Os gliomas são o tipo de tumor primário cerebral mais comum em adultos. A sobrevida média dos pacientes é de cerca de um ano para pacientes de glioblastoma multiforme, o maior grau de malignidade. As terapias disponíveis atualmente, que incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia, não têm sido eficientes devido a vários fatores, em particular a capacidade invasiva das células tumorais. RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) é um importante gene supressor de tumor cuja atividade anti-tumoral têm sido associada à sua atividade inibitória sobre algumas MMPs. A perda da função de RECK compromete a integridade tecidual, em parte causada pela atividade aumentada das MMPs. A linhagem celular T98G, derivada de glioblastoma multiforme (GBM), apresenta grande capacidade invasiva e níveis elevados de MMP-2 e -9. A fim de avaliar o efeito de RECK na contenção da invasão no modelo de glioma humano, foi feita a superexpressão de RECK nesta linhagem. A expressão de RECK, MMP-2, MMP-9 a MT1-MMP foram avaliadas por qPCR e por western blotting nas células T98G/RECK+ (células T98G superexpressando RECK após transfecção estável utilizando o vetor pCXN2). O potencial invasivo e migratório das células T98G/RECK+foi inibido, verificado por ensaio transwell. Foram observadas nas células T98G/RECK+ alterações importantes no arranjo do citoesqueleto, mas não nas células controle. Arranjos de actina na forma de \"stress fibers\" presentes no clone positivo podem ser responsáveis pela alteração observada na migração. A distribuição de FAK foi avaliada por imunocitoquímica e sua expressão por Western blot, mostrando que RECK só altera a distribuição desta proteína no citoesqueleto celular. Quanto ao potencial de inibição de MMPs, observou-se uma diminuição significativa dos níveis gênicos de MMP-9, mas não em termos protéicos ou de atividade de MMPs. Assim, este trabalho contribui para a discussão do papel de RECK na migração de células do modelo de glioma humano, uma das características responsáveis pela ausência de terapia efetiva deste tipo de tumor. / Malignant gliomas are the most common type of primary brain tumors in adults. Patient survival is less than one year in average for glioblastoma, the most malignant glioma. Therapies available today, which include surgery, radiotherapy and chemotherapy, have not been successful due to several factors, specially the invasiveness of the tumor. RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) is an important tumor suppressor gene whose anti-tumoral activity is associated to its anti-MMPs activity. Lack of functional RECK compromises tissue integrity, in part due to elevated MMPs activity. T98G cells, derived from a human multiform glioblastoma (GBM), were described as a highly invasive glioma cell line, which displays high levels of MMPs 2 and 9. In order to evaluate the effect of RECK in restraining glioma invasion, we overexpressed RECK in these invasive cell line derived from GBM. The expression of RECK, MMP-2, MMP-9 and MT1-MMP was evaluated by qPCR and by western blotting in T98G/RECK+ (T98G cells overexpressing RECK cells, where RECK gene was cloned into the pCXN2 vector generating a stable transfection). The invasion and migration capacity of T98G/RECK+ cells was inhibited in transwell assay. Important cytoskeleton modifications were also observed in T98G/RECK+ cells but not on the control cells. Actin arrangements representing stress fibers on the positive clones may be responsible for motility alteration patterns observed. FAK distribution was assessed through imunocytochemical staining, and its expression evaluated by western blot analyses, showing that RECK forced expression changed the distribution pattern but not FAK expression. Concerning MMPs inhibition, a significant inhibition of MMP-9 gene expression was observed in T98G/RECK+, but neither protein levels nor protein activity were affected. Thus, the present study improves the discussion about RECK role in the migration of glioma cells, an important feature for the failure of current therapies for this kind of tumor.

