L’énorme diversité des immunoglobulines (IG) permet la reconnaissance spécifique d’un nombre presqu’infini d’antigènes, et assure à l’organisme une protection à long-terme envers les pathogènes déjà rencontrés. La région déterminant de la complémentarité 3 (CDR3) de la chaine lourde des IG est le principal déterminant de la spécificité de l’IG. A l’aide des technologies de séquençage à haut débit, nous avons évalué si une vaccination peut conduire à la production d’IG antigène-spécifiques et partagées entre individus (réponse humorale publique), en nous intéressant particulièrement à la région CDR3. Ces «signatures» antigène-spécifiques peuvent potentiellement être utilisées pour reconstruire a posteriori l’histoire immunitaire d’un individu. Pour tester cette hypothèse, des rats transgéniques produisant des anticorps humains (OmniRatTM) ont été vaccinés avec divers antigènes, en particulier du virus de la rougeole (souche vaccinale et sauvage). Une forte réponse immunitaire publique a été observée au sein de différents groupes de rats, caractérisée par des séquences CDR3 partagées entre les animaux ayant reçu le même vaccin. Ces groupes de CDR3s constituent des signatures complexes antigène-spécifiques. De futures études de suivi vaccinal et d’infection devraient nous permettre de déterminer si les signatures identifiées se retrouvent également chez l’humain. Ces outils pourront se révéler précieux dans le cadre de la campagne de l'Organisation mondiale de la Santé en vue de l’éradication de la rougeole, en permettant de distinguer entre les individus vaccinés et infectés / The enormous diversity of immunoglobulins (IG) allows the specific recognition of an almost infinite number of antigens, and ensure a long-term protection against pathogens previously encountered by the organism. The complementarity-determining region 3 (CDR3) of the immunoglobulin heavy chain (IGH) is the major antigen binding domain and determinant of antigen-specificity of the antibody molecule. Using next-generation sequencing, we tested whether immunization resulted in the generation and accumulation of similar IGH CDR3 sequences that are antigen-specific and shared across individuals, i.e. public IGH CDR3s. Such public "antigen-specific signatures" can potentially be used to retrospectively reconstruct past antigenic challenges. To test this hypothesis, transgenic rats with fully functional human Ig heavy and light chain loci (OmniRatTM) have been immunized with diverse antigens, and particularly measles virus (MV)-derived antigen. We demonstrated a strong public immune response within the different groups of rats characterized by convergent IGH CDR3 amino acid sequences in the animals that received the same vaccine. These clusters of CDR3s represent complex antigen-specific IGH CDR3 signatures. We are now transposing this concept to human studies by performing infection and vaccination follow ups to test whether similar CDR3 signatures can also be found in peripheral blood B cells. In the context of the MV eradication campaign of the World Health Organization, new epidemiological tools that enable to distinguish between immunized and infected individuals would be valuable assets

Ce mémoire porte sur la conception de l'interface numérique s'occupant, lors de la réception au sein d'un système de transmission de données, des problèmes d'accès au canal dans les protocoles large bande de type W-CDMA (Wideband Code Division Multiple Access / Multiplexage à large bande par code). Le cœur de la problématique se situe dans la partie numérique en bande de base, le récepteur RAKE. Ce récepteur est responsable de la démodulation du signal et de l'exploitation de la diversité du signal en identifiant et combinant les composantes de trajets multiples d'un même signal. En effet, cette dernière fonction est particulièrement importante d’une part de son rôle pour contrer les effets d'évanouissement causés par les trajets multiples, et d’autre part du rôle central du récepteur RAKE. La conception et l'implantation de celui-ci revêtent un caractère primordial. Dans ce mémoire, nous proposons une nouvelle architecture pour le récepteur RAKE : CodeRAKE. Les caractéristiques architecturales principales recherchées sont une grande flexibilité et une extensibilité aisée, tout en préservant la fonctionnalité et un bon équilibre entre ressources utilisées (et donc surface consommée) et performances (vitesse de fonctionnement). Pour satisfaire les