectiu de desenvolupar nous models in vitro i in vivo de les mutacions implicades en la LMA. Degut a la baixa eficiència de transfecció dels plasmids CRISPR en les línies cel·lulars leucèmiques, el mètode més emprat per a introduir els elements CRISPR han sigut principalment vectors lentivirals. Per a evitar els inconvenients d'aquesta mena de vectors, en aquesta Tesis s'ha desenvolupat una estratègia alternativa per a la introducció de la nucleasa Cas9 i els guies CRISPR. El gen codificant de la Cas9 es va introduir al genoma de cèl·lules NB4 mitjançant transducció amb lentivirus, generant una línia cel·lular amb expressió constitutiva de la nucleasa. D'altra banda, es va desenvolupar un sistema fàcil de producció dels guies CRISPR mitjançant PCR amb els elements essencials d'expressió i amb l'expressió del reporter GFP de manera opcional. Amb l'objectiu d'optimitzar la tècnica i provar la seua eficiència en diferents dianes es van modificar dos gens implicats en LMA. Aquests van ser el gen IDH2, en el qual es va buscar introduir la mutació R172, i el gen MYBL2. Finalment, les eficiències d'edició obtingudes amb la nova estratègia es van comparar amb l'ús de complexos ribonucleotproteïnes CRISPR, molt utilitzats per la seua alta eficiència. Mentre que els complexos de ribonucleoproteïnes van presentar una major eficiència de tall, l'eficiència d'edició de la mutació R172 va ser similar en les dues estratègies. Mitjançant seqüenciació massiva es va confirmar i caracteritzar aquesta edició i es va comprovar que la maquinària d'edició no havia produït talls inespecífics en regions similars del genoma. D'aquesta manera, la nova metodologia desenvolupada permet editar de manera precisa línies cel·lulars leucèmiques amb eficiències similars a altres tècniques CRISPR més esteses i sense produir efectes inespecífics no desitjats. D'altra banda, gràcies a la gran conservació evolutiva del gen IDH2, els residus R140 i R172 es troben conservats en la proteïna idh-2 de Caenorhabditis elegans. Es va utilitzar l'estratègia co-CRISPR per a desenvolupar i seleccionar ceps mutants amb les mutacions ortòlogues a R140 i R172, i un cep amb dues mutacions. Malgrat l'alta conservació, no es va observar l'augment del oncometabolit 2-HG esperat en els ceps mutants en comparació amb el cep salvatge control N2. Un estudi exhaustiu de les vies implicades ens serviria per a desenvolupar models d'investigació amb les alteracions moleculars observades en els pacients. Per a concloure, l'estratègia desenvolupada d'introducció d'elements CRISPR en línies cel·lulars, al costat dels models produïts en C. elegans permetran en estudis futurs investigar detalladament els efectes moleculars de mutacions detectades en pacients, la seua implicació en el desenvolupament i prognosi de la LMA i comprendre el seu paper en l'estratificació dels pacients. / [EN] Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a heterogeneous group of haematological disorders caused by genetic alterations in myeloid precursors. Mutations in the Isocitrate dehydrogenase enzyme are among these alterations. The most frequent mutations in this protein affect R140 and R172 positions, leading to a gain of function with the production of the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (2-HG). Although both induce the 2-HG production, the R172 mutation generates greater amount of oncometabolite, has fewer co-occurrences with other genetic alterations and is associated with worse chemotherapy response and higher relapse risk. Research models have made possible to study the role of genetic mutations in disease development. Despite this progress, new models with endogenous expression of these mutations are needed to study in depth the molecular pathways involved. Therefore, in this Thesis we have developed new gene editing strategies using the CRISPR/Cas9 system with the aim of developing new in vitro and in vivo models of mutations involved in AML. Regarding in vitro model, due to the low transfection efficiency of CRISPR plasmids in leukemic cell lines, the most commonly method used for introducing CRISPR elements have been mainly lentiviral vectors. To avoid the disadvantages of this type of vectors, in this Thesis we have developed an alternative strategy for introducing Cas9 nuclease and CRISPR guides. The gene encoding the Cas9 was introduced into NB4 genome by lentiviral transduction producing a stable cell line that constitutively express the nuclease. On the other hand, a simple system for the production of CRISPR guides by PCR with essential elements of expression was developed and with GFP reporter expression optionally. In order to optimise the technique and test its efficiency in different targets, two genes involved in AML were modified. These were IDH2 gene, in which R172 mutation was introduced, and MYBL2 gene. Finally, editing efficiencies obtained