Proteingebundene Maillard-Reaktionsprodukte (MRP) und Crosslink-Aminosäuren (CLAS) werden mit der Nahrung täglich in nicht unerheblichen Mengen aufgenommen. In Humanstudien wurde gezeigt, dass einzelne dieser Produkte resorbiert werden. Die Beteiligung einzelner MRP und CLAS an pathophysiologischen Prozessen wird diskutiert. Im ersten Teil der Arbeit wurden MRP (Fructoselysin, Lactuloselysin, CML, CEL, Pyrralin, MG-H1, Pentosidin) und CLAS (LAL, Glutamyllysin) in Casein angereichert und die Caseine einer simulierten gastrointestinalen Verdauung unterzogen. Mit der posttranslationalen Modifizierung ging eine Verschlechterung der Verdaubarkeit einher. Dies zeigte sich daran, dass während der Verdauung bei zunehmendem Modifizierungsgrad Peptide mit Molmassen > 1000 Da schlechter abgebaut wurden und somit die Bildung von Peptiden < 1000 Da abnahm. Die Verschlechterung der Verdaubarkeit ließ sich vor allem auf die Quervernetzung der Caseine, weniger auf die Modifizierung von Aminosäuren zurückführen. Zudem wurde die Freisetzbarkeit einzelner Aminosäuren durch posttranslationale Modifizierung gesenkt. Dies konnte praktisch ausschließlich auf die Modifizierung von Lysinresten, nicht auf die Quervernetzung, zurückgeführt werden. Vor allem Aminosäuren, die im Casein in der Nähe von Lysinresten überrepräsentiert sind, wurden mit zunehmender Modifizierung schlechter freigesetzt. Die modifizierten Aminosäuren selbst wiesen ein sehr differenziertes Freisetzungsmuster auf. Amadori-Produkte wurden sehr gut freigesetzt, quervernetzende Aminosäuren dagegen nur zu einem geringen Anteil. Als Referenzsubstanzen für chromatographische Messungen und als Testsubstanzen für Inhibitions- und Transportexperimente wurden im zweiten Teil der Arbeit insgesamt 19 freie MRP (Fructoselysin, Lactuloselysin, Tagatoselysin, Ribuloselysin, Carboxymethyllysin, Carboxyethyllysin, Pyrralin, Formylin, Maltosin, MG-H1, 3-DG-H, PIO, Argpyrimidin, Pentosidin) und CLAS (Lysinoalanin, π- und τ-Histidinoalanin, Ornithinoalanin, Lanthionin) in hohen Ausbeuten synthetisiert und charakterisiert. Zwölf der Produkte (Fructoselysin, Carboxymethyllysin, Carboxyethyllysin, Pyrralin, Formylin, Maltosin, MG-H1, Argpyrimidin, Lysinoalanin, π- und τ-Histidino¬alanin und N-ε-(γ-Glutamyl)-Lysin) wurden erstmals auch Dipeptidderivate (Ala-Xaa bzw. Xaa-Ala) synthetisiert und charakterisiert. Mithilfe von Kompetitionsexperimenten an Caco-2-Zellen konnte gezeigt werden, dass freie MRP und CLAS die Aufnahme von L-[3H]Lysin kaum hemmten und somit nicht mit Transportsystemen für basische Aminosäuren wechselwirken können. Der überwiegende Teil der dipeptidgebundenen Derivate hemmte jedoch in konzentrationsabhängiger Weise den Transport von [14C]Gly-Sar . Diese Dipeptide stellen somit z.T. hoch affine Inhibitoren des Peptidtransporters dar. Die Affinität zum Transporter ist stark sequenzabhängig. Caco-2-Zellen, die als Monolayer wachsen, wurden auf porösen Polycarbonatmembranen kultiviert und zu Transportstudien eingesetzt. Keines der freien MRP und CLAS wurde aktiv über den Monolayer transportiert. Wurden die Derivate dagegen dipeptidgebunden eingesetzt, stieg, außer bei fructosylierten Peptiden, der transepitheliale Transport stark an. Allerdings wurden die Peptide meist nicht intakt transportiert, sondern intrazellulär gespalten und die freien Aminosäuren basolateral abgegeben. Zum Teil reicherten sich die modifizierten Aminosäuren, besonders die hydrophilen, intrazellulär an. Hydrophobe Aminosäuren (Pyrralin, Formylin, Maltosin, Argpyrimidin) konnten die Zelle dagegen schnell verlassen. Diese Aminosäuren sollten daher auch in vivo effektiv resorbiert werden. In Kompetitionsexperimenten an OK-Zellen zeigte sich, dass modifizierte Aminosäuren auch an Nierenzellen nicht mit Transportsystemen für Lysin wechselwirken. Keine der freien Aminosäuren wurde aktiv über den OK-Zellmonolayer transportiert. Somit ist nicht von einer renalen Reabsorption der untersuchten MRP und CLAS auszugehen.

