El NFAT5 es un factor de transcripción de la familia Rel, la cual incluye a los NFATc y los NF-[kappa]B. Hasta ahora, el NFAT5 había sido caracterizado principalmente como un factor de respuesta a estrés osmótico ya que regula la expresión de genes osmoprotectores y citoquinas en respuesta a hipertonicidad. En este trabajo hemos identificado y caracterizado una nueva función del NFAT5, la regulación de genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activados por la vía de los receptores de tipo Toll (TLR), importantes para la respuesta inmunitaria innata y adaptativa a una amplia variedad de estímulos patogénicos. Nuestros resultados muestran que el NFAT5 es un regulador importante en la ruta de los TLR, jugando un papel en la actividad de varios miembros de esta familia de receptores, tal y como lo hacen los factores de transcripción NF[kappa]B e IRF5. / NFAT5 is a transcription factor of the Rel family, which includes NFATc and NF-[kappa]B. NFAT5 has been mainly characterized as a hypertonicity responsive factor, since it regulates the expression of osmoprotective genes and cytokines in response to osmotic stress. In this work we have identified and characterized a novel role for NFAT5, the regulation of genes (TNF[alfa], IL6, iNOS) activated by the Toll-like receptor pathway (TLR), important for innate and adaptive immunity responses to a wide variety of pathogenic molecules. Our results show that NFAT5 is an important transcription factor of the TLR pathway, playing a role in the activity of several members of this receptor family, like other transcription factors such as NF-[kappa]B and IRF5.

Regulation of transcription by Stress Activated Protein Kinases (SAPKs) is an essential aspect for adaptation to extracellular stimuli. In mammals, the activation of the p38 SAPK results in the regulation of gene expression through the direct phosphorylation of several transcription factors. However, how p38 SAPK regulates the proper gene expression program of adaptation to stress as well as the basic mechanisms used by the SAPK remains uncharacterized. The results displayed in this manuscript show that the p38 SAPK plays a central role in the regulation of gene expression upon stress, as up to 80% of the upregulated genes are p38 SAPK dependent. Moreover, we also observed that a specific set of genes were upregulated in response to each specific stimuli, and just a small set of genes were commonly up-regulated by several stresses, which involves mainly transcription factors. In addition, we observed that, to proper regulate gene transcription, the p38 SAPK is recruited to stress-induced promoters via its interaction with transcription factors. Additionally, p38 activity allows the recruitment of RNA polymerase II and the MAPKK MKK6 to stress-responsive promoters. The presence of active p38 SAPK at open reading frames also suggests the involvement of the SAPK in elongation. Altogether, the results showed in this manuscript establish the p38 SAPK as an essential regulator in the transcriptional response to stress, as well as define new roles for p38 in the regulation of transcription in response to stress. / La regulación de la transcripción por las Proteínas Quinasas activadas por Estrés (SAPKs) es un aspecto esencial para la adaptación a los estímulos extracelulares. En mamíferos, la activación de la SAPK p38 da lugar a la regulación de la expresión génica a través de la fosforilación de varios factores de transcripción. Sin embargo, cómo p38 SAPK regula el programa de expresión génica de adaptación al estrés así como los mecanismos utilizados por la SAPK permanece sin caracterizar. Los resultados presentados en este manuscrito muestran que p38 SAPK juega un rol central en la regulación de la expresión génica en respuesta a estrés, ya que hasta el 80% de los genes inducidos son dependientes de p38 SAPK. También observamos que en respuesta a cada tipo de estrés se induce un grupo de genes específicos, y sólo hay una pequeña respuesta de genes comunes a los diferentes tipos de estrés la cual engloba principalmente factores de transcripción. Además, hemos observado que para regular la transcripción, p38 se recluta a los promotores de respuesta a estrés a través de su interacción con factores de transcripción. Asimismo, la actividad de p38 permite el reclutamiento de la RNA Polimerasa II y de la MAPKK MKK6 a los promotores inducidos por estrés. La presencia de p38 activa en las regiones codificantes sugiere su participación durante la elongación. En conjunto, los resultados mostrados en este manuscrito establecen a p38 como un regulador esencial de la transcripción en respuesta a estrés, así como definen nuevas funciones de p38 en la regulación de la transcripción en respuesta a estrés.

