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La reproduction sexuée repose sur deux processus fondamentaux : la méiose qui permet la formation des gamètes dont le génome est haploïde et la syngamie qui permet, après fécondation, de restaurer la diploïdie par fusion des deux noyaux parentaux haploïdes. Alors que la méiose repose respectivement sur le génome maternel pour l'ovocyte et paternel pour le spermatozoïde, la restauration de la diploïdie dans le zygote repose exclusivement sur le génome maternel. Si un pronucleus maternel compétent pour la réplication est formé au terme de la méiose ovocytaire, le génome paternel quant à lui, n'acquiert cette compétence que sous l'influence de facteurs maternels. En effet, à la fin de la méiose, le génome paternel est « empaqueté » avec des protamines qui le rendent inactif pour toute fonction biologique, en particulier la réplication. L'éviction des protamines et leur remplacement par des histones maternelles sont des étapes indispensables à l'acquisition par le génome paternel de sa compétence à la réplication, préalable à la syngamie. Tous ces événements doivent être extrêmement coordonnés afin de permettre à un premier noyau zygotique comportant les deux lots de chromosomes parentaux de se former et d'entrer dans le premier cycle mitotique.Notre laboratoire a identifié yemanuclein-alpha, aussi appelé yemanuclein (yem) dans un crible moléculaire pour des gènes exprimés spécifiquement dans la lignée germinale femelle, et son premier allèle muté yem1. Cette mutation ponctuelle (V478E) a été identifiée dans un crible génétique de « stérilité femelle ». Une descendance exceptionnelle observée chez les femelles yem1, présente la propriété inattendue d'être parthénogénétique. Cette propriété révèle un double défaut chez le mutant : dans le processus de méiose ovocytaire qui conduit à la formation d'un pronucleus maternel haploïde mais aussi dans la formation d'un pronucleus paternel compétent pour la syngamie. Mes travaux de thèse ont porté sur les deux aspects de la fonction de la Yemanucléine. En conjuguant des méthodes de génétique, de biochimie, et de biologie cellulaire, nous avons pu mettre en évidence des fonctions essentielles de la Yemanucléine dans les étapes initiales de la prophase méiotique de l'ovocyte de drosophile. Nous avons pu montrer que la Yemanucléine joue un rôle clé dans la recombinaison méiotique et plus particulièrement dans la fréquence et la cinétique d'apparition des cassures double brin. Son association au complexe synaptonémal et au complexe cohésine, tous deux connus comme étant nécessaires à la ségrégation chromosomique, est un élément clé de cette fonction.Outre cette fonction méiotique, la Yemanucléine, facteur maternel, est aussi requise pour l'assemblage de la chromatine du pronucleus paternel. Nous montrons dans ce manuscrit qu'elle joue ce rôle à travers son action dans un troisième complexe, en partenariat avec la protéine HIRA. Le complexe multiprotéique contenant la protéine HIRA est connu pour sa fonction de chaperon du variant de l'histone H3.3 et son rôle dans l'assemblage de la chromatine du pronucleus paternel. La Yemanucléine est le premier membre de la famille HPC2/UBN1 caractérisé. Son rôle dans l'assemblage des nucléosomes découplé de la réplication est décrit pour la première fois dans ce manuscrit. C'est aussi la première fois qu'une protéine spécifique de la reproduction est décrite pour son implication à deux étapes clés de ce processus. / Sexual reproduction relies on two key events: formation of cells with a haploid genome through meiosis and restoration of diploidy through syngamy in the zygote. Meiosis completion is supported exclusively by the maternal genome for the oocyte and the paternal genome for the sperm cell. In contrast diploidy restoration in the zygote is entirely dependent on maternal factors. At the end of meiosis the maternal pronucleus is competent for replication, whereas the paternal genome is packed with protamines. These proteins need to be removed in the zygote and replaced by maternally provided histones before the paternal genome acquires competence for replication, a prerequisite for syngamy. All these events must be highly coordinated to allow the first zygotic nucleus to form with the two sets of parental chromosomes and enter the first mitotic cycle. Our laboratory has identified yemanuclein-alpha, also called yemanuclein (yem) in a molecular screen for genes specifically expressed in the female germ line and its first mutant allele yem1, in a female sterile screen. The role played by yem not only in the meiotic process through which a haploid maternal pronucleus is formed but also in the zygotic process that makes a paternal pronucleus competent for syngamy, is underscored by the obtention of exceptional parthenogenetic progeny from yem1 mothers.My thesis work is precisely dedicated to the analysis of both aspects of Yemanuclein function: in the oocyte and the zygote. Using genetic, biochemical and cell biology methods we were able to uncover essential functions of Yemanuclein in early meiotic prophase in the Drosophila oocyte. Using yem1 allele (V478E), we could show its requirement for meiotic recombination especially for the frequency and timing of the double strand breaks formation. Yemanuclein association with two protein complexes, the Synaptonemal Complex (SC) and the Cohesin complex known to be required for proper chromosome segregation, supports these findings. Beyond its meiotic function, Yemanuclein is also required in the zygote for assembly of paternal pronucleus chromatin. This is achieved through a third complex that acts as histone H3.3 chaperone. In the present manuscript we identify Yemanuclein as a partner of HIRA in its role in H3.3 nucleosome assembly and deposition on the paternal pronucleus. Interestingly Yemanuclein is the first member of the HPC2/UBN1 protein family ever characterized. The role of Yem/ HPC2/ UBN1 in replication independent chromatin remodeling remained elusive until very recently. Our work is original in that it is the first to report on a role of one member of this family in oocyte meiosis and paternal chromatin assembly in the zygote.