contraintes de flexibilité et d'extensibilité, l'architecture CodeRAKE est partitionnée (pour être modulaire) en fonction du nombre d'utilisateurs et du nombre de codes par utilisateur, sans perdre de vue les contraintes de limitions de ressources utilisées et de préservation des performances. La modularité élevée de CodeRAKE permet l'application aisée de techniques de parallélisation permettant d'augmenter facilement les performances pour satisfaire notamment les besoins du côté de la station de base. L'approche architecturale mise en œuvre est souple et peut être facilement adaptée à d'autres protocoles existants ou futurs. Elle répond ainsi au défi des années à venir, où les récepteurs devront être capables de supporter de multiples protocoles et interfaces d'accès, notamment sous le contrôle de couches logicielles / This thesis focuses on the design of the air interface of W-CDMA (Wideband Code Division Multiple Access) systems, particularly on the aspects related to the channel access problems at the reception side. The main concern herein is the design of the baseband digital parts, that is, the RAKE receiver. This receiver is in charge of the signal demodulation and responsible for making profit of signal diversity. This late functionality is particularly important as it allows to counter signal fading by detecting and combining multipath components (leading to signal reinforcement) Given the central role of the RAKE receiver, its design and implementation are of paramount importance. In this thesis, we propose a new architecture for the RAKE receiver: CodeRAKE. The main architectural characteristics being aimed are high flexibility and scalability, yet preserving a good trade-off between resource use (and hence, area consumption) and performance (operation speed). In order to satisfy the flexibility and scalability constraints, the CodeRAKE architecture is modular and partitioned according to the number of users and the number of codes per user, with the resource limitation and performance preservation constraints in mind. The high levels of modularity of the CodeRAKE architecture allow an easy use of parallelisation techniques, which in turn allow an easy increase of performances, particularly at the base station side.The architectural approach proposed herein are versatile and can be easily adapted to other existing or future protocols. It responds to the challenge of the coming years, where the receiver will have to support multiple protocols and access interfaces, including control software layers

Les systèmes de communication modernes exigent des débits de plus en plus élevés afin de traiter des volumes d'informations en augmentation constante. Ils doivent être flexibles pour pouvoir gérer des environnements multinormes, et évolutifs pour s'adapter aux normes futures. Pour ces systèmes, la qualité du service (QoS) doit être garantie malgré l'évolution des technologies microélectroniques qui augmente la sensibilité des circuits intégrés aux perturbations externes (impact de particules, perte de l'intégrité du signal, etc.). La tolérance aux fautes devient un critère important pour améliorer la fiabilité et par conséquence la qualité de service. Cette thèse s'inscrit dans la continuité des travaux menés au sein du laboratoire LICM concernant la conception architecturale d'une chaîne de transmission à haut débit, faible coût, et sûre de fonctionnement. Elle porte sur deux axes de recherche principaux : le premier axe porte sur les aspects rapidité et flexibilité, et en particulier sur l'étude et l'implantation d'architectures parallèles-pipelines dédiées aux codeurs convolutifs récursifs. Le principe repose sur l'optimisation des blocs calculant le reste de la division polynomiale qui constitue l'opération critique du codage. Cette approche est généralisée aux filtres récursifs RII. Les caractéristiques architecturales principales recherchées sont une grande flexibilité et une extensibilité aisée, tout en préservant la fonctionnalité ainsi qu'un bon équilibre entre quantité de ressources utilisées (et donc surface consommée) et performances obtenues (vitesse de fonctionnement) ; le deuxième axe de recherche porte sur le développement d'une méthodologie de conception de codeurs sûrs en présence de fautes, améliorant ainsi la tolérance de circuits intégrés numériques. L’approche proposée consiste à ajouter aux codeurs des blocs supplémentaires permettant la détection matérielle en ligne de l'erreur