CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As lectinas constituem ferramentas biotecnolÃgicas de fundamental importÃncia em estudos histoquÃmicos e citoquÃmicos para a detecÃÃo de glicoconjugados nos tecidos. Entre estas aplicaÃÃes, destacam-se a identificaÃÃo de receptores de membrana e a detecÃÃo de estruturas caracterÃsticas de neoplasias. A Frutalina, uma lectina -D-galactose-ligante encontrada em sementes de Artocarpus incisa, jà foi utilizada na detecÃÃo histoquÃmica de lesÃes malignas de mama e tireÃide. No presente trabalho foi realizada a clonagem e expressÃo do gene da frutalina em cÃlulas de Escherichia coli Origami (DE3) e foi determinada a estrutura tridimensional dessa proteÃna atravÃs da modelagem por homologia. A clonagem do gene da frutalina foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes em diferentes estÃgios de maturaÃÃo dos frutos de A. incisa. Foram obtidos 12 clones, dos quais 5 foram seqÃenciados. A lectina recombinante foi expressa como cadeia Ãnica, formada pela cadeia beta com 20 resÃduos, ligada a um peptÃdeo de ligaÃÃo com quatro resÃduos, e a cadeia alfa com 133 resÃduos. A expressÃo da lectina foi indicada pelo aparecimento de uma banda protÃica com massa molecular aparente de 19,2 kDa, superior a da lectina nativa (15 kDa), apÃs a induÃÃo com IPTG 1mM. A lectina recombinante foi mantida exclusivamente em corpos de inclusÃo e foi reconhecida imunologicamente por anticorpos policlonais anti-Frutalina. Os modelos gerados para os clones obtidos indicam que as mutaÃÃes ocorridas nÃo alteram os sÃtios de ligaÃÃo a carboidratos das molÃculas. As mutaÃÃes nos clones obtidos sugerem a ocorrÃncia de isoformas dessa proteÃna. / The lectins constitute biotechnological tools of fundamental importance in hystochemical and cytochemical studies for the detection of tissue glycoconjugates. Among their applications are the identification of membrane receptors and the detection of neoplastic characteristic structures. Frutalin, an -D-galactose-binding lectin from Artocarpus incise seeds, has already been used in the hystochemical detection of thyreoid and breast neoplasia. In this work was made a study of the cloning and expression of the frutalin gene in Escherichia coli Origami (DE3) cells and was determined the three-dimensional structure of this protein through homology modeling. The frutalin gene cloning was accomplished from the product on RT-PCR with seeds in distinct stages of development of the Artocarpus incisa fruits. Twelve clones were obtained, from which five were sequenced. The frutalin gene was expressed in E. coli using the pET15b expression vector. A recombinant lectin (rFrutalin) was expressed by growing the bacteria in the presence of isopropyl -D-thiogalactopyranoside 1mM. All the recombinant lectin was found in an insoluble aggregated form as inclusion bodies. The recombinant lectin had a higher molecular mass (19,2 kDa) than the native lectin (15 kDa) as estimated by SDS-PAGE and Western blot analyses, showing that the recombinant single chain Frutalin is not processed in E. coli cells. The models generated for the clones obtained indicate that the mutations do not change the molecules active sites. Mutations in the clones obtained suggest the occurrence of isoforms of this protein.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / No presente trabalho, foi realizado um estudo preliminar sobre a expressÃo de um gene de quitinase de classe I de feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata L.Walp), a clonagem e expressÃo desse gene em cÃlulas de Escherichia coli BL21(λ)DE3 e a determinaÃÃo via modelagem por homologia da estrutura tridimensional dessa proteÃna. A expressÃo do gene da quitinase de classe I de feijÃo-de-corda foi obtida a partir de RT-PCR com oligonucleotÃdeos iniciadores especÃficos. Nessas reaÃÃes, foram usadas amostras de RNA total de sementes e vagens em diferentes estÃgios de crescimento (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 e 18 dias), pertencentes a dois genÃtipos contrastantes quanto a infecÃÃo pelo Callosobruchus maculatus, IT81D-1053 (resistente) e TE97-419-07F (suscetÃvel). A expressÃo foi avaliada tambÃm em folhas, raÃzes, epicÃtilo e hipocÃtilo de dois genÃtipos contrastantes quanto a infecÃÃo pelo nematÃide