Les histones acetyl transférase sont une classe de protéines jouant un rôle primordial dans la modification de l'état de la structure chromatinienne. Leur capacité à réaliser des modifications post-traductionnelles des queues N-terminales d'histone contribue à l'élaboration du « code histone ». Son interprétation permet d'influer sur le recrutement de co-facteurs, l'activité des complexes de remodelage et la possibilité pour certaines d'être maintenues à travers les divisions cellulaires, mettant en évidence un mécanisme primordial dans le contrôle de l'expression des gènes. Le gène chm code pour l'une de ces protéines de la famille MYST. Découvert dans le laboratoire, son étude a révélé sa capacité à maintenir la transcription de gènes Hox, à moduler l'activité transcriptionnelle de Fos/Jun par l'acétylation de l'histone H4 aux loci des gènes cibles dans la voie de signalisation Jun N-terminal Kinase (JNK) et enfin de contrôler l'origine de réplication. Aux phénotypes majeurs des mutants zygotiques pour chm ; qui sont : un défaut de fermeture du thorax adulte et la mort au stade pupe pharate ; s'ajoute : l'apparition de soies sensorielles extra-numéraire en position dorsocentral et scutellaire, des phénotypes reliés à un défaut des voies hormonales (hormone juvénile, peptide insulinique) : anomalies lors de la métamorphose, accroissement de la susceptibilité aux stress durant le stade adulte. Mes travaux de thèse m'ont permis d'identifier la place de Chm dans la voie de régulation de la formation de cluster prérequis à l'apparition de soies sensorielles. / The histone acetyltransferase (HAT) Chameau (Chm) plays in various epigenetic mechanisms of transcription control : maintenance of Hox gene transcription ; modulation of Fos/Jun transcriptional activity by histone H4 acetylation at target gene loci; control of replication origins. Here, I will discuss about a neural function of Chm, which acts in few brain neurosecretory neurons to control the activity of neurohaemal organs. Genetic evidences for a neuroendocrine function of Chm are the following. On the one hand, chm inactivation causes phenotypes suggesting hormonal signaling defects : null mutation prevents abdominal differentiation and hatching – correlated to an juvenile hormone (JH) excess - chm late inactivation allows the emergence of adults that are highly susceptible to different types of stress (starvation, oxidative, infections) – related to a defect in insulin signaling. On the other hand, these two phenotype classes are rescued by providing back Chm in 6 neurons of the pars lateralis (CA-LPs, which innervate the CA) during development, and in 12 neurons of pars intercerabralis (IPCs, which produce insulin-like peptides and innervate the CC/CA complex) in adult. DNA chip experiments showed that chm mutation affects 6 functional classes of genes (defined by ‘biological process' Gene Ontology term) : (i) neurotransmission, synaptic activity; ii) hormones, JH and ecdysone; iii) nutritional control; iv) oxidative stress; v) life span; vi) immune defense. These classes match perfectly the phenotypes described above. Furthermore a significant fraction of these genes are similarly affected by the mutation of chm and by the inactivation of CA-LPs and IPCs neurons.