afin d'obtenir des architectures sûrs en présence des fautes. Les solutions proposées permettent d'obtenir un bon compromis entre complexité et fréquence de fonctionnement. Afin d'améliorer encore le débit du fonctionnement, nous proposons également des versions parallèles-pipelines des codeurs sûrs. Différents campagnes d'injection de fautes simples, doubles, et aléatoires ont été réalisées sur les codeurs afin d'évaluer les taux de détection d’erreurs. L'étude architectures sûrs de fonctionnement a ensuite été étendue aux décodeurs parallèles-pipeline pour les codes cycliques en blocs. L'approche choisie repose sur une légère modification des architectures parallèles-pipeline développées / Nowadays, modern communication systems require higher and higher data throughputs to transmit increasing volumes of data. They must be flexible to handle multi-norms environments, and progressive to accommodate future norms. For these systems, quality of service (QoS) must be guaranteed despite the evolution of microelectronics technologies that increase the sensitivity of integrated circuits to external perturbations (impact of particles, loss of signal integrity, etc). Fault-tolerance techniques are becoming more and more an important criteria to improve the dependability and the quality of service. This thesis’work continues previous research undertaken at the LICM laboratory on the architectural design of high-speed, low-cost, and dependable transmission systems. It focuses on two principal areas of research : The first research area concerns the speed and flexibility aspects, particularly on the study and implementation of parallel-pipelined architectures dedicated to recursive convolutional encoders. The principle is based on the optimization of blocks that calculate the remainder of the polynomial division which constitute the critical operation of the encoding. This approach is generalized to recursive IIR filters. The main architectural characteristics being aimed are high flexibility and scalability, yet preserving a good trade-off between the amount of resources used (and hence, area consumption) and the obtained performance (operation speed). The second topic concerns the developing of a methodology for designing FS (fault-secure) encoders, improving the tolerance of digital integrated circuits. The proposed approach consists in adding an extra blocks to the encoders, allowing online error detection. The proposed solutions offer a good compromise between complexity and frequency operation. For even higher throughput, parallel-pipelined implementations of FS encoders were considered. Different fault injection campaigns of single, double, and random errors were applied to the encoders in order to evaluate error detection rates. The study of dependable architecture was extended to pipeline-parallel decoders for cyclic block codes. This approach is based on a slight modification of the parallel-pipeline architectures developed at LICM laboratory, introducing some redundancy in order to make it dependable

Anticiper l’impact de fluctuations environnementales de nature climatique ou alimentaire est un enjeu crucial dans les systèmes de productions animales, et plus particulièrement sur la volaille. Cette influence de l’environnement sur les phénotypes passe en partie par des phénomènes épigénétiques, notamment la méthylation de l’ADN, et qui peuvent intervenir dans la régulation de l'expression des gènes. Ce sont des mécanismes qui n'affectent pas la séquence d'ADN mais qui peuvent être transmis par la mitose ou la méiose. Ces interactions entre épigénomes et expression des gènes sont de plus en plus étudiées dans les modèles animaux et chez les plantes. Cependant, les mécanismes de régulation de l'expression du génome par la méthylation de l’ADN sont assez peu connus chez les oiseaux. Ce travail de thèse repose sur deux dispositifs expérimentaux réalisés chez la poule, le but étant de caractériser le méthylome par séquençage haut-débit. Les profils de méthylation le long du génome, et le lien avec l’expression, sont établis d’abord par un séquençage tout-génome (WGBS) au sein d’embryons entiers, puis par un séquençage d'une sous-représentation du génome (RRBS) au sein d’hypothalamus d’individus adultes. À ce jour, aucune étude d'analyses de méthylome par RRBS chez la poule n'a été publiée. Ces deux analyses sont réalisées grâce au développement d'un pipeline bioinformatique, optimisé, disponible à la communauté