Os gliomas representam o tipo de tumor primário mais comum do sistema nervoso central. Apesar dos avanços nas técnicas cirúrgicas e de radioterapia e nos protocolos de quimioterapia, não há tratamento eficiente disponível. O ácido retinóico na forma all-trans (atRA) é um agente anti-proliferativo utilizado para o tratamento de alguns tipos de lesões pré-malígnas e tumores, como a leucemia promielocítica. Entretanto, sua utilização no tratamento clínico de tumores sólidos, incluindo os gliomas, é limitada, devido ao rápido desenvolvimento de resistência aos efeitos anti-tumorais do atRA. Para endereçar este problema, foi proposto: a) clonar e analisar a função de cyp26b1 de rato, uma enzima da família dos citocromos P450 envolvida na metabolização de ácido retinóico, previamente descrito em nosso laboratório como potencialmente envolvido na resposta de células de glioma ao tratamento com atRA; b) gerar e caracterizar uma variante da linhagem celular C6 de glioma de rato resistente aos efeitos anti proliferativos de atRA. O cDNA de cyp26b1 de rato, até então desconhecido, foi amplificado, clonado e seqüenciado com sucesso. A seqüência protéica correspondente é conservada e agrupa-se no dendrograma com outras proteínas Cyp26B1, mesmo de organismos distantes como zebrafish, em detrimento de outras proteínas parálogas da família Cyp26. Cyp26b1 é fortemente induzida por atRA em células de glioma de rato e humano, de forma dose-dependente. Embora seja expresso em amostras de cérebros humanos normais e de glioma, não foram encontradas diferenças significativas entre os diferentes graus de matlignidade tumoral, ou em comparação com cérebro normal. A super-expressão de cyp26b1 de rato através de transfecção estável de células de glioma de rato e humano, bem como de células P19 de teratocarcinoma de camundongo, não alterou significativamente as características de crescimento celular, tanto em substrato sólido quanto em substrato semi-sólido. O tratamento prolongado de células C6 de glioma de rato com atRA levou à obtenção de uma população policlonal resistente aos efeitos anti-proliferativos de atRA, a partir da qual uma linhagem celular clonal resistente foi isolada com sucesso. Esta variante clonal, denominada linhagem celular C6R, apresenta inibição de crescimento por atRA diminuída, quando comparada com a linhagem celular C6 parental e com a variante ST1. Além disso, esta variante também mostrou uma tendência, embora não significativa estatisticamente, de gerar tumores maiores quando injetados no subcutâneo de camundongos do tipo nude. A expressão de genes previamente descritos como induzidos pelo tratamento com atRA em células ST1 é fortemente inibida na linhagem celular C6R. Além disso, menor expressão de RARβ, RARγ e CRABP-1 foi também observada em células C6R, enquanto que expressão muito maior de RXRγ e CRABP-2 foi encontrada nas células resistentes a atRA, em comparação com as células C6 parentais. Como conclusões gerais deste trabalho, foi proposto que cyp26b1 parece estar envolvido no metabolismo e detoxificação de atRA e parece não ser efetor da inibição de crescimento induzida por atRA, nem estar relacionado com a resistência de células de glioma ao tratamento com atRA. Por outro lado, o isolamento e caracterização de uma linhagem celular resistente ao tratamento com atRA sugere que a resistência está relacionada à expressão diferencial de receptores de retinóides e de proteínas de ligação ao ácido retinóico. / Gliomas are among the most common primary tumors of the central nervous system. Despite the advances in surgical and radiotherapy procedures and chemotherapy protocols, efficient treatment is still not available. Retinoic acid is a anti-proliferative agent used for treatment of a number of pre-malignant lesions and tumors, as promyelocytic leukemia. However, its clinical use in treatment of solid tumors, including gliomas, is impaired by the rapid development of resistance to the anti-tumoral effects of atRA. In order to address this problem, we proposed: a) to clone and analyze the role of rat cyp26b1, a member of cytochrome P450 superfamily envolved in the metabolization of retinoic acid, which has previously been described by our group as being potentially involved in the response of glioma cells to retinoic acid treatment; b) to generate and characterize a variant of rat C6 glioma cell line resistant to anti proliferative effects of atRA. The previously unknown cDNA of rat cyp26b1 was successfully amplified, cloned and sequenced. The protein is conserved and clustered in dendrograms with other cyp26b1 proteins, even from distant organisms as zebrafish, in detriment of other cyp26 paralogs. Cyp26b1 is strongly induced by atRA in rat and human glioma cells, in a dose-dependent fashion. Although expressed in human normal brains and glioma samples, no significant differences were found among different tumor grades nor comparing to normal brain. Stable-transfection and overexpression of rat cyp26b1 in rat and human glioma cell lines, as well as P19 mouse teratocarcinoma cell line, did not significantly modified cell growth properties, either on solid or semi-solid substrates. Prolonged treatment of C6 rat glioma cell line with atRA leads to isolation of an atRA-resistant polyclonal cell population, from which a resistant clonal cell line was successfully isolated. This clonal variant, named C6R cell line, displayed diminished growth inhibition by atRA compared to the parental C6 cell line and the variant ST1 cell line. In addition, this variant also showed a trend, although not quite statistically significant, to generate larger tumors when xenografted s.c. into nude mice. Expression of genes previously described as being induced by atRA-treatment in ST1 cells is strongly impaired in the C6R resistant cell line. In addition, lower expression of RARβ, RAR&#947 and CRABP-1 was also observed in C6R cells, whereas a much higher expression of RXRγ and CRABP-2 was found in the resistant cells when compared to the parental C6 cells. As general conclusions of this work, we found that cyp26b1 is more likely to be involved in primary atRA metabolism and detoxification and does not seem to be an effector of atRA-induced cell growth arrest nor to be related to the resistance of glioma cells to atRA treatment. On the other hand, isolation and characterization of an atRA-resistant cell line suggests that atRA resistance is more likely to be due to differential expression of retinoid receptors and retinoic acid binding proteins.

