A enzima Glucosamina-6-fosfato desaminase (GlcN6P desaminase) é envolvida na conversão reversível da D-glucosamina-6-fosfato (GlcN6P) em Fru6P e amônia, como parte do caminho metabólico de aminoaçúcares como fonte de energia celular. A enzima hexamérica (peso mol. 178200) exibe uma cooperatividade homotrópica intensa em direção à GlcN6P a qual é modulada alostericamente pelo ativador N-acetil-D-glucosamina 6-fosfato (GlcNAc6P). A GlcN6P desaminase foi cristalizada no grupo espacial R32, com parâmetros de rede a = b = 125.9 &#197 e c = 223.2 &#197 e um conjunto de dados à 2.1 &#197 de resolução foi coletado usando radiação de luz síncrotron (Horjales et ai., 1992). A procura no banco de dados de seqüências OWL não mostrou homologia significante com qualquer outra família de proteína, desta maneira a determinação da estrutura foi feita pela técnica de substituição isomórfica múltipla (MIR) a partir de dois derivados, um composto de platina, o K2PtCl4 e um complexo de mercúrio, o ácido mersálico. O mapa MIR a 3 &#197 de resolução mostrou contornos claros e utilizando técnicas de nivelamento de solvente (solvent flattening) estendeu-se as fases até 2.5 &#197. A enzima cristaliza-se com dois monômeros na unidade assimétrica. A densidade eletrônica final foi interpretada com o auxílio do programa gráfico \'O\', sendo possível determinar sem ambigüidade 230 dos 266 resíduos de cada monômero; a partir daí foram usados subseqüentes mapas de Fourier diferença para a localização de todos os outros resíduos. O refinamento do modelo foi feito utilizando o programa X-PLOR (Brünger, 1993), usando a rotina simulated annealing, obtendo o fator R final de 17.4% com 348 moléculas de água e quatro íons inorgânicos de fosfato. O enovelamento do monômero tem uma estrutura do tipo &#945/&#946 com uma folha-&#946 pregueada paralela central com sete fitas com topologia 4x, 1x, 1x, -3x, -1x, -1x, envolvida por ambos os lados por oito hélices-&#945 e uma hélice 310 com duas voltas. A sexta fita da folha-&#946 central tem um prolongamento no C-terminal que faz parte de uma segunda folha-&#946 antiparalela de três fitas com topologia 2, -1. O hexâmero tem uma simetria local 32, com dois trímeros empacotados frente-a-frente com uma rotação relativa de 15&#176 em tomo do eixo de ordem 3 e ligados por pontes salinas e algumas interações hidrofóbicas em tomo do eixo não cristalográfico de ordem 2. As moléculas de cada trímero formam um contato não usual de três resíduos Cis 219 próximo ao eixo de ordem três. Os complexos com ativador alostérico (GlcNAc6P) e inibidor competitivo (2-desoxi 2-amino glucitol 6-fosfato) foram co-cristalizados isomorficamente com a estrutura nativa. Os mapas Fourier diferença mostram claramente densidades para os ligantes, definindo sem ambigüidade o sítio ativo e alostérico. O refinamento dos complexos produziu a mesma conformação da proteína nativa, na margem de erro experimental. Os sítios alostéricos (seis) estão localizados na interface adjacente dos monômeros de cada trímero e os sítios ativos (ou catalíticos) no lado externo de cada monômero, no C-terminal da folha-&#946 central. O monômero tem uma topologia com enovelamento similar a um domínio de ligação de NAD, excluindo os segmentos de aminoácidos 1-35, 145-188 e 243-266. As estruturas dos complexos e da nativa estão em um estado alostérico R em concordância com o modelo MWC para um sistema do tipo K (Monod et al, 1965). Um mecanismo alostérico similar ao da GlcN6P desaminase é encontrado na enzima fosfofrutoquinase (Evans, 1981). Um mecanismo catalítico é proposto para a reação de isomerisação-desaminação da enzima GlcN6P desaminase a partir do mecanismo geral para aldose-cetona isomerases. / The enzyme Glucosamine-6-phosphate deaminase (GlcN6P deaminase) is involved in the reversible conversion of D-glucosamine-6-phosphate (GlcN6P) into Fru6P and ammonia. The hexameric enzyme (mol.wt.