Periplaneta americana apresenta em seu tubo digestivo pelo menos oito atividades β-glucanásicas distintas. Destas, cinco puderam ser purificadas até a homogeneidade e parcialmente caracterizadas. LAM (Mr=46.000) apresenta atividade exclusiva sobre laminarina, é inibida por altas concentrações de substrato e gera oligossacarídeos de baixo grau de polimerização (1 a 4) a partir de laminarina solúvel. LIQl (Mr=24.600) é capaz de hidrolisar laminarina e liquenana, produzindo oligossacarídeos de grau de polimerização 1, 2 e 4 a partir de laminarina solúvel e um único oligossacarídeo (grau de polimerização entre 3 e 4) a partir de liquenana. LIQ 2 (Mr= 22.300) é capaz de clivar laminarina e liquenana e é inibida por laminarina, clivando apenas ligações internas ao polímero. CELl e CEL2 (Mr=71.600 e 72.700) clivam liquenana e carboximetilcelulose, também atacando apenas ligações internas destes polissacarídeos. CELl e CEL2 também são capazes de atacar celulose cristalina. Todas as β-glucanases purificadas apresentam um pH ótimo em torno de 6,0, próximo ao pH luminal, e são relativamente estáveis em condições fisiológicas. Estas enzimas são purificadas a partir da fração solúvel do tubo digestivo do inseto em quantidades muito pequenas (até 7µg), o que inviabiliza sua caracterização estrutural refinada. Além destas proteínas, o sistema β-glucanásico de P. americana conta com duas celulases de baixo peso molecular (Mr= 15.000 e 17.000), e uma atividade ainda não caracterizada. Aparentemente, estas enzimas estão envolvidas na digestão incompleta da celulose e hemiceluloses ingeridas pelo inseto. LIQ 1 possui capacidade lítica sobre células de Saccharomyces cerevisiae, podendo estar envolvida na defesa do epitélio contra agentes infecciosos. / P. americana midgut has at least eight β-glucanases. Five were purified and partially characterized. LAM (Mr=46,000) is active only upon soluble laminarin, is inhibited by high amounts of substrate, and releases small oligosaccharides (1 to 4 glucoses). LIQ1 (Mr=24,600) is active upon laminarin and lichenan, releasing oligosaccharides with 1,2 and 4 glucosyl residues from soluble laminarin and only one oligossacharide, with a degree of polimerization between 3 and 4, from lichenan. LIQ2 (Mr=22,300) is active upon laminarin and lichenan and hydrolyzes only internal bond. CEL1 and CEL2 are active upon lichenan and carboxymethylcellulose, hydrolyzing internal bonds in these substrates. CEL1 and CEL2 also attack AVICEL. All β-glucanase activities have an optimum pH around 6.0 (near luminal pH) and are stable under physiological conditions. These enzymes are purified in very low amounts (up to 7µg from 10 animais). P. americana &#946,-glucanasic system also has two cellulases of low molecular weight (Mr= 15,000 and 17,000), and another not yet characterized. Probably these enzymes are involved in incomplete digestion of cellulose and hemicellulose ingested by the insect. LIQ 1 lyses Saccharomyces cerevisiae cells, and may be involved in epithelium defense against microorganisms.