Gliomas são tumores altamente invasivos, resistentes aos tratamentos disponíveis atualmente e com alta taxa de mortalidade. A superexpressão de RECK na linhagem de glioma humano T98G comprometeu a capacidade das células de migrar e invadir in vitro, com rearranjo do citoesqueleto e alteração na distribuição espacial de FAK fosforilado. Entretanto, o possível mecanismo envolvido na inibição da migração mediada por RECK não foi desvendado. Para estudarmos os mecanismos envolvidos nesta alteração da capacidade migratória, as células T98G foram transfectadas com o vetor plasmidial pCXN2-hRECK (RECK+). A via das integrinas, a atividade de alguns membros da família das RhoGTPases e elementos do citoesqueleto foram avaliados através de imunoblotting, imunomarcação e ensaios de pull-down para as células RECK+ em comparação com células T98G não-transfectadas (WT), células T98G transfectadas com vetor pCXN2 na ausência do gene RECK (vetor) e fibroblastos primários humanos (FF287). Nossos resultados mostram um aumento na expressão de integrina β1 e uma diminuição da fosforilação de FAK no sítio de auto-fosforilação Tyr397 que, juntamente com o aumento das fibras de estresse e a diminuição dos lamelipódios, sugerem um fenótipo menos migratório da célula. Porém, quando avaliada a atividade de Rac1, esta se mostrou aumentada, embora uma das vias de ativação de Rac1 seja através da fosforilação de FAK levando à formação dos lamelipódios. A hipótese é que RECK inibe a quebra das adesões focais que participam do processo de migração, dificultando a mobilidade celular. Como as células continuam recebendo o estímulo para migrar, estas ativam Rac1 através de uma via independente de FAK. Além disso, a imunomarcação de paxilina mostrou um aumento no tamanho das adesões focais nas células RECK+, indicando que RECK pode influenciar nas estruturas responsáveis pelo contato célula-matriz. / Gliomas are highly invasive, treatment-resistant and lethal tumors. Overexpression of RECK in human glioma cell line T98G decreased cell migration and invasion in vitro, lead to cytoskeleton rearrangement and caused changes in phospho-FAK distribution. However, the pathway involved in RECK-mediated inhibition of cell migration has not been elucidated yet. To study the mechanisms by which RECK affects cell motility, T98G cells were transfected with pCXN2-hRECK vector (RECK+). Some proteins involved in the integrin pathway, activity of some proteins of RhoGTPase family and cytoskeleton proteins were analyzed through immunoblotting, immunostaining and pull-down assay in RECK+ cells and compared with non-transfected T98G cells, T98G transfected with pCXN2 without RECK gene and human primary fibroblasts (FF287). Our results showed an increase in integrin β1 expression and a decrease in FAK phosphorylation in the Tyr397 site, which together with the increase of stress fibers and decrease of lamellipodia, suggest a less migratory phenotype. Despite this, Rac1 activity was increased even though one of Rac activation pathways is through phospho-FAK, leading to lamellipodium formation. Our hypotheses is that RECK affects focal adhesion turnover, diminishing cell motility. As cells are still receiving a positive signal to migrate, they activate Rac1 through a FAK-independent pathway. Besides that, paxillin immunostaining showed that focal adhesions are larger in RECK+ cells, indicating that RECK can influence structures related with cell-matrix contact.