=178200) exhibits an intense homotropic co-operativity towards GlcN6P which is allosterically modulated by the activator N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate (GlcNAc6P). The GlcN6P deaminase was crystallized in space group R32, with cell parameters a=b= 125.9 &#197 and c = 223.2 &#197 and a native dataset was collected to 2.1 &#197 resolution at a synchrotron source (Horjales et al, 1992). A search of the OWL sequences database has shown no significant homology with any other known protein family. Therefore, the structure determination will have to be achieved through the Multiple Isomorphous Replacement technique from two isomorphous derivatives, a platinum compound K2PtCl4 and a mercury complex, mersalyl acid. The MIR map at 3 &#197 resolution showed clear molecular boundaries and solvent flattening techniques (Wang, 1985) were used to extend the phase set to 2.5 &#197. The final electron density map was interpreted with the aid of the graphic program \'O\'. The enzyme crystallizes with a dimmer in the asymmetric unit and 230 out of the total 266 residues of each crystallographically independent monomer could be unambiguously identified in the map. The remaining residues were located after subsequent difference Fourier maps. The refinement was made with program X-PLOR (Brunger, 1993), using the simulated annealing routine, obtained R=17.4 % with 348 water molecules and four inorganic phosphate ions. The monomer fold shows an &#945/&#946 structure with a central 7-stranded &#946-sheet with topology 4x, 1x, 1x, -3x, -1x, -1x, surrounded on both sides by eight &#945-helices and 2-turn 310 -helix. The sixth strand of the central &#946-sheet is common to a second 3-stranded anti-parallel &#946-sheet with topology 2, -1. The hexamer has local 32 symmetry, with two trimmers packed in a face-to-face arrangement with a relative rotation of 15&#176 around the 3-fold axis, and linked together by salt-bridge and some hydrophobic contacts. The molecules of each trimmer have extensive contacts and show an unusual feature of the three Cys219 residues closely clustered around the 3-fold axis. The complexes with allosteric activator (GlcNAc6P) and inhibitor (2-deoxy-2-amino glucitol 6-phosphate) were co-crystallized isomorphously with the native structure. The difference Fourier maps shows clear density for the ligands, unambiguously defining the active and allosteric sites. The complexes refinement produced the same conformation of the native, within experimental error. The allosteric sites are located at the interfaces of adjacent monomers from each trimer and the active sites (or catalytic) lie at the external side of each monomer, at the C-terminal end of the central parallel &#946-sheet. The monomer has a similar folding topology as a typical NAD binding domain, excluding the segments of aminoacids 135, 145-188 and 243-266. The native and complexes structures are at the allosteric state R concerted with MWC model for a K-system (Monod et al, 1965). A similar allosteric mechanism is found in the enzyme phosphofructokinase (Evans, 1981). A catalytic mechanism is proposed for the isomerisation-deamination reaction of the enzyme from general mechanism for aldo-keto isomerases.

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OBJETIVOS: Avaliar o efeito de sulfato de glicosamina e sulfato de condroitina sobre a nocicepção e o dano da cartilagem articular em um modelo de osteoartrite experimental em ratos. MÉTODOS: Osteoartrite (OA) foi induzida em ratos Wistar machos por transecção do ligamento cruzado anterior (TLCA) do joelho direito. Um grupo falso-operado (SHAM) foi utilizado como controle. Animais OA foram tratados v.o. desde 7 dias antes, até o sacrifício, 70 dias após a TLCA, com sulfato de glicosamina 500 mg/kg (Glu), a combinação sulfato de glicosamina 500 mg/kg e sulfato de condroitina 400 mg/kg (GluChon), ou salina (OANT). Um grupo controle positivo recebeu meloxicam 6 mg/kg s.c. A dor articular foi avaliada pelo teste de incapacitação articular para ratos. Os animais foram sacrificados em