La dépression est fréquente, sa prise en charge difficile et les connaissances de sa physiopathologie très incomplètes. Il est établi qu’il existe une composante familiale et héréditaire au trouble dépressif mais le substrat biologique de cette vulnérabilité est inconnu et souvent les études souffrent d’un manque de reproductibilité. Par ailleurs, il n’existe pas de bio-marqueur validé utilisable en pratique courante.Nous proposons dans ce travail de thèse d’explorer les ARN périphériques chez les patients souffrant de dépression de façon à explorer s’ils peuvent définir des bio-marqueurs et si leur étude peut nous permettre de mieux comprendre le processus physiopathologique.Nous avons recruté des patients souffrant de dépression sévère dans plusieurs études pour répondre à nos objectifs. Nous avons été attentif dans ces études à des problèmes méthodologiques importants, en particulier à propos du choix des gènes de contrôle pour les PCR en temps réel, du choix de critères statistiques dans l’étude pan-génomique et de la prise en compte de prélèvements répétés chez les sujets sains pour contrôler toute variation due à des facteurs non contrôlés. En accord avec une abondante littérature sur le sujet, nous avons pu mettre en évidence des gènes déjà décrits dont l’expression transcriptionnelle est dérégulée chez les patients par rapport aux sujets contrôles ou au cours de l’évolution de la dépression, dans des études centrées sur des gènes candidats et une étude pan-génomique.Nous avons pu également mettre en évidence de façon nouvelle l’expression dérégulée chez les patients déprimés de gènes impliqués dans la régulation chromatinienne ou l’expression des gènes.Nous avons également pu nous rendre compte que les approches pan-génomiques complétaient l’approche gène candidat avec une meilleure convergence que ne le laissait supposer la littérature.Nous avons également étudié les micro-ARN et mis en évidence qu’un certain nombre d’entre eux étaient des marqueurs traits ou des marqueurs liés à l’état au cours de la dépression.L’ensemble des données issues de notre étude pan-génomique et de notre étude sur les micro-ARN montre qu’il existe des interactions probables entre les micro-ARN et les ARNm dérégulés et ces données confirment le rôle possible des gènes régulant la chromatine ou l’expression des gènes dans la dépression.Enfin, l’étude des variabilités inter- et intra-individuelles de l’expression génétique confirme l’absence d’altération globale de la transcription au cours de la dépression et souligne l’importance d’un ensemble de molécules régulant la transcription dont l’expression est contrainte c’est à dire très peu variable d’un individu à l’autre et d’un moment à l’autre chez un même sujet.Si nous n’avons pas pu mener une étude validant des marqueurs biologiques, nos résultats ouvrent la voie à l’exploration à plus grande échelle de ces marqueurs potentiels comme à l’étude d’hypothèses originales sur la physiopathologie de la dépression. / Major depression is a frequent and severe disease whose treatment is often inconsistent and patients care remains insufficient. Despite some hypothesis which implicate mono-amine and genetic factors, the pathophysiology of major depression remains unclear. Moreover, no biological marker is available in current clinical practice.Our work aims to propose methodological tools and offers preliminary results to develop such biological markers by studying gene expression in peripheral blood mononuclear cells from severe depressive patients and sex and age-matched controls in different comparative prospective studies. Candidate gene and pangenomic approaches were combined. Moreover, we explored for the first time human microRNA transcription variation in major depression by multiplex RT-qPCR.Among our main findings, we demonstrate that some well-known candidate gene such as serotonin transporter mRNA could be interesting biomarkers of major depression evolution or prognosis. In addition, pangenomic study highlights the implication of genes related to chromatin structure and gene expression regulation like histone family. We also identified variations in the expression of a set of microRNAs during a major depressive episode and, with in silico approaches, we propose putative functional interactions between candidate miRNAs and mRNAs.Overall, our work underlines the feasibility and the relevance of studying the level of expression of RNAs in a psychiatric disorder using peripheral tissues. We obtained both convergent and novel results in regard to previous investigations opening the way to better knowledge of major depression pathophysiology as well as biomarkers development.

Le remodelage de la chromatine et la modification des histones jouent des rôles très importants dans l’établissement et la reprogrammation de l’état de l’expression génique. Il reste largement inconnu concernant les mécanismes de la régulation de ces processus chromatiniens dans le contrôle de l’expression génique impliquée dans le développement de la plante et son adaptation à l’environnement. Mon sujet de thèse se focalise sur l’analyse fonctionnelle d’un facteur de remodelage de la chromatine de type Chromodomain/Hélicase/DNA-binding 1 (CHD1) d’Arabidopsis, appelé CHR5 et une histone démethylase qui est spécifiquement impliquée dans la démethylation de l’histone H3 lysine 4 (H3K4), appelée JMJ15. Dans la première partie de cette étude, nous avons montré que le gène CHR5 est activé au cours de l’embryogénèse et que son expression se maintient élevé dans les tissues/organes en développement. L’analyse de mutants révèle que la perte de fonction de ce gène fait réprimer l’expression de gènes régulateurs de la maturation de l’embryon tels que LEC1, ABI3 et FUS3 pendant le développement des graines, et fait baisser l’accumulation des protéines de réserve. L’analyse