with the new strategy were compared with CRISPR ribonucleoproteins methodology, widely used for its high efficiency. Whereas ribonucleoprotein complexes showed higher cut efficiencies, the efficiency of edition of R172 mutation efficiency was similar in both strategies. These results were validated and characterized by means of next generation sequencing, and no off-target effects were found. Therefore, the new developed methodology allows precise gene editing in leukemic cell lines with similar efficiencies with other popular CRISPR techniques and without off-target effects. On the other hand, thanks to the high evolutive conservation of IDH2 gene R140 and R172 residues are conserved in Caenorhabditis elegans idh-2 protein. The co-CRISPR strategy was used to produce and select mutant strains with ortholog mutations to R140, R172 and one strain with both mutations. Despite the high conservation, the expected increase in oncometabolite 2-HG concentration was not detected in mutant strains compared to the N2 wild type strain. A comprehensive study of the pathways involved would help us to develop a research model with molecular alterations noticed in patients. In conclusion, the new developed strategy for CRISPR elements introduction in cell lines, together with C. elegans models, will allow an in-depth research of molecular effect of mutations detected in patients, its implication in AML progression and prognosis and understand their role in patient stratification. / González Romero, E. (2022). Investigación de la Leucemia Mieloide Aguda mediante el desarrollo de modelos in vitro e in vivo [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181891 / TESIS

El trabajo realizado en la Tesis Doctoral llega a las siguientes conclusiones:1.- T. halophila muestra una relación en peso raíz/parte aérea mayor que A. thaliana, y esta diferencia se ve incrementada en condiciones de estrés salino, lo que podría suponer una ventaja para afrontarlo.2.- El estrés salino produce en A. thaliana mayores reducciones en la absorción y en las concentraciones internas de K+ que en T. halophila, a la vez que T. halophila presenta menor absorción de Na+ y transporte a la parte aérea que A. thaliana. Ambas circunstancias resultan en una mayor relación K+/Na+ en T. halophila, lo que puede suponer una mayor tolerancia a la salinidad.3.- El gen ThHAK5 codifica para un transportador que media un transporte de K+ de alta afinidad en levaduras similar al observado en las plantas de T. halophila lo que sugiere que este transportador juega un papel fundamental en la absorción de K+ en el rango de la alta afinidad en esta especie vegetal.4.- Aunque AtHAK5 y ThHAK5 presentan una gran homología de secuencia y unas características funcionales similares, la regulación de los genes que los codifican difieren en condiciones salinas. Así, la salinidad reduce en menor medida la inducción de ThHAK5 por ayuno de K+. En consecuencia, la absorción de K+ de alta afinidad está menos afectada por la presencia de NaCl en el medio externo en T. halophila.5.- La mutagénesis al azar permite encontrar aminoácidos importantes para la función de las proteínas y ésta ha permitido identificar dos versiones mutantes del transportador de K+ de alta afinidad AtHAK5 más eficientes, capaces de transportar K+ a concentraciones externas de Na+ muy elevadas (0.1 mM K+ y 800 mM Na+). / The work done in this Thesis provides some interesting conclusions:1.- Thellungiella halophila show a weight ratio root/shoot bigger than Arabidopsis thaliana, and this difference arise under salt stress, what might provide an effective mechanism of salt tolerance to T. halophila.2.- In A. thaliana, salt stress induces a bigger reduction of K+ uptake and tissue concentrations than in T. halophila, and at the same time T. halophila shows a reduced Na+ uptake and Na+ transport to the shoot. Both properties enable a higher ratio K+/Na+ in T. halophila which might be another mechanism of salt tolerance. 3.- The ThHAK5 gene isolated in this Thesis, encode a K+ transporter that mediates high affinity K+ transport in Saccharomyces cerevisiae similar to the observed in intact plants of T. halophila, which suggest a key role of this transporter in the high affinity range of concentrations.4.- Although AtHAK5 and ThHA5 shows high sequence homology and similar functional properties, gene regulation is different under salt stress. Thus, salinity reduces to a lesser extent the K+-starvation ThHAK5 induction. As a consequence, high affinity K+ uptake is less affected by NaCl in T. halophila. 5.- Random mutagenesis allows the identification of important aminoacids for protein function, and with this technique two more efficient mutant versions of AtHAK5 have been isolated. The evolved AtHAK5 mutant versions are able to transport K+ at high Na+ external concentrations (0.1 mM K+ and 800 mM Na+) in yeast.