Schätzungsweise 1 – 2 % der europäischen Bevölkerung reagieren allergisch auf bestimmte Lebensmittel. Die verantwortlichen Allergene sind meist Proteine und können während der Lebensmittelverarbeitung, vor allem infolge thermischer Prozesse, erheblich modifiziert werden. Daraus kann sowohl eine Senkung als auch eine Erhöhung des allergenen Potentials resultieren. Insbesondere die Entstehung von sog. „Neoepitopen“ in der Folge der Maillard-Reaktion ist bereits diskutiert worden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Glykierung und dem allergenen Potential von Lebensmitteln, im Speziellen von Karotten und Erdnüssen, untersucht. Die Karottenallergie ist in der europäischen Bevölkerung relativ häufig. Etwa 23 – 25 % aller Nahrungsmittelallergiker leiden an dieser meist pollenassoziierten Allergie. Es ist bekannt, dass das allergene Potential von Karotten durch Hitzebehandlung, infolge der irreversiblen Denaturierung des Hauptallergens Dau c 1, stark gesenkt wird. Daher stellte sich die Frage, ob bestimmte Maillard-Reaktionsprodukte (MRP) als Indikatoren für die Senkung des allergenen Potentials infolge der Hitzebehandlung geeignet sind. Da zum Ausmaß der Maillard-Reaktion in hitzebehandelten Karotten bisher kaum Daten vorlagen, wurden zunächst Untersuchungen zu relevanten Glykierungsprodukten und zur resultierenden Aminosäuremodifizierung durchgeführt. In verschiedenen Handelsproben (Säfte, Breie, Konserven und getrocknete Karotten) waren neben Fru-Lys die Amadori-Produkte (AP) zahlreicher Aminosäuren, wie Fru-Ala und Fru-GABA nachweisbar. Als Produkte der fortgeschrittenen Phase der Maillard-Reaktion (advanced glycation endproducts, AGEs) wurden erstmals Pyrralin, Carboxymethyllysin (CML) und Pentosidin detektiert. Die resultierenden Aminosäure-modifizierungen waren in Produkten mit hohem Wasseranteil (Säfte, Breie sowie Konserven) mit bis zu 5 % gering. Dagegen zeigten getrocknete Karotten sehr hohe Derivatisierungsgrade (z. B. Lysin bis 58 %). Dabei war besonders die frühe Phase der Glykierung von Bedeutung, während die fortgeschrittene Phase kaum eine Rolle spielte. Das AP Fru-Lys bzw. dessen Hydrolyseprodukt Furosin gilt zwar als anerkannter Erhitzungsmarker für Lebensmittel, erwies sich aber in Karottenprodukten aufgrund von schnell stagnierenden Gehalten nur als bedingt geeignet. Insbesondere FM-GABA zeigte eine wesentlich bessere Korrelation mit der Intensität der Hitzebehandlung. Zudem korrelierte der Anstieg dieses AP gut mit der Senkung des Gehaltes an IgE-reaktivem Dau c 1. Damit ist FM-GABA ein geeigneter Parameter sowohl für die Hitzebehandlung von Karotten als auch für die damit verbundene Senkung des allergenen Potentials. Die Erdnussallergie gewinnt mit dem ansteigenden Verzehr von Erdnüssen zunehmend an Bedeutung. Diese Allergie zeichnet sich durch eine mitunter sehr schwere Symptomatik aus, so dass Erdnüsse hinsichtlich lebensbedrohender und letal verlaufender Nahrungsmittel-allergien an erster Stelle stehen. Bereits der Verzehr kleinster Mengen an Erdnuss, selbst Hautkontakt oder Inhalation können eine allergische Reaktion auslösen. Die Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, sind bekanntermaßen stabil und behalten ihr allergenes Potential während der Hitzebehandlung bei. Dennoch besteht die Vermutung, dass die Zubereitung von Erdnüssen deren Allergenität maßgeblich beeinflusst. Daher wurde der Einfluss des Röstens bereits untersucht, jedoch sind die erhaltenen Ergebnisse bisher sehr widersprüchlich. Während in einigen Studien keine Unterschiede zwischen rohen und gerösteten Erdnüssen beobachtet wurden, berichteten andere Autoren von einer 90-fachen Erhöhung des IgE-Bindungsvermögens infolge der Röstung, die mit der Bildung von Neoepitopen durch die Maillard-Reaktion in Verbindung gebracht wurde. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss der Röstung und insbesondere der Glykierung auf das allergene Potential von Erdnüssen untersucht. Da bisher kaum Daten zu MRP-Gehalten in Erdnüssen vorlagen, wurden zunächst verschiedene handelsübliche Proben (ungeröstete und geröstete Erdnüsse, Erdnussbutter und Erdnussflips) auf ihre Gehalte an Glykierungsprodukten und die resultierende Aminosäure-modifizierung untersucht. Dabei wurde erstmals das AP Fru-Lys und die AGEs Pyrralin und CML identifiziert und quantifiziert. Definierte Erhitzungsexperimente zeigten, dass während der Röstung von Erdnüssen insbesondere Pyrralin in hohen Mengen gebildet wird. Während in erhitzten Lebensmitteln üblicherweise Fru-Lys das dominierende MRP darstellt, trug Pyrralin in gerösteten Erdnüssen in vergleichbarem oder höherem Maße zur Lysinmodifizierung bei als das AP. Aufgrund der stetigen Zunahme ist Pyrralin als Erhitzungsparameter in Erdnüssen wesentlich besser geeignet als das Hydrolyseprodukt Furosin, dessen Gehalt schnell ein Plateau erreichte. Durch die Röstung von Erdnüssen wurden hohe Lysinmodifizierungen bis zu 55 % erreicht, die jedoch nur zu einem Zehntel durch die gemessenen MRP erklärbar waren. Da zahlreiche andere Aminosäuren ebenfalls deutliche Abnahmen zeigten, müssen andere Reaktionen neben der Maillard-Reaktion einen wesentlichen Beitrag zur Aminosäurederivatisierung leisten. Aufgrund des hohen Gehaltes an ungesättigten Fettsäuren liegt die Vermutung nahe, dass es sich um Reaktionen mit Lipidperoxidationsprodukten handeln könnte. Der Einfluss der Röstung auf das allergene Potential der Erdnüsse wurde anhand des Antikörperbindungsvermögens bewertet. Dabei zeigten die Proteinextrakte roher und gerösteter Erdnüsse keine Unterschiede in der IgE-Reaktivität. Jedoch sind aufgrund der schlechten Extrahierbarkeit gerösteter Erdnussproteine keine Rückschlüsse auf das allergene Potential der gesamten Erdnüsse möglich. Vor allem das Allergen Ara h 1 bildete zunächst Di- und Trimere, unter drastischeren Bedingungen kam es zur weiteren Aggregation und damit zur Unlöslichkeit. Analog wurde auch die Löslichkeit aller anderen Erdnussproteine deutlich reduziert. Folglich konnten insbesondere stark modifizierte, aggregierte Proteine mit der verwendeten Extraktionsmethode nicht erfasst werden. Mittels Immunoblot wurde gezeigt, dass das IgE-Bindungsvermögen des Ara h 1 bei der Röstung nicht verändert wurde, solange das Allergen noch löslich war. Aussagen zum allergenen Potential des aggregierten Proteins waren noch nicht möglich. Hingegen wurden deutliche Hinweise auf die Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung erhalten. Um den Einfluss der Maillard-Reaktion im Einzelnen auf die beiden Hauptallergene der Erdnuss, Ara h 1 und Ara h 2, untersuchen zu können, wurden diese Allergene aus rohen Erdnüssen isoliert und unter röstungsrelevanten Bedingungen glykiert. Durch diese Modifizierung wurde deren Antikörperbindungsvermögen jedoch nicht beeinflusst. Folglich liegen keine Hinweise auf die Bildung von Neoepitopen im Zuge der Maillard-Reaktion vor. Die beobachtete Erhöhung der IgE-Reaktivität des Ara h 2 infolge der Röstung ist daher auf andere Reaktionen, vermutlich mit Produkten der Lipidperoxidation, zurückzuführen. Die Grundvoraussetzung für eine allergische Reaktion ist, dass die verantwortlichen Epitope die gastrointestinale Verdauung überstehen und intakt aufgenommen werden. Durch thermische Behandlung und die daraus resultierende Umfaltung sowie kovalente Modifizierung kann die Verdauungsresistenz erheblich beeinflusst werden. Daher wurde mit Hilfe einer simulierten gastrointestinalen Verdauung der Einfluss der Röstung von Erdnüssen sowie der Glykierung von Ara h 1 und Ara h 2 auf die Verdaubarkeit der Allergene untersucht. Diese orientierenden Verdauungsstudien gaben Hinweise auf eine erhöhte Verdauungsresistenz der Proteinaggregate in gerösteten Erdnüssen. Durch Glykierung der Allergene Ara h 1 und Ara h 2 wurde hingegen keine Veränderung der Verdaubarkeit erreicht. Für die hohe Proteolyseresistenz der Proteine in gerösteten Erdnüssen sind offenbar wiederum Reaktionen mit peroxidierten Erdnusslipiden verantwortlich.