das galhas Meloidogyne incongnita, CE-31 (resistente) e TE97-411-1F (suscetÃvel). A clonagem do gene VuChiI foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes de IT81D-1053, e do produto amplificado a partir do DNA genÃmico de MONTEIRO. Foram obtidos 11 clones confirmados, dos quais 9 foram seqÃenciados. A subclonagem do clone R7 foi realizada em pET15b e a expressÃo da proteÃna recombinante foi induzida na presenÃa de IPTG 1mM. A proteÃna recombinante, com aproximadamente 30 kDa, foi visualizada atravÃs de um SDS-PAGE. A proteÃna purificada atravÃs de uma cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose com NÃquel imobilizado nÃo apresentou atividade quitinÃsica significativa. Os modelos gerados para os clones obtidos e para a quitinase nativa, indicam que as mutaÃÃes ocorridas nÃo alteram os sÃtios ativos das molÃculas. Dessa forma, a quitinase de classe I do feijÃo-de-corda parece apresentar expressÃo constitutiva em todas as partes da planta. A quitinase recombinante obtida foi pouco ativa. As mutaÃÃes pontuais nos clones obtidos sugerem a ocorrÃncia de isoformas dessa proteÃna, o que ainda deve ser elucidado no futuro / In this work we have made a preliminary study on the expression of a class I chitinase gene from cowpea (Vigna unguiculata L.Walp), cloning and expression of this gene in Escherichia coli BL21(λ)DE3 cells and, through homology modeling, we determined the three dimensional structure of this protein. The expression of the class I quitinase gene from cowpea was performed by RTÂPCR from the total RNA, with specific primers, from seeds and pods in distinct stages of development (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 and 18 days), belonging to two contrasting genotypes regarding to infection by Callosobruchus maculatus, IT81DÂ1053 (resistant) e TE97Â419Â07F (susceptible). The gene expression in leaves, roots, epicotyls and hipocotyls from two contrasting genotypes considering the infection by the nematoid Meloidogyne incongnita, CEÂ31(resistant) e TE97Â411Â1F (susceptible). The VuChiI gene cloning was accomplished from the amplified product on RTÂPCR with IT81DÂ1053 seeds, and the amplified product from the genomic DNA of MONTEIRO. Eleven clones were obtained, from which nine were sequenced. The cloning of R7 clone was accomplished in pET15b vector and the expression of the recombinant protein was induced in the presence of IPTG 1mM. The protein, with 30 kDa, was visualized through a SDSÂPAGE. The protein purified through an affinity chromatography in Sepharose column with immobilized Nickel did not had a significative hydrolytic activity. The models generated for the clones and for the native chitinase, have indicated that mutations that occurred did not changed the molecule's active sites. Thus, the class I chitinase gene from feijÃo de corda seems to present constitutive expression in all parts of the plant. The recombinant chitinase obtained was inactive. The specific mutations in the resulting clones suggests the occurrence of isoforms of this protein, what should be elucidated in the future.

As hialuronidases de peçonhas animais são capazes de clivar o hialuronan presente na matriz extracelular, facilitando a difusão das toxinas no tecido da vítima. Essas enzimas têm sido negligenciadas, devido à instabilidade enzimática e à baixa concentração na peçonha. Assim, a expressão heteróloga das hialuronidases permite a sua obtenção em quantidades que viabilizam seu estudo estrutural e funcional. Associado a isso, o transcriptoma propicia a identificação de novas toxinas e componentes de baixa proporção na peçonha. Portanto, o presente trabalho realizou o transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus serrulatus e a clonagem e expressão heteróloga da hialuronidase. No transcriptoma foram obtidos 558 ESTs, dos quais 61,8% correspondem às toxinas, dentre elas neurotoxinas com ação em canais iônicos, metaloproteinas, hipotensinas, peptídeos antimicrobianos, dentre outros. Foram também identificadas novas toxinas como o neuropeptídeo e Ts16.1, descritos pela primeira vez para o gênero Tityus. Dentre os transcritos obtidos, foi identificado apenas um clone correspondente ao C-terminal incompleto de uma hialuronidase de T. serrulatus. Consequentemente, foi produzido