A osteodistrofia renal é uma complicação comum da insuficiência renal crônica. A biópsia óssea continua sendo o melhor método para o diagnóstico das doenças ósseas metabólicas. O objetivo deste estudo foi avaliar a utilidade da ultra-sonografia e da cintilografia com Tc-99m-sestamibi da paratireóide, como métodos diagnósticos não invasivos em pacientes com osteodistrofia renal em hemodiálise. Foram investigados 30 pacientes com insuficiência renal crônica, em tratamento com hemodiálise por no mínimo 6 meses, com sintomas e/ou com alterações bioquímicas sugestivas de doença óssea renal, sendo 19 mulheres e 11 homens, com média de idade de 43,9  9,17 anos. Quinze pacientes (50%) apresentaram diagnóstico de hiperparatireoidismo secundário, 5 (16,7%) de doença óssea mista, 3 (10%) de osteomalácia e 3 (10%) de doença óssea adinâmica. Glândulas aumentadas da paratireóide foram observadas em 12 (40%) pacientes na ultra-sonografia e em 15 (50%) na cintilografia com Tc-99m-sestamibi. O grupo de pacientes com glândulas aumentadas da paratireóide na ultra-sonografia, comparado com o grupo com glândulas não detectadas, apresentaram níveis séricos de PTHi aumentados (1536,6  881,8 x 811,7  705,5 pg/ml, p<0,05) e níveis séricos de albumina menores (3,690,24 x 4,030,44 g/dl, p<0,05). Todos os pacientes com níveis séricos de PTHi inferiores a 280 pg/ml apresentaram ecografias da paratireóide com resultados normais. Nove de 12 pacientes (83,3%), com ultra-sonografia com glândulas aumentadas da paratireóide, apresentavam níveis de PTHi superiores a 720 pg/ml. Ultra-sonografia mostrando glândulas aumentadas da paratireóide apresentou uma sensibilidade de 50%, uma especificidade de 66% e um valor preditivo positivo de 83% para o diagnóstico de doenças de alto remanejamento ósseo. Em relação aos resultados das cintilografias de paratireóide com Tc-99m-sestamibi, não houve diferenças nas médias dos níveis de PTHi entre os pacientes com ou sem glândulas aumentadas da paratireóide, assim como para os outros exames bioquímicos. Quando comparado aos níveis de PTHi, 2 pacientes apresentaram resultados positivos na cintilografia com PTHi inferior a 280 pg/ml e 8 (53,4%) acima de 720 pg/ml. Semelhante aos resultados das ultra-sonografias, a sensibilidade, a especificidade e o valor preditivo positivo da cintilografia para o diagnóstico das doenças de alto remodelamento ósseo foram baixos, 50%, 33% e 71%, respectivamente. Podemos concluir que a ultra-sonografia e a cintilografia com Tc-99m-sestamibi da paratireóide não foram bons métodos para o diagnóstico de doenças ósseas com alto remodelamento, no entanto, a ultra-sonografia da paratireóide foi superior a cintilografia com Tc-99m-sestamibi na detecção de glândulas aumentadas, sugerindo ser um marcador mais útil de gravidade em pacientes sintomáticos com hiperparatireoidismo secundário severo.

Contexto. A deficiência de vitamina D em adultos pode precipitar ou agravar osteopenia e osteoporose, causar fraqueza muscular e osteomalácia, e aumentar o risco de fraturas ósseas. Alguns destes efeitos podem ser mediados pelo hiperparatireoidismo secundário a níveis diminuídos de 25-hidroxivitamina D (25-OHD). Não está claro porque alguns indivíduos não desenvolvem elevação dos níveis de hormônio da paratireóide (PTH) em conseqüência à deficiência de vitamina D. Objetivos. Estimar a prevalência de hipovitaminose D e hiperparatireoidismo secundário em uma amostra de pacientes adultos ambulatoriais, e analisar possíveis causas de ausência de correlação entre os níveis de 25-OHD e PTH. Delineamento e cenário. Estudo transversal de 91 pacientes ambulatoriais de um centro de atenção terciária no sul do Brasil (latitude 300 sul). Pacientes. Adultos a partir de 40 anos de idade. Desfechos principais. Níveis séricos de 25-OHD medidos por quimioluminescência e níveis de PTH medidos por eletroquimioluminescência. Resultados. Idade média foi 60,3 ± 12 anos, 56 (61,5%) eram mulheres, e 70 (76,9%) eram brancos. Hipovitaminose D foi encontrada em 69 (75,9%), 11 (12,1%) tinham hiperparatireoidismo secundário e nenhum tinha hipomagnesemia (Mg <1,5 mg/dl). Não houve correlação significativa entre os níveis de 25-OHD e PTH, porém esta correlação tornou-se significativa quando apenas indivíduos com níveis de magnésio acima de 2,1 mg/dl foram considerados na análise (r = 0,37, p = 0,02). Houve correlação positiva entre os níveis de PTH e magnésio na faixa normal (r = 0,29, p < 0,01). Conclusões. A associação entre hipovitaminose D e hiperparatireoidismo secundário é dependente dos níveis séricos de magnésio.