One of the greatest risk factors for disease is advanced age. As the human lifespan has increased, so too have the burdens of caring for an increasingly older population suffering from rising rates of cardiovascular disease, kidney disease, diabetes, and dementia. The need for improving medical technology and developing new therapies for age-related diseases is manifest. Yet our understanding of the processes of aging and how to attenuate the effects of aging remains incomplete. Various studies have established calorie restriction as a robust method for extending lifespan in laboratory organisms; however the mechanism is a topic of much debate. Advancing our understanding of calorie restriction holds promise for illuminating biochemical processes involved in the aging process. One of the best explanations for the lifespan extension benefits of calorie restriction is that it improves cellular protein homeostasis (proteostasis), but because proteostasis is dynamic, it can be difficult to measure. We developed a novel combined omics methodology integrating kinetic proteomics, and applied it to a mouse model placed on calorie restriction. Our unbiased approach integrating just three measurements (kinetic proteomics, quantitative proteomics, and transcriptomics) enabled us to characterize the synthesis and degradation of thousands of proteins, and determine that calorie restriction largely alters proteostasis by slowing global protein synthesis post-transcriptionally. Validating our omics approach, we were able to replicate many previous results found in the literature, demonstrating the differential regulation of various protein ontologies in response to the nutrient stress of calorie restriction. Moreover, we were able to detect differential degradation of the large and small ribosomal subunits under calorie restriction, and proposed a model in which the rate of protein synthesis could be attenuated by the depletion of the large ribosomal subunit relative to the small subunit. The flexibility of our dynamic combined omics approach was demonstrated by the expansion of measurements to include nucleic acids and lipids. Flux measurements of DNA, ribosomal RNA, and lipids yielded cellular division rates, ribosome turnover, and lipid metabolism insights, respectively. We also adapted this approach to two-dimensional tissue imaging by DESI-MS in a proof-of-concept study to demonstrate its utility for studying regional differences in metabolism. The future integration of metabolomics and lipidomics into our combined omics approach would be facile, and add unprecedented depth to systems-wide studies involving cellular metabolism. Applied to the regulation of cellular homeostasis in humans, this has the potential to open new avenues for elucidating the etiology of aging, understanding the pathology of age-related diseases, and identifying novel targets for therapeutics.