β-1,3-glucanases são enzimas encontradas em muitos organismos, como fungos, bactéria e plantas. Suas funções incluem remodelamento de parede celular, defesa e digestão. É um alvo interessante para o controle populacional de insetos-praga, porque é ausente em vertebrados. Em insetos, é encontrada no intestino de muitas ordens diferentes, e hidrolizam β-1,3 ou β-1,3(4)-glucanas ingeridas, mas pouco se sabe sobre as propriedades e a função dessas enzimas. Nós estudamos três espécies de insetos, de três ordens diferentes. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) e Abracris flavolineata (Orthoptera) são insetos herbívoros e pestes de plantações, mas suas beta-1,3-glucanases diferem significativamente. A β- 1,3-glucanase de S. frugiperda (SLAM) foi purificada do intestino médio da larva. Ela apresenta uma massa molecular de 37,5 kDa, um pH ótimo alcalino de 9,0, é ativa contra β-1,3-glucana (laminarina), mas é incapaz de hidrolizar β-1,3-1,6-glucana de levedura ou outros polisacarídeos. SLAM é não-processiva (0,4), e não é inibida por altas concentrações de substrato. Diferente de outras β-1,3-glucanases digestivas de insetos, SLAM é incapaz de lisar células de Saccharomyces cerevisae. O cDNA correspondente à SLAM foi clonado e sequenciado, demonstrando que a proteína pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases. A modelagem tridimensional de SLAM, feito com base em homologia de sequência, sugere que o resíduo E228 possa afetar a ionização dos resíduos catalíticos, causando o deslocamento do pH ótimo da enzima. Anti-corpos específicos para SLAM foram produzidos, e estes reagem com uma única proteína oriunda do intestino médio da larva, responsável pela atividade β-1,3- glucanásica majoritária. A imunocitolocalização de SLAM demonstra que a enzima é encontrada em vesículas secretórias e no glicocálix das células colunares, e portanto não é originária de simbiontes. Nós clonamos e sequenciamos o cDNA correspondente à β-1,3-glucanase majoritária presente no intestino médio da larva de T. molitor (TLAM). Ela pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases e está relacionada com proteínas ligantes de β -glucanas, da mesma forma que a enzima de S. frugiperda. A modelagem tridimensional por homologia de sequência permitiu identificar alguns resíduos de amino-ácidos (E174, E179, H204, Y304, R127 e R2181) no sítio ativo da enzima, que podem ser importantes para a atividade de TLAM. A β-1,3-glucanase digestiva do gafanhoto Abracris flavolineata (Orthoptera) é diferente das enzimas já estudadas em insetos. Ela apresenta uma estratégia catalítica processiva, liberando glicose como maior parte dos produtos, e é inibida por altas concentrações de substrato. Para estudar as bases estruturais desse mecanismo, nós procuramos obter a sequência de cDNA correspondente à enzima já caracterizada. O alinhamento múltiplo das β-1,3- glucanases de insetos e proteínas ligantes de beta-glucanas indicou que uma duplicação gênica da enzima do ancestral comum de moluscos e artrópodes. Uma cópia originou as beta-1,3-glucanase de insetos, perdendo uma região N-Terminal com cerca de 100 pares de bases, enquanto a outra cópia originou as proteínas ligantes de beta-glucana, perdendo os resíduos catalíticos. / β-1,3-glucanases are widespread enzymes, found in all major groups of invertebrates, fungi, bacteria and plants. Since this enzyme is absent in vertebrates, it constitutes an interesting target for control of insect pests population. Its functions range from cell wall remodeling, defense and digestion. In insects, it is found in the gut of many different orders, hydrolyzing β-1,3 or β-1,3(4)-glucanas, but little is known about the properties and function of these enzymes. We studied three insect species each pertaining to a different order. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) and Abracris flavolineata are herbivores and crops pests, but their β-1,3- glucanases differ significantly. S. frugiperda β -1,3-glucanase (SLAM) was purified from the larval midgut. It has a molecular mass of 37.5 kDa, an alkaline optimum pH of 9.0, is active against β-1,3-glucan (laminarin), but cannot hydrolyze yeast β-1,3-1,6-glucan or other polysaccharides. The enzyme is an endoglucanase with low processivity (0.4), and is not inhibited by high concentrations of substrate. In contrast to other digestive β-1,3- glucanases from insects, SLAM is unable to lyse Saccharomyces cerevisae cells. The cDNA encoding SLAM was cloned and sequenced, showing that the protein belongs to glycosyl hydrolase family 16 as other insect glucanases and glucan-binding proteins. SLAM homology modeling suggests that E228 may affect the ionization of the catalytic residues, thus displacing the enzyme pH optimum. SLAM antiserum reacts with a single protein in the insect midgut. Immunocytolocalization reveals the presence of the enzyme in secretory vesicles and glycocalyx from columnar cells. We cloned and sequenced the cDNA of T. molitor β-1,3-glucanase. It belongs to glycoside hydrolase family 16, and is related to other insect glucanases and glucan-binding proteins. Sequence analysis and homology modeling allowed the identification of some residues (E174, E179, H204, Y304, R127 and R181) at the active site of the enzyme, which may be important for TLAM activity. The grasshopper A. flavolineata has a β-1,3-glucanase with a processive catalytic strategy. To study the structural basis of this property, we aimed to obtain its encoding sequence to better understand this catalytic mechanism. Multiple sequence alignment of insects β-1,3-glucanases and β-glucan-binding protein indicates that the β- 1,3-glucanase gene duplicated in the ancestor of mollusks and arthropods. One copy originated the insect β-1,3-glucanases after losing a 100 bp N-terminal portion and the arthropode β-glucan-binding proteins by the loss of the catalytic residues.