Contexto. A deficiência de vitamina D em adultos pode precipitar ou agravar osteopenia e osteoporose, causar fraqueza muscular e osteomalácia, e aumentar o risco de fraturas ósseas. Alguns destes efeitos podem ser mediados pelo hiperparatireoidismo secundário a níveis diminuídos de 25-hidroxivitamina D (25-OHD). Não está claro porque alguns indivíduos não desenvolvem elevação dos níveis de hormônio da paratireóide (PTH) em conseqüência à deficiência de vitamina D. Objetivos. Estimar a prevalência de hipovitaminose D e hiperparatireoidismo secundário em uma amostra de pacientes adultos ambulatoriais, e analisar possíveis causas de ausência de correlação entre os níveis de 25-OHD e PTH. Delineamento e cenário. Estudo transversal de 91 pacientes ambulatoriais de um centro de atenção terciária no sul do Brasil (latitude 300 sul). Pacientes. Adultos a partir de 40 anos de idade. Desfechos principais. Níveis séricos de 25-OHD medidos por quimioluminescência e níveis de PTH medidos por eletroquimioluminescência. Resultados. Idade média foi 60,3 ± 12 anos, 56 (61,5%) eram mulheres, e 70 (76,9%) eram brancos. Hipovitaminose D foi encontrada em 69 (75,9%), 11 (12,1%) tinham hiperparatireoidismo secundário e nenhum tinha hipomagnesemia (Mg <1,5 mg/dl). Não houve correlação significativa entre os níveis de 25-OHD e PTH, porém esta correlação tornou-se significativa quando apenas indivíduos com níveis de magnésio acima de 2,1 mg/dl foram considerados na análise (r = 0,37, p = 0,02). Houve correlação positiva entre os níveis de PTH e magnésio na faixa normal (r = 0,29, p < 0,01). Conclusões. A associação entre hipovitaminose D e hiperparatireoidismo secundário é dependente dos níveis séricos de magnésio.

A osteodistrofia renal é uma complicação comum da insuficiência renal crônica. A biópsia óssea continua sendo o melhor método para o diagnóstico das doenças ósseas metabólicas. O objetivo deste estudo foi avaliar a utilidade da ultra-sonografia e da cintilografia com Tc-99m-sestamibi da paratireóide, como métodos diagnósticos não invasivos em pacientes com osteodistrofia renal em hemodiálise. Foram investigados 30 pacientes com insuficiência renal crônica, em tratamento com hemodiálise por no mínimo 6 meses, com sintomas e/ou com alterações bioquímicas sugestivas de doença óssea renal, sendo 19 mulheres e 11 homens, com média de idade de 43,9  9,17 anos. Quinze pacientes (50%) apresentaram diagnóstico de hiperparatireoidismo secundário, 5 (16,7%) de doença óssea mista, 3 (10%) de osteomalácia e 3 (10%) de doença óssea adinâmica. Glândulas aumentadas da paratireóide foram observadas em 12 (40%) pacientes na ultra-sonografia e em 15 (50%) na cintilografia com Tc-99m-sestamibi. O grupo de pacientes com glândulas aumentadas da paratireóide na ultra-sonografia, comparado com o grupo com glândulas não detectadas, apresentaram níveis séricos de PTHi aumentados (1536,6  881,8 x 811,7  705,5 pg/ml, p<0,05) e níveis séricos de albumina menores (3,690,24 x 4,030,44 g/dl, p<0,05). Todos os pacientes com níveis séricos de PTHi inferiores a 280 pg/ml apresentaram ecografias da paratireóide com resultados normais. Nove de 12 pacientes (83,3%), com ultra-sonografia com glândulas aumentadas da paratireóide, apresentavam níveis de PTHi superiores a 720 pg/ml. Ultra-sonografia mostrando glândulas aumentadas da paratireóide apresentou uma sensibilidade de 50%, uma especificidade de 66% e um valor preditivo positivo de 83% para o diagnóstico de doenças de alto remanejamento ósseo. Em relação aos resultados das cintilografias de paratireóide com Tc-99m-sestamibi, não houve diferenças nas médias dos níveis de PTHi entre os pacientes com ou sem glândulas aumentadas da paratireóide, assim como para os outros exames bioquímicos. Quando comparado aos níveis de PTHi, 2 pacientes apresentaram resultados positivos na cintilografia com PTHi inferior a 280 pg/ml e 8 (53,4%) acima de 720 pg/ml. Semelhante aos resultados das ultra-sonografias, a sensibilidade, a especificidade e o valor preditivo positivo da cintilografia para o diagnóstico das doenças de alto remodelamento ósseo foram baixos, 50%, 33% e 71%, respectivamente. Podemos concluir que a ultra-sonografia e a cintilografia com Tc-99m-sestamibi da paratireóide não foram bons métodos para o diagnóstico de doenças ósseas com alto remodelamento, no entanto, a ultra-sonografia da paratireóide foi superior a cintilografia com Tc-99m-sestamibi na detecção de glândulas aumentadas, sugerindo ser um marcador mais útil de gravidade em pacientes sintomáticos com hiperparatireoidismo secundário severo.