Type II diabetes mellitus is associated with many detrimental health situations including heart complications. The purpose of this study was to identify a role for PKA-dependent Rap1a signaling in the AGE-RAGE cascade. My hypothesis was Rap1a GTPase increased the downstream effects of AGE-RAGE signaling in diabetes via a PKA-dependent pathway leading to elevated ECM remodeling in the heart. Cardiac fibroblasts were isolated from heterozygous (Het) and diabetic (db/db) mice. To test the hypothesis, gain-ofunction and loss-ofunction treatments were used. PKC-Zeta is known as a major signaling hub that potentially links PKA-dependent and AGE-RAGE signaling cascades so PKC-Zeta inhibition to downregulate PKA-dependent cascade at PKC-Zeta was also used. Results showed a downregulation of signaling markers in the AGE-RAGE cascade when disrupting Rap1a crosstalk at PKC-Zeta. By understanding where the PKA-dependent and AGE-RAGE signaling cascades crosstalk, a new molecular mechanism is understood possibly leading to decreasing remodeling in a diabetic heart.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Τα τελικά προϊόντα προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (AGEs: Advanced Glycation Endproducts) παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια των διαβητικών αγγειακών επιπλοκών. Το καλύτερα χαρακτηριζόμενο είναι η N-καρβοξυμεθυλ-λυσίνη (CML). Τα AGEs προκαλούν σημαντικές επιδράσεις στα αγγεία με την πρόσδεσή τους σε ειδικούς υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, όπως τον RAGE (Receptor for Advanced Glycation Endproducts). Διαλυτές μορφές του RAGE (sRAGE) εμφανίζονται στο ανθρώπινο αίμα και δρουν ως παγίδα αιχμαλωτίζοντας τους φλεγμονώδεις προσδέτες του RAGE εξωκυττάρια, προστατεύοντας με αυτό τον τρόπο τα κύτταρα από τη βλάβη που προάγεται από τα AGEs. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να μελετηθούν τα επίπεδα του sRAGE, η πρωτεϊνική έκφραση του RAGE, καθώς και τα επίπεδα CML σε σχέση με διάφορες κλινικές και βιοχημικές παραμέτρους σε παιδιά, εφήβους και νεαρούς ενήλικες με ΣΔ1. Τα επίπεδα sRAGE και CML προσδιορίστηκαν με ELISA και η πρωτεϊνική έκφραση του RAGE στα μονοπύρηνα του περιφερικού αίματος με ανοσοαποτύπωση κατά Western σε 74 παιδιά, εφήβους και νεαρούς ενήλικες με ΣΔ1 (13± 4 χρονών) και 43 μάρτυρες αντίστοιχης ηλικίας, φύλου και σταδίου Tanner. Σ’ αυτή την εργασία τα αυξημένα επίπεδα sRAGE στα παιδιά με ΣΔ1 και πιο ειδικά, σ’ αυτά ηλικίας κάτω από 13 ετών και με διάρκεια διαβήτη κάτω από 5 έτη, μπορεί να είναι ένα προσωρινό προστατευτικό μέτρο ενάντια στην κυτταρική βλάβη και πιθανόν να είναι επαρκές για να εξουδετερώσει επαρκώς τα κυκλοφορούντα CML, εμποδίζοντας έτσι τις διαβητικές αγγειακές επιπλοκές. Επίσης, μια ήπια αύξηση της LDL θα μπορούσε να είναι ένα ερέθισμα για την αύξηση του sRAGE, οδηγώντας στη δέσμευση του CML και τελικά τη μείωση των επιπέδων CML στην κυκλοφορία. Τα μειωμένα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης του RAGE 55 kd (υποδοχέα πλήρους μήκους) μπορεί να αντανακλούν την αυξημένη έκφραση του sRAGE στους ασθενείς με ΣΔ1 συνολικά λόγω της αποκοπής του RAGE με μεταλλοπρωτεϊνάσες. Με την παρουσία κάποιου παράγοντα κινδύνου, όπως αύξηση ηλικίας, περιμέτρου κοιλίας, BMI, συστολικής ή διαστολικής αρτηριακής πίεσης ή επιδείνωση λιπιδαιμικού προφίλ αυξάνεται η πρωτεϊνική έκφραση της ισομορφής αυτής, ενώ φαίνεται αντίστοιχα να μειώνονται τα επίπεδα του sRAGE. Φαίνεται τελικά ότι συνολικά στα παιδιά, τους εφήβους και τους νεαρούς ενήλικες με ΣΔ1 υπάρχει μια υποκλινική διαταραχή του άξονα sRAGE-RAGE-CML, η οποία δύναται να μετατραπεί σε κλινικά εμφανείς αγγειακές βλάβες, αν προστεθούν περαιτέρω επιβαρυντικοί παράγοντες. / The binding of Advanced Glycation Endproducts (AGEs) to their receptor (RAGE) plays a major role in the development of diabetic vascular complications. This work is based on the relation between circulating soluble RAGE (sRAGE) levels in children, adolescents and young adults with IDDM and RAGE protein expression in association with N-(carboxymethyl)lysine (CML), a major antigenic AGEs component. Circulating sRAGE and CML levels were determined by ELISA and RAGE protein expression was evaluated in peripheral blood mononuclear cells by western immunoblotting in 74 children, adolescents and young adults with IDDM (134 years old) and 43 age, sex and Tanner stage-matched controls. Serum sRAGE levels were significantly higher in IDDM than in controls, inversely correlated to diabetes duration and directly correlated to LDL levels. Furthermore, circulating CML levels were not significantly different between IDDM and controls. Also, the protein expression of the RAGE isoforms 55 kd (full-length), 64 kd and 100 kd, measured by western immunoblotting, was significantly lower in IDDM than in controls, whereas RAGE 37 kd levels were not significantly different between IDDM and controls. Finally, when there was a risk factor, such as increased age, poor lipid profile, increased BMI or waist circumference or increased systolic or diastolic pressure, then it seemed that isoforms RAGE 55, 64 and 100 kd were increased. Isoform RAGE 64 kd could be RAGE-v5, a splice variant which resulted in a change of amino acid sequence in the extracellular ligand-binding domain of RAGE. Isoform RAGE 37 kd seemed to be Δ8-RAGE, a soluble splice variant with probably protective function, which had been found increased in patients with increased HDL. Finally, isoform RAGE 100 kd seemed to be some other splice variant in peripheral mononuclear cells. In conclusion, increased serum levels of sRAGE seen in IDDM children may be a temporary protective measure against cell damage and may be sufficient to efficiently eliminate excessive circulating CML. Moreover, the lower protein expression of the full-length RAGE in IDDM may also reflect the increased sRAGE expression in patients due to RAGE cleavage by metalloproteases. Consequently, in IDDM children, adolescents and young adults there may be a subclinical perturbation of the sRAGE-RAGE-CML axis, which could lead to future clinical vascular damage if additional risk factors are added over time.