Adaptive responses allow cells to maintain their growth as well as their proliferative potential under diverse stress conditions. It is known that, growth and proliferation can be suppressed by intense stress, but maintained under tolerable stress conditions under which cells can induce compensatory responses. The kinase mTOR is a central regulator of proliferative and growing capacity in mammalian cells, and has been shown to be sensitive to diverse stressors. However, little is known about the role played by mTOR in the adaptive responses that cells utilize to resist stress and maintain their growth capacity. We addressed this question in the context of osmotic stress, to which cells can adapt by inducing the transcription of specialized genes. We showed that mTOR is active under moderate osmostress conditions and regulates the induction of a set of genes by mechanisms dependent and independent of NFAT5, the main transcription factor involved in the transcription of genes upon hypertonic stress. In addition, we observed that the overall set of genes whose induction was sensitive to mTOR activity is enriched in regulators of growth and proliferation. We also have identified REDD1 and REDD2 as two osmostress and mTOR-dependent induced genes, which previously had been characterized in other stress contexts acting as negative regulators of the mTORC1 pathway. We observed that mTOR promoted changes in chromatin predisposing it towards a transcriptional permissive configuration, with higher levels of acetylated histone H4 and increased recruitment of active RNA-pol II to promoters as well as transcribed regions. Altogether, the results described in this thesis reveal a new role for the mTOR kinase in the regulation of gene expression to facilitate the cellular adaptive response upon osmostress. / Las respuestas adaptativas frente al estrés permiten a las células mantener su crecimiento así como su potencial proliferativo. Aunque se ha establecido que el crecimiento y la proliferación celular pueden inhibirse en respuesta a un estrés intenso, en situaciones de estrés tolerable las células pueden mantener su crecimiento y proliferación mediante la inducción de respuestas compensatorias. La quinasa mTOR es una proteína clave para el mantenimiento de la capacidad proliferativa y del crecimiento en las células de mamífero; además se ha descrito que es sensible a varios estreses. Sin embargo, poco se sabe acerca del papel que juega en las respuestas de adaptación que son utilizadas por las células para resistir el estrés y mantener así su capaciad de crecimiento. Nuestro trabajo se ha centrado en el ámbito del estrés osmótico, en cuyo caso las células pueden adaptarse mediante la transcripción de diversos genes especializados. Nuestro estudio demuestra que mTOR se encuentra activo en condiciones moderadas de estrés osmótico y regula la indución de un conjunto de genes mediante mecanismos dependientes e independientes de NFAT5, el principal factor de transcripción responsable de la transcripción de genes en respuesta a un estrés hipertónico. Además, observamos que la mayoría de los genes cuya inducción es sensible a la actividad de mTOR tienen funciones en la regulación del crecimiento y de la proliferación. También hemos identificado a REDD1 y REDD2 como genes que se inducen en respuesta a estrés osmótico dependientes de mTOR, y que con anterioridad se habían caracterizado en otros escenarios de estrés actuando como reguladores negativos de la ruta de señalización de mTORC1. Por último hemos observado que mTOR origina cambios en la cromatina, promoviendo una configuración permisiva para la transcripción, con un incremento de la acetilación de la histona H4 y un aumento en el reclutamiento de la forma activa de la RNA-polimerasa II en los promotores y regiones transcritas de ciertos genes. En resumen, los resultados descritos en esta tesis muestran un nuevo papel de la quinasa mTOR en la regulación de la expresión génica facilitando así la respuesta de adaptación celular frente al estrés osmótico.

[ES] La insuficiencia cardiaca (IC) es un síndrome multifactorial resultado de una compleja red de alteraciones estructurales, funcionales y moleculares que conducen a la progresión de la disfunción ventricular. La IC es denominador común de la mayoría de cardiopatías y su complejidad da lugar a diagnósticos y tratamientos imprecisos que comportan el aumento progresivo de su prevalencia, morbimortalidad y coste sanitario. Es por ello que existe la necesidad de desarrollar nuevas estrategias, a través de la investigación básica y clínica, que permitan diagnósticos más precisos y tratamientos más eficaces que las terapias actuales. Dicha compleja red de alteraciones en la morfología, composición e interacciones entre los distintos componentes del corazón se conoce como remodelado cardiaco. Histopatológicamente, el remodelado se caracteriza por proliferación y migración celular, fibrosis cardiaca, hipertrofia de cardiomiocitos y por muerte celular necrótica y apoptótica. Subyacente a estos procesos podemos encontrar, entre otros, alteraciones del metabolismo del colágeno que pueden conducir a rigidez ventricular y/o debilitamiento de las uniones estructurales y dilatación cardiaca, cuya progresión producirá disfunción ventricular e IC. El principal objetivo de esta tesis es estudiar la fibrosis miocárdica y el remodelado cardiaco en pacientes con IC (miocardiopatía isquémica, MCI; y miocardiopatía dilatada, MCD) a través del análisis de expresión de las moléculas de colágeno, así como investigar la relevancia de las posibles alteraciones de su expresión mediante el estudio de las relaciones con distintos marcadores moleculares del proceso de remodelado y con parámetros de disfunción ventricular. Los resultados obtenidos muestran un aumento en la expresión de colágenos fibrilares y no fibrilares en ambas cardiomiopatías, destacando el porcentaje de genes codificantes de colágenos no fibrilares que se encuentran alterados y que no habían sido descritos en la IC hasta ahora. Los cambios en la expresión de algunos de estos colágenos fueron validados por PCR cuantitativa en tiempo real y, mediante western blot, se determinó que la alteración en la expresión se mantenía a nivel proteico. En cuanto al estudio de la relación entre