A osteodistrofia renal é uma complicação comum da insuficiência renal crônica. A biópsia óssea continua sendo o melhor método para o diagnóstico das doenças ósseas metabólicas. O objetivo deste estudo foi avaliar a utilidade da ultra-sonografia e da cintilografia com Tc-99m-sestamibi da paratireóide, como métodos diagnósticos não invasivos em pacientes com osteodistrofia renal em hemodiálise. Foram investigados 30 pacientes com insuficiência renal crônica, em tratamento com hemodiálise por no mínimo 6 meses, com sintomas e/ou com alterações bioquímicas sugestivas de doença óssea renal, sendo 19 mulheres e 11 homens, com média de idade de 43,9  9,17 anos. Quinze pacientes (50%) apresentaram diagnóstico de hiperparatireoidismo secundário, 5 (16,7%) de doença óssea mista, 3 (10%) de osteomalácia e 3 (10%) de doença óssea adinâmica. Glândulas aumentadas da paratireóide foram observadas em 12 (40%) pacientes na ultra-sonografia e em 15 (50%) na cintilografia com Tc-99m-sestamibi. O grupo de pacientes com glândulas aumentadas da paratireóide na ultra-sonografia, comparado com o grupo com glândulas não detectadas, apresentaram níveis séricos de PTHi aumentados (1536,6  881,8 x 811,7  705,5 pg/ml, p<0,05) e níveis séricos de albumina menores (3,690,24 x 4,030,44 g/dl, p<0,05). Todos os pacientes com níveis séricos de PTHi inferiores a 280 pg/ml apresentaram ecografias da paratireóide com resultados normais. Nove de 12 pacientes (83,3%), com ultra-sonografia com glândulas aumentadas da paratireóide, apresentavam níveis de PTHi superiores a 720 pg/ml. Ultra-sonografia mostrando glândulas aumentadas da paratireóide apresentou uma sensibilidade de 50%, uma especificidade de 66% e um valor preditivo positivo de 83% para o diagnóstico de doenças de alto remanejamento ósseo. Em relação aos resultados das cintilografias de paratireóide com Tc-99m-sestamibi, não houve diferenças nas médias dos níveis de PTHi entre os pacientes com ou sem glândulas aumentadas da paratireóide, assim como para os outros exames bioquímicos. Quando comparado aos níveis de PTHi, 2 pacientes apresentaram resultados positivos na cintilografia com PTHi inferior a 280 pg/ml e 8 (53,4%) acima de 720 pg/ml. Semelhante aos resultados das ultra-sonografias, a sensibilidade, a especificidade e o valor preditivo positivo da cintilografia para o diagnóstico das doenças de alto remodelamento ósseo foram baixos, 50%, 33% e 71%, respectivamente. Podemos concluir que a ultra-sonografia e a cintilografia com Tc-99m-sestamibi da paratireóide não foram bons métodos para o diagnóstico de doenças ósseas com alto remodelamento, no entanto, a ultra-sonografia da paratireóide foi superior a cintilografia com Tc-99m-sestamibi na detecção de glândulas aumentadas, sugerindo ser um marcador mais útil de gravidade em pacientes sintomáticos com hiperparatireoidismo secundário severo.

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:56:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1328_1.pdf: 1344003 bytes, checksum: 91cf8b180a2ff7d9a8accf92e8ac328a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Introdução: Alguns relatos de casos têm sugerido uma associação entre hiperparatireoidismo primário (HPTP) e polineuropatia periférica (PNP). Entretanto não existem estudos analisando esta possível relação. O objetivo deste estudo foi avaliar a condução nervosa periférica de sujeitos com HPTP. Métodos: 17 pacientes com HPTP foram incluídos. A média (±DP) de idade foi de 60,5 (±12,9) anos, de cálcio sérico de 11,5 (±1,0) mg/dl e de PTH sérico de 315 (±569) pg/ml. Um grupo controle foi formado por 17 indivíduos sem HPTP. A média (±DP) de idade foi de 60,8 (±12,5) anos e de cálcio sérico de 9,8 (±0,3) mg/dl. A condução nervosa sensitiva e motora foi avaliada através da eletroneurografia. Resultados: A velocidade de condução do potencial de ação de nervo sensitivo dos nervos surais direito (D) e esquerdo (E) foram menores no grupo com HPTP versus grupo controle, com média (±DP) de 52,7 (±6,3) versus 58,0 (±8,0) m/s (p=0,046) e de 51,6 (±6,8) versus 56,3 (±6,7) m/s (p=0,057), respectivamente. A amplitude do potencial de ação de músculo composto (PAMC) dos nervos medianos D e E também foi menor nos sujeitos com HPTP: média (±DP) de 7,4 (±1,6) versus 8,9 (±1,7) mV (p=0,008) e de 6,5 (±2,4) versus 7,6 (±2,0) mV (p=0,083), respectivamente. A latência do PAMC do nervo mediano D foi maior no grupo com HPTP, com média (±DP) de 4,3 (±1,2) versus 3,6 (±0,6) ms (p=0,025), assim como nos nervos tibiais D e E: 4,2 (±1,1) versus 3,3 (±0,4) ms (p=0,001) e 3,9 (±0,7) versus 3,4 (±0,6) ms (p=0,063), respectivamente. O exame neurológico foi normal em todos os pacientes. Conclusão: Nossos dados demonstram uma associação entre HPTP e alterações neurológicas periféricas, compatíveis com o quadro de PNP sensitivo-motora subclínica