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Orientador: Helia Harumi Sato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-01T14:14:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferro_LilianAparecida_D.pdf: 39343182 bytes, checksum: 85dd4ff7fee79e9940cf96d45fae535d (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Este trabalho objetivou o isolamento de microrganismos capazes de produzir enzimas que lisam a parede celular de leveduras, a produção, purificação e caracterização de 13-1,3-glucanase lítica. As bactérias líticas foram isoladas de Iodo da usina de açúcar e álcool Santa Helena, Piracicaba, SP. As bactérias líticas isoladas aderiram-se às células viáveis de Saccharomyces cerevisiae 701 e lisaram-nas. A linhagem YLM-B191-1, selecionada para o estudo, foi identificada através das características bioquímicas e fisiológicas como Cellulomonas cellulans. Para a produção da 13-1,3-glucanase lítica, a linhagem de C. cellulans YLM-B191-1 foi cultivada em meio composto de 15 9 de levedura seca; 2,0 9 de (NH4hSO4; 13,6 9 de KH2PO4; 4,2 9 de KOH; 0,2 9 de MgSO47H2O; 0,001 9 de Fe2(SO4h 6H2O; 1 mg de biotina e 1 mg de tiamina por litro. A 13-1,3-glucanase foi purificada do sobrenadante do meio de cultura através de ultrafiltração e cromatografia em coluna de CM-Sepharose CL-6B. A enzima purificada apresentou atividade ótima a 55°C e na faixa de pH entre 4,5 a 6,5. A 13-1,3- glucanase purificada apresentou estabilidade na faixa de pH 5,5 a 6,5 e foi inativada em temperaturas superiores a 55°C. A massa molecular da 13-1,3- glucanase purificada foi estimada em 17,1 kDa através de SDS-PAGE. A 13-1,3- glucanase purificada hidrolisou as ligações 13-1,3-glicosídicas da laminarina atuando como uma endoenzima. Através de microscopia eletrônica de varredura, observou- se que as enzimas líticas da linhagem de C. cellulans YLM-B191-1 foram capazes de alterar a superfície celular de leveduras / Abstract: The objective of this research was to isolate microorganisms which produced yeast cell walllytic enzymes and to study the production, purification and characterization of a Iytic ~-1,3-glucanase. The yeast-Iytic bacterium was isolated from the sludge of the Santa Helena sugar and alcohol factory in Piracicaba, SP. The isolated yeast-Iytic bacterium adhered to viable cells of Saccharomyces cerevisiae701 and Iysed them.The yeast-IyticbacteriumYLM-8191-1, selected for this study, was identified as Cellulomonas cellulans, from its biochemical and physiological characteristics.The strain C. cellulansYLM 8191-1 was cultivated in a medium containing (per liter) 2.0 9 of (NH4hSO4; 13.6 9 of KH2PO4;4.2 9 of KOH; 0.2 9 of MgSO47H2O; 0.001 9 of Fe2(SO4h6H2Oand 1 mg each of biotin and thiamin being supplemented with 15 9 of dried yeast as the carbon source for the production of ~-1,3-glucanase. The ~1 ,3-glucanase was purified from the culture fluid of C. cellulans YLM-8191-1 by ultrafiltration and CM-Sepharose CL-68 column chromatography. The purified enzyme showed greatest activity at 55°C and between pH 4.5 - 6.5. The purified ~-1,3-glucanase was stable in the range from pH 5.5 to 6.5 and was inactivated by heating at temperatures above 55°C. The molecular weight of purified ~-1,3-glucanasewas estimated at about 17.1 kDa by SDS-PAGE. The ~-1,3-glucanase hydrolyses the ~-1,3-glucosidic linkages of the laminarin acting as an endoenzyme. Scanning electron microscopy showed that Iytic enzymes from C. cellulans YLM-8191-1 were able to modify the cellular surface of yeast / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