o gene sintético contendo a sequência da TsHyal-1, obtida em bancos de dados, no vetor de expressão pPICZ?A para expressão heteróloga em P. pastoris. A rTsHyal-1 foi expressa em escala laboratorial em meio não suplementado (BMM) em pH 7,0 durante 96 h da indução com alimentação diária de metanol a 0,75%. A rTsHyal-1 foi produzida na sua forma solúvel e ativa (838,31 UTR/mg) e resultou em um rendimento proteico de 250 mg/L de material expresso. O secretoma do meio de expressão mostrou que além da rTsHyal-1, a P. pastoris também secreta proteínas nativas associadas à ligação do ATP, metabolismo de carboidrato e resposta ao estresse oxidativo. A rTsHyal-1 foi parcialmente purificada em troca catiônica fraca e apresentou atividade específica de 1.097,45 UTR/mg. A rTsHyal-1 apresenta massa molecular de 49,5 kDa e o tratamento com PNGase F seguido da análise por espectrometria de massas (MALDI-TOF) indicou que uma possível N-glicosilação de 4,5 kDa. Adicionalmente, o sequenciamento dos digestos trípticos da enzima realizado no MALDI-TOF e pelo Q-Exactive resultaram em 46,8% de cobertura da sequencia da proteína. A rTsHyal-1 apresenta especificidade pelo substrato hialuronan, seguido da condroitina C, A e B e apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40°C. Adicionalmente, o ensaio do MTT indicou que a enzima recombinante não apresenta citotoxicidade in vitro. Os resultados obtidos determinaram as melhores condições para a expressão heteróloga da rTsHyal-1, que corresponde à primeira hialuronidase recombinante de escorpião expressa em P. pastoris com atividade enzimática preservada / The venom hyaluronidases of animals are able to cleave hyaluronan present in the extracellular matrix, acting as a spreading factor for the toxins into the tissues of the victim. These enzymes have been neglected due to their instability and low concentration in the venom. Thus, heterologous expression of hyaluronidases permits the obtainment of sufficient amount for structural and functional studies. Moreover, the transcriptome allows the identification of new toxins or components with low proportion in the venom. In this way, this study aimed the construction of the transcriptome of Tityus serrulatus venom gland and cloning/heterologous expression of hyaluronidase. In the transcriptome, 558 ESTs were identified and 61.8% corresponded to toxins, such as neurotoxins with action on ion channels, metalloproteins, hypotensins, antimicrobial peptides, among others. In addition, new toxins were identified, comprising one neuropeptide and Ts16.1, described for the first time to the genus Tityus. Among the obtained transcripts, one identified clone corresponded to an incomplete C-terminal of a hyaluronidase. Consequently, a synthetic gene was synthesized containing the sequence of TsHyal-1 (obtained from databases) in the pPICZ?A vector for heterologous expression in P. pastoris. The rTsHyal-1 was expressed at laboratorial scale in unsupplemented medium (BMM) at pH 7.0 for 96 h, after induction time, with daily feeding of 0.75% methanol. The rTsHyal-1 was produced in soluble and active form (838.31 UTR/mg) and resulted in a protein yield of 0,266 mg/mL in final expressed material. Besides, the secretome of the medium showed that P. pastoris also secretes native proteins bound with ATP, proteins related to carbohydrate metabolism and oxidative stress response. The rTsHyal-1 was partially purified in a weak cation exchange and presented specific activity of 1097.45 UTR/mg. The rTsHyal-1 has molecular mass of 49.5 kDa and the treatment with PNGase F and analysis by mass spectrometry (MALDI-TOF) indicated a potential N-glycosylation of 4.5 kDa. Additionally, the sequencing of tryptic digests performed in the MALDI-TOF and Q-Exactive resulted in 46.8% of protein sequence coverage. The rTsHyal-1 presents substrate specificity for hyaluronan followed by chondroitin C, A and B and showed an optimum activity at pH 6.0 and 40°C. Furthermore, the MTT assay indicated that the recombinant enzyme does not display in vitro cytotoxicity. These results validate the biotechnological process of the heterologous expression of rTsHyal-1. This is the first recombinant hyaluronidase from scorpions expressed in P. pastoris system with enzymatic activity preserved.