diferentes períodos (7,14,28 e 70 dias) após a TLCA. A gravidade das lesões histopatológicas foi graduada nos fêmures após coloração por H&E e azul de toluidina através do escore da OARSI. A quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) extraídos da cartilagem articular dos côndilos femorais foi medida após eletroforese em gel de agarose. O tamanho molecular dos GAGs foi medido após eletroforese em gel de poliacrilamida. A liberação de NO no líquido sinovial foi medida 7 dias após TLCA. RESULTADOS: GluChon reduziu significativamente a dor articular nesse modelo (p<0,01). Glu também reduziu a dor articular, mas não se alcançou significância estatística. Os animais OA apresentaram um aumento significativo dos GAGs na cartilagem articular aos 70 dias após TLCA (77,68±3,38 µg/mg) quando comparados aos animais SHAM (53,46±4,58 µg/mg). O tamanho molecular dos GAGs foi significativamente maior nos animais OA que nos animais SHAM 70 dias após a cirurgia (p<0,01). GluChon preveniu tanto o aumento da quantidade de GAGs (54,42±5,39 µg/mg), quanto de seu tamanho molecular (p<0,05), e estes resultados acompanharam-se de melhora significativa da lesão histopatológica (p<0,05). Os resultados obtidos com Glu foram semelhantes, porém menos evidentes, e não alcançaram significância estatística. Glu aumentou significativamente a quantidade de NO na cavidade articular 7 dias após a TLCA. CONCLUSÕES: GluChon foi antinociceptivo e reduziu significativamente a incapacitação articular. A lesão da cartilagem articular no modelo de TLCA em ratos se acompanha de aumento da concentração e do tamanho molecular dos GAGs, e o tratamento com GluChon previne essas alterações e reduz o dano histopatológico. GluChon foi mais eficaz do que Glu tanto na redução da dor quanto da lesão da cartilagem articular, sugerindo benefício da combinação sobre o uso isolado de sulfato de glicosamina. / OBJECTIVES: Evaluate the antinociceptive and chondroprotective effects of glucosamine sulfate and chondroitin sulfate. METHODS: Male Wistar rats underwent anterior cruciate ligament transection (ACLT) or sham operation of the right knee. Animals were treated p.o. with glucosamine sulfate (Glu) 500 mg/kg, the combination of glucosamine sulfate 500 mg/kg and chondroitin sulfate 400 mg/kg (GluChon), or saline, since 7 days prior to surgery until the sacrifice 70 days after ACLT. A positive control group received meloxicam 6 mg/kg s.c. for antinociceptive evaluation comparisons. Joint pain was evaluated with rat incapacitation test. Animals were sacrificed 7,14,28 or 70 days after ACLT. The severity of histopathologic lesions was evaluated on femoral condyles after hematoxylin-eosin or toluidine blue staining with OARSI grading and staging system. Cartilage extracted glycosaminoglycans (GAGs) concentration was assessed after agarose gel electrophoresis. GAGs\' molecular weight was evaluated after polyacrylamide gel electrophoresis. NO release in synovial fluids was assessed 7 days after ACLT. RESULTS: GluChon reduced joint pain (p<0.01). Glu also reduced joint pain, but results did not reach statistical significance. A significant increase in articular cartilage\'s GAGs concentration was observed in OA animals (77.68±3.38 µg/mg) as compared to sham (53.46±4.58 µg/mg). OA animals also had significantly higher molecular weight GAGs than sham (p<0.01). GluChon prevented both GAG concentration and molecular weight elevations in OA animals, and that was associated with significant less cartilage damage assessed by histopathologic examination (p<0.05). Glu effects were less evident, and did not reach statistical significance. Glu was associated with significant higher concentrations of NO in synovial fluid. CONCLUSIONS: GluChon was antinociceptive on the ACLT model in rats. Articular cartilage damage was associated with increased amounts of GAG with higher molecular weight, and the prevention of these alterations with GluChon treatment was associated with less histopathologic damage. GluChon was more efficient than Glu for both pain and articular cartilage damage reduction, suggesting that combined treatment is better than glucosamine sulfate alone.