los cambios de la expresión de estos genes con parámetros de función y remodelado ventricular, así como con marcadores de fibrosis, hipertrofia y apoptosis por ser los principales procesos que subyacen al remodelado cardiaco, observamos que, en la MCI, la sobre-expresión de COL4A5 y COL16A1 está relacionada significativamente con la fracción de acortamiento y con los diámetros tele-sistólico y tele-diastólico del ventrículo izquierdo, respectivamente; mientras que, en la MCD, la sobre-expresión de COL8A1 se relaciona con el índice de masa ventricular izquierdo. Además, encontramos relaciones significativas entre la alteración de estos colágenos y los marcadores moleculares de los principales procesos biológicos que tienen lugar durante el remodelado ventricular. En definitiva, estos resultados confirman la hipótesis de la existencia de una alteración en la expresión de los genes que codifican colágenos fibrilares y no fibrilares que podría estar participando de forma crucial en el desarrollo de remodelado cardiaco, proporcionando nuevas dianas para futuras investigaciones que permitan dilucidar el papel de estos colágenos y ofrecer nuevas opciones terapéuticas para las personas que padecen IC. / [CA] La insuficiència cardíaca (IC) és una síndrome multifactorial resultat d'una complexa xarxa d'alteracions estructurals, funcionals i moleculars que conduïxen a la progressió de la disfunció ventricular. La IC es denominador comú de la majoria de cardiopaties i la seua complexitat dóna lloc a diagnòstics i tractaments imprecisos que comporten l'augment progressiu de la seua prevalença, morbimortalitat i cost sanitari. Es per això que existix la necessitat de desenvolupar noves estratègies, a través de la investigació bàsica i clínica, que permeten diagnòstics més precisos i tractaments més eficaços que les teràpies actuals. Dita complexa xarxa d'alteracions en la morfologia, composició i interaccions entre els distints components del cor es coneix com remodelat cardíac. Histopatològicament, el remodelat es caracteritza per proliferació i migració cel·lular, fibrosi cardíaca, hipertròfia de cardiomiòcits i per mort cel·lular necròtica i apoptótica. Subjacent a estos processos podem trobar, entre altres, alteracions del metabolisme del col·lagen que poden conduir a rigidesa ventricular i/o debilitament de les unions estructurals i dilatació cardíaca, la progressió dels quals produirà disfunció ventricular i IC. El principal objectiu d'esta tesi és estudiar la fibrosi miocardíaca i el remodelat cardíac en pacients amb IC (miocardiopatia isquèmica, MCI; i miocardiopatia dilatada, MCD) a través de l'anàlisi d'expressió de les molècules de col·lagen, així com investigar la rellevància de les possibles alteracions de la seua expressió mitjançant l'estudi de les relacions amb distints marcadors moleculars del procés de remodelat i amb paràmetres de disfunció ventricular. Els resultats obtinguts mostren un augment en la expressió de col·làgens fibril·lars i no fibril·lars en ambdues cardiomiopaties, destacant el percentatge de gens que codifiquen col·làgens no fibril·lars que es troben alterats i que no han sigut descrits en la IC fins ara. Els canvis en la expressió d'alguns d'estos col·làgens, van ser validats per PCR quantitativa en temps real i, mitjançant western blot, es determinà que l'alteració en l'expressió es mantenia a nivell proteic. En quant al estudi de la relació entre els canvis de l'expressió d'aquestos gens amb paràmetres de funció i remodelat ventricular, així com amb marcadors de fibrosi, hipertrofia i apoptosis per ser els principals processos subjacents al remodelat cardíac, vam observar que, en la MCI, la sobre-expressió de COL4A5 i COL16A1 està relacionada significativament amb la fracció d'acurtament i amb els diàmetres tele-sistòlic i tele-diastòlic del ventricle esquerre, respectivament; mentre que, en la MCD, la sobre-expressió de COL8A1 es relaciona amb l'índex de massa ventricular esquerre. A més, trobarem relacions significatives entre l'alteració d'aquestos col·làgens i els marcadors moleculars dels principals processos biològics que es produeixen durant el remodelat ventricular. En definitiva, estos resultats confirmen la hipòtesi de l'existència d'una alteració en la expressió dels gens que codifiquen col·làgens fibril·lars i no fibril·lars que podrien estar participant de forma crucial en el desenvolupament de remodelat cardíac, proporcionant noves dianes per a futures investigacions que permeten dilucidar el paper d'estos col·làgens i oferir noves opcions terapèutiques per a les persones que pateixen IC. / [EN] Heart failure (HF) is a multifactorial syndrome resulting from a complex network of structural, functional and molecular alterations that ultimately lead to ventricular dysfunction. HF is the common denominator in most heart diseases, and its complexity originates imprecise diagnoses and treatments, so that its prevalence, morbidity and mortality increase progressively. For this reason, there is a significant requirement to develop new strategies through basic scientific and clinical research that will enable more accurate diagnoses and more effective treatments than are currently available. The complex network of alterations in the morphology, composition, and interactions between different components of the heart is known as cardiac remodelling. Histopathologically, remodelling is characterised by cell proliferation and migration, fibrosis, cardiomyocyte hypertrophy, and apoptotic and necrotic cell death. Underlying these processes, we have found, among others, alterations in collagen turnover within the myocardium that may lead to ventricular stiffness and/or weakening of structural linkages and cardiac dilation. Progression of these states is accompanied by ventricular dysfunction and HF. The main objective of this thesis is to study myocardial fibrosis and cardiac remodelling in patients with HF (ischaemic cardiomyopathy, ICM, and dilated cardiomyopathy, DCM) through analysis of the expression of collagen molecules, as well as to investigate the relevance of possible alterations in their expression by studying relationships with molecular markers of the remodelling process and with parameters of ventricular dysfunction. Our results show an increase in the expression of both