A leptospirose é causada por bactérias do gênero Leptospira e constitui um problema de saúde pública mundial, por acometer humanos e animais. Sua patogênese ainda é pouco esclarecida, especialmente quanto aos processos de invasão, adesão e colonização dos hospedeiros. Recentemente, proteínas secretadas por leptospiras foram identificadas por proteômica e análises in silico, algumas das quais apresentam possível envolvimento no desenvolvimento de quadros hemorrágicos, bem como podem ser possíveis antígenos para diagnóstico. Sendo assim, o presente trabalho propôs a clonagem em vetor de expressão heteróloga bacteriano das sequências codificantes das proteínas Sph2, LipA, ColA e LipL32 de L. interrogans sorovar Copenhageni, caracterização funcional das proteínas recombinantes purificadas e estudo do seu potencial uso no diagnóstico para a leptospirose. Essas proteínas foram escolhidas por possivelmente estarem envolvidas na patogênese de leptospiras. Para tanto, as sequências correspondentes aos genes das proteínas foram clonadas nos vetores de expressão em Brevibacillus choshinensis e Escherichia coli. A produção de soro policlonal e técnicas de ELISA, western-blotting e imuno-histoquímica foram realizadas para avaliar a funcionalidade das proteínas recombinantes purificadas. Também foram realizados testes de comprovação e caracterização da atividade enzimática para proteína LipA, que se apresenta como uma provável lipase na análise in silico. Os resultados obtidos mostraram que o sistema de expressão em Brevibacillus foi eficiente na expressão das proteínas, porém com baixo rendimento na purificação das proteínas Sph2, ColA e LipA. A proteína recombinante LipL32 purificada não apresentou diferença na sua atividade antigênica, em relação aos dois sistemas de expressão utilizados. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína LipA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. A proteína LipA apresentou atividade lipásica sobre ésteres graxos de p-nitrofenil, sendo uma provável lipase euritérmica. Os dados obtidos com a análise de imuno-histoquímica sugerem que esta proteína possa participar dos eventos que levam a lesões na membrana celular no tecido hepático. Resultados de ELISA com soro de pacientes mostraram que as proteínas ColA e Sph2 são potenciais antígenos para diagnóstico da leptospirose. Apenas a proteína ColA apresentou ação hemorrágica na pele de camundongos. Estes resultados indicam que as proteínas LipA, ColA e Sph2 podem estar envolvidas em mecanismos patogênicos na leptospirose. / Leptospirosis is caused by bacteria of the genus Leptospira and it is a public health problem worldwide, for affecting humans and animals. Its pathogenesis is still unclear, especially regarding the processes of invasion, adhesion and colonization of hosts. Recently, proteins secreted by leptospires were identified by proteomics and in silico analyzes, some of which present possible involvement in the development of hemorrhagic conditions, as well they could be possible antigens for the diagnosis. Thus, the present work proposed the cloning into bacterial heterologous expression vectors of the coding sequences of the Sph2, LipA, ColA and LipL32 proteins of L. interrogans serovar Copenhageni, the functional characterization of the purified recombinant proteins and the study of their potential use in the diagnosis for the Leptospirosis. These proteins were chosen because they may be involved in the pathogenesis of leptospires. To that end, the coding sequences were cloned into the expression vectors in Brevibacillus choshinensis and Escherichia coli. The production of polyclonal serum and ELISA, Western-blotting and immunohistochemistry techniques were performed to evaluate the functionality of the purified recombinant proteins. Also, tests were carried out to prove and characterize the enzymatic activity of LipA protein, which presents as a probable lipase in the in silico analysis. The obtained results showed that the expression in the Brevibacillus system was efficient, but with low yield in the purification of Sph2, ColA and LipA proteins. The purified recombinant LipL32 protein showed no difference in its antigenic activity, in relation to the two expression systems used. Western-blotting experiments demonstrated the presence of LipA protein in different pathogenic serovars of Leptospira spp. The LipA protein showed lipase activity on p-nitrophenyl fatty esters, being a probable eurythermic lipase. The data obtained with the immunohistochemical analysis suggest that this protein can participate in the events that lead to cell membrane lesions in the hepatic tissue. ELISA results using serum from patients showed that ColA and Sph2 proteins are potential antigens for the diagnosis of leptospirosis. Only the ColA protein presented hemorrhagic action on the mice skin. These results indicate that LipA, ColA and Sph2 proteins may be involved in pathogenic mechanisms in leptospirosis.