OBJETIVOS: Avaliar o efeito de sulfato de glicosamina e sulfato de condroitina sobre a nocicepção e o dano da cartilagem articular em um modelo de osteoartrite experimental em ratos. MÉTODOS: Osteoartrite (OA) foi induzida em ratos Wistar machos por transecção do ligamento cruzado anterior (TLCA) do joelho direito. Um grupo falso-operado (SHAM) foi utilizado como controle. Animais OA foram tratados v.o. desde 7 dias antes, até o sacrifício, 70 dias após a TLCA, com sulfato de glicosamina 500 mg/kg (Glu), a combinação sulfato de glicosamina 500 mg/kg e sulfato de condroitina 400 mg/kg (GluChon), ou salina (OANT). Um grupo controle positivo recebeu meloxicam 6 mg/kg s.c. A dor articular foi avaliada pelo teste de incapacitação articular para ratos. Os animais foram sacrificados em diferentes períodos (7,14,28 e 70 dias) após a TLCA. A gravidade das lesões histopatológicas foi graduada nos fêmures após coloração por H&E e azul de toluidina através do escore da OARSI. A quantidade de glicosaminoglicanos (GAGs) extraídos da cartilagem articular dos côndilos femorais foi medida após eletroforese em gel de agarose. O tamanho molecular dos GAGs foi medido após eletroforese em gel de poliacrilamida. A liberação de NO no líquido sinovial foi medida 7 dias após TLCA. RESULTADOS: GluChon reduziu significativamente a dor articular nesse modelo (p<0,01). Glu também reduziu a dor articular, mas não se alcançou significância estatística. Os animais OA apresentaram um aumento significativo dos GAGs na cartilagem articular aos 70 dias após TLCA (77,68±3,38 µg/mg) quando comparados aos animais SHAM (53,46±4,58 µg/mg). O tamanho molecular dos GAGs foi significativamente maior nos animais OA que nos animais SHAM 70 dias após a cirurgia (p<0,01). GluChon preveniu tanto o aumento da quantidade de GAGs (54,42±5,39 µg/mg), quanto de seu tamanho molecular (p<0,05), e estes resultados acompanharam-se de melhora significativa da lesão histopatológica (p<0,05). Os resultados obtidos com Glu foram semelhantes, porém menos evidentes, e não alcançaram significância estatística. Glu aumentou significativamente a quantidade de NO na cavidade articular 7 dias após a TLCA. CONCLUSÕES: GluChon foi antinociceptivo e reduziu significativamente a incapacitação articular. A lesão da cartilagem articular no modelo de TLCA em ratos se acompanha de aumento da concentração e do tamanho molecular dos GAGs, e o tratamento com GluChon previne essas alterações e reduz o dano histopatológico. GluChon foi mais eficaz do que Glu tanto na redução da dor quanto da lesão da cartilagem articular, sugerindo benefício da combinação sobre o uso isolado de sulfato de glicosamina. / OBJECTIVES: Evaluate the antinociceptive and chondroprotective effects of glucosamine sulfate and chondroitin sulfate. METHODS: Male Wistar rats underwent anterior cruciate ligament transection (ACLT) or sham operation of the right knee. Animals were treated p.o. with glucosamine sulfate (Glu) 500 mg/kg, the combination of glucosamine sulfate 500 mg/kg and chondroitin sulfate 400 mg/kg (GluChon), or saline, since 7 days prior to surgery until the sacrifice 70 days after ACLT. A positive control group received meloxicam 6 mg/kg s.c. for antinociceptive evaluation comparisons. Joint pain was evaluated with rat incapacitation test. Animals were sacrificed 7,14,28 or 70 days after ACLT. The severity of histopathologic lesions was evaluated on femoral condyles after hematoxylin-eosin or toluidine blue staining with OARSI grading and staging system. Cartilage extracted glycosaminoglycans (GAGs) concentration was assessed after agarose gel electrophoresis. GAGs\' molecular weight was evaluated after polyacrylamide gel electrophoresis. NO release in synovial fluids was assessed 7 days after ACLT. RESULTS: GluChon reduced joint pain (p<0.01). Glu