Apesar das evidências apontarem à participação da amilóide sérica A (SAA) em processos que favorecem a carcinogênese e metástase, associado à proposta da SAA como um marcador de progressão tumoral, não há ainda nenhum estudo avaliando a atividade direta da SAA em células tumorais. Este estudo examinou o efeito direto da SAA em duas linhagens de glioma humano. Gliomas são tumores cerebrais primários mais comuns em adultos e as linhagens deste estudo, A172 e T98G, representam carcinomas humanos caracterizados por um comportamento biológico altamente agressivo e quase sempre fatais, sendo classificados como grau IV. As linhagens A172 e T98G possuem algumas diferenças importantes em relação à invasividade; elas são respectivamente menos invasiva e mais invasiva. Para este estudo, avaliamos o efeito de SAA sobre a síntese de compostos representativos de algumas das diferentes classes de substâncias que estão envolvidas na progressão do tumor; entre elas estão a citocina IL-8, IL-6, TNF-α, a molécula mensageira NO, as metaloproteases, MMP2 e MMP9 e o gene RECK. Além disso, nos perguntamos se SAA pode estar envolvida nos processos de proliferação, migração e invasão celular. SAA induziu a produção de NO em ambas as linhagens de glioma. Em relação a IL-8 observamos que sua produção basal é bastante diferente dependendo da linhagem, sendo pouco produzida pela linhagem A172 que foi a única que respondeu à SAA. IL-6 e TNF-α não foram produzidas pelos gliomas quando estimulados com SAA. O tratamento das células com SAA aumentou a expressão das MMP-2 e MMP-9 e diminuiu a de RECK em ambas linhagens. SAA mostrou ser um estímulo mitogênico para os gliomas T98G e A172. SAA aumentou a migração e invasão da linhagem T98G e inibiu estes mesmos parâmetros nas células A172. SAA é constitutivamente expressa e produzida por ambas linhagens, sendo que a isoforma SAA1 é a predominante. A expressão gênica de todas as isoformas, SAA1, SAA2, SAA4, e a síntese protéica das SAA foram aumentadas pela adição de IFN-γ. Nossos resultados com base em ensaios in vitro suportam uma contribuição direta da SAA para a progressão e metástase do tumor, dependendo do tipo de célula e concentração da SAA. O fato de que IFN-γ é um indutor de SAA nos gliomas aponta que SAA pode exercer tanto um efeito intrácrino quanto autócrino ou parácrino nos tumores. / In spite of the evidences sustaining the participation of SAA in processes that favor carcinogenesis and metastasis, and the proposal of SAA as a marker of tumor progression, no studies have yet addressed a potential direct activity of SAA on tumor cells. This study examined the direct effect of SAA on two human glioma lineages. Gliomas are primary brain tumors more common in adults and the lineages of this study, A172 and T98G, represent human carcinomas characterized by a highly aggressive biological behaviour and almost always fatal, classified as grade IV. A172 and T98G have some important differences in the invasiveness, they are less invasive and more invasive, respectively. For this study, we evaluated the effect of SAA on the synthesis of compounds representing different classes of substances that are somehow involved in tumor progression, among them we can cite the cytokine IL-8, the messenger molecule NO, the metalloproteinases MMP2 and MMP9 and RECK gene. Furthermore, we wonder if SAA was involved in the processes of proliferation, migration and cell invasion. SAA stimulated the production of IL-8 in lineage A172, while T98G produced high amounts of IL-8 that were not modified by SAA addition. SAA did not stimulate the production of IL-6 and TNF-α. SAA induced the production of NO, increased the expression of MMP-2 and MPP-9 and decreased the regulator of the expression of the MMPs; gene RECK. Moreover, we observed that SAA was a mitogenic stimulus, but it had a dual effect on migration and invasiveness behavior depending on cell lineage. For T98G SAA increased migration and invasion, and for A172 SAA inhibited migration and invasion. SAA was constitutively expressed and produced by both strains, and the isoform SAA1 predominated. The gene expression of all isoforms, SAA1, SAA2, SAA4, and protein synthesis of SAA were increased by the addition of INF-γ. Our findings based on in vitro assays support a direct contribution of SAA to tumor development, progression and metastasis depending on the cell type and concentration of SAA. Besides the role of SAA on tumor growth during an acute phase, the fact that SAA was expressed in tumor cells suggests an intracrine or an autocrine action of SAA.