As CDKs 9 e 11 fazem parte da subfamília de CDKs transcricionais, e portanto desempenham papéis de controle na dinâmica atividade de síntese e processamento do RNA mensageiro pela RNA Polimerase II. Devido à sua capacidade de modular individualmente a atividade dos complexos de transcrição da RNAP II, estas quinases assumem uma grande importância para a regulação da expressão gênica em células eucarióticas. Casos de desregulação da atividade de CDKs transcricionais têm sido frequentemente relacionados a diversas patologias humanas graves, incluindo vários tipos de câncer e também a AIDS (em razão do papel essencial desempenhado pela CDK9 na replicação do HIV. O objetivo deste trabalho é a obtenção das CDKs humanas 9 e 11 através da expressão heteróloga em Escherichia coli, buscando o aperfeiçoamento de métodos para produzir estas enzimas em quantidade e pureza suficientes para aplicação em estudos estruturais. A utilização de um sistema bacteriano oferece muitas vantagens práticas, como a simplicidade da técnica, baixo custo, altos níveis de expressão, e elevado rendimento na purificação do produto. No entanto, a obtenção de quinases humanas ativas a partir de E. coli sempre representou um desafio experimental, devido aos problemas comumente associados à expressão heteróloga. Os resultados apresentados aqui demonstram a possibilidade de se obter a CDK9 humana enzimaticamente ativa pelo reenovelamento in vitro da proteína expressa pela bactéria na forma de corpos de inclusão, após etapas de solubilização e purificação em condições desnaturantes. Por outro lado, a CDK11 humana só pôde ser obtida em uma versão encurtada, consistindo apenas no seu domínio quinase, devido à forte inibição que um trecho N-terminal da sequência mostrou exercer sobre a expressão da proteína. Assim, este trabalho fornece exemplos de como é possível superar algumas das adversidades comuns da expressão heteróloga a fim de se obter CDKs humanas ativas empregando o sistema bacteriano. / CDK9 and CDK11 are members of the subfamily of transcriptional CDKs and therefore play central roles in the control of the dynamic activity of messenger RNA synthesis and processing by RNA polymerase II. Because of their ability to individually modulate the activity of RNAP II transcription complexes, these kinases are of great importance for the regulation of gene expression in eukaryotic cells. Several cases of deregulation of the transcriptional CDKs have been linked to important human diseases, including various types of cancer and also AIDS (due to the essential role of CDK9 in HIV replication). The objective of this work is to obtain human CDK9 and CDK11 heterologously expressed in Escherichia coli, seeking improved methods to produce these enzymes in quantity and purity suitable for structural studies. A bacterial system offers many practical advantages to protein production, such as technical simplicity, low costs, high levels of expression and high purification yield. However, it has always been an experimental challenge to obtain active human kinases from E. coli, because of the problems commonly associated with heterologous expression. The results presented here demonstrate the possibility of obtaining the enzymatically active human CDK9 by in vitro refolding of the protein expressed as bacterial inclusion bodies, after its solubilization and purification under denaturing conditions. Human CDK11, on the other hand, could only be obtained in a shortened form consisting just of its kinase domain, due to the strong inhibition that an N-terminal stretch exerts on the protein\'s own expression. Therefore, this work provides examples of how it is possible to overcome some of the common adversities of heterologous expression in order to obtain active human CDKs through the bacterial system.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-04T11:57:30Z No. of bitstreams: 1 leticiastephantavares.pdf: 1145142 bytes, checksum: 8dd69d31541451cdce69de313d2a2aa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-04T15:35:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 leticiastephantavares.pdf: 1145142 bytes, checksum: 8dd69d31541451cdce69de313d2a2aa6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T15:35:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 leticiastephantavares.pdf: 1145142 bytes, checksum: 8dd69d31541451cdce69de313d2a2aa6 (MD5) Previous issue date: 2009-03-12 / A busca por novos antibióticos de amplo espectro de ação tem aumentado nas últimas décadas devido ao número crescente de bactérias resistentes aos antibióticos convencionais. O peptídeo recombinante Pg-AMP1, expresso em um sistema heterólogo em Escherichia coli, apresentou atividade antibacteriana contra linhagens Gram-positivas e Gram-negativas. A partir da seqüência de aminoácidos do peptídeo isolado de sementes de goiaba (Psidium guajava L.) o gene correspondente ao peptídeo foi modificado utilizando-se o códon preferencial para expressão em E. coli e construído um vetor de expressão. Uma região codificadora para cauda de histidina foi fusionada ao gene pg-amp1 permitindo a purificação por cromatografia de afinidade com