also reduced joint pain, but results did not reach statistical significance. A significant increase in articular cartilage\'s GAGs concentration was observed in OA animals (77.68±3.38 µg/mg) as compared to sham (53.46±4.58 µg/mg). OA animals also had significantly higher molecular weight GAGs than sham (p<0.01). GluChon prevented both GAG concentration and molecular weight elevations in OA animals, and that was associated with significant less cartilage damage assessed by histopathologic examination (p<0.05). Glu effects were less evident, and did not reach statistical significance. Glu was associated with significant higher concentrations of NO in synovial fluid. CONCLUSIONS: GluChon was antinociceptive on the ACLT model in rats. Articular cartilage damage was associated with increased amounts of GAG with higher molecular weight, and the prevention of these alterations with GluChon treatment was associated with less histopathologic damage. GluChon was more efficient than Glu for both pain and articular cartilage damage reduction, suggesting that combined treatment is better than glucosamine sulfate alone.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-01T16:45:23Z No. of bitstreams: 1 Fernanda Katharine de Souza Lins Borba.pdf: 4059966 bytes, checksum: cce20c494a8d5b3926e4508d0ff50750 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-01T16:45:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Katharine de Souza Lins Borba.pdf: 4059966 bytes, checksum: cce20c494a8d5b3926e4508d0ff50750 (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Chondroitin Sulfate (CS) and Glucosamine Sulfate (GS) are functional constituents of vertebrate tissues. GS is an amino sugar and CS is part of the glucosaminoglycans group (GAGs). Studies have suggested CS and GS to have anti-inflammatory properties, however it has also been shown that these compounds promote scarring and proliferation of fibroblasts, which express molecules important for blood vessel growth (angiogenesis). This study was aimed at evaluating the effects of CS and GS on in vitro models regarding cell viability (cytotoxicity - MTT), proliferation (BrdU incorporation) and differentiation (tubulogenesis in Matrigel support) on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC line). In vivo angiogenesis was also evaluated in (1) extraembryonic membranes of Gallus domesticus (number of chorioallantoic vessels - CAM assay and vitelinic YSM assay; and fractal geometry analysis); (2) and subcutaneous tissue of adult mice (Mus muscullus) by hemoglobin quantification (Spectroscopy) in Gelfoam implants. In the HUVEC assay, both CS and GS (1-3000 g/mL) displayed partial cytotoxic effect (~50% viability), but only in the highest tested concentrations (3000 and 1000 g/mL). It was observed that CS (3 g/mL), but not GS, promoted proliferation and tubulogenesis of HUVEC in 40% (P < 0.05) and 64% (P < 0.05), respectively, relative to control (RPMI-1640 medium). These effects did not significantly differ from the respective 28% and 53% promoted by the well known angiogenic growth factor FGF-2 (50 ng/mL). In the in vivo vasculoangiogenesis YSM assay on 2 to 4-day old embryos, GS (0.001-0.1mg/disk) and, to a lesser extent, CS (0.030-0.1mg/disk) increased the amount of vessels relative to control (P < 0.05). The effects of administration of CS and GS (0.1mg/disk) did not differ from what was observed in groups treated with 50 ng/mL FGF2. In the CAM angiogenesis assay on 6 to 8-days old embryos, again both CS and GS increased the amount of vessels relative to control, but only in concentrations as high as 2.0 mg/disk. This effect was no different from what was observed in groups treated with 50 ng/mL FGF2. The pro-angiogenic effects of CS (2 mg/disk) in embryonary angiogenesis were confirmed in the advanced angiogenesis of mice: only the group treated with CS (2 mg/implant) displayed a significant increase in the amount of blood vessels, expressed as hemoglobin content (0.52 ± 