fibrillar and non-fibrillar collagens in both cardiomyopathies, highlighting changes in the number of non-fibrillar collagen genes that have not previously been described in HF. Changes in the expression of some of these collagens were validated by quantitative real-time PCR. Alterations in expression at protein level were shown by western blot. Regarding the relationship between changes in collagen gene expression and parameters of ventricular remodelling and function, as well as with markers of fibrosis, hypertrophy, and apoptosis, the main processes underlying cardiac remodelling, we observed that in patients with ICM, COL4A5 and COL16A1 overexpression is significantly related to the shortening fraction and left ventricular end-systolic and end-diastolic diameters, respectively; whereas in the DCM group, COL8A1 overexpression is related to left ventricular mass index. In addition, we observed significant relationships between the changes in these collagens and established molecular markers for the major biological processes that occur during ventricular remodelling. In conclusion, these results support the hypothesis that alterations in the expression of genes encoding fibrillar and non-fibrillar collagens might be crucially involved in the development of cardiac remodelling. This in turn will identify new targets for future work aimed at elucidating the role of these collagens, and offer new therapeutic options for patients with HF. / “Cinética del transporte núcleo-citoplasmático de los cardiomiocitos humanos en la insuficiencia cardiaca. Análisis celular y de expresión génica”. PI-10/00275, Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS). IP: Dr. J. Miguel Rivera Otero. “Alteraciones moleculares y estructurales en la insuficiencia cardiaca”. RD12/0042/0003, Red de Investigación Cardiovasular (RIC), Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS). IP: Dr. J. Miguel Rivera Otero. “Transporte núcleo-citoplasma y cambios de expresión génica en la insuficiencia cardiaca. Puesta en marcha de una nueva estrategia terapéutica”. PI-13/00100, Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS). IP: Dr. J. Miguel Rivera Otero. “Seguimiento de pacientes sometidos a trasplante cardiaco. Estudio de marcadores de rechazo implicados en el transporte núcleo-citoplasma”. PI-14/01506, Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS). IP: Dra. Esther Roselló Lletí. “Daño miocárdico y sus consecuencias. Identificación de nuevos biomarcadores en insuficiencia cardiaca”. CB16/11/00261, Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Cardiovasculares (CIBERCV), Instituto de Salud Carlos III. IP: Dr. J. Miguel Rivera Otero. Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). / Gil Cayuela, C. (2019). Estudio del papel físiopatológico del colágeno en la insufíciencia cardiaca. Implicaciones en el remodelado ventricular [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/118657 / TESIS

[ES] Los cilios son estructuras eucariotas complejas conservadas evolutivamente que, proyectando desde la superficie de las células, desempeñan un gran número de funciones biológicas. Los cilios se clasifican tradicionalmente en móviles o sensoriales y en su composición intervienen cientos de proteínas. Este conjunto de genes que codifican para los componentes ciliares se conoce como cilioma. Las mutaciones en el cilioma subyacen a un grupo cada vez mayor de enfermedades multisistémicas altamente pleiotrópicas denominadas globalmente como ciliopatías. Estas enfermedades se caracterizan, entre otros síntomas, por retraso mental, defectos sensoriales y/o trastornos metabólicos. A pesar de que se estima que 1 de cada 1.000 personas está afectada por estas enfermedades, las bases moleculares de las ciliopatías son todavía poco conocidas. El adecuado ensamblaje y funcionalidad del cilio requieren de la expresión estrechamente coordinada de los componentes del cilio; sin embargo, se sabe poco sobre la lógica reguladora que controla la transcripción del cilioma. La mayoría de los genes del cilioma son compartidos tanto por cilios móviles como sensoriales. Los factores de transcripción (FTs) de la familia RFX tienen un papel evolutivamente conservado en la regulación transcripcional del cilioma tanto móvil como sensorial. En los vertebrados, la transcripción del cilioma móvil también está regulada directamente por FoxJ1, un FT de la familia forkhead (FKH). Sin embargo, hasta la fecha, se desconocen los FTs que actúan junto a RFX en la transcripción del cilioma sensorial en cualquier organismo. En este trabajo, hemos identificado a FKH-8, un FT de la familia FKH, como selector terminal del cilioma sensorial de C. elegans. fkh-8 se expresa de forma consistente en las sesenta neuronas sensoriales ciliadas de C. elegans, se une a las regiones reguladoras de los genes del cilioma sensorial, también es necesario para la correcta expresión de los genes del cilioma y actúa de forma sinérgica con el conocido regulador maestro de la ciliogénesis DAF19/RFX. En consecuencia, los mutantes para fkh-8 muestran una amplia gama de defectos de comportamiento en una plétora de paradigmas sensoriales, incluyendo la olfacción, la gustación y la mecano-sensación. Así, hemos identificado, por primera vez, un FT que actúa junto con los FTs de la familia RFX en la regulación directa del cilioma sensorial. Además, nuestros resultados, junto con trabajos anteriores, muestran que los FTs FKH y RFX actúan conjuntamente en la regulación de los cilios tanto móviles como sensoriales, lo que sugiere que esta lógica reguladora podría ser un rasgo evolutivo antiguo anterior a la subespecialización funcional de los cilios. Finalmente, esperamos que los resultados de nuestro trabajo ayuden a entender mejor las bases biológicas de las ciliopatías huérfanas / [CA] Els cilis són estructures eucariotes complexes conservades evolutivament que, projectant des de la superfície de les cèl·lules, exerceixen un gran nombre de funcions biològiques. Els cilis es classifiquen tradicionalment en mòbils o sensorials i en la seua composició intervenen centenars de proteïnes. Aquest conjunt de gens que codifiquen per als components ciliars es coneix com el cilioma. Les mutacions en el cilioma subjauen a un grup cada vegada major de malalties multisistèmiques altament