scientifique. Globalement, le profil de méthylation chez la poule est similaire à ce qui est connu chez les mammifères : les îlots CpG - régions riches en dinucléotides CG, souvent peu méthylées, qui ponctuent le génome principalement dans les régions promotrices des gènes - sont globalement peu méthylés dans les promoteurs sur les données WGBS et RRBS. Les analyses du méthylome des embryons ont confirmé l'absence d'un phénomène de compensation de dose sur les chromosomes sexuels, ou la présence sur le chromosome Z d'une région hyperméthylée. Les analyses des données RRBS révèlent une hyperméthylation globale des CG sur le génome, suggérant une réponse de la méthylation à un stress environnemental. Sur les données WGBS, le niveau de méthylation dans le promoteur est négativement corrélé à l'expression du gène associé. Une méthylation allèle spécifique est également détectée entre les lignées, phénomène mis en évidence pour la première fois chez la poule et dont la fréquence est comparable à ce qui a été observé chez l'Homme. Sur les données RRBS, des résultats préliminaires de la réponse du méthylome aux stress environnementaux montrent le caractère complexe de cette relation. L’utilisation d’aliments moins énergétiques entraînerait une plus grande mobilisation des réserves lipidiques, tandis que les individus soumis à un stress à la chaleur ont un poids corporel plus léger. Une intégration de ces données à des mesures phénotypiques permettrait de faire le lien entre méthylation et environnement. Au-delà de l'aspect fondamental de cette thèse, l'application plus concrète de ces connaissances peut s'appliquer aux systèmes d'élevage pour obtenir des animaux mieux adaptés à l’environnement, en améliorant les caractères de production

La disponibilité à la fois des données à grande échelle du transcriptome et du génome de tumeurs permet maintenant d'identifier assez facilement des oncogènes candidats, gènes qui sont surexprimés en conséquence de l'amplification d'ADN. Ces oncogènes candidats doivent alors être fonctionnellement validés et leur rôle dans la cellule normale et tumorale doit être étudié.Dans cette étude, nous nous sommes principalement focalisés sur le cancer du sein, le cancer le plus fréquent chez les femmes et la deuxième cause de décès par cancer chez les femmes à travers le monde. En France, 52.000 nouveaux cas avec 12.000 décès dus au cancer du sein ont été estimés en 2010 représentant 34% de tous les nouveaux cas de cancer chez les femmes. Les chromosomes les plus fréquemment altérés dans le cancer du sein sont les chromosomes 8, 11 et 17, qui contiennent les amplicons 17q12 (ERBB2) et 11q13 (CCND1). Le développement de «l 'herceptine" contre ERBB2 illustre le potentiel de la génomique fonctionnelle du cancer pour l'identification de cibles thérapeutiques. Plusieurs études ont identifié d'autres amplicons avec des oncogènes candidats. Cependant très peu d'études ont rapporté la validation fonctionnelle des candidats identifiés, mettant ainsi en évidence la nécessité des analyses fonctionnelles à grande échelle des différents amplicons dans le cancer du sein pour identifier de nouveaux gènes pilotes qui pourraient ensuite être utilisés pour le développement de stratégies thérapeutiques pour le cancer du sein. Ces dernières années, l'ARNi est devenu un outil de choix pour le criblage à haut débit pour caractériser la fonction des gènes dans des lignées cellulaires. Dans cette étude, nous avons effectué un criblage fonctionnel à moyen-débit basé sur l’utilisation de l'ARNi de 127 gènes amplifiés et surexprimés appartenant à 11 amplicons majeurs sur les chromosomes 8, 11 et 17 dans le cancer du sein. Ce crible à permis l'identification de 8 oncogènes au sein de 5 amplicons différents. En outre, la validation fonctionnelle de 5 de ces gènes a permis de démontrer que 4 gènes, RAD21, EIF3H, TANC2 et CHRAC1 au sein de 3 amplicons, régulent l'apoptose, la prolifération et la transformation cellulaire de cellule dérivées de carcinomes mammaires. Les régions d'altération génétique dans un cancer peuvent être également modifiées dans de multiples types d’autres cancers. L'amplicon 8p11-p12 a par exemple été décrit dans le cancer du sein, du pancréas, du poumon et de la vessie. Ces amplicons communs dans différents cancers peuvent contenir des oncogènes « pilote » communs. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons évalué l'implication possible dans des lignées cellulaires dérivées de cancer du pancréas et du poumon présentant un amplicon en 8p11-p12 de deux oncogènes à savoir, PPAPDC1B et WHSC1L1 qui ont été décrits comme des gènes « driver » de l'amplicon 8p11-p12 dans le cancer du sein et également dans le cancer du poumon pour WHSC1L1. L'inhibition de ces deux gènes réduit la survie cellulaire et la croissance indépendante de l'ancrage à un support de lignées tumorales du pancréas et du poumon présentant une amplification en 8p11-p12. Cette constatation met en évidence l'importance de ces deux gènes dans de multiples cancers et l'intérêt thérapeutique potentiel d'inhiber ces enzymes dans les cancers présentant un amplicon en 8p11-p12. Des modèles de souris transgéniques permettent d’étudier la fonction de gènes candidats in vivo. Pour évaluer in vivo le rôle de PPAPDC1B, nous avons établi des souris transgéniques sur-exprimant PPAPDC1B sous la dépendance du promoteur de la kératine 5 permettant de cibler les épithéliums pluri ou pseudo stratifiés. Les souris transgéniques développent deux phénotypes inattendus, le développement de poils le long des incisives et une inflammation aiguë des glandes salivaires, des ganglions lymphatiques, de la vessie et du pancréas. / Availability of both large scale transcriptomic and genomic data of tumours now allows to identify relatively easily candidate oncogenes that are over-expressed as a consequence of DNA amplification. These candidate oncogenes have then to be functionally validated and studied for their role in the normal and cancer cell.In this study, we mainly focused on breast cancer, the most common cancer among women and the second leading cause of cancer deaths in women around the world. In France, 52,000 new cases with 12,000 deaths of breast cancer were estimated in 2010 accounting for 34% of all new cases of cancer in women. In breast cancer the main altered chromosomes include chromosome 8, 11 and 17 which contain the 17q12 (ERBB2) and the 11q13 (CCND1) amplicons. Development of “herceptin” against ERBB2 illustrates the potential of cancer genomics in identifying therapeutic targets. Several studies have identified other amplicons with candidate oncogenes. However very few studies reported functional validation of identified candidates, thus highlighting the need of large scale functional analyses of different amplicons in breast cancer to identify new driver genes which may be used for development of therapeutic strategies for breast cancer. In recent years, RNAi has become a tool of choice for high-throughput screening to characterize gene function in cultured cells. In this study we performed high-throughput RNAi based functional screening of 127 amplified and over-expressed genes from 11 major amplicons on chromosome 8, 11 and 17 in breast cancer. This resulted in the identification of 8 driver genes from 5 amplicons. Further functional validation of 5 of these genes demonstrated that 4 genes, RAD21, EIF3H, TANC2 and CHRAC1 from 3 amplicons, regulate breast cancer cell proliferation, apoptosis and transformation. Regions of genetic alteration in one cancer may be altered in multiple cancer types. One such example includes the 8p11-p12 amplicon which has been reported to be amplified in breast, pancreatic, lung and bladder cancer. Also common amplicons from different cancers may harbor common driver oncogenes. To investigate this hypothesis we evaluated the possible involvement in 8p11-12 amplified pancreatic and lung cancer cell lines of two oncogenes namely, PPAPDC1B and WHSC1L1 that have been described to be driver genes of the 8p11-12 amplicon in breast cancer and furthermore in lung cancer for WHSC1L1. Inhibition of both genes reduced cell survival and anchorage independent growth in amplified pancreatic and lung cancer cell lines. This finding highlights the importance of these two genes in multiple cancers and therapeutic potential interest to inhibit these enzymes in multiple cancers with 8p11-p12 amplification.Transgenic mouse models play an important role to investigate in vivo function of candidate genes. To evaluate in vivo role of PPAPDC1B, we established a transgenic mouse model over-expressing PPAPDC1B under the Keratin 5 promoter. Transgenic mice developed two unexpected phenotypes including development of hair follicles along front teeth and acute inflammation of salivary glands, lymph nodes, bladder and pancreas. This is an ongoing study that may help to understand the mechanism of action of PPAPDC1B in vivo.