0.08g/dL), relative to control (vehicle; PBS; 0.20 ± 0.07 g/dL). This pro-angiogenic effect was no different than that of FGF2 (0.53 ± 0.1g/dL). The in vitro and in vivo results indicate the pro-angiogenic properties of CS and GS. However, CS (GAG) was the more effective compound in the tests performed. As a constituent of proteoglycans, it is suggested that CS exerts its effects by interacting with FGF and other angiogenic factors in the extracellular matrix, stabilizing the receptor, and thus positively modulating the pro-angiogenic signal in endothelial cells. While the cellular mechanisms underlying CS and GS activity demand more specific research, there is an evident potential therapeutic use for both compounds in clinical situations, such as those related to vascular discrepancy. / Sulfato de glucosamina (SG) e Sulfato de condroitina (SC) são constituintes funcionais dos tecidos de vertebrados. O SG é um aminoaçúcar e o SC integra o grupo das glicosaminoglicanas (GAG). Estudos apontam propriedades antiinflamatórias do SC e SG, e demonstram ainda que essas substâncias promovem a cicatrização e a proliferação de fibroblastos, os quais expressam moléculas que atuam na formação de vasos sanguíneos (angiogênese). Os objetivos deste estudo foram avaliar a ação do SC e SG em modelos in vitro sobre a viabilidade (citotoxicidade pelo MTT), proliferação (incorporação por BrdU) e diferenciação (tubulogênese em suporte matrigel) na linhagem de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC). Também se investigou a angiogênese in vivo: (1) em membranas anexas de embriões de Gallus domesticus (número de vasos corioalantóides - ensaio da CAM, e vitelínicos – ensaio da YSM; e análise por geometria fractal); (2) e no tecido subcutâneo de camundongos adultos por meio de quantificação da hemoglobina em implantes de Gelfoam. No ensaio com HUVEC, SC e SG (1-3000 g/mL) exerceram efeito citotóxico parcial (~50% de viabilidade), e somente nas respectivas maiores concentrações (3000 e 1000 g/mL). Verificou-se que o SC (3 g/mL), mas não o SG, estimulou a proliferação e a tubulogênese de HUVEC em 40% (p < 0,05) e em 64% (p < 0,05) respectivamente, em relação ao controle (meio RPMI-1640). Estes efeitos não diferiram estatisticamente dos 28% e 53%, respectivamente, promovidos pelo bem conhecido fator de crescimento angiogênico FGF-2 (50 ng/mL). No ensaio de vasculo-angiogênese na YSM de embriões de 2-4 dias de idade o SG (0,001-0,1mg/disco) principalmente, e o SC (0,030-0,1mg/disco) aumentaram o número de vasos em relação ao grupo controle (p < 0,05). Os efeitos da administração de SC e SG (0,1 mg/disco) não diferiram do observado no grupo tratado com 50 ng/mL de FGF-2. No ensaio de angiogênese na CAM de embriões de 6-8 dias de idade, ambos, SC e SG também elevaram o número de vasos em relação ao controle na concentração elevada de 2,0 mg/disco. Este efeito também não diferiu do observado no grupo exposto a 50 ng/mL de FGF- 2. O efeito pró-angiogênico do SC (2 mg/disco) na angiogênese embrionária foi confirmado na angiogênese avançada de camundongos adultos. Apenas o grupo que recebeu SC (2 mg/implante) mostrou um aumento significativo de vasos sanguíneos, expresso como conteúdo de hemoglobina (0,52 ± 0,08g/dL), comparado ao controle (veículo; PBS; 0,20 ± 0,07 g/dL). Este efeito pró-angiogênico não diferiu do obtido com FGF2 (0,53 ± 0.1g/dL). Os resultados in vitro e in vivo demonstram as propriedades pró-angiogênicas do SC e SG, contudo o SC (GAG) foi o mais efetivo nos ensaios. Como um constituinte de proteoglicanas, o SC sugere exercer seus efeitos pela interação com o FGF e outros fatores angiogênicos na matriz extracelular, estabilizando-os nos receptores e modulando assim, positivamente, o sinal pró-angiogênico nas células endoteliais. Embora mecanismos celulares subjacentes à atividade de SC e SG demandem mais estudos, evidencia-se um potencial papel terapêutico das duas substâncias em situações clínicas relacionadas à defasagem vascular.