Kohlenhydrate und Proteine gehören neben Wasser und Fetten zu den quantitativ bedeutendsten Grundbestandteilen biologischer Systeme und der Lebensmittel. Unter milden Bedingungen in lebenden Organismen oder unter thermischer Belastung bei der Lebensmittelverarbeitung können reduzierende Kohlenhydrate amin-katalysiert durch die Abspaltung von Wasser und Fragmentierungen des Kohlenstoffgerüsts abgebaut werden, wobei die noch reaktiveren 1,2-Dicarbonylverbindungen entstehen. Aus der Reaktion der N-α-Aminogruppe und funktioneller Gruppen der Seitenketten von Aminosäuren mit Kohlenhydraten bzw. 1,2-Dicarbonylverbindungen können stabile Endprodukte entstehen. In vivo können proteingebundene Maillard-Produkte (MRPs) aus der Reaktion mit Glucose (Amadori-Produkte) oder 1,2-Dicarbonylverbindungen (Advanced Glycation Endproducts: AGEs) entstehen. Beispielsweise ist das „N-terminale“ N-α-Fructosylderivat der β-Kette des Hämoglobins ein etablierter Parameter zur Diagnose von Diabetes mellitus (HbA1c-Wert). Diese nicht-enzymatische, posttranslationale Modifizierung von Proteinen wird allgemein als Glykierung bezeichnet und kann die Funktionalität von Proteinen beeinträchtigen. Deshalb wird untersucht, ob die Trübung der Augenlinsen, die Versteifung von Blutgefäßen oder Schädigungen von Nervenzellen durch eine erhöhte Glykierung verursacht werden. Diese Veränderungen treten im Alter und bei Stoffwechselkrankheiten wie Diabetes mellitus und Urämie auf, die durch eine erhöhte Glucosekonzentration bzw. die Anreicherung von 1,2-Dicarbonylverbindungen im Blut gekennzeichnet sind. Zwar gibt es Publikationen zum Vorkommen N-terminaler Amadori-Produkte an Hämoglobin und in Lebensmitteln, aber die Bildung N-terminaler AGEs wurde bisher nur in wenigen Studien untersucht. Deshalb waren die Bildung und das Vorkommen N-terminaler AGEs im physiologischen Modell, in Hämoglobin und in Backwaren Gegenstand der vorliegenden Arbeit. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals systematisch die Sequenzabhängigkeit der Bildung der Fructosylderivate bzw. der CM-Derivate in Konkurrenz zu den Glyoxal-2(1H)-Pyrazinonen am N-Terminus von Peptiden unter physiologischen und backtechnologischen Bedingungen untersucht. Dabei wurde nachgewiesen, dass die Variation der C-terminalen Aminosäure in Dipeptiden den Glykierungsgrad und das Produktspektrum erheblich beeinflusst. Mit dem konsequenten Nachweis der N-terminalen von Glyoxal und Methylglyoxal ableitbaren Carboxyalkylderivate und 2(1H)-Pyrazinone in humanen Hämoglobin wurde die Relevanz der N-terminalen Glykierung in vivo untermauert. Damit wird eine umfassendere Beurteilung des Dicarbonylstresses und der Glykierung insbesondere bei Urämikern und Diabetikern ermöglicht. Am Beispiel von Backwaren wurde für Lebensmittel gezeigt, dass unter trockenen Reaktionsbedingungen die 2(1H)-Pyrazinone und in wasserhaltigen Systemen die Carboxyalkylderivate bevorzugt zu erwarten sind.