O funcionamento pleno e harmônico de uma célula está intimamente associado à sua capacidade de manter a integridade genômica. Diversos agentes químicos e físicos exógenos, bem como produtos do próprio metabolismo celular, podem interagir com o DNA, causando danos a esta molécula. Em respota a esses eventos, um intrincado mecanismo de resposta a danos ao DNA é ativado, podendo culminar tanto na correção das lesões, como na ativação de programas de morte celular, como a apoptose, sempre com o intuito de preservar a homeostase tecidual. Falhas neste mecanismo estão associadas a um aumento nas taxas de mutação, que apesar de constituírem a base da diversidade genética e evolução das espécies, está intimimamente associado à tumorigênese e ao envelhecimento. Neste trabalho, dividido em duas partes, utilizamos células de glioma humano como modelo de estudo para quimioterapia adjuvante, bem como também utilizamos neurônios humanos obtidos à partir de células-tronco pluripotente-induzidas como modelo de estudo para a neurodegeneração característica da síndrome de Cockayne, uma doença genética na qual os pacientes apresentam deficiências em mecanismos de reparo de DNA, bem como envelhecimento precoce. Na primeira etapa, avaliamos a resposta de células de glioma a cloroquina, um promissor adjuvante no tratamento desta enfermidade, e notamos que a resistência das células a esta droga estava intimamente relacionada ao seu potencial de membrana mitocondrial, o qual podia ser desfeito por meio da inibição da quinase ATR. Apesar da função canônica desta proteína se dar através da regência da resposta a danos ao DNA, notamos que a sua participação como agente promotor de resistência à cloroquina se dava independentemente deste mecanismo. Também notamos que a combinação da cloroquina com a inibição de ATR via silenciamento gênico exercia um potente efeito tóxico sobre as células tumorais tratadas com o quimioterápico Temozolomida. Já na etapa final desta tese, através do emprego da reprogramação celular, obtivemos, pela primeira vez, neurônios humanos de pacientes portadores da síndrome de Cockayne a partir de fibroblastos de pele. Com este modelo de estudo, foi possível observar que esses neurônios apresentavam uma reduzida densidade de puncta sináptica, bem como uma aparente deficiência na sincronia de suas atividades. Por fim, por meio do sequenciamento do RNA destes neurônios, identificamos uma desregulação na expressão de diversas vias relacionadas ao funcionamento e comunicação neural. As implicações para o uso da cloroquina como adjuvante no tratamento de gliomas, bem como as vantagens do uso de neurônios humanos de Cockayne em detrimento aos modelos atualmente disponíveis, também são discutidos. / Genome integrity is constantly threatened by chemical and physical exogenous agents, as well as products of cells own metabolism, and capability of cells to overcome these challenges is essential to achieve homeostasis. In response to DNA lesions, cells activate a dynamic and intricate DNA damage response that ultimately results either in lesion resolution, or in cell death through apoptosis. Regardless the fate chosen, tissue homeostasis is the ultimate goal. Flaws in this mechanism are associated to an increase in mutation rates. Although it constitutes the basis of genetic diversity and evolution, it is also strictly associated to tumorigenesis and aging. In this thesis, separated in two chapters, we used human glioma cells as a model to study adjuvant chemotherapy, and induced pluripotent stem cells-derived human neurons as a model to study neurodegeneration in Cockayne syndrome, a genetic disease in which patients display defects in DNA repair mechanisms, and also premature aging. In the first chapter, we investigated the response of cancer cells to chloroquine, a promising adjuvant drug in glioma therapy, and we noticed that cellsresistance to this drug was strictly associated to its mitochondrial membrane potential values, which could be dismantled through ATR inhibition. Interestingly, we noticed that the ability of ATR to promote resistance of glioma cells to chloroquine was independent of its canonical role in the DNA damage response. We also noticed that combined treatment of chloroquine to ATR inhibition through gene silencing exerted a powerful toxic effect on glioma cells treated with the chemotherapeutic Temozolomide. In the second chapter of this thesis, we employed cell reprogramming technique to obtain, for the first time, human neurons from Cockayen Syndrome patients from skin fibroblasts. With this model, we were able to identify a reduced density of synaptic puncta, as well as reduced synchrony in the activity of the patients neurons. Through RNA sequencing, we noticed several pathways related to synapses and neuronal function deregulated in Cockayne Sydrome patients neurons. Implications for the use of chloroquine as an adjuvant drug in glioma therapy, as well as the advantage of using iduced pluripotent stem cells-derived Cockayne syndrome human neurons (instead of currently available models) to study this disease, are also discussed.