Introdução: O quelante de fósforo (P) Osvaren® foi lançado recentemente no mercado internacional para tratamento da hiperfosfatemia nos pacientes com Doença Renal Crônica (DRC). Não existem estudos experimentais com esta medicação. Objetivo: Avaliar a ação deste quelante no tratamento do Distúrbio Mineral e Ósseo (DMO) de ratos com DRC induzida por adenina e por nefrectomia 5/6 (NX5/6). Métodos: Experimento 1: Durante 4 semanas, ratos Wistar receberam dieta com adenina [2 semanas (0,75%); 2 semanas (0,50%)] e então foram divididos em 3 grupos para receber dieta padrão (grupo DRC); dieta padrão com 3% de Acetato de Cálcio (grupo Ca); e dieta padrão com 3% de Osvaren® (grupo CaMg). Um grupo Controle (função renal normal) recebeu a dieta padrão durante todo o estudo. Ao final de cinco semanas de tratamento os animais foram sacrificados. Experimento 2: ratos da mesma espécie foram submetidos à NX5/6, divididos em grupos como no experimento 1 para receberem os quelantes de P imediatamente após a nefrectomia, e sacrificados após 9 semanas. Nos dois experimentos foram coletados soro, fêmures, aortas e paratireóides para análise bioquímica, histomorfometria óssea, pesquisa de calcificação vascular (CV) e imunohistoquímica de paratireóides, respectivamente. Resultados: Experimento 1: Os animais que receberam adenina apresentaram níveis maiores de creatinina, PTH, P e magnésio (Mg) que os do grupo Controle. Os quelantes de P reduziram a fração de excreção de P (FeP), mas não o P sérico, enquanto os níveis de PTH, FGF23 e calcitriol diminuíram de forma não significativa nos grupos tratados. O Mg sérico foi significativamente maior no grupo CaMg, enquanto maior calciúria, mais CV e menor marcação pelo PCNA nas paratireóides foram observadas no grupo Ca. Os animais que receberam adenina apresentaram doença óssea mista e ambos os quelantes de P melhoraram a remodelação, mas favoreceram a um acúmulo ainda maior de osteóide. Experimento 2: Da mesma forma que no experimento 1, o animais submetidos à NX5/6 evoluíram com uremia, e os efeitos dos quelantes no PTH, na CV e nas paratireóides foram similares. No entanto, o grupo CaMg apresentou mortalidade de 54% (vs 20% no grupo Ca), além de retardo na mineralização óssea. Conclusão: O tipo de nefropatia pode ter influência no efeito do quelante de P Osvaren®, já que o acúmulo de Mg provavelmente foi o responsável pela maior mortalidade e déficit de mineralização observados no experimento 2. Em relação ao efeito como quelante de P, o Osvaren® foi equivalente ao acetato de cálcio, mas este último está associado a maior sobrecarga de cálcio e a CV. O acúmulo de osteóide observado em ambos os experimentos parece ser o preço pago pela reduzida absorção intestinal de P favorecida pelos quelantes no hiperpatireoidismo secundário severo e esse efeito deveria ser avaliado em pacientes em diálise / Introduction: Osvaren® is a phosphate (P) binder that has been recently introduced for Chronic Kidney Disease (CKD) patients therapy. However, it has not been tested in experimental models yet. Aims: To study Osvaren® effects on mineral and bone metabolism in CKD experiment models. Methods: Experiment 1: For 4 weeks (wk), rats were fed normal chow or an adenine-enriched diet (0,75% for 2 wks; 0,50% for 2 wks). After that, adenine was discontinued and rats were divided into 3 groups: Ca (3% calcium acetate); CaMg (3% Osvaren®) and CKD (normal diet/untreated). A control group, with normal renal function was also studied. After 5 wks of therapy, animals were sacrificed. Experiment 2: Animals underwent 5/6 nephrectomy, and were submitted to different P binders treatment as in experiment 1 and then sacrificed 9 weeks after surgery. We performed biochemical and histomorphometric analyses, parathyroid PCNA imunohistochemistry, as well as Von Kossa staining and calcium content of aortic sections. Results: Experiment 1: Higher creatinine, PTH, FGF-23, P and Mg were found in all adenine-fed rats. P binders did not reduce serum P but decreased fractional excretion of P (FeP) and tended to reduce PTH, FGF23 and calcitriol levels. In the CaMg group, Mg was slightly elevated, whereas Ca group had greater urinary calcium as well as vascular calcification and smaller parathyroid PCNA staining. Adenine-fed rats presented features of mixed bone disease and P binders therapy was able to decrease bone resorption, but was associated with an osteoid accumulation. Experiment 2: As in experiment 1, nephrectomized rats were uremic and P binder effects on PTH, vascular calcification and parathyroid were very similar, except for the mortality rate, that was higher in CaMg group (54% vs 20% in Ca group). An increase in mineralization lag time was also found in CaMg group. Conclusions: Osvaren® may cause different effects on different types of nephropathy, as in experiment 2 the Mg was probably the responsible for higher mortality as well as for bone mineralization defect. In terms of P binding efficacy, Osvaren® was equivalent to calcium acetate, but the last one caused calcium overload and vascular calcification. The osteoid accumulation is probably related to the decrease in intestinal P absorption caused by the P binders in these models of secondary hyperparathyroidism. These effects should also be evaluated in dialysis patients