pleiotròpiques denominades globalment com ciliopaties. Aquestes malalties es caracteritzen, entre altres símptomes, per retard mental, defectes sensorials i/o trastorns metabòlics. A pesar que s'estima que 1 de cada 1.000 persones està afectada per aquestes malalties, les bases moleculars de les ciliopaties són encara poc conegudes. L'adequat assemblatge i funcionalitat del cili requereixen de l'expressió estretament coordinada dels components del cili; no obstant això, se sap poc sobre la lògica reguladora que controla la transcripció del cilioma. La majoria dels gens del cilioma són compartits tant per cilis mòbils com sensorials. Els factors de transcripció (FTs) de la família RFX tenen un paper evolutivament conservat en la regulació transcripcional del cilioma tant mòbil com sensorial. En els vertebrats, la transcripció del cilioma mòbil també està regulada directament per FoxJ1, un FT de la família forkhead (FKH). No obstant això, fins hui, es desconeixen els FTs que actuen al costat de RFX en la transcripció del cilioma sensorial en qualsevol organisme. En aquest treball, hem identificat a FKH-8, un FT de la família FKH, com a selector terminal del cilioma sensorial de C. elegans. fkh-8 s'expressa de manera consistent en les seixanta neurones sensorials ciliades de C. elegans, s'uneix a les regions reguladores dels gens del cilioma sensorial, també és necessari per a la correcta expressió dels gens del cilioma i actua de manera sinèrgica amb el conegut regulador mestre de la ciliogènesi DAF-19/RFX. En conseqüència, els mutants per a fkh-8 mostren una àmplia gamma de defectes de comportament en una plètora de paradigmes sensorials, incloent la olfacció, la gustació i la mecano-sensació. Així, hem identificat, per primera vegada, un FT que actua juntament amb els FTs de la família RFX en la regulació directa del cilioma sensorial. A més, els nostres resultats, juntament amb treballs anteriors, mostren que els FTs FKH i RFX actuen conjuntament en la regulació dels cilis tant mòbils com sensorials, la qual cosa suggereix que aquesta lògica reguladora podria ser un tret evolutiu antic anterior a la subespecialització funcional dels cilis. Finalment, esperem que els resultats del nostre treball ajuden a entendre millor les bases biològiques de les ciliopaties òrfenes. / [EN] Cilia are complex evolutionary conserved eukaryotic structures that, projecting from cell surfaces, perform a variety of biological roles. Cilia are traditionally classified into motile or sensory and hundreds of proteins take part in their composition. This set of genes coding for ciliary components is known as the ciliome. Mutations in the ciliome underlie an ever-growing group of highly pleiotropic multisystemic diseases globally termed as ciliopathies. These diseases are characterized, among other symptoms, by mental retardation, sensory defects and/or metabolic disorders. Despite an estimated 1 in 1,000 people affected by these diseases, the molecular bases of the ciliopathies are still poorly understood. Proper cilium assembly and functionality requires the tightly co-regulated expression of ciliary components; however, little is known about the regulatory logic controlling ciliome transcription. Most ciliome genes are shared between motile and sensory cilia. RFX transcription factors (TFs) have an evolutionarily conserved role in the transcriptional regulation of both motile and sensory ciliome. In vertebrates, transcription of motile ciliome is also directly regulated by FoxJ1, a Forkhead (FKH) TF. However, to date, TFs working together with RFX in the transcription of the sensory ciliome are unknown in any organism. In this work, we have identified FKH-8, a FKH TF, as a terminal selector of the sensory ciliome in C. elegans. fkh-8 is consistently expressed within the sixty ciliated sensory neurons of C. elegans, it binds the regulatory regions of the sensory ciliome genes, it is also required for correct ciliome gene expression and acts synergistically with the known master regulator of the ciliogenesis DAF-19/RFX. Accordingly, fkh-8 mutants display a wide range of behavioural defects in a plethora of sensory mediated paradigms, including olfaction, gustation, and mechano-sensation. Thus, we have identified, for the first time, a TF that acts together with RFX TFs in the direct regulation of the sensory ciliome. Moreover, our results, together with previous work, show that FKH and RFX TFs act together in the regulation of both motile and sensory cilia, suggesting this regulatory logic could be an ancient trait pre-dating functional sub-specialization of cilia. Finally, we hope our results could help better understand the biological basis of orphan ciliopathies. / This thesis project has been made possible thanks to a pre-doctoral fellowship from the FPI Programme (BES-2015-072799) conferred by the (now extinct) Spanish Ministry of Economy & Competitivity. The following grants also provided a funding frame throughout the whole research process: “Estudio de los mecanismos transcripcionales que regulan la diferenciación de las neuronas monoaminérgicas y su conservación evolutiva.” SAF2014-56877-R “Dissecting the gene regulatory mechanisms that generate serotonergic neurons and their link to mental disorders.” ERC-St 281920 “Programas de regulación transcripcional asociados a enfermedades genéticas.” SAF2017-84790-R “Regulatory rules and evolution of neuronal gene expression.” ERC-Co 101002203 / Brocal Ruiz, R. (2022). Transcriptional Regulatory Logic of Cilium Formation in C. Elegans [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181667 / TESIS