Para avanzar en el entendimiento de las vías de señalización moleculares involucradas en la progresión de cáncer tumoral, se construyo una plataforma personalizada de cDNAs, la cual contiene genes de vías de señalización representativas para investigar la respuesta dinámica temporal a hormonas (progesterona y estradiol) empleando como modelo la línea celular T47D-MTVL e inhibidores específicos de las vías de señalización. Adicionalmente, se realizó un análisis de los perfiles de expresión de un grupo de tumores de mama encontrando buena correlación con los datos clínico-histopatológicos y mostrando como fenotipos específicos correlacionan con mal pronóstico. Los genes más significativos capaces de discriminar entre los fenotipos de tumor fueron determinados, y probados sobre un nuevo grupo de muestras, asignándolas a los subtipos predichos. El análisis de las vías de señalización de los genes más significativos de cada fenotipo fue realizado para elucidar las vías moleculares más representativas afectadas en cada clase de tumor.

[ES] El correcto desarrollo de tejidos vasculares depende del ajuste preciso entre la proliferación de células vasculares y la diferenciación celular. En Arabidopsis thaliana, la proliferación de células vasculares en el cambium es potenciada por la citoquinina, la síntesi de la cual está promovida por la actividad dependiente de auxina de un heterodímero de factores de transcripción (TF) formado por LONESOME HIGHWAY (LHW) y por TARGET OF MONOPTEROS 5 (TMO5). Como mecanismo de seguridad, las auxinas también activan un módulo inhibidor que implica la inducción precisa de la Termospermina (Tspm) sintasa ACAULIS5 (ACL5) en células vasculares proliferantes por acción conjunta de las auxinas y del TF Class III HD-ZIP (C3HDZ) AtHB8. Entonces, la Tspm permite la traducción de las proteínas SACL de forma celular autónoma, que perjudican la actividad de LHW. Sin embargo, la observación de que estos elementos están presentes en los genomas de todas las plantas terrestres - y no sólo de las plantas vasculares - plantea dos preguntas desde una perspectiva evolutiva: (i) ¿cuál es la función de estos genes en las plantas terrestres no vasculares? y (ii) ¿cuándo se creó el módulo regulador concreto? En esta Tesis, mediante la combinación de análisis filogenéticos, celulares y moleculares con la hepática Marchantia polymorpha, proponemos que la auxina y C3HDZ son reguladores ancestrales de la expresión de ACL5, y que esta conexión se mantiene en las traqueófitas y las briófitas existentes. Por el contrario, la traducción dependiente de Tspm de SACL parece ser específica de las traqueófitas, basado en la aparición de un uORF conservado en la secuencia 5' líder de los tránscritos de SACL y en evidencia experimental basada en ensayos transitorios para la traducción de SACL. De acuerdo con estas observaciones, las funciones de MpACL5 y MpSACL son diferentes en M. polymorpha. MpACL5 se expresa en "notches" apicales y modula la bifurcación de los meristemos. Por otro lado, la expresión de MpSACL está mayoritariamente excluida de los "notches" apicales y su actividad afecta negativamente la producción de gemas y rizoides mediante la interacción con MpRSL1. Finalmente, la hibridación de ARN in situ de ortólogos de C3HDZ, ACL5 y SACL en la gimnosperma Ginkgo biloba, el helecho Ceratopteris richardii y la licófita Selaginella kraussiana indican que la expresión de los tres genes se solapa en los tejidos vasculares. Nuestros resultados sugieren que la función de C3HDZ, ACL5 y SACL ha seguido trayectorias evolutivas divergentes en briófitas y traqueófitas, para controlar, finalmente, diferentes funciones específicas dentro de cada linaje. Sólo en las traqueófitas se formó el módulo regulador y se asoció con la restricción de la proliferación de células vasculares. / [CA] El correcte desenvolupament dels teixits vasculars depèn del precís ajust entre la proliferació de cèl·lules vasculars i la diferenciació cel·lular. En Arabidopsis thaliana, la proliferació de cèl·lules vasculars al càmbium és potenciada per la citoquinina, la síntesi de la qual està promoguda per l'activitat dependent d'auxina d'un heterodímer de factors de transcripció (TF) format per LONESOME HIGHWAY (LHW) i TARGET OF MONOPTEROS 5 (TMO5). Com a mecanisme de seguretat, l'auxina també activa un mòdul inhibidor que implica la inducció precisa de la Termospermina (Tspm) sintasa ACAULIS5 (ACL5) en cèl·lules vasculars proliferants per l'acció conjunta de