íons de níquel imobilizados em coluna de sefarose. Utilizando SDS-PAGE e análise in sílico identificamos a massa molecular do PgAMP1 recombinante de 7,368 kDa e pI 8.93. O peptídeo recombinante foi expresso principalmente na forma insolúvel, agregando-se em corpos de inclusão que foram tratados com agentes desnaturantes obtendo o peptídeo solúvel. Após a purificação pela coluna de níquel obtivemos um rendimento de 13 mg por litro de meio de cultura. O peptídeo Pg-AMP1 recombinante apresentou atividade contra as bactérias Gram-negativas Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa e contra as Grampositivas Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermides. O peptídeo recombinante Pg-AMP1 não mostrou atividade contra os fungos fitopatogênicos testados. Devido a sua ação contra estas cepas de bactérias patogênicas humanas, o Pg-AMP1 recombinante torna-se um promissor antimicrobiano a ser utilizado no desenvolvimento de novos antibióticos contra cepas resistentes aos fármacos comumente usados. / The search for new antibiotics of broad spectrum of activity has increased in recent decades due to the increasing number of bacteria resistant to conventional antibiotics. The Pg-AMP1 recombinant peptide expressed in a heterologous system in Escherichia coli, strains showed antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative. From the sequence of amino acid peptide isolated from the seeds of guava (Psidium guajava L.) peptide corresponding to the gene was modified using the preferred codon for expression in E. coli and constructed a vector for expression. A region coding for the histidine tail was merged the gene-pg amp1 allowing purification by affinity chromatography with nickel ions immobilized on the column sepharose. Using SDS-PAGE and in silico analysis identified the molecular weight of Pg-AMP1 recombinant with 7.368 kDa and pI 8.93. The recombinant peptide was expressed mostly as insoluble form, adding up in inclusion bodies, which were treated with denaturants agents to solubilize the peptide. The purification of peptide by nickel sepharose column yielded 13 mg per liter of culture medium. The Pg-AMP1 recombinant peptide showed activity against Gram-negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa and against gram-positive Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. The recombinant peptide Pg-AMP1 showed no activity against the phytopathogenic fungi tested. Due to its action against these strains of human pathogenic bacteria, the recombinant Pg-AMP1 is a promising antimicrobial for use in developing new antibiotics against strains resistant to commonly used drugs.

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T14:46:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milanez_GuilhermePaier_M.pdf: 1651986 bytes, checksum: 4681c88f937b4fe6f4d915fce0eb3f20 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Salmonelose e a malária são duas doenças infecciosas negligenciadas de grande prevalência no mundo, mas acometendo particularmente populações humanas que vivem em regiões e países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento. Apesar dos esforços ainda não existem formulações vacinais totalmente efetivas no controle destas enfermidades. Desta forma, nosso grupo tem buscado aprimorar a expressão do Domínio M2 do antígeno MAEBL de Plasmodium yoelii, que apresenta similaridade com a proteína de Plasmodium falciparum, em linhagens de Salmonella enterica Typhimurium, atenuadas para virulência. Em estudos prévios constatou-se que a expressão em níveis baixos não seria suficiente para a indução de uma resposta imune protetora. Com isso, ficou clara a necessidade de se aprimorar os níveis de expressão deste antígeno nas linhagens a serem testadas. Para tanto, o vetor de expressão anteriormente utilizado foi modificado, os codons da seqüência a ser expressa foram otimizados para expressão em salmonela e um sinal de secreção periplasmática foi adicionado no início da seqüência a ser expressa. Adicionalmente, modificamos novas linhagens atenuadas de S. enterica desenvolvidas por nosso grupo de tal forma a utiliza-las na expressão de antígenos heterólogos, empregando um sistema letal balanceado (Asd) de estabilização da expressão gênica. Apesar do sucesso na construção dos novos vetores, e da otimização de codons para a expressão, constatamos um possível efeito deletério do domínio M2 quando expresso em grande quantidade, o que impossibilitou a obtenção de algumas construções planejadas. Entretanto, os resultados obtidos na estabilização de plasmídios em novas linhagens vacinais significam um avanço no teste e uso de tais linhagens no desenvolvimento de vacinas multifatoriais / Abstract: Salmonellosis and malaria are two infectious diseases of high prevalence in the world, particularly affecting human populations living in underdeveloped regions and countries or developing countries. Despite several efforts, there is not a vaccinal formulation totally effective to control these diseases. This way, our group has sought to enhance the expression of M2 MAEBL's antigen Domain of Plasmodium yoelii, which is quite