INTRODUÇÃO: Os mecanismos moleculares que levam ao desenvolvimento do hiperparatireoidismo primário (pHPT) ainda são desconhecidos. No entanto, alguns genes parecem ter seu papel definido na oncogênese das paratireóides, como os genes PRAD1 e MEN-1 que apresentam expressão aumentada em adenomas de pacientes com pHPT em relação ao tecido normal. Outro achado importante é a expressão aumentada do gene HRPT2 em carcinomas de paratireóide familiares ou não. A distinção entre hiperplasia, adenoma e carcinoma é difícil pelas limitações técnicas dos exames histo-patológicos atuais. Assim, este estudo tem como objetivo central identificar genes que possam servir como marcadores diferenciais entre hiperplasia, adenoma e carcinoma em pacientes com pHPT, com o intuito utilizá-los de forma auxiliar no diagnóstico diferencial destas condições. MÉTODOS: Foram empregadas três metodologias: 1) utilização de clones obtidos no Projeto Genoma Humano do Câncer (HCGP) que foram fixados em membrana e hibridizados com sonda ora de adenomas (n = 2) ora de carcinoma (n = 1). 2) utilização de membranas comerciais (Atlas© cDNA Expression Array Human Oncogene/Tumor Suppressor, Human Cancer 1.2. BD Biosciences Clontech. Palo Alto, USA) contendo respectivamente 190 e 1176 genes conhecidos, utilizadas como substrato para hibridização com sondas de adenoma e carcinoma. 3) desenvolvimento da técnica de RDA (Representational Difference Analysis) para obtenção de fragmentos de cDNA diferencialmente expressos que foram clonados e seqüenciados para posterior análise. Os genes diferencialmente expressos, entre adenoma e carcinoma obtidos nas três metodologias tiveram sua expressão confirmada por RT-PCR em tecidos de paratireóide de pacientes portadores de pHPT, entre eles: hiperplasias, adenomas e carcinomas. RESULTADOS: foram escolhidos para confirmação por PCR os genes: IRF-1, RAF, TIMP-3, NOTCH-2 e bFGF, cuja expressão nas membranas mostrou-se aumentada nos adenomas e os genes IGF-1-R, PTK7 e RET, cuja expressão mostrou-se elevada nos carcinomas. Dois genes tiveram sua expressão diferencial confirmada. O gene IRF-1, apresenta expressão diminuída nas três condições estudadas (hiperplasia, adenoma e carcinoma) quando comparada à expressão do tecido normal. O gene PTK7, confirmou sua expressão aumentada nas amostras de carcinomas quando comparadas às hiperplasias e aos adenomas. DISCUSSÃO: Os dois genes que apresentaram sua expressão diferencial confirmada, IRF-1 e PTK7, não foram , até o momento, descritos como coadjuvantes no aparecimento e progressão tumoral nas paratireóides. Nossos achados associaram o gene supressor tumoral IRF-1 ao aparecimento de alterações morfológicas e funcionais nas paratireóides, uma vez que sua expressão nos tecidos acometidos por hiperplasia, adenoma ou carcinoma é sensivelmente menor que aquela encontrada nos tecidos normais, sugerindo que este gene tenha importante papel nos eventos iniciais de tumorigênese desta glândula. Por outro lado, expressão aumentada de PTK7 já foi descrita em tumores malignos de diversos tecidos. Embora seus mecanismos de ativação e ação permaneçam desconhecidos, nossos achados corroboram os da literatura e sugerem que este gene participe dos mecanismos moleculares de transformação celular nas paratireóides / INTRODUCTION: The molecular mechanisms to the development of primary hyperparathyroidism (pHPT) are still unknown. Otherwise, several genes as PRAD1 and MEN-1 seem to play a role in parathyroid oncogenesis and are highly expressed in adenomas of pHPT patients when compared to normal glands. Another important data is the increased expression of HRPT2 in familiar and non-familiar parathyroid carcinomas. The distinction among hyperplasia, adenoma and carcinoma is a difficult task because there are limits in histopathologic parathyroid analysis in our days. This study has as main goal to identify genes that might help to distinguish hyperplasias from adenomas and both from carcinomas in pHPT patients. METHODS: Three techniques were employed: 1) clones from Human Cancer Genome Project (HCGP) fixed in membranes and hybridized with adenomas or carcinoma probes; 2) commercially available membranes (Atlas© cDNA Expression Array Human Oncogene/Tumor Suppressor, Human Cancer 1.2. BD Biosciences Clontech. Palo Alto, USA) which contain 190 and 1176 identified genes that were employed as substrate to hybridization with adenomas (n = 2) and carcinoma (n = 1) probes; 3) RDA technique (Representational Difference Analysis) in order to obtain differentially expressed cDNA fragments what in other steps were cloned and sequenced for further analysis. The genes, obtained from the three methods, that were differentially expressed between adenomas and carcinomas had their expression evaluated by RT-PCR in parathyroid tissues from patients bearing pHPT caused by hyperplasias, adenomas or carcinomas. RESULTS: genes chosen for PCR analysis: IRF-1, RAF, TIMP-3, NOTCH-2 and bFGF, whose expressions in the membrane were increased in