[ES] A escala mundial, la Citricultura es uno de los sectores dentro de la Fruticultura con mayor producción, superando los 158 millones de toneladas en el año, pero es sensible de un gran número de estreses abióticos al ser un cultivo subtropical. La baja temperatura es uno de los estreses abióticos que más afecta a los cítricos produciendo grandes pérdidas anuales. El cambio climático está muy presente dando lugar cambios en los patrones de El tiempo originando un gran número de olas de frío y calor. Pero gracias a la técnica del injerto y al uso de patrones de cítricos los problemas causados por los estreses abióticos pueden mejorarse. El IVIA cuenta con un programa de mejora de patrones cuyo objetivo es la búsqueda de nuevo material vegetal con el fin de satisfacer los problemas de la citricultura. Tradicionalmente, el patrón más tolerante a la baja temperatura es Poncirus trifoliata, el cual se han realizado la mayoría de los trabajos en la bibliografía. Como patrón sensible, se empleó Citrus macrophylla ya que se trata de un patrón del tipo limonero que se sabe popularmente de su sensibilidad al frío. También se empleó el patrón citrange Carrizo, el cual se trata de patrón comercial más cultivado en España en la actualidad y la variedad Taroco Rosso, que se sabe de su pigmentación a causa de la baja temperatura. Así pues, los capítulos planteados en la presente tesis fueron: 1. Estrés a baja temperatura a corto plazo, 2. Estrés a baja temperatura a largo plazo y 3. El efecto del patrón en la variedad Tarocco Rosso. / [CAT] A escala mundial, la Citricultura és un dels sectors dins de la Fruticultura amb més producció, superant els 158 milions de tones a l'any, però és sensible d'un gran nombre d'estressos abiòtics per ser un cultiu subtropical. La baixa temperatura és un dels estressos abiòtics que més afecta els cítrics produint grans pèrdues anuals. El canvi climàtic està molt present donant lloc a canvis en els patrons de El temps originant un gran nombre d'onades de fred i calor. Però gràcies a la tècnica de l'empelt i a l'ús de patrons de cítrics, els problemes causats pels estressos abiòtics es poden millorar. L'IVIA compta amb un programa de millora de patrons que te com a objectiu la recerca de nou material vegetal per tal de satisfer els problemes de la citricultura. Tradicionalment, el patró més tolerant a la baixa temperatura és Poncirus trifoliata, el qual s'han realitzat la majoria dels treballs a la bibliografia. Com a patró sensible, es va fer servir Citrus macrophylla ja que es tracta d'un patró del tipus llimoner que se sap popularment de la seva sensibilitat al fred. També es va emprar el patró citrange Carrizo, el qual es tracta del patró comercial més cultivat a Espanya actualment i la varietat Taroco Rosso, que se sap de la seva pigmentació a causa de la baixa temperatura. Així doncs, els capítols plantejats en aquesta tesi van ser: 1. Estrès a baixa temperatura a curt termini, 2. Estrès a baixa temperatura a llarg termini i 3. L'efecte del patró en la varietat Tarocco Rosso. / [EN] On a global scale, Citriculture is one of the sectors within Fruit Growing with the highest production, exceeding 158 million tons per year, but it is sensitive to many abiotic stresses as it is a subtropical crop. Low temperature is one of the abiotic stresses that most affects citrus, producing large annual losses. Climate change is very present, giving rise to changes in weather patterns, causing many cold and heat waves. But thanks to the grafting technique and the use of citrus rootstocks, problems caused by abiotic stresses can be improved. IVIA institute has a rootstock improvement program whose objective is to search for new plant material to satisfy the problems of Citriculture. Traditionally, the most low-temperature tolerant rootstock is Poncirus trifoliata, on which most of the work in the literature has been done. As a sensitive rootstock, Citrus macrophylla was used since it is a lemon type rootstock that is popularly known for its sensitivity to cold. The citrange Carrizo rootstock was also used, which is currently the most cultivated commercial rootstock in Spain, and the Taroco Rosso variety, which is known for its pigmentation due to low temperature. Thus, the chapters proposed in this thesis were: 1. Short-term low-temperature stress, 2. Long-term low-temperature stress, and 3. The rootstock effect on the Tarocco Rosso variety. / Primo Capella, MA. (2023). Caracterización fisiológica y molecular de la respuesta de patrones de cítricos a estrés por baja temperatura [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/192892

El sistema TK/GCV es, problamente, la estrategia suicida mejor caracterizada hasta el momento. No obstante, se desconocen muchos aspectos relacionados con su mecanismo de acción. Con el objetivo de indentificar condicionantes de la respuesta TK/GCV, realizamos un estudio comparativo de la expresión de genes y de las vías de señalización que se activan en células sensibles y en células resistentes al tratamiento. Así, pudimos asociar la actividad de la quinasa Chk1, y la expresión de genes involucrados en el control del ciclo celular, con una mayor respuesta al sistema suicida. Así mismo, determinamos que la combinación de TK/GCV con el inhibidor de Chk1 UCN-01 produce un efecto antagónico en las células sensibles a TK/GCV. Por otro lado, la terapia combinada capaz de lisar las células e inducir muerte celular por fosforilación de GCV, en un único agente (ICOVIR11), resultó en una potenciación de sus efectos citotóxicos, permitiendo la compensación de la pérdida de potencia secundaria al uso de un promotor selectivo de tumor. Más aún, la expresión de TK como gen tardío de ICOVIR11,permitió la monitorización in vivo y de manera no invasiva, de la actividad TK y la replicación viral. / Although extensively characterized, the paradigmatic suicide system TK/GCV conceals the details of its ultimate mechanism of action. In order to shed some light on this issue, we conducted a series of experiments with resistant and sensitive cell lines, allowing us to identify cell cyclerelated genes that are deregulated in cells with induced resistance to TK/GCV. In addition, the association of Chk1 activation with a greater sensitivity to TK/GCV, pointed out the relevance of the cell cycle status at the moment of receiving the treatment, and its control in response to genotoxic insults. Treatment with a Chk1 inhibitor induced, in sensitive cells, an antagonistic effect on TK/GCV cytotoxicity. On the other hand, single-agent combination therapy of TK/GCV with adenoviral lysis resulted in enhanced cytotoxicity. In this setting the expression of TK as a late gene in an oncolytic adenovirus minimized the loss of potency associated to the conditioning of viral replication. On top of that, TK expression allowed for in vivo, real time, non-invasive monitoring of viral replication in mice, and was used to analyze the effects of treatment schedule on treatment outcome.