Kohlenhydrate und Proteine gehören neben Wasser und Fetten zu den quantitativ bedeutendsten Grundbestandteilen biologischer Systeme und der Lebensmittel. Unter milden Bedingungen in lebenden Organismen oder unter thermischer Belastung bei der Lebensmittelverarbeitung können reduzierende Kohlenhydrate amin-katalysiert durch die Abspaltung von Wasser und Fragmentierungen des Kohlenstoffgerüsts abgebaut werden, wobei die noch reaktiveren 1,2-Dicarbonylverbindungen entstehen. Aus der Reaktion der N-α-Aminogruppe und funktioneller Gruppen der Seitenketten von Aminosäuren mit Kohlenhydraten bzw. 1,2-Dicarbonylverbindungen können stabile Endprodukte entstehen. In vivo können proteingebundene Maillard-Produkte (MRPs) aus der Reaktion mit Glucose (Amadori-Produkte) oder 1,2-Dicarbonylverbindungen (Advanced Glycation Endproducts: AGEs) entstehen. Beispielsweise ist das „N-terminale“ N-α-Fructosylderivat der β-Kette des Hämoglobins ein etablierter Parameter zur Diagnose von Diabetes mellitus (HbA1c-Wert). Diese nicht-enzymatische, posttranslationale Modifizierung von Proteinen wird allgemein als Glykierung bezeichnet und kann die Funktionalität von Proteinen beeinträchtigen. Deshalb wird untersucht, ob die Trübung der Augenlinsen, die Versteifung von Blutgefäßen oder Schädigungen von Nervenzellen durch eine erhöhte Glykierung verursacht werden. Diese Veränderungen treten im Alter und bei Stoffwechselkrankheiten wie Diabetes mellitus und Urämie auf, die durch eine erhöhte Glucosekonzentration bzw. die Anreicherung von 1,2-Dicarbonylverbindungen im Blut gekennzeichnet sind. Zwar gibt es Publikationen zum Vorkommen N-terminaler Amadori-Produkte an Hämoglobin und in Lebensmitteln, aber die Bildung N-terminaler AGEs wurde bisher nur in wenigen Studien untersucht. Deshalb waren die Bildung und das Vorkommen N-terminaler AGEs im physiologischen Modell, in Hämoglobin und in Backwaren Gegenstand der vorliegenden Arbeit. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals systematisch die Sequenzabhängigkeit der Bildung der Fructosylderivate bzw. der CM-Derivate in Konkurrenz zu den Glyoxal-2(1H)-Pyrazinonen am N-Terminus von Peptiden unter physiologischen und backtechnologischen Bedingungen untersucht. Dabei wurde nachgewiesen, dass die Variation der C-terminalen Aminosäure in Dipeptiden den Glykierungsgrad und das Produktspektrum erheblich beeinflusst. Mit dem konsequenten Nachweis der N-terminalen von Glyoxal und Methylglyoxal ableitbaren Carboxyalkylderivate und 2(1H)-Pyrazinone in humanen Hämoglobin wurde die Relevanz der N-terminalen Glykierung in vivo untermauert. Damit wird eine umfassendere Beurteilung des Dicarbonylstresses und der Glykierung insbesondere bei Urämikern und Diabetikern ermöglicht. Am Beispiel von Backwaren wurde für Lebensmittel gezeigt, dass unter trockenen Reaktionsbedingungen die 2(1H)-Pyrazinone und in wasserhaltigen Systemen die Carboxyalkylderivate bevorzugt zu erwarten sind.