similar to same protein of P. falciparum, in attenuated strains of Salmonella enterica Typhimurium. In previous studies we found that the expression at low levels was not sufficient to induce a protective immune response. Thus, there was a clear need to improve M2 expression levels in the new strains to be tested. The expression vector previously used was modified, the m2 sequence was codon-optimized for expression in Salmonella, and a periplasmic secretion signal was added at the beginning of the sequence to be expressed. Additionally, new attenuated S. enterica strains developed by our group were modified in a way to use them in the expression of heterologous antigens, employing a balanced lethal system (ASD) for expression plasmid stabilization. Despite of the new vectors successfully built as well as codon optimization for m2 expression, we found a possible deleterious effect of the M2 domain when expressed in large quantities, making it impossible to obtain some planned constructs. However, the results obtained on stabilization of expression vectors in the new vaccine strains are an important advance for the use of such strains as multifactorial vaccines / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Microsporidia are obligate intracellular eukaryotic parasites related to fungi, possessing greatly reduced genomic and cellular components. The microsporidian Nosema ceranae threatens honeybee (Apis mellifera) populations. Nosemosis has a complex epidemiology affected by host, pathogen and environmental factors. Although a draft of the N. ceranae genome has been published, the molecular basis underpinning pathogenicity is not known. The lack of established culturing techniques and a tractable genetic system necessitates use of model systems for both host and parasite such as Saccharomyces cerevisiae. I hypothesise effectors essential to disease progression exist amongst N. ceranae secretome genes. In this study I have started characterising these genes using a combination of established and novel techniques for studying microsporidia proteins including bioinformatics, heterologous expression in S. cerevisiae, and the genome-wide analysis platform of Synthetic Genetic Arrays. This effort has yielded new insights into N. ceranae secreted proteins which lack similarity to known sequences. I identified N. ceranae protein NcS77 as a candidate effector implicated in targeting host nuclear pores. NcS50 and NcS85 co-localise with ERG6 a marker for lipid droplets (an organelle known to be targeted by another obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis) when expressed in S. cerevisiae. N. ceranae polar tube proteins (PTP) induce filament formation when expressed in S. cerevisiae and PTP2 co-localises with the cell wall. Interestingly this phenotype is replicated by another secreted protein which may infer a common function. Together these data contribute to knowledge on N. ceranae pathology bringing us closer to understanding the disease and ultimately lead the way to mitigation.

Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T05:28:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rampasio_RaquelRodrigues_M.pdf: 2052024 bytes, checksum: 07f4cd2fcba87af264e6efceab06d527 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Epóxidos enantiopuros e dióis vicinais têm sido utilizados na síntese de inúeras moléculas bioativas. Dessa forma, as epóxido-hidrolases microbianas capazes de hidrolisar enantioseletivamente epóxidos racêmicos emergiram como uma alternativa promissora na obtenção destes compostos. Recentemente, a linhagem P. stipitis CCT 2617 foi selecionada por apresentar atividade hidrolítica frente a epóxidos terminais e teve seu genoma completo publicado. Assim, esta levedura foi selecionada para o trabalho de clonagem e expressão de sua epóxido hidrolase. Neste trabalho, a clonagem do gene SEH1, que codifica para a epóxido hidrolase de P. stipitis, foi efetuada com sucesso em P. pastoris, tanto no vetor pPICZa A, quanto no vetor pPICZ B. A clonagem da proteína com a cauda de histidina deve auxiliar na detecção da expressão. A detecção de uma banda, referente a uma proteína de 46 kDa, no gel de eletroforese foi um indício de que a expressão da enzima SEH (contendo o fator a) ocorreu, porém, não conseguimos reproduzir este resultado posteriormente. Além disso, buscamos melhores alternativas para a detecção da atividade enzimática, como o teste de adrenalina e o ensaio baseado em substrato fluorogênico, que devem ser aperfeiçoados para a utilização com células íntegras. A modelagem computacional da estrutura tridimensional da PSEH resultou em um modelo contendo 40% de hélices a e 12% de folhas b. Determinamos que os resíduos que devem fazer parte do sítio ativo são Tyr319, Asp209, Asp352 e His383 e, tendo em vista que a PSEH deve se apresentar na forma de um homodímero com sítio ativo similar ao das EHs de P. aeruginosa, A. radiobacter e A. niger, nossa hipótese é que esta enzima deve hidrolisar epóxidos pouco volumosos e aromáticos com algum nível de enantiosseletividade / Abstract: Enantiopure epoxides and vicinal diols have been used to