Le niveau médiocre des taux de réponses et des améliorations de survie lorsque des stratégies conventionnelles sont appliquées souligne la nécessité de développer des outils prédictifs performants, robustes et applicables en clinique. La démocratisation des technologies d’analyses à haut-débit est le substrat de la médecine de précision permettant le développement de modèles prédictifs capables d’orienter les stratégies thérapeutiques et la définition d’une nouvelle taxonomie des cancers par l’intégration de données moléculaires de haute dimension. A travers cette thèse, nous avons d’abord analysé des données publiques d’expression génique de cancer bronchique non à petites cellules dans le but de prédire la probabilité de survie à trois ans. Le fort pouvoir prédictif de la TNM seule et la faible taille des cohortes de validation ont malheureusement limité la possibilité de traduire nos résultats en clinique. Nous avons ensuite développé un prédicteur du phénotype « KRAS muté » spécifique du cancer colorectal, permettant d’identifier de nouveaux traits moléculaires responsables de ce phénotype et d’améliorer la prédiction de la réponse au cetuximab chez les patients KRAS sauvage. Enfin, nous avons combiné les données moléculaires des panels de lignées cellulaires CCLE et Sanger avec les données des cohortes du TCGA pour produire des prédicteurs performants de la sensibilité aux drogues. Ces modèles sont concordants avec des screens produits par interférence RNA et permettent d’expliquer la réponse extrême de patients sectionnés dans le programme de screening moléculaire MOSCATO.Les défis spécifiques posés par les données moléculaires de haute dimension dans le développement d’outils prédictifs applicables en clinique sont discutés dans cette thèse. / The mediocre level of the rates of answers and the improvements of survival when conventional strategies are applied underlines the necessity of developing successful, strong and applicable predictive tools in private hospital. The democratization of the technologies of analyses with top-debit(-flow) is the substratum of the medicine of precision allowing the development of predictive models capable of directing the therapeutic strategies and the definition of a new taxonomy of cancers by the integration of molecular data of high dimension(size).Through this thesis(theory), we analyzed at first public data of genic expression of bronchial cancer not in small cells(units) with the aim of predicting the probability of survival in three years. The strong predictive power of the only TNM and

Les aptamères sont des oligomères d'ADN ou d'ARN simple brin qui, en se repliant sous forme de structures tridimensionnelles peuvent avoir des interactions fortes et spécifiques envers un certain nombre de cibles. L'objectif de cette thèse a été de compléter les études existantes sur l'utilisation de l'électrophorèse capillaire (CE) et les aptamères afin de mettre au point une méthode de sélection d'aptamères par CE couplée à la fluorescence induite par laser et le séquençage haut-débit Illumina. Dans un premier temps, nous avons mis au point une méthode de détection et de séparation par électrophorèse capillaire couplée à la double détection UV-LEDIF d'une banque d'ADN en interaction avec une cible : la thrombine. C'est un modèle déjà étudié pour lequel deux aptamères ont fait l'objet de publications. Nous avons utilisé l'aptamère T29 dans le cadre de notre étude car c'est celui qui présente la meilleure affinité. L'électrophorèse capillaire est un puissant outil analytique qui facilite l'efficacité de sélection des aptamères et précise la détermination des paramètres d'interactions. Nous avons ainsi pu déterminer la constante d'affinité KD par CE-UV-LEDIF sur le modèle de base : la thrombine. Par ailleurs, nous montrons également comment l'utilisation du tampon Tris peut dégrader un ADN simple brin en électrophorèse capillaire et nous proposons comme alternative l'utilisation d'un tampon sodium phosphate dibasique qui évite ce phénomène de dégradation. Enfin, nous expliquons la difficulté d'amplification par qPCR et PCR d'un aptamère comme le T29 ayant une structure en G-quadruplex. Nous avons montré que le séquençage haut-débit Illumina nous a permis de trouver une corrélation entre le nombre de molécules séquencées et le nombre de séquences obtenues. L'analyse des séquences obtenues montre une quantité importante (20%) de séquences de T29 qui ne correspondent pas à la séquence de cet aptamère. Cela prouve que les étapes de PCR et de séquençage haut débit pour la détection de G-quadruplex peuvent induire un biais dans l'identification de ces molécules. / Aptamers are oligomers of small single-stranded DNA or RNA which can have strong and specific interactions with some targets when they fold into three-dimensional structures. The objective of this thesis was to complete existing studies on the use of capillary electrophoresis in order to develop a method for the selection of aptamers by CE coupled to laser induced fluorescence and Illumina high-throughput sequencing. In a first step, we developed a method of detection and separation by capillary electrophoresis coupled with the double detection UV-LEDIF of a DNA library interacting with a target: thrombin. It is a model already studied and for which two aptamers have been published. We used aptamer T29 as part of our study because it has the best affinity. Capillary Electrophoresis is a powerful analytical tool that facilitates the selection efficiency of aptamers and specifies the determination of the interaction parameters. We thus were able to determine the affinity constant KD by CE-UV-LEDIF on the basic model: thrombin. Moreover, we also show how the use of Tris buffer can degrade single-stranded DNA during capillary electrophoresis and we propose as an alternative the use of a dibasic sodium phosphate buffer which avoids the phenomenon of degradation. Finally, we explain the difficulty of amplification by qPCR and PCR of an aptamer such as T29 with a G-quadruplex structure. We showed that the Illumina high-throughput sequencing allowed us to find a correlation between the number of sequenced molecules and the number of sequences obtained. Analysis of the sequences obtained shows a significant amount (20%) of T29 sequences which do not correspond to the sequence of this aptamer. This shows that the PCR and high-throughput sequencing steps for the detection of G-quadruplex can induce bias in the identification of these molecules.