O glioblastoma multiforme, tumor de alta malignidade é conhecido por ser um câncer de difícil cura devido sua resistência ao tratamento de quimioterapia. Neste contexto sabe-se a existência de um gene responsável pelo fenótipo de resistência (MDR) e produção de proteínas associadas à resistência a uma grande variedade de drogas (MRPs). As proteínas de resistência a múltiplas drogas funcionam como bombas de efluxo, capazes de retirar das células compostos citotóxicos, deixando o tratamento quimioterápico sem o efeito esperado. Atualmente a suposta relação entre as ciclooxigenases e as proteínas de resistência a múltiplas drogas tem sido estudada em alguns tipos de câncer e na maioria deles observa-se uma relação positiva no sentido da COX poder participar da super-expressão de proteínas de resistência, fazendo com que as células fiquem ainda mais resistentes ao tratamento. O objetivo do projeto é analisar o possível efeito das COX 1 e 2 na expressão e atividade de MDRs e MRPs. / Glioblastoma multiforme, a highly malignant tumor is difficult to cure because of its resistance to chemotherapy treatment. A well-established cause of multidrug resistance (MDR) involves the increased expression of members of the ATP binding cassette (ABC) transporter superfamily, many of which transport chemotherapeutic compounds from cells. Multidrug resistance proteins can act as efflux pumps allowing. The cells to remove cytotoxic compounds and often leaving the chemotherapy treatment without the expected effect. The possible relationship between cyclooxygenase and MDRPs has been studied in several cancers and in most there is a positive relationship. The role of cyclooxygenases (COX) has been extensively studied, especially COX-2, which is expressed in many human cancers. Recently studies have been performed to identify whether the presence of COXs has some involvement with the expression of MDRPs. A positive correlation between COXs and MDRPs has been identified in certain cancers. To analyze the possible relationship between COX 1 and 2 and the expression and activity of MDRs and MRPs in gliomas. The following family members of ABC transporters were studied: MDR1, MRP1, MRP2, MRP3, MRP4 e MRP5. Our analysis show e da constitutive expression of Cox-2 in U138MG and U251 cells, as well as the expression of all the MDRPs studied (MDR1 and MRPs1-6). However, in the U138MG cell line where COX-1 was not is expressed there was a large decrease in the expression of MDR1 in comparison with the COX 1 positive U251 cell line.

Tanto hormônios glicocorticóides (GCs) como o gene supressor de tumor TP53, medeiam a resposta celular a uma diversidade de condições fisiológicas de estresse, sendo reguladores fundamentais do processo de vida/morte de diversos tipos celulares. A interação funcional entre estes fatores vem sendo explorada, recentemente, revelando que GCs exercem um efeito dual sobre p53. O modelo celular ST1/P7 de glioma de rato é particularmente interessante para investigar o papel de p53 na ação de GCs, já que estas linhagens apresentam respostas distintas a GCs. O tratamento com Hidrocortisona (Hy) leva as células ST1 a uma complexa reversão fenotípica tumoral→normal, enquanto as células P7 são altamente resistentes ao tratamento. Foi possível observar que a ativação de p53 por Hy ocorre apenas em células ST1, mas não em P7. Esta ativação é mediada pela indução de fosforilação da Ser15 de p53 e seu acúmulo nuclear, o que resulta no aumento de sua ligação a elementos responsivos a p53 no DNA e na sua capacidade de transativação de p53, levando a um aumento da expressão de alguns de seus genes-alvo. Contudo, o bloqueio de p53 através de siRNA não foi suficiente para alterar a resposta de células ST1 a GCs, indicando que a regulação positiva de p53 por GCs pode ser um evento secundário, mas não essencial, para a resposta anti-tumoral exercida por estes hormônios em células ST1. / Both glucocorticoid hormones (GCs) and the TP53 tumor suppressor gene mediate cellular responses to a diversity of physiological stress conditions, acting as crucial regulators of the life/death process in a wide variety of cell types. The ST1/P7 rat glioma model cell system is particularly interesting to investigate the role of p53 in the action of GCs, since these cell lines display opposite responses to GCs. Treatment with Hydrocortisone (Hy) leads ST1 cells to a complete tumoral→normal phenotypic reversion, while P7 cells are highly resistant to this treatment. It was possible to observe that activation of p53 by Hy occurs only in ST1 cells, but not in GC-resistant P7 cells. This activation is mediated by induction of phosphorylation of the Ser15 residue of p53 and its accumulation in the nucleus, resulting in increased binding of p53 to its responsive elements on the DNA and in activation of its transactivating potential, leading to increased expression of some of its target genes. However, blocking of p53 through siRNA was not sufficient to alter ST1 cells response to GCs, indicating that the positive regulation of p53 by GCs may be a secondary, non-essential, event for the anti-tumor response exerted by these hormones in ST1 cells.