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Orientador: Helia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T08:10:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_GiselledeArruda_M.pdf: 925514 bytes, checksum: 300372a4285d7efd417f8a717a850023 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A enzima ß-1,3-glucanase da bactéria Cellulosimicrobium cellulans 191 é capaz de lisar a parede celular de diversas leveduras dentre elas as linhagens de Kluyveromyces sp., produtoras da enzima intracelular ß-galactosidase. Este trabalho visou a produção de ß-1,3-glucanase lítica de Cellulosimicrobium cellulans 191 para obtenção das preparações enzimáticas bruta concentrada e purificada com alta atividade lítica para aplicação na obtenção de protoplastos de leveduras e lise das células de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus para extração de b-galactosidase. A ß-1,3-glucanase extracelular foi produzida pela bactéria Cellulosimicrobium cellulans 191 em meio otimizado composto de 10g/L de parede celular de levedura, 2,0g/L de (NH4)2SO4; 0,2g/L de MgSO4.7H2O em tampão fosfato 0,2M, pH 7,5 como descrito por SCOTT e SCHEKMAN (1980) e modificado por SOARES (2002). Foi obtida maior produção da ß-1,3-glucanase na fermentação do microrganismo em frascos aletados a 30ºC, 200rpm por 24 horas do que em fermentador contendo o mesmo meio a 30ºC, 1,5vvm por 24 horas, obtendo-se 0,724 e 0,351U/mL, respectivamente. Os sobrenadantes dos meios fermentados em frascos agitados e em fermentador de 5L apresentaram atividade de 0,120 e 0,064U/mL de protease, respectivamente. Foi estudada a influência dos compostos sacarose (10mM), lactose (10mM), maltose (10mM), glicerol (10mM), gelatina (125mg/mL), albumina de ovo (125mg/mL), sulfato de amônio (10mM), EDTA (10mM), b-mercaptoetanol (10mM) e cisteína (10mM) na preservação da atividade de ß-1,3-glucanase da preparação enzimática bruta a 45ºC, 50ºC e 55ºC, no entanto, nenhum dos compostos testados aumentou a estabilidade da enzima. Foi testada a concentração da preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase por liofilização, ultrafiltração, fracionamento com sulfato de amônio, pela remoção de água com carboximetilcelulose (CMC) e precipitação com os solventes orgânicos acetona e etanol. A concentração da preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase utilizando-se sacos de diálise e CMC em pó para a adsorção da água mostrou-se como o método mais eficiente, sendo que a enzima foi concentrada 6,38 vezes com manutenção de 96% da atividade inicial. A preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase foi purificada aproximadamente 2 vezes por fracionamento com sulfato de amônio 30% de saturação. A ß-1,3-glucanase da preparação enzimática bruta foi purificada aproximadamente 6,66 vezes através de fracionamento com sulfato de amônio a 30% de saturação, dessalinização em coluna de exclusão Sephadex PD10 e cromatografia em coluna de troca iônica DEAE-Sephacelè, com rendimento de 18%. Dentre as linhagens das leveduras Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Kluyveromyces drosophilarium, Kluyveromyces marxianus NRRL7571, Kluyveromyces marxianus NRRL1196, a primeira foi selecionada como maior produtora da enzima b-galactosidase. As preparações enzimáticas bruta concentrada e purificada de ß-1,3-glucanase apresentaram capacidade de lisar as células de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus a 37ºC. Para a formação de protoplastos foi utilizado 0,1U de ß-1,3-glucanase por mL de suspensão de levedura equivalente a 1,3mg de massa celular seca, durante 1 hora a 37ºC. A extração da ß-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi testada pelos métodos químico (solventes orgânicos), enzimático (ß-1,3-glucanase) e físico (ultrasonicação). O método de pré-tratamento enzimático e posterior aplicação de ultrasonicação apresentou melhores resultados seguido pelos métodos de permeabilização com etanol 50%, b-1,3-glucanase purificada, ultrasonicação, permeabilização com tolueno 20% e ß-1,3-glucanase bruta, obtendo-se, respectivamente, atividades de ß-galactosidade (massa celular seca) iguais a 25,13U/mg/min; 14,00U/mg/min; 13,11U/mg/min; 10,95U/mg/min; 10,75U/mg/min