prepare a number of bioactive molecules. Thus, the microbial epoxide hydrolases able to enantioselectivity hydrolyze racemic epoxides emerged as a promising alternative in the synthesis of these compounds. Recently, the P. stipitis CCT2617 strain was selected due to the presence of hydrolytic activity against terminal epoxides and had its genome completely described. Therefore, this yeast was selected for cloning and expression of the gene SEH1, which was annoted as epoxide hydrolase. In this work, the cloning of SEH1 gene, codifying for the epoxide hydrolase of P. stipitis, was done with success in P. pastoris, both in pPICZa A and pPICZ B vectors. The cloning of the protein with a histidine tag should help in the detection of expression. The detection of a protein with 46 kDa evidenced that the expression of SEH enzyme (containing the a factor) is occurring, however, this result was not reproducible due to the sample degradation. Furthermore, better alternatives for the detection of enzyme activity were performed, as adrenaline test and fluorogenic assay, which must be optimized for application with whole cells. The 3D structure computational modeling of PSEH resulted in a model that contains 40% of a helices and 12% of b sheets. Our hypothesis is that the residues that make part of the active site are Tyr319, Asp209, Asp352 and His 383. And, considering that the PSEH should be in the homodimeric form with an active site similar to that of the EHs of P. aeruginosa, A. radiobacter and A. niger, this enzyme should hydrolyze small and aromatic epoxides probably with some enantioselectivity / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-07-12T15:56:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação_Anna_Jessica_PPGG.pdf: 2035458 bytes, checksum: 6a4bc578c9eaea104302f33af03c3f21 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-12T15:56:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação_Anna_Jessica_PPGG.pdf: 2035458 bytes, checksum: 6a4bc578c9eaea104302f33af03c3f21 (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / CNPQ / A infecção pelo Papilomavírus Humano, além de representar uma doença sexualmente transmissível altamente disseminada, é responsável por 5% dos cânceres em humanos, destacando o câncer cervical com altos índices de incidência e mortalidade. Embora comprovadamente eficazes, as vacinas vigentes não combatem infecções já estabelecidas e apresentam um elevado custo de produção. Esse cenário revela a necessidade de estratégias vacinais alternativas. O presente trabalho propõe a expressão de diferentes genes recombinantes em Escherichia coli, uma plataforma biotecnológica econômica, de fácil manipulação e de alto rendimento. Os genes recombinantes utilizados foram: L1 de HPV16 e construções quiméricas basedas na substituição de epítopos da oncoproteína E5 na alça h4 e na região C-terminal de L1, com potencial para geração de antígenos profiláticoterapêuticos e na substituição de epítopos da proteína L2 na região da alça h4 para avaliação de possível neutralização cruzada. Após subclonagem em pGEM-T, esses genes foram clonados em vetor de expressão pAE e linhagens de Escherichia coli BL21 e Rosetta foram transformadas com os vetores de expressão gerados. A confirmação da produção das proteínas se deu por Western blot, a partir de extratos de culturas induzidas com IPTG. Otimizações nos protocolos de indução, lise e preparo das amostras foram realizadas ao longo dos experimentos. Os resultados obtidos demonstraram a produção dos antígenos recombinantes, e deverão ser validados em futuros ensaios imunológicos quanto à capacidade de induzir respostas imunes em animais desafiados. / Human papillomavirus infection, besides to represent a widespread sexually transmitted disease, is responsible for 5% of cancers in humans, highlighting cervical cancer with high rates of incidence and mortality. Although proven effective, the existing vaccines do not eliminate infections already established and have a high cost of production. This scenario shows the need for alternative vaccine strategies. This study proposes the expression of different recombinant genes in Escherichia coli, an economic, easy handling and high performance biotechnology platform. Recombinant genes used were: L1 of HPV16 and chimeric basedas constructions in replacement E5 oncoprotein epitopes on h4 loop and L1 C-terminal region, with the potential to generate prophylactic-therapeutic antigens and replacing L2 protein epitopes in loop region h4 for evaluation of possible cross-neutralization. After subcloning in pGEM-T, these genes were cloned into vector pAE expression and Escherichia coli BL21 and Rosetta were transformed with the expression vectors generated. Confirmation of protein production was performed by Western blot from extracts of cultures induced with IPTG. Optimizations in the induction protocols, lysis and preparation of the samples were carried out throughout the experiments. The results demonstrated the production of recombinant antigens and should be validated in future immunological assays for the ability to induce immune responses in challenged animals.