Malignant glioma is a highly lethal and destructive disease with no proper cure. We have investigated some of the hallmarks of cancer in connection to glioma and found ways to disrupt these and prevent tumor growth. The work is done within the context of a glioma subtype distinguished by activation of PDGF signaling termed the proneural subtype. In two of the studies we have investigated mechanisms regulating the glioma cells themselves, and in the other two we have focused on the tumor stroma. In the first study, glioma-initiating cells were isolated in defined serum free culture medium from PDGF-B driven murine glioma and shown to be independent of EGF and FGF2 for self-renewal and proliferation. When cultured in serum the GICs displayed an aberrant differentiation pattern that was reversible. Specific depletion of the transduced PDGF-B caused a loss of self-renewal and tumorigenicity and induced oligodendrocyte differentiation. The transcription factor S-SOX5 has previously been shown to have a tumor suppressive effect on PDGF-B induced murine glioma, and to induce cellular senescence in PDGF-B stimulated cells in vitro. We found that S-SOX5 had a negative effect on proliferation of newly established human glioma cells cultured under stem cell conditions. We also revealed a connection between alterations causing up-regulation of SOX5 with the proneural subgroup and a tendency towards co-occurrence with PDGFRA alterations. Angiogenesis, the formation of new blood vessels from existing ones, is an important hallmark for glioma malignancy. We found that the anti-angiogenic protein HRG had a negative effect on glioma progression in PDGF-B induced experimental tumors and that HRG was able to completely prevent formation of glioblastomas. Subsequently it was shown that HRG could skew pro-tumorigenic tumor associated macrophages into an anti-tumorigenic phenotype. Stromal cells had not previously been fully investigated in gliomas. We observed a correlation between tumor malignancy and increased numbers of tumor-associated macrophages as well as pericytes in PDGF-B induced gliomas. There was also a correlation between tumor grade and vessel functionality that had not previously been shown. Our results offer further understanding of gliomagenesis and present possible future therapies.

Thesis (Ph.D. in Cancer Biology) -- University of Colorado at Denver and Health Sciences Center, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 136-169). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Recentemente, nosso grupo demonstrou que a matriz extracelular de astrocitomas promove a seleçãode células endoteliais altamente proliferativas, porém com reduzida capacidade tubulogênica, além de determinar a morte de uma segunda sub-população endotelial, por desaderência ou anoikis. Estratégias de simulação dos teores de tenascina-C (TN-C) e fibronectina (FN) nas matrizes de astrocitomas, realizados com ambas as proteínas purificadas na forma de substratos definidos, sugeriram que o balanço TN-C:FN estava relacionado com os fenótipos endoteliais observados. No entanto, este procedimento não permitia abordar a participação de outros componentes da matriz tumoral nativa neste processo. Com objetivo de estudar a modulação do fenótipo angiogênico das células endoteliais por matrizes de astrocitoma, realizamos o silenciamento da expressão de TN-C na linhagem de astrocitoma U-373 MG. O silenciamento foi confirmado por western blotting, PCR em tempo real e ELISA, que permitiram concluir que, no período pós-transfecção (120h) necessário para se obter matrizes tumorais nativas para ensaios funcionais com células endoteliais, as células U-373 MG mantiveram-se silenciadas em índices superiores a 90%. A diminuição de TN-C nas matrizes tumorais resultou em um pequeno (≅18%, em média), porém significativo aumento na taxa de adesão endotelial. HUVECs incubadas com a matriz secretadas por células silenciadas apresentaram uma redução de ≅35% do número de núcleos picnóticos, quando comparadas a HUVECs incubadas com a matriz de células U-373 MG (selvagens ou transfectadas com siRNA controle). O silenciamento da expressão da TN-C na matriz nas células U-373 MG restaurou ainda o defeito tubulogênico das células endoteliais, que passaram a apresentar formação de tubos comparável à obtida quando HUVECs foram incubadas com sua matriz autóloga, rica em FN. Tais resultados apoiam observações anteriores do grupo, que já sugeriam que a