e 7,25U/mg/min utilizando-se lactose como substrato. A b-galactosidase bruta apresentou atividade ótima em pH 7,0 e 32ºC e mostrou-se estável na faixa de 30 a 35ºC após 3 horas em pH 7,0 e na faixa de pH entre 6,5 e 7,5 após 3 horas a 35ºC. A b-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi purificada 2,3 vezes após fracionamento com sulfato de amônio a 60% de saturação, diálise e cromatografia em coluna de troca iônica DEAE-Sephacelè, com rendimento de 31%. As preparações enzimáticas bruta e purificada da ß-glucanase lítica da bactéria Cellulosimicrobium cellulans podem ser utilizadas na obtenção de protoplastos de leveduras e extração de enzimas intracelulares de leveduras / Abstract: The enzyme ß-1,3-glucanase from the bacteria Cellulosimicrobium cellulans 191 is capable of lysing the cell wall of various yeasts including strains of Kluyveromyces sp., producers of the intracellular enzyme ß-galactosidase. This work aimed to produce lytic ß-1,3-glucanase from Cellulosimicrobium cellulans 191 in order to obtain crude, concentrated and purified enzyme preparations with high lytic activity, for application in the obtaining of yeast protoplasts and in the lysis of Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus to extract ß-galactosidase. Extracellular ß-1,3-glucanase was produced by the bacteria Cellulosimicrobium cellulans 191 in an optimised culture medium composed of 10g/L yeast cell wall, 2.0g/L (NH4)2SO4 and 0.2g/L MgSO4.7H2O in 0.2M phosphate buffer, pH 7.5. The production of ß-1,3-glucanase from the microorganism was greater in flasks with flaps incubated at 30ºC and 200rpm for 24 hours than in a fermenter containing the same medium and incubated at 30ºC and 1.5vvm for 24 hours, obtaining yields of 0.724U/mL and 0.351U/mL, respectively. The supernatants from the media fermented in the shaken flasks and in the 5L fermenter presented protease activities of 0.120U/mL and 0.064U/mL, respectively. The influences of sucrose (10mM), lactose (10mM), maltose (10mM), glycerol (10mM), gelatine (125mg/mL), egg albumin (125mg/mL), ammonium sulphate (10mM), EDTA (10mM), b-mercaptoethanol (10mM) and cysteine (10mM) in the preservation of the ß-1,3-glucanase activity of the crude enzyme preparation at 45ºC, 50ºC and 55ºC, were studied, but none of the compounds tested increased the stability of the enzyme. Concentration of the crude ß-1,3-glucanase preparation was tested using freeze drying, ultrafiltration, ammonium sulphate fractionation, by the removal of water using carboxymethylcellulose (CMC) and by precipitation with the organic solvents acetone and ethanol. Concentration of the crude ß-1,3-glucanase preparation using dialysis bags and powdered CMC to adsorb the water was shown to be the most efficient method, the enzyme being concentrated 6.38 times with 96% maintenance of the initial activity. The crude ß- 1,3- glucanase preparation was purified about two-fold by ammonium sulphate fractionation at 30% saturation. The ß-1,3-glucanase of the crude enzyme preparation was purified about 6.66 times using ammonium sulphate fractionation at 30% saturation, desalting in a Sephadex PD10 exclusion column and ion exchange column chromatography using DEAE-Sephacelè, with an 18% yield. Of the following yeast strains, Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Kluyveromyces drosophilarium, Kluyveromycesmarxianus NRRL7571 and Kluyveromyces marxianus NRRL1196, the first one was selected as the greatest producer of the enzyme ß-galactosidase. The crude, concentrated and purified ß-1,3-glucanase preparations were capable of lysing the cells of Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus at 35ºC. In order to form protoplasts a ß-1,3-glucanase preparation with 0.1U activity was used per mL yeast suspension equivalent to 1.3mg dry cell mass, for 1 hour at 35ºC. Physical (ultrasound), chemical (organic solvents) and