adenomas and the genes IGF-1-R, PTK7 and RET, whose expression in the membrane were increased in carcinomas. Two genes had their differential expression confirmed. The IRF-1 had a decreased expression in the three situations of pHPT (hyperplasia, adenoma and carcinoma) when compared to its expression in the normal gland. The gene PTK7 confirmed its increased expression in samples obtained from carcinomas when compared to hyperplasias or to adenomas. DISCUSSION: The two genes whose differential expressions were confirmed, IRF-1 and PTK7, have not been described till this moment as coadjutants in the beginning or progression of parathyroid tumors. Our results associate the tumor suppressor gene IRF-1 to the origin of morphological and functional disturbs in parathyroid, because its expression in hyperplasia, adenoma or carcinoma of this gland were clearly lower in these conditions when compared to normal tissues, thus suggesting an important role of this gene in early steps of parathyroid oncogenesis. On the other hand, increased expression of PTK7 has already been described in malignant tumors of several tissues. Although their mechanisms of activation and action remain unknown, our results reinforce the literature data and suggest that this gene shares the molecular mechanisms of cell transformation in parathyroids

INTRODUÇÃO: Os mecanismos moleculares que levam ao desenvolvimento do hiperparatireoidismo primário (pHPT) ainda são desconhecidos. No entanto, alguns genes parecem ter seu papel definido na oncogênese das paratireóides, como os genes PRAD1 e MEN-1 que apresentam expressão aumentada em adenomas de pacientes com pHPT em relação ao tecido normal. Outro achado importante é a expressão aumentada do gene HRPT2 em carcinomas de paratireóide familiares ou não. A distinção entre hiperplasia, adenoma e carcinoma é difícil pelas limitações técnicas dos exames histo-patológicos atuais. Assim, este estudo tem como objetivo central identificar genes que possam servir como marcadores diferenciais entre hiperplasia, adenoma e carcinoma em pacientes com pHPT, com o intuito utilizá-los de forma auxiliar no diagnóstico diferencial destas condições. MÉTODOS: Foram empregadas três metodologias: 1) utilização de clones obtidos no Projeto Genoma Humano do Câncer (HCGP) que foram fixados em membrana e hibridizados com sonda ora de adenomas (n = 2) ora de carcinoma (n = 1). 2) utilização de membranas comerciais (Atlas© cDNA Expression Array Human Oncogene/Tumor Suppressor, Human Cancer 1.2. BD Biosciences Clontech. Palo Alto, USA) contendo respectivamente 190 e 1176 genes conhecidos, utilizadas como substrato para hibridização com sondas de adenoma e carcinoma. 3) desenvolvimento da técnica de RDA (Representational Difference Analysis) para obtenção de fragmentos de cDNA diferencialmente expressos que foram clonados e seqüenciados para posterior análise. Os genes diferencialmente expressos, entre adenoma e carcinoma obtidos nas três metodologias tiveram sua expressão confirmada por RT-PCR em tecidos de paratireóide de pacientes portadores de pHPT, entre eles: hiperplasias, adenomas e carcinomas. RESULTADOS: foram escolhidos para confirmação por PCR os genes: IRF-1, RAF, TIMP-3, NOTCH-2 e bFGF, cuja expressão nas membranas mostrou-se aumentada nos adenomas e os genes IGF-1-R, PTK7 e RET, cuja expressão mostrou-se elevada nos carcinomas. Dois genes tiveram sua expressão diferencial confirmada. O gene IRF-1, apresenta expressão diminuída nas três condições estudadas (hiperplasia, adenoma e carcinoma) quando comparada à expressão do tecido normal. O gene PTK7, confirmou sua expressão aumentada nas amostras de carcinomas quando comparadas às hiperplasias e aos adenomas. DISCUSSÃO: Os dois genes que apresentaram sua expressão diferencial confirmada, IRF-1 e PTK7, não foram , até o momento, descritos como coadjuvantes no aparecimento e progressão tumoral nas paratireóides. Nossos achados associaram o gene supressor tumoral IRF-1 ao aparecimento de alterações morfológicas e funcionais nas paratireóides, uma vez que sua expressão nos tecidos acometidos por hiperplasia, adenoma ou carcinoma é sensivelmente menor que aquela encontrada nos tecidos normais, sugerindo que este gene tenha importante papel nos eventos iniciais de tumorigênese desta glândula. Por outro lado, expressão aumentada de PTK7 já foi descrita em tumores malignos de diversos tecidos. Embora seus mecanismos de ativação e ação permaneçam desconhecidos, nossos achados corroboram os da literatura e sugerem que este gene participe dos mecanismos moleculares de transformação celular nas paratireóides / INTRODUCTION: The molecular mechanisms to the development of primary hyperparathyroidism (pHPT) are still unknown. Otherwise, several genes as PRAD1 and MEN-1 seem to play a role in parathyroid oncogenesis and are highly expressed in adenomas of pHPT patients when compared to normal glands. Another important data is the increased expression of HRPT2 in familiar and non-familiar parathyroid carcinomas. The distinction among