l'auxina i del TF Class III HD-ZIP (C3HDZ) AtHB8. Llavors, la Tspm permet la traducció de les proteïnes SACL de forma autònoma cel·lular, que perjudiquen l'activitat de LHW. Tanmateix, l'observació de que aquests elements estan presents en els genomes de totes les plantes terrestres - i no només de les plantes vasculars - planteja dues preguntes des d'una perspectiva evolutiva: (i) quina és la funció d'aquests gens en les plantes terrestres no vasculars? i (ii) quan es va crear el mòdul regulador complet? En aquesta Tesi, mitjançant la combinació d'anàlisis filogenètics, cel·lulars i moleculars amb la hepàtica Marchantia polymorpha, proposem que l'auxina i C3HDZ són reguladors ancestrals de l'expressió d'ACL5, i que aquesta connexió es mantén en els traqueòfits i briòfits existents. Per contra, la traducció depenent de Tspm de SACL sembla ser específica dels traqueòfits, basat en l'aparició d'un uORF conservat a la seqüència 5' líder dels trànscrits de SACL i en evidència experimental basada en assajos transitoris per a la traducció de SACL. D'acord amb aquestes observacions, les funcions de MpACL5 i MpSACL són diferents a M. polymorpha. MpACL5 s'expressa en "notch" apicals i modula la bifurcació dels meristems. D'altra banda, l'expressió de MpSACL està majoritàriament exclosa dels "notch" apicals i la seva activitat afecta negativament la producció de gemmes i rizoids mitjançant la interacció amb MpRSL1. Finalment, la hibridació d'ARN in situ d'ortòlegs de C3HDZ, ACL5 i SACL a la gimnosperma Ginkgo biloba, la falguera Ceratopteris richardii i el licòfit Selaginella kraussiana indica que l'expressió dels tres gens es solapa als teixits vasculars. Els nostres resultats suggereixen que la funció de C3HDZ, ACL5 i SACL va seguir trajectòries evolutives divergents en briòfits i traqueòfits, per controlar, finalment, diferents funcions específiques dins de cada llinatge. Només en els traqueòfits es va formar el mòdul regulador i es va associar amb la restricció de la proliferació de cèl·lules vasculars. / [EN] The correct development of vascular tissues depends on the precise adjustment between vascular cell proliferation and cell differentiation. In Arabidopsis thaliana, vascular cell proliferation in the cambium is enhanced by cytokinin, whose synthesis is promoted by the auxin-dependent activity of a transcription factor (TF) heterodimer formed by LONESOME HIGHWAY (LHW) and TARGET OF MONOPTEROS 5 (TMO5). As a safety mechanism, auxin also deploys a negative feedforward regulatory module which involves the precise induction of the Thermospermine (Tspm) synthase ACAULIS5 (ACL5) in proliferating vascular cells by the joint action of auxin and the class-III HD-ZIP (C3HDZ) AtHB8 TF. Tspm then allows the cell-autonomous translation of the SACL proteins, which impair the activity of LHW. However, the observation that these elements are present in the genomes of all land plants -and not only vascular plants- poses two questions from an evolutionary perspective: (i) what is the function of these genes in non-vascular land plants? and (ii) when was the full regulatory module assembled? In this Thesis, through the combination of phylogenetic, cellular, and molecular genetic analyses with the liverwort Marchantia polymorpha, we propose that auxin and C3HDZ are ancestral regulators of ACL5 expression, and that this connection is maintained in extant tracheophytes and bryophytes. On the contrary, thermospermine-dependent translation of SACL seems to be specific of tracheophytes, based on the appearance of a conserved uORF in the 5' leader sequence of SACL transcripts and on experimental evidence using transient assays for SACL translation. In agreement with these observations, the functions of MpACL5 and MpSACL are different in M. polymorpha. MpACL5 is expressed in apical notches and modulates meristem bifurcation. On the other hand, MpSACL expression is mostly excluded from apical notches and its activity negatively affects gemmae and rhizoid production through the interaction with MpRSL1. Finally, in situ RNA hibridization of C3HDZ, ACL5 and SACL orthologs in the gymnosperm Ginkgo biloba, the fern Ceratopteris richardi and the lycophyte Selaginella kraussiana indicates that the expression of the three genes overlaps in vascular tissues. Our results suggest that the function of C3HDZ, ACL5 and SACL followed divergent evolutionary trajectories in bryophytes and tracheophytes, to ultimately control different lineage-specific functions. Only in tracheophytes was the regulatory module assembled and associated with the restriction of vascular cell proliferation. / Solé Gil, A. (2023). Origin & Evolution of the C3HDZ-ACL5-SACL Regulatory Module in Land Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/196681