enzymatic (ß-1,3-glucanase) methods were tested for their efficiency in extracting ß-galactosidase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus. The method using an enzymatic pre-treatment followed by the application of ultrasound gave the best results, followed by methods of permeabilization by ethanol 50%, purified ß-1,3-glucanase, ultrasonication, toluene 20% and crude ß-1,3- glucanase, obtaining ß-galactosidase activities (dry cell mass) of, respectively, 25.13U/mg/min, 14.00U/mg/min, 13.11U/mg/min, 10.95U/mg/min, 10.75U/mg/min e 7.25U/mg/min using lactose as the substrate. The crude ß-galactosidase preparation showed optimum activity at pH 7.0 and 32ºC and was stable in the range from 30-35ºC after 3 hours at pH 7.0 and between pH 6.5 and 7.5 after 3 hours at 35ºC. The ß-galactosidase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus was purified 2.3 fold after ammonium sulphate fractionation at 60% saturation, dialysis and ion exchange column chromatography on DEAE-Sephacelè, with a 31% yield. The crude and purified lytic ß-glucanase preparations of Cellulosimicrobium cellulans bacteria can be used to obtaining yeast protoplasts and extraction of intracellular enzymes of yeasts / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

P. americana e T. molitor são capazes de secretar β-1,3-glucanases no tubo digestivo, pelas glândulas salivares e pelo epitélio do ventrículo, respectivamente. As laminarinases majoritárias de P. americana (LIQ1, 42kDa; LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) e T. molitor (LAM_T, 50kDa) foram purificadas até a homogeneidade. Essas enzimas têm diferentes especificidades, padrões de ação e resíduos envolvidos em catálise, fazendo parte dos E.C. 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), E.C. 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) ou E.C. 3.2.1.58 - exo-β-1,3-glucanase (LAM_A e LAMT). O papel dessas enzimas é digerir β-glucanas de fungos e de cereais. LAM_P e LAMA são inibidas por laminarina, pela formação de complexos enzima-substrato não-produtivos. LIQ1, LAM_P e LAM_A são enzimas processivas, com diferentes graus de ataque múltiplo e produzem série distintas de oligossacarídeos. LAM_A possui um sítio acessório de ligação para laminarina, o qual pode estar envolvido no mecanismo de processividade. Quitinases digestivas de insetos podem ser diferentes das descritas até o momento. A. flavolineata e T. molitor possuem sistemas celulásicos completos. Os três insetos apresentam proteínas de baixo peso molecular capazes de ligar-se a celulose ou a pachyman. O ancestral dos hexapoda provavelmente possuía β-1,3 e β-1,3(4) glucanases digestivas associadas a um hábito detritívoro. / P. americana salivary glands and T. molitor midgut epithelium actively secrete laminarinases into the midgut. The major laminarinases from P. americana (LIQ1, 42kDa and LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) and T molitor (LAM_T, 50kDa) were purified until homogeneity. These enzymes have different specificities, action patterns and activesite catalytic groups, and correspond to E.C.s 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) or 3.2.1.58 -exo-β-1,3-glucanase (LAM_A and LAM_T). Their physiological role is fungai and cereal β-glucan digestion. LAM_P and LAM_A are inhibited by excess substrate (non-productive enzyme-substrate complexes). LIQ1, LAM_P and LAMA have different multiple attack degrees and produce different oligosaccharides. LAM_A has a second substrate binding site, probably involved with processivity. T. molitor digestive chitinase is different from other insect chitinases. A. flavolineata and T. molitor can hydrolyse cristalline cellulose efficiently. The three studied insects have cellulose or pachyman-binding proteins with low molecular weights. Hexapoda ancestors probably had digestive β-1,3 and β-1,3(4)-glucanases and a detritivore habit.