hyperplasia, adenoma and carcinoma is a difficult task because there are limits in histopathologic parathyroid analysis in our days. This study has as main goal to identify genes that might help to distinguish hyperplasias from adenomas and both from carcinomas in pHPT patients. METHODS: Three techniques were employed: 1) clones from Human Cancer Genome Project (HCGP) fixed in membranes and hybridized with adenomas or carcinoma probes; 2) commercially available membranes (Atlas© cDNA Expression Array Human Oncogene/Tumor Suppressor, Human Cancer 1.2. BD Biosciences Clontech. Palo Alto, USA) which contain 190 and 1176 identified genes that were employed as substrate to hybridization with adenomas (n = 2) and carcinoma (n = 1) probes; 3) RDA technique (Representational Difference Analysis) in order to obtain differentially expressed cDNA fragments what in other steps were cloned and sequenced for further analysis. The genes, obtained from the three methods, that were differentially expressed between adenomas and carcinomas had their expression evaluated by RT-PCR in parathyroid tissues from patients bearing pHPT caused by hyperplasias, adenomas or carcinomas. RESULTS: genes chosen for PCR analysis: IRF-1, RAF, TIMP-3, NOTCH-2 and bFGF, whose expressions in the membrane were increased in adenomas and the genes IGF-1-R, PTK7 and RET, whose expression in the membrane were increased in carcinomas. Two genes had their differential expression confirmed. The IRF-1 had a decreased expression in the three situations of pHPT (hyperplasia, adenoma and carcinoma) when compared to its expression in the normal gland. The gene PTK7 confirmed its increased expression in samples obtained from carcinomas when compared to hyperplasias or to adenomas. DISCUSSION: The two genes whose differential expressions were confirmed, IRF-1 and PTK7, have not been described till this moment as coadjutants in the beginning or progression of parathyroid tumors. Our results associate the tumor suppressor gene IRF-1 to the origin of morphological and functional disturbs in parathyroid, because its expression in hyperplasia, adenoma or carcinoma of this gland were clearly lower in these conditions when compared to normal tissues, thus suggesting an important role of this gene in early steps of parathyroid oncogenesis. On the other hand, increased expression of PTK7 has already been described in malignant tumors of several tissues. Although their mechanisms of activation and action remain unknown, our results reinforce the literature data and suggest that this gene shares the molecular mechanisms of cell transformation in parathyroids

Orientador: Lilia F. R. de Souza Li / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T01:59:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_SimoneCaixetade_M.pdf: 1991149 bytes, checksum: 4c5b783ab7776886c12977300fbb6af7 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O CASR pertence à família C dos receptores que se acoplam à proteína G e é ativado quando interage com o cálcio extracelular, sendo responsável pelo ajuste do ¿set point¿ do cálcio extracelular por meio da regulação da secreção de PTH e excreção de cálcio. Mutações no Receptor Sensor de Cálcio (CASR) estão associadas a FHH (Hipercalcemia Hipocalciúrica Familiar) e NSHTP (Hiperparatireoidismo Neonatal Grave) quando inativadoras do receptor e ADH (Hipoparatireoidismo Autossômico Dominante) quando ativadoras. O Hiperparatireoidismo Neonatal Grave (NSHPT) é uma doença rara caracterizada por calcemias elevadas, próximas às consideradas incompatíveis à vida, associada ao aumento da concentração de PTH, desmineralização óssea grave e sintomas neonatais como hipotonia e baixo ganho ponderal. Trata-se de uma doença familiar, com pais portadores de Hipercalcemia Hipocalciúrica Familiar (FHH), uma doença autossômica dominante, geralmente assintomática, com calcemias elevadas ou no limite superior da normalidade, associada a concentrações de PTH normais, porém não suprimidas e hipocalciúria. ADH, por sua vez, cursam com desregulação no ajuste da concentração de cálcio extracelular, onde baixas concentrações de cálcio ativam o receptor e inibem a secreção de PTH pelas paratireóides e aumentam a excreção de cálcio pelos rins. Indivíduos afetados apresentam hipocalcemia, PTH no limite inferior ou abaixo do normal, hiperfosfatemia e hipercalciúria. O objetivo desse trabalho foi estudar duas famílias portadoras de NSHPT e FHH, identificar novas mutações e analisar o grau de expressão dos receptores mutados. Identificamos três mutações pontuais, nas posições c.1913.G>T, c.2.T>G e c.2244.C>G. Na família S encontramos a mutação c.1913.G>T que resulta em mudança de aminoácido Arginina por Leucina na posição 638 e a mutação silenciosa c.2244.C>G que não altera o aminoácido Prolina da posição 748. Na família J encontramos a mutação c.2.T>G que resulta em mudança do primeiro aminoácido Metionina e em perda da seqüência Kozak (AXXATGG). Um programa de análise para a previsão de seqüências utilizadas para início da tradução