La cocaïna i l’èxtasi (MDMA, 3,4-metilendioximetamfetamina) són drogues psicoestimulants que incrementen l’activitat del sistema nerviós central i perifèric amb efectes com l’augment de l’estat d’alerta, la resistència, la productivitat, la motivació, la locomoció, el ritme cardíac i la pressió sanguínia. Ambdues drogues tenen efectes sobre l’estat d’ànim, tot induint sentiments d’eufòria i provocant plaer i recompensa. El seu consum, principalment per part d’adolescents i adults joves, té conseqüències greus per a la salut, i a la llarga el consum reiterat pot esdevenir crònic donant lloc a abús o dependència. Tant la cocaïna com l’MDMA actuen principalment activant els sistemes de neurotransmissió dopaminèrgica i serotoninèrgica en els circuits neuronals de plaer i de recompensa. La genètica juga un paper molt important en la transició del consum a l’abús i a la dependència: d’una banda totes dues drogues indueixen canvis en l’expressió gènica que estan a la base de les neuroadaptacions i del remodelatge dels circuits neuronals que condueixen al consum crònic, i de l’altra hi ha factors genètics de predisposició a la dependència que poden afavorir el desenvolupament d’aquest fenomen en certs individus. El treball que es presenta en aquesta Tesi Doctoral ha permès identificar variacions en el genoma que predisposen a la dependència de cocaïna, així com alteracions en el transcriptoma de cèl•lules neuronals (in vitro) o de determinades estructures cerebrals (in vivo) causades per l’acció de la cocaïna o de l’MDMA. Així, s’ha estudiat la participació de variants genètiques de susceptibilitat a la dependència de cocaïna mitjançant estudis d’associació de tipus cas–control cobrint sistemes gènics sencers implicats en la neurotransmissió dopaminèrgica i serotoninèrgica, en el control de l’alliberament de neurotransmissors i factors neurotròfics i els seus receptors. S’han avaluat un total 446 variants polimòrfiques en 52 gens, seleccionades mitjançant criteris de cobertura genètica. Els resultats més remarcables són la identificació de dos haplotips de risc per la dependència a cocaïna als gens 5-HT1E i NSF (que codifiquen per un receptor de serotonina i per una proteïna implicada l’alliberament de vesícules de neurotransmissor, respectivament). En el cas de l’haplotip de risc del gen NSF, a més predisposa a la dependència ràpida (en dos o menys anys des de l’inici del consum). També s’ha avaluat l’efecte del tractament agut amb cocaïna sobre l’expressió gènica en cèl•lules humanes SH-SY5Y diferenciades a neurones dopaminèrgiques mitjançant microarrays i l’estudi mostra alteracions en la transcripció de gens implicats en la regulació de la transcripció i expressió gènica, moviment cel•lular i adaptacions neuronals. I finalment, s’ha estudiat l’efecte de l’administració activa i passiva d’MDMA sobre la transcripció gènica en quatre estructures cerebrals de ratolí implicades en el fenomen de recompensa. L’estudi de l’efecte directe del MDMA sobre l’expressió gènica mitjançant la comparació de ratolins que reben una solució salina de forma passiva i ratolins que reben MDMA de forma passiva o activa, mostra alteracions en la transcripció de gens implicats principalment en la funció immunitària i en processos inflamatoris a les quatre estructures cerebrals estudiades. La comparació entre el consum actiu i passiu d’MDMA ha permès identificar canvis d’expressió relacionats amb neuroadaptacions i canvis de plasticitat sinàptica a hipocamp i als nuclis dorsals de rafe. En aquesta última regió cal destacar quatre gens que se sobreexpressen com a conseqüència del consum actiu d’MDMA, tots ells implicats en la plasticitat sinàptica, els canvis en la morfologia de les espines dendrítiques i processos neuronals relacionats amb la memòria i l’aprenentatge: Camk2a, Kalrn, Ddn i Egr3. Aquesta troballa reforçaria la idea que aquesta estructura cerebral podria estar involucrada en el comportament de cerca activa d’MDMA, tot recolzant el potencial addictiu d’aquesta droga. / Cocaine and ecstasy (MDMA, 3,4-metilendioximetamfetamina) are psychostimulant drugs that activate the central and peripheral nervous system increasing alertness, energy and motor activity, motivation, cardiac rate and blood preassure. Both drugs have effects on mood, inducing feelings of well-being, euphoria, pleasure and reward. Cocaine and ecstasy use, mainly used by young people, has serious detrimental health effects, and repeated use can become chronic leading to abuse or dependence. Both drugs exert their main psychostimulant effects by activating the dopaminergic and serotoninergic neurotransmission systems in the brain circuits involved in pleasure and reward. Genetics play an important role in the transition from use to abuse and dependence: on one hand, both drugs induce changes in gene expression that are on the basis of neuroadaptations and neuronal circuit remodeling that lead to the chronic use, on the other hand, there are genetic risk factors that predispose to dependency that can drive the development of addiction in some individuals. The work presented in this Doctoral Thesis has allowed to identify genomic variants that predispose to cocaine dependence, as well as gene expression changes in the transcriptome in in vitro and in vivo models. For this purpose, the participation of susceptibility genetic variants to cocaine dependence have been studied using case-control association studies, covering whole gene systems involved in dopaminergic and serotoninergic neurotransmission, in the control of neurotransmitter release, and also encoding neurotrophic factors and their receptors. It has also been evaluated gene expression changes in a human dopaminergic neuronal model after an acute exposure to cocaine. Finally the effect of active and passive MDMA administration on gene expression in mice has been evaluated in four brain structures involved in reward and reinforcing effects of the drug.