Prebióticos são aditivos alimentares não digeríveis que afetam beneficamente a saúde do hospedeiro pela estimulação seletiva do crescimento ou da atividade de um número limitado de bactérias probióticas. Apesar do avanço científico observado nesta área, poucos estudos têm sido reportados no que diz respeito à utilização de derivados de parede celular de levedura como prebióticos. Sendo assim, o presente estudo visou avaliar diferentes condições de crescimento e produção de enzimas extracelulares pela cepa Bacillus licheniformis E-44, com o objetivo de se obter um extrato enzimático para promover a hidrólise da parede celular de Saccharomyces cerevisiae gerando derivados que apresentam propriedades prebióticas. Os cultivos foram realizados em reator de bancada e em frascos Erlenmeyer sob diferentes condições de pH, composição de meio, fonte de carbono, agitação e aeração, sendo as amostras retiradas periodicamente para determinação do crescimento celular por turbidimetria e quantificação das respectivas enzimas (protease, ? -1,3-glucanase e ? -mananase). Os resultados demostraram que Bacillus licheniformis E-44 apresentou melhor desempenho, no que se refere ao crescimento celular, na presença de caseína como fonte de carbono, pH 8,0-8,5, agitação de 200 rpm e relação volume de frasco/volume de meio de 1:10. Por outro lado, no tocante à síntese das respectivas enzimas, essa não foi detectada nas condições avaliadas. / Prebiotics are described as \"non-digestible food additives that beneficially affect the host health by selectively stimulating the growth and/or activity of some probiotic species\". In despite of the scientific developments observed in this area, few studies are found concerning the utilization of yeast cell wall compounds as prebiotics. Therefore, the present study aimed to evaluate different conditions of growth and extracellular enzyme production by Bacillus licheniformis E-44 with the goal of obtaining an enzymatic extract to promote the hydrolysis of the cell wall of Saccharomyces cerevisiae generating compounds which present some prebiotic properties. The growth was carried out in lab scale bioreactors and in Erlenmeyer flasks under different conditions of the pH, medium composition, carbon sources, agitation and aeration. The samples were withdraw periodically for determination of cellular growth by turbidimetry and quantification of protease, ? -1,3-glucanase and ? -mannanase activities. The results showed that Bacillus licheniformis E-44 presented the best performance concerning to cellular growth when this strain was cultivated in a medium containing casein as carbon source, pH 8,0-8,5, 200 rpm of agitation rate and flask/medium bulk relation of 1:10. On the other hand, regarding the synthesis of those enzymes, there was not detected any activities in the conditions evaluated.