Tesis por compendio / [ES] La producción en acuicultura se ha visto menguada por aparición de enfermedades en los sistemas de cría de peces. En concreto, en la dorada (Sparus aurata), hay dos parásitos destacados: Enteromyxum leei (Myxozoa) y Enterospora nucleophila (Microsporidia). Hasta la fecha, para ninguno de los dos se ha establecido un cultivo in vitro, y solo para E. leei se ha conseguido establecer un modelo de mantenimiento de la infección in vivo. La presente tesis pretende incrementar el conocimiento sobre estos parásitos y sus relaciones con el hospedador, sentando las bases para generar soluciones que puedan ser aplicadas en la acuicultura. El objetivo con E. leei fue estudiar la inmunidad adquirida inducida en la dorada y la posibilidad de generar herramientas de diagnóstico y vacunas frente a esta enfermedad. Para ello, primero se demostró la resistencia del pez al parásito tras una segunda exposición, la cual duró hasta 16 meses. Además, la resistencia parece estar correlacionada con altos niveles de inmunoglobulina (Ig) M específica en sangre, y una alta expresión de Igs, incluso antes de la re-exposición al parásito. El siguiente paso fue afinar el protocolo de infección con E. leei. Los resultados mostraron que una semana es suficiente para transmitir la infección de E. leei por efluente, independientemente de la temperatura. Tras la demostración de la respuesta adaptativa eficaz frente a E. leei, y al disponer de un modelo de infección refinado, se realizó un ensayo de inmunización pasiva. Aquí, los resultados mostraron que los anticuerpos especi'ficos efectivamente consigue ralentizar la invasión del intestino por el parásito y disminuir los síntomas de la enfermedad. Paralelamente, el resultado del análisis del repertorio de las regiones variables de la IgM e IgT del intestino peces resistentes mostró la inducción de una respuesta policlonal en las ce'lulas B. En base a estos resultados, se realizó una búsqueda de antígenos de E. leei que pudieran ser utilizados como candidatos para la producción de vacunas (análisis proteómico) o herramientas de diagnóstico (análisis in silico). Para ello, se ensambló un transcriptoma de novo utilizando una muestra mixta de intestino de dorada y parásito. Los resultados dieron lugar a 7 y 12 candidatos en la búsqueda in silico y proteómica, respectivamente. En los estudios de E. nucleophila, debido a que fue descrita muy recientemente, el punto de partida fue más básico. Las muestras de este parásito solo se pueden obtener de brotes naturales en piscifactorias. Por ello, primero se realizó un estudio de caracterización de la patología de la infección a partir de peces infectados naturalmente. En etapas tempranas de la infección, el parásito se localiza principalmente en el intestino, pero meses después, la prevalencia en intestino baja e incrementa en los órganos hematopoyéticos y el esto'mago. Los signos clínicos de la infección consistieron en una reducción significativa del crecimiento, emaciación, y palidez de las paredes intestinales. A nivel celular, en los casos ma's graves se observó hipercelularidad en el epitelio intestinal y proliferación de ce'lulas rodlet, un elevado número de linfocitos en la base del epitelio e infiltración de granulocitos acidófilos en el epitelio intestinal. Finalmente se probaron varias formas de transmisión horizontal de E. nucleophila (cohabitación, efluente, intubación oral y anal) con para desarrollar un modelo de mantenimiento in vivo. Se consiguió la transmisión el parásito por todas las vías, pero con una disminución de prevalencia a lo largo del tiempo. Variables como la temperatura, la dosis, y el estado de los peces donantes parecen ser más determinantes que la ruta seleccionada para la transmisión. Entre las rutas probadas, la intubación anal parece ser la más prometedora, pero ninguna de ellas fue capaz de reproducir los signos clínicos observados en las infecciones naturales. / [CA] La producció en aqüicultura s'ha vist minvada per aparició de malalties en els sistemes de cria de peixos. En concret, en l'orada (Sparus aurata), hi ha dos paràsits destacats: Enteromyxum leei (Myxozoa) i Enterospora nucleophila (Microsporidia). Fins avui, per a cap