La microbiologie est la science qui s'attache à l'étude des microorganismes et de leurs propriétés. Depuis ses débuts au XV II siècle, les méthodes développées par les microbiologistes ont permis de révéler un énorme potentiel de connaissances et d'applications. Dans les dernières décennies, les industriels ont vu un intérêt tout particulier dans ce domaine d'étude. Le besoin de prévenir les contaminations en inhibant le développement microbien, ou au contraire la volonté de l'optimiser pour profiter des capacités de transformations chimiques des microorganismes a fait naître une demande croissante de tests microbiologiques. Le faible rendement des méthodes traditionnelles ne permettant pas de satisfaire à cette demande, la recherche de nouvelles méthodes de test focalise les intérêts. Les outils fluidiques miniaturisés ont d'ores et déjà fait preuve de leur potentiel pour ce type d'application, bien que leur validation vis-à-vis des méthodes classiques manque souvent.Dans ce travail de thèse, nous avons développé des incubateurs miniaturisés et des méthodes de suivi de populations de microorganismes optimisés. L'objectif est d'aborder l'impact de la réduction d'échelle d'incubation sur la croissance par rapport aux dispositifs de culture traditionnel, pour ensuite aboutir à un outil haut-débit pour la caractérisation de biocides. / Microbiology is the part of science linked with the study of microorganisms and their properties. Since its beginnings in the XV IIth century, the methods developped by the microbiologists revealed a huge potential of knowledge and applications.In the last decades, industrials realized the interests of this study areaThe need to prevent contaminations by inhibiting microbial development, or on the contrary the will to improve it to enjoy the chemical transformations capacities of the microorganisms gave birth to an increasing demand for microbiological tests. The poor yield of traditionnal methods does not allow to satisfy this need, and the search for new test methods is thus focalizing interests. Miniaturized fluidic tools have already proven their potential for this kind of applications, and yet, their validation towards traditionnal methods often lacks.In this work, we aim at developping miniaturized cultivation techniques and optimized growth analysis methods, to study the scale reduction impact of incubator's size on growth, in order to end up with a high-throughput tool for biocide caracterization.

Cette thèse a pour objectif de développer une méthode électrochimique permettant de cribler à haut débit des inhibiteurs d'enzymes. Pour cela, une enzyme cible a été sélectionnée pour son intérêt thérapeutique, la transcétolase (TK) : elle est impliquée dans de nombreuses pathologies (cancer, maladies neurodégénératives, diabète…) et dans la survie de certains parasites pathogènes. Afin de mesurer l'activité de la TK, deux systèmes rapporteurs ont été développés, à l'aide de plaques de criblage électrochimique (PCE) constituées de 96 électrodes indépendantes. Le premier système rapporteur repose sur un système bienzymatique nécessitant l'intervention d'une enzyme auxiliaire, la galactose oxydase (GAOx) sous forme libre ou immobilisée dans la laponite. Cette enzyme est capable d'oxyder les produits de réaction de la TK et de produire du peroxyde d'hydrogène. Le format 96 des PCE a permis d'optimiser rapidement la détection électrochimique par ampérométrie pulsée par intermittence (IPA) d'activité oxydase et seulement 10 minutes sont nécessaires pour réaliser 96 mesures simultanées. Parallèlement, afin d'exploiter au maximum le système à 96 électrodes, cette détection d'activité oxydase a également été réalisée, en 10 minutes par électrochimiluminescence. Cette méthode offre l'avantage d'être plus sensible et moins variable que par IPA, mais limite l'utilisation de matrice d'immobilisation d'enzymes. La GAOx a ensuite été utilisée pour mesurer l'activité TK, cependant, les conditions réactionnelles n'étant pas optimales en présence du système bienzymatique (TK-GAOx), des temps d'incubation longs sont nécessaires et sont peu adaptées au criblage d'inhibiteurs de la TK. Un second système rapporteur