Amyloid beta (Aβ) has been postulated to be the principle initiator of the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Therefore, understanding the underlying mechanisms of Aβ induced neurotoxicity in the early stages of AD would be essential for finding potential therapeutic targets of AD. Aβ-binding alcohol dehydrogenase (ABAD) has been shown to be a mitochondrial binding site for Aβ. Expression of ABAD has been found to be increased in brains of AD sufferers. Two dimensional electrophoresis studies have revealed that endophilin 1 was upregulated in Tg mAPP/ABAD mice brains as compared to Tg mAPP, Tg ABAD and non-Tg mice brains. Increased expression of endophilin 1 has also been found in brains of AD patients as compared to non-demented control brain tissues. Endophilin1 has been reported to regulate c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation. In this study, expression of dominant negative forms of endophilin 1 (DN-endophilin 1) in mouse cortical neurons exhibited a significant reduction of Aβ induced JNK activation. Furthermore, using cell counting methods, it was shown that the transfection of DN-endophilin 1 increased neuron survival after Aβ treatment. Aβ has also been proposed to disrupt the interaction of ABAD and Cyclophilin D (CypD), which would trigger mitochondrial permeable transition, thereby leading to neurotoxicity. For fluorescence resonance energy transfer (FRET) analysis of the interaction of ABAD and CypD, a mitochondria targeted, EYFP tagged ABAD plasmid (pMito-ABAD-EYFP) and an ECFP tagged CypD (pCypD-ECFP) plasmid were developed. Positive FRET signals in SK-N-SH cells co-expressing pMito-ABAD-EYFP and pCypD-ECFP indicated that ABAD interacts with CypD in the mitochondria of mammalian cells. RAGE (receptor for advanced glycation end products) has been reported to bind to Aβ and mediate the toxic effects of Aβ peptides on neurons and microglia. It has been shown previously that Tg mAPP/DN-RAGE mice display preserved cognitive function as compared to Tg mAPP mice. To investigate possible mechanisms involved in rescuing cognitive function by RAGE blockage, two dimensional electrophoresis was used to analyze differential protein expression between Tg mAPP and Tg mAPP/DN-RAGE mice cortex. Altered expression of four proteins, including NADH dehydrogenase flavoprotein 2 (NDUFV2), glyoxalase 1 (GLO1), proteasome subunit beta type 4 (PSMB4, or β7 subunit of proteasome) and nitrilase family, member 2 (Nit2) have been observed between Tg mAPP/DN-RAGE mice cortex and Tg mAPP mice cortex. NDUFV2 is a 24kDa subunit of complex 1 which is involved in ATP synthesis. GLO1 is a cytosolic enzyme that plays a role the glutathione-dependent detoxification of α-oxoaldehydes, such as methylglyoxal. PSMB4 is a subunit of the 26s proteosome which is in the degradation of ubiquitinylated proteins. The function of Nit2 is still unclear.

Avaliamos os efeitos da glicação do colágeno (CG) e da glicose elevada sobre a migração de fibroblastos. Utilizamos células de ratos controle e diabéticos (D) e células NIH-3T3, cultivadas em glicose 5 mM ou 30 mM (HG). Para glicação utilizou-se ácido glioxílico. O CG apresentou menor resistência à tração e elasticidade. Fibroblastos migraram menos sob HG e sobre o CG. As células D no CG não se deslocaram, apresentaram menos integrina &#946;141 e expressaram mais &#945;-actina de músculo liso. A viscoelasticidade do citoesqueleto foi menor em células D, especialmente sobre o CG. Sobre fibronectina, células NIH-3T3 em HG apresentaram menos fibras de estresse e deficiência na retração da parte traseira. A expressão de miosinas IIA (MIIA), IIB (MIIB) e MRLC não foi alterada, mas a fosforilação de MII diminuiu. A distribuição de MIIB ficou mais difusa, enquanto MIIA não mudou. Células HG exerceram menor força sobre o substrato. A migração de fibroblastos em ambiente hiperglicêmico é deficiente, especialmente frente ao CG, em parte devido a uma redução da contratilidade celular. / We evaluated the effects of collagen glycation (GC) and high glucose concentrations on fibroblasts migration. Fibroblasts derived from control and diabetic rats (D) and NIH-3T3 cells were cultured under 5 mM or 30 mM glucose (HG). For glycation, glyoxylic acid was used. The GC showed lower tensile strength and elasticity. Fibroblasts migrated less in HG and over the GC. D cells did not move on GC, showed less &#946;141 integrin and a higher expression of smooth muscle &#945;-actin. The viscoelasticity of the cytoskeleton was lower in D cells, especially on the GC. On fibronectin, NIH-3T3 cells under HG had fewer stress fibers and showed impaired contraction at the rear, presenting long tails. The expression of myosin IIA (MIIA), IIB (MIIB) and MRLC has not changed, but the phosphorylation of MII decreased. The distribution of MIIB became more diffuse, while MIIA has not changed. Cells under HG exerted less force on the substrate. The migration of fibroblasts in hyperglycemic environment is impaired, especially on GC, partly due to a reduction of cell contractility.