Prebióticos são aditivos alimentares não digeríveis que afetam beneficamente a saúde do hospedeiro pela estimulação seletiva do crescimento ou da atividade de um número limitado de bactérias probióticas. Apesar do avanço científico observado nesta área, poucos estudos têm sido reportados no que diz respeito à utilização de derivados de parede celular de levedura como prebióticos. Sendo assim, o presente estudo visou avaliar diferentes condições de crescimento e produção de enzimas extracelulares pela cepa Bacillus licheniformis E-44, com o objetivo de se obter um extrato enzimático para promover a hidrólise da parede celular de Saccharomyces cerevisiae gerando derivados que apresentam propriedades prebióticas. Os cultivos foram realizados em reator de bancada e em frascos Erlenmeyer sob diferentes condições de pH, composição de meio, fonte de carbono, agitação e aeração, sendo as amostras retiradas periodicamente para determinação do crescimento celular por turbidimetria e quantificação das respectivas enzimas (protease, ? -1,3-glucanase e ? -mananase). Os resultados demostraram que Bacillus licheniformis E-44 apresentou melhor desempenho, no que se refere ao crescimento celular, na presença de caseína como fonte de carbono, pH 8,0-8,5, agitação de 200 rpm e relação volume de frasco/volume de meio de 1:10. Por outro lado, no tocante à síntese das respectivas enzimas, essa não foi detectada nas condições avaliadas. / Prebiotics are described as \"non-digestible food additives that beneficially affect the host health by selectively stimulating the growth and/or activity of some probiotic species\". In despite of the scientific developments observed in this area, few studies are found concerning the utilization of yeast cell wall compounds as prebiotics. Therefore, the present study aimed to evaluate different conditions of growth and extracellular enzyme production by Bacillus licheniformis E-44 with the goal of obtaining an enzymatic extract to promote the hydrolysis of the cell wall of Saccharomyces cerevisiae generating compounds which present some prebiotic properties. The growth was carried out in lab scale bioreactors and in Erlenmeyer flasks under different conditions of the pH, medium composition, carbon sources, agitation and aeration. The samples were withdraw periodically for determination of cellular growth by turbidimetry and quantification of protease, ? -1,3-glucanase and ? -mannanase activities. The results showed that Bacillus licheniformis E-44 presented the best performance concerning to cellular growth when this strain was cultivated in a medium containing casein as carbon source, pH 8,0-8,5, 200 rpm of agitation rate and flask/medium bulk relation of 1:10. On the other hand, regarding the synthesis of those enzymes, there was not detected any activities in the conditions evaluated.

P. americana e T. molitor são capazes de secretar β-1,3-glucanases no tubo digestivo, pelas glândulas salivares e pelo epitélio do ventrículo, respectivamente. As laminarinases majoritárias de P. americana (LIQ1, 42kDa; LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) e T. molitor (LAM_T, 50kDa) foram purificadas até a homogeneidade. Essas enzimas têm diferentes especificidades, padrões de ação e resíduos envolvidos em catálise, fazendo parte dos E.C. 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), E.C. 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) ou E.C. 3.2.1.58 - exo-β-1,3-glucanase (LAM_A e LAMT). O papel dessas enzimas é digerir β-glucanas de fungos e de cereais. LAM_P e LAMA são inibidas por laminarina, pela formação de complexos enzima-substrato não-produtivos. LIQ1, LAM_P e LAM_A são enzimas processivas, com diferentes graus de ataque múltiplo e produzem série distintas de oligossacarídeos. LAM_A possui um sítio acessório de ligação para laminarina, o qual pode estar envolvido no mecanismo de processividade. Quitinases digestivas de insetos podem ser diferentes das descritas até o momento. A. flavolineata e T. molitor possuem sistemas celulásicos completos. Os três insetos apresentam proteínas de baixo peso molecular capazes de ligar-se a celulose ou a pachyman. O ancestral dos hexapoda provavelmente possuía β-1,3 e β-1,3(4) glucanases digestivas associadas a um hábito detritívoro. / P. americana salivary glands and T. molitor midgut epithelium actively secrete laminarinases into the midgut. The major laminarinases from P. americana (LIQ1, 42kDa and LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) and T molitor (LAM_T, 50kDa) were purified until homogeneity. These enzymes have different specificities, action patterns and activesite catalytic groups, and correspond to E.C.s 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) or 3.2.1.58 -exo-β-1,3-glucanase (LAM_A and LAM_T). Their physiological role is fungai and cereal β-glucan digestion. LAM_P and LAM_A are inhibited by excess substrate (non-productive enzyme-substrate complexes). LIQ1, LAM_P and LAMA have different multiple attack degrees and produce different oligosaccharides. LAM_A has a second substrate binding site, probably involved with processivity. T. molitor digestive chitinase is different from other insect chitinases. A. flavolineata and T. molitor can hydrolyse cristalline cellulose efficiently. The three studied insects have cellulose or pachyman-binding proteins with low molecular weights. Hexapoda ancestors probably had digestive β-1,3 and β-1,3(4)-glucanases and a detritivore habit.