dels dos s'ha establert un cultiu in vitro, i només per a E. leei s'ha aconseguit establir un model de manteniment de la infecció in vivo. La present tesi pretén incrementar el coneixement sobre aquests paràsits i les seves relacions amb l'hoste, establint les bases per a generar solucions que puguin ser aplicades en l'aqüicultura. L'objectiu amb E. leei va ser estudiar la immunitat adquirida induïda en l'orada i la possibilitat de generar eines de diagnòstic i vacunes enfront d'aquesta malaltia. Per a això, primer es va demostrar la resistència del peix al paràsit després d'una segona exposició, la qual va durar fins a 16 mesos. A més, la resistència sembla estar correlacionada amb alts nivells d'immunoglobulina (Ig) M específica en sang, i una alta expressió de Igs, fins i tot abans de la re-exposició al paràsit. El següent pas va ser afinar el protocol d'infecció amb E. leei. Els resultats van mostrar que una setmana és suficient per a transmetre la infecció de E. leei per efluent, independentment de la temperatura. Després de la demostració de la resposta adaptativa eficaç enfront de E. leei, i en disposar d'un model d'infecció refinat, es va realitzar un assaig d'immunització passiva. Aquí, els resultats van mostrar que els anticossos específics efectivament aconsegueix alentir la invasió de l'intestí pel paràsit i disminuir els símptomes de la malaltia. Paral·lelament, el resultat de l'anàlisi del repertori de les regions variables de la IgM i IgT de l'intestí peixos resistents va mostrar la inducció d'una resposta policlonal en les cèl·lules B. Sobre la base d'aquests resultats, es va realitzar una cerca d'antígens de E. leei que poguessin ser utilitzats com a candidats per a la producció de vacunes (anàlisis proteómico) o eines de diagnòstic (anàlisi in silico). Per a això, es va assemblar un transcriptoma de novo utilitzant una mostra mixta d'intestí d'orada i paràsit. Els resultats van donar lloc a 7 i 12 candidats en la cerca in silico i proteòmica, respectivament. En els estudis de E. nucleophila, pel fet que va ser descrita molt recentment, el punt de partida va ser més bàsic. Les mostres d'aquest paràsit només es poden obtenir de brots naturals en piscifactorias. Per això, primer es va realitzar un estudi de caracterització de la patologia de la infecció a partir de peixos infectats naturalment. En etapes primerenques de la infecció, el paràsit es localitza principalment en l'intestí, però mesos després, la prevalença en intestí baixa i incrementa en els òrgans hematopoètics i l'estómac. Els signes clínics de la infecció van consistir en una reducció significativa del creixement, emaciació, i pal·lidesa de les parets intestinals. A nivell cel·lular, en els casos més greus es va observar hipercelularidad en l'epiteli intestinal i proliferació de cèl·lules rodlet, un elevat nombre de limfòcits en la base de l'epiteli i infiltració de granulòcits acidòfils en l'epiteli intestinal. Finalment es van provar diverses formes de transmissió horitzontal de E. nucleophila (cohabitació, efluent, intubació oral i anal) amb per a desenvolupar un model de manteniment in vivo. Es va aconseguir la transmissió el paràsit per totes les vies, però amb una disminució de prevalença al llarg del temps. Variables com la temperatura, la dosi, i l'estat dels peixos donants semblen ser més determinants que la ruta seleccionada per a la transmissió. Entre les rutes provades, la intubació anal sembla ser la més prometedora, però cap d'elles va ser capaç de reproduir els signes clínics observats en les infeccions naturals. / [EN] Aquaculture production is hampered by the emergence of parasite diseases in fish farming systems. Among them, in Sparus aurata, there are two important enteric parasites described: Enteromyxum leei (Myxozoa) Enterospora nucleophila (Microsporidia). To date, no in vitro culture has been established for either parasite, and only for E. leei was it possible to establish a model for maintaining the infection in vivo. The aim of this thesis is to gain new knowledge about these parasites and their relationship with the host, also the basic foundations for generating solutions that can be applied in aquaculture. The general objective for E. leei was to study the acquired immunity induced in gilthead bream and the possibility of generating diagnostic tools and vaccines against this disease. To this end, resistance against the parasite was assessed with a second exposure against the parasite, which showed a resistance