maior proporção de FN na matriz autóloga, comparada a matriz do astrocitoma, seria o fator principal para a seleção dos fenótipos angiogênicos observados, demonstrando mais uma vez a importância do balanço FN:TN-C na regulação de processos angiogênicos. Dados anteriores sugeriam ainda que a sub-população endotelial que morre por anoikisapós contato prolongado (24 horas) com matrizes de astrocitomas corresponde a células que já haviam entrado na fase S do ciclo celular, no início da incubação. A fim de nos aprofundarmos sobre a participação do ciclo celular neste processo, a expressão da proteína p27, um inibidor de quinases dependentes de ciclinas (CKI), também foi analisada. HUVECs incubadas com a matriz de astrocitoma apresentaram um aumento de 2 a 3 vezes na expressão de p27, quando comparada com HUVECs provenientes de sua matriz autóloga. No entanto, células endoteliais incubadas com matriz secretada por células U-373 MG silenciadas apresentaram um nível de expressão de p27 comparável ao das HUVECs incubadas com matriz secretada por células selvagens, indicando que a expressão de TN-C não modula, ou não está diretamente correlacionada à expressão da proteína p27. Este resultado sugere que outros componentes da matriz tumoral devam estar envolvidos na modulação do ciclo celular endotelial. / We have previously shown that extracellular matrices secreted by high-grade astrocitoma promotes the selection of highly proliferative and tubulogenesis-defective endothelial cells, while also leading to the death, by anoikis, of another endothelial subpopulation. The use of defined adhesion substrata containing various levels of tenascin-C (TN-C) and fibronectin (FN) allowed us to confirm that the balance between TN-C and FN was a major cause of the selection of both endothelial phenotypes. However, this strategy did not allow us to address the potential role of other molecular components present in tumor matrices. In the present work, we studied the effect of a matrix produced by U-373 MG cells previously silenced for TN-C expression in endothelial cell adhesion, survival and tubulogenic differentiation, as compared to the matrix secreted by wild-type astrocitoma cells. U-373 MG cells silencing was confirmed by Western blotting, real time RT-PCR and ELISA, and cells remained silenced (≥ 90 %) throughout the 120 hours period necessary for generating immobilized native matrices required for endothelial cell function assays. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) adhesion to the extracellular matrix secreted by astrocitoma cells silenced for TN-C expression was significantly increased by ≅18 %, as compared to wild-type tumor matrix. The number of HUVECs exhibiting picnotic nuclei a hallmark of advanced apoptosis has also been significantly decreased by ≅35 %, when endothelial cells were allowed to incubate with TN-C-depleted tumor matrix, as compared to the wild-type tumor matrix. Concerning angiogenic differentiation, endothelial cells incubated with the matrix produced by silenced U-373 cells were strongly attenuated for their tubulogenesis defect, as compared to HUVECs incubated with the TN-C-rich wild-type matrix. Thus, these data corroborated our previous observations that TN-C in astrocitoma matrices crucially interferes with endothelial cell differentiation. Besides adhesion, survival and tubulogenic differentiation, the responses of endothelial cells to astrocitomas matrices are also affected by cell cycle transitions. We have previously shown that endothelial cells undergoing anoikis had already transitioned through the S-phase of cell cycle at the moment of seeding. Thus, we decided to investigate the expression of p27 protein, an inhibitor of ciclin-dependent kinases (CKI) that has been already implicated in glioma angiogenesis. We found that HUVECs incubated with the matrix secreted by U-373 MG wild-type cells for 24 hours exbibited a 2 to 3-fold increase in p27 expression. In contrast to the other results discussed herein, these differences were not correlated with the expression of TN-C by U-373 MG cells, since the matrix produced by tumor cells silenced for TN-C did not alter the expression of p27 in endothelial cells. Overall, the present data suggest that, although TN-C in native tumor matrix does play a major role in endothelial cell angiogenic differentiation, other matrix components may act in concert with TN-C to modulate endothelial cell proliferation in tumor contexts.