At least eleven histone H1 variants exist in mammalian somatic cells that bind to the linker DNA and stabilize the nucleosome particle contributing to higher order chromatin compaction. In addition of playing a structural role, H1 seems to be involved in the activation and repression of gene expression. It is not well known whether the different variants have specific roles or regulate specific promoters. We have explored this by inducible shRNA-mediated knock-down of each of the H1 variants in a human breast cancer cell line. Rapid inhibition of each H1 variant was not compensated by changes of expression of other variants. A different, reduced subset of genes is altered in each H1 knock-down. Interestingly, H1.2 depletion represses expression of a number of cell cycle genes. This is concomitant with a G1 arrest phenotype observed in this cell line. In addition, H1.2 depletion caused decreased global nucleosome spacing. These effects are specific of H1.2 depletion as they are not complemented by overexpression of other variants and they do not occur in knock-downs for the other variants. Moreover, H1.4 depletion caused cell death in T47D, being the first report of the essentiality of an H1 variant for survival in a human cell type. In addition to this, we have also investigated specificities of H1 subtypes location in particular promoters of interest in our laboratory, as well as specific interactions with other factors by generating HA-tagged H1 variant expressing cell lines. / Al menos once variantes de la histona H1 han sido identificadas en mamíferos, todas ellas se unen al ADN entre nucleosomas contribuyendo así, a la estabilización de la partícula nucleosómica y a la compactación de la cromatina en estructuras de alto orden. Además de jugar un papel estructural, H1 parece estar implicada en la activación y represión de la expresión génica. Se desconoce si las diferentes variantes de H1 tienen funciones específicas o regulan promotores específicos. Con el objetivo de investigar esta hipótesis se han generado líneas celulares que inhiben de forma inducible, mediante la tecnología de ARN interferente, la expresión de cada una de las variantes de forma específica. La inhibición de cada una de las variantes no es compensada por cambios en la expresión del resto de subtipos. Distintos grupos de genes resultan alterados con la depleción de cada una de las variantes de H1. La inhibición de H1.2 reprime la expresión de una serie de genes de ciclo celular, correlacionando con un fenotipo de arresto celular en fase G1 observado en esta línea. Además, la inhibición de H1.2 causa una disminución global del espaciamiento entre nucleosomas. Todos estos efectos parecen ser específicos para la falta de H1.2 ya que no son complementados por la sobreexpresión de otras variantes. Por otro lado, la inhibición de H1.4 causa muerte celular en T47D. Ésta es la primera vez que se describe que una variante de H1 es esencial para la supervivencia de una línea celular humana.En un segundo plano, se han construido líneas celulares con expresión de las variantes de H1 fusionadas al péptido HA, con el objetivo de estudiar la especificidad de su localización en promotores de interés para el grupo, así como interacciones específicas con otros factores celulares.

DYRK1A es uno de los principales genes candidatos que podrían explicar algunos de los defectos neurológicos asociados al fenotipo Síndrome de Down (SD); desde el retraso mental, rasgo común a todos los individuos con SD hasta los déficits motores, también muy frecuentes entre la población con SD. Con el fin de validar la implicación de DYRK1A en el fenotipo SD se ha desarrollado una estrategia de terapia génica basada en la reducción de la expresión del gen mediante interferencia del RNA, en el modelo transgénico TgDyrk1A, y se han evaluado los efectos en el fenotipo motor de estos animales. Además se ha estudiado la implicación de los receptores glutamatérgicos de tipo NMDA en las alteraciones motoras descritas en el modelo. Los resultados obtenidos en este trabajo ponen de manifiesto la validez de la estrategia desarrollada y apuntan a una desregulación de los receptores de NMDA como uno de los mecanismos moleculares subyacentes de las disfunción motora presente en el modelo TgDyrk1A. / The are growing evidences to consider DYRK1A as a candidate gene for some of the neurological alterations present in DS phenotype such as mental retardation which is a common feature in the syndrome, or motor deficits which show a high prevalence among DS individuals. With the aim to validate the contribution of Dyrk1A to DS phenothype, we have developped a gene therapy strategy based on RNA interference to reduce gene expression in the transgenic model TgDyrk1A, and we have evaluated the effects in the motor phenotype of these animals. Moreover, we have studied the implication of the NMDA glutamate receptor in the motor alterations present in the model. The results obtained validate the strategy developped and suggest the deregulation of the NMDA receptor as one of the main causes underlying motor dysfunction in TgDyrk1A mice.