for at least 16 months. Besides resistance seemed to be correlated with high levels of specific immunoglobulin (Ig) M in blood, and a high expression of Igs, in particular, the soluble forms, even before re-exposure to the parasite. The next step was refining the protocol for effluent infection with E. leei by studying infection at different exposure time points, temperatures and population densities. The results showed that one week of exposure is sufficient to spread E. leei infection by effluent, regardless of temperature. After demonstrating the resistance against E. leei, and with a refined infection model, a passive immunization assay was performed. The results showed that the serum with specific antibodies effectively slows down the invasion of the gut by the parasite and reduces the symptoms of the disease. At the same time, the analysis of the repertoire of the variable regions of intestinal IgM and IgT showed an induction of a polyclonal response in B cells. On the basis of these results, a research was carried out for E. leei antigens that could have use as candidates for the production of vaccines (proteomic study) or diagnostic tools (in silico study) using the parasite transcriptomic data. To do this, a de novo transcriptome was assembled using a mixed sample of gilthead sea bream and parasite, with a posterior filtrate of the sequences. The In silico and proteomic analysis search resulted in 7 and 12 transcripts, respectively, which are being used for diagnostic and vaccine production. The starting point was more basic in E. nucleophila studies, since this is a recently described disease. The samples of this parasite can only be obtained from natural outbreaks in fish farms. Therefore, first study was carried out to characterize the pathology of the infection of naturally infected fish. In the early stages of the infection, the parasite is mainly located in the intestine, but months later, the prevalence is lower in the intestine and increases in the hematopoietic organs and the stomach. Clinical signs of infection were significant reduction in growth, wasting, and intestinal walls paleness. At the cellular level, in the most severe cases hypercellularity in the intestinal epithelium, proliferation of rodlet cells, high number of lymphocytes at the base of the epithelium and infiltration of acidophilic granulocytes in the intestinal epithelium were observed. Finally, horizontal transmission of E. nucleophila was tried using different transmission methods: cohabitation, effluent, and oral and anal intubation. Transmission of the parasite was achieved with all routes, but there was a decrease in prevalence over time in all cases except for the anal route. Variables such as temperature, dose, and the status of the donor fish appear to be more important than the selected route. Among the routes tested, anal intubation seemed to be the most promising, as it was sustained over a longer period of time, but none of them was able to reproduce the same clinical signs of infection observed in natural infections. / The authors kindly acknowledge the collaboration of anonymous fish farming companies allowing access to the animals during the disease outbreaks. We thank J. Monfort and L. Rodríguez (IATS-CSIC) for the technical assistance on histological processing.This work has been carried out with financial support from the European Union and the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO) under grant projects ParaFishControl (H2020-634429) and AGL2013-R-48560-C2-2-R, respectively. APS was contracted under ParaFishControl project. Primer sequences and access to the gilthead sea bream transcriptomic database were kindly provided by Prof. J. Pérez-Sánchez of the IATS- Nutrigenomics group. The authors thank I. Vicente for fish maintenance and technical assistance during samplings. The authors thank P. Boudinot (INRAE) for his help in designing and interpreting the immunoglobulin repertoire study and results, J. Pérez-Sánchez (IATS-CSIC) for providing access to the gilthead sea bream genome sequences to perform the repertoire analysis.This work was funded by the European Research Council (ERC Consolidator Grant 2016 725061 TEMUBLYM). / Picard Sánchez, MA. (2021). Control of enteric parasitic diseases of farmed gilthead sea bream: New insights into Enteromyxum leei (Myxozoa) and Enterospora nucleophila (Microsporidia) infections [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/167035 / TESIS / Compendio