ne nécessitant plus d'enzyme auxiliaire et faisant intervenir uniquement un seul substrat de la TK a été optimisé. Ce système repose sur l'oxydation de l'intermédiaire réactionnel formé par la fixation du cofacteur (la thiamine pyrophosphate) et du substrat sur l'enzyme par le ferricyanure. Cette méthode permet de mesurer 96 activités TK en seulement 7 minutes et a aisément été utilisée pour cribler une bibliothèque de molécules. Le criblage de 1360 molécules a permis d'identifier un nouvel inhibiteur de cet enzyme, présentant une CI50 de 63 μM. Le système électrochimique a également été utilisé pour déterminer le mécanisme d'inhibition (non compétitive pure partielle) et la constante d'inhibition associée (3,4 μM). Ces résultats sont inédits dans le domaine de l'électrochimie et offrent un large éventail d'applications que ce soit pour le criblage d'activité enzymatiques ou d'inhibiteurs d'enzymes / This thesis focuses on the development of a new electrochemical method allowing the high throughputscreening of enzyme inhibitors. For this purpose, a target enzyme has been selected for its therapeutic interest,transketolase (TK): this enzyme is involved in many diseases (cancer, neurodegenerative diseases, diabetes ...) and inthe survival of pathogenic parasites. To measure TK activity, two reporter systems have been developed by usingelectrochemical plates, composed of 96 independent electrodes.The first one is based on a bienzymatic system, requiring the use of an auxiliary enzyme, galactose oxidase(GAOx), in its soluble form or immobilized in laponite. This enzyme is able to oxidize TK products and producehydrogen peroxide. The 96-well format allowed to quickly optimize the electrochemical detection of oxidase activityby intermittent pulse amperometry (IPA) of oxidase activity and only 10 minutes are required to perform 96simultaneous measurements. In parallel, in order to harness the 96-well electrochemical system, this detection ofoxidase activity was also carried out in 10 minutes using electrochemiluminescence. This method is more sensitiveand less variable than IPA but is limited to the use of soluble enzymes. However, the reaction conditions are notoptimal for the bienzymatic system (TK-GAOx): long incubation times are required and are poorly adapted for thescreening of TK inhibitors.A second reporter system no longer requiring an auxiliary enzyme and involving only one TK substrate hasbeen optimized. This system relies on the oxidation by ferricyanide of the reactional intermediate resulted of thebinding of the cofactor (thiamine pyrophosphate) and the substrate. This method allows to measure 96 TK activitiesin only 7 minutes and was easily used to screen an in-house chemical library. The screening of 1360 molecules leadto the identification of a new TK inhibitor with an IC50 of 63 μM. This electrochemical system was also used todetermine the mechanism of inhibition (partial non-competitive mechanism) and the associated inhibition constant(3.4 μM). These results are innovative in the field of electrochemistry and offer a wide range of applications forenzymatic activity screening or the screening of enzymes inhibitors

Le travail décrit dans ce manuscrit présente l'utilisation de deux techniques immunoenzymatiques pour le criblage à haut débit de catalyseurs chimiques et biologiques. Ces méthodes, jusqu'à présent réservées au monde du diagnostic sont employées ici pour la découverte de nouveaux catalyseurs pour des réactions énantiosélectives ainsi que pour des réactions de couplage. Les dosages immunologiques « par compétition » faisant appel aux anticorps monoclonaux se sont avérés des excellents outils pour le criblage à haut débit de catalyseurs asymétriques pour les réactions d'insertion de carbénoïdes dans la liaison OH de l'eau tandis que celles utilisant des anticorps polyclonaux ont été utilisées avec succès pour le criblage de biocaytalyseurs pour la réaction d'ouverture énantiosélective des oxazolones par l'eau. Un autre type de méthode utilisant des anticorps monoclonaux, appelée « sandwich » nous a permis de réaliser le criblage à haut débit de catalyseurs pour la réaction de cycloaddition alcyne-azoture.