protéica, indicou que, na presença da mutação, o ATG com maior probabilidade de ser utilizado como o novo sítio de início de tradução localiza-se no exon 3, na mesma matriz de leitura original. Para análise da expressão do receptor, com a mutação no códon inicial de transcrição do receptor (p.M1?), inserimos no cDNA do CASR um fragmento correspondente à região -226 a 66 do CASR, contendo cinco potenciais seqüências Kozak. Para o estudo da expressão dos receptores mutados da família S inserimos as mutações no cDNA do CASR através de mutagênese sítio dirigida. Analisamos a expressão dos receptores mutados através do Western Blot. O receptor mutado p.R638L apresentou uma expressão similar ao receptor nativo e foram visualizadas as formas monoméricas correspondentes às bandas de 140kDa (forma imatura, parcialmente glicosilada) e 160kDa (forma madura e glicosilada) e bandas superiores maiores que 220kDa. A mutação c.2244.C>G é silenciosa e apresentou expressão similar à do receptor nativo. Em contraste, a expressão do receptor mutado p.M1? através do Western blot estava consideravelmente reduzida. Nos experimentos de imunocitoquímica, observamos que o receptor nativo foi bem expresso na superfície celular tanto em células não permeabilizadas, quanto permeabilizadas. Padrão semelhante foi observado para o receptor mutado p.R638L, indicando maturação e processamento apropriado no retículo endoplasmático enquanto que o receptor com a mutação p.M1? não foi visualizado na superfície celular de células não permeabilizadas e só foi identificado no interior de células permeabilizadas, sugerindo que o receptor mutado era retido no retículo endoplasmático não conseguindo se expressar na membrana plasmática / Abstract: The CASR belongs to family C of the G protein coupled receptors and it is activated by the interaction with extracellular calcium, which is responsible for adjusting extracellular calcium set point adjusting PTH and calcium excretion. Calcium Sensing Receptor mutations are related to Familial Hypocalciuric Hypercalcemia (FHH) and Neonatal Severe Hyperparathyroidism (NSHPT) when inactivating and to Autosomal Dominant Hypocalcemia (ADH) when activating. Neonatal Severe Hyperparathyroidism (NSHPT) is a rare disease characterized by hypercalcemia, calcium levels close to those incompatible with life, markedly elevated PTH levels, severe bone demineralization and neonatal symptoms as hypotonia and poor weight gain. Familial Hypocalciuric Hypercalcemia is a familial disease with Autosomal dominant inheritance, in which parents are usually affected, generally asymptomatic, mild ¿ to ¿ moderate hypercalcemia and normal PTH levels (but not suppressed) and hypocalciuria. In ADH, affected individuals¿ present hypocalcemia, PTH at the lower limit or normal range, hyperphosphatemia and hypercalciuria. The objective of this work was study of two families (S and J) with Neonatal Severe Hyperparathyroidism and Familial Hypocalciuric Hypercalcemia, search for new mutations and analyze the expression pattern of mutated receptors. Three new missense mutations were found: c.1913.G>T, c.2.T>G and c.2244.C>G. The mutation c.1913.G>T was identified at family S. and resulted in Arginine to Leucine change at codon 638. The silent mutation c.2244.C>G didn¿t change the amino acid Proline at codon 748. A novel mutation in exon 2, T to G transition at nucleotide 2, changing Metionine to Arginine was identified at family M. The mutation disrupts the original Kozak sequence (AXXATGG), altering the protein start site. Computational analysis using a program that predicts start sites showed that the putative new translation start site was in the exon 3 in frame. A portion of the gene containing the mutation and five cryptic Kozak sequences (-226 to 66) was used to analyze the expression of the mutant receptor (p.M1?). To analyze the expression pattern of Family S, the mutated cDNAs was inserted in a vector, using site direct mutagenesis. Western blot was performed to analyze the expression analysis of the mutated receptors. The p.R638L receptor showed similar expression pattern compared with the wild type receptor, presenting the monomeric forms of 140 (immature, partial glycosylated) and 160kDa (mature, glycosylated) and other forms higher than 200kDa. The mutation c.2244.C>G showed similar expression pattern compared with the wild type receptor. In contrast, Western blot expression levels of the mutant receptor p.M1? was dramatically reduced. Immunocytochemistry experiments showed strong staining at the cell surface of nonpermeabilized and permeabilized HEK293 cells expressing the wild type receptor. The same pattern was observed for the mutant receptor p.R638L, suggesting correct maturation and trafficking. While the mutant receptor p.M1? was not expressed on the cell surface and the staining was only identified inside permeabilized cells, suggesting that the mutant receptor was trapped within the endoplasmatic reticulum and was not expressed at the plasmatic membrane / Mestrado / Mestre em Farmacologia