de double mutants a permis de démontrer une fonction antagoniste entre CHR5 et PKL, une protéine du groupe « CHD3 », dans l’activité du promoteur de gènes régulateurs du développement de l’embryon et l’accumulation de réserve de graine. Nous avons montré que la protéine CHR5 s’associe directement avec les promoteurs d’ABI3 et FUS3 et que la mutation du gène CHR5 conduit à l’augmentation de présence de nucléosome dans la région du départ de transcription. Ces résultats suggèrent que CHR5 est impliquée dans le positionnement de nucléosome pour stimuler l’expression de gènes de la maturation de l’embryon, ce qui est contrebalancé par l’action de PKL au cours du développement de l’embryon. La deuxième partie de cette étude a permis de montrer que l’expression du gène de l’histone démethylase JMJ15 manifeste une forte spécificité tissulaire. L’analyse de mutants du gène a permis de l’identification de 2 allèles de gain de fonction (avec surexpression du gène), et un allèle de perte de fonction. La surexpression du gène réduit la croissance d’hypocotyle et de tige de la plante avec accumulation de lignine dans la tige, mais le perte de fonction du gène ne produise pas de phénotype apparent. Par ailleurs, la surexpression du gène renforce la tolérance de la plante au stress salin, alors la perte de fonction du gène rend la plante plus sensible. L’analyse du transcriptome a révélé beaucoup plus de gènes réprimés qu’activés par la surexpression du gène JMJ15. Ces gènes réprimés sont préférentiellement marqué la H3K4me2 ou H3K4me3, parmi lesquels beaucoup codent de facteurs de transcription. Ces données suggèrent que l’induction de JMJ15 pourrait réguler le programme de l’expression génique qui coordonne la restriction de la croissance de la plante et la tolérance au stress. Ces travaux de thèse a permis ‘identifier quelques nouveaux éléments dans la compréhension de la fonction de régulateurs chromatiniens dans l’expression génique de la plante. / Chromatin remodeling and histone modification play important roles in the establishment and dynamic regulation of gene expression states. However, little is known regarding to the regulatory mechanism of chromatin modification and remodeling that control gene expression involved in plant development and responses to environmental cues. My thesis work concerns functional analysis of an Arabidopsis Chromodomain/Helicase/DNA-binding 1 (CHD1) type chromatin remodeling gene known as CHR5 and a histone demethylase gene that specifically removes methyl groups from methylated histone H3 lysine 4 (H3K4me), called JMJ15 in regulating chromatin structure or in resetting chromatin modifications that control the expression of plant developmental and stress responsive genes. In the first part of the study we found that CHR5 expression is activated during embryogenesis and remained to be expressed in developing organs/tissues. Analysis of mutants revealed that loss-of-function of the genes led to decreased expression of key embryo maturation genes LEC1, ABI3 and FUS3 in developing seeds and reduced seed storage protein accumulation. Analysis of double mutants revealed an antagonistic function between CHR5 and PKL, a CHD3 gene, in embryo gene promoter activity and seed storage protein accumulation. CHR5 was directly associated with the promoters of ABI3 and FUS3 and chr5 mutations led to increased nucleosome occupancy near the transcriptional start site. The results suggest that CHR5 is involved in nucleosome occupancy to regulate embryo identity genes expression, which is counterbalanced by PKL during embryo development. The second part of this study showed that expression of JMJ15 was restricted to a few tissues during vegetative growth. The jmj15 gain-of-function mutations reduced the length of seedling hypocotyls and inflorescence stems with higher accumulation of lignin in the stem, while the loss-of-function mutants did not show any visible phenotype. The gain-of-function mutants enhanced salt tolerance, whereas the loss-of-function mutants were more sensitive to salt. Transcriptomic analysis revealed a much higher number of genes down-regulated in JMJ15 over-expression plants, which are highly enriched for H3K4me3 and H3K4me2. Among the down-regulated genes, many encode transcription regulators of stress responsive genes. The data suggest that increased JMJ15 levels may regulate the gene expression program that may coordinate plant growth restrains and enhances stress tolerance. Taken together, my thesis work brought a few new elements to the current understanding of chromatin regulators function in plant gene expression.

La schistosomiase représente actuellement la seconde endémie parasitaire mondiale après le paludisme. Annuellement, cette pathologie est responsable de 280 000 décès et 700 millions d’individus y sont exposés dans 74 pays à travers le monde. Actuellement, le traitement de la schistosomiase repose sur l’utilisation d’un seul médicament, le Praziquantel®. Ainsi, le développement de nouveaux médicaments est devenu une priorité absolue pour l’OMS. Dans cette étude, notre objectif a été d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de développer de nouveaux précurseurs de médicaments. Au cours de ce projet, nous avons focalisé nos recherches sur les enzymes impliquées dans la modification des histones et plus particulièrement sur les sirtuines, qui sont des lysines désacétylases NAD+ dépendantes.Dans une première partie, nous avons caractérisé 5 orthologues de sirtuines de mammifères chez Schistosoma mansoni (SmSirt1, 2, 5, 6 et 7). De plus, nous avons étudié le potentiel des sirtuines comme cibles thérapeutiques pour le traitement de la schistosomiase en évaluant la toxicité d’inhibiteurs génériques de sirtuines humaines sur des parasites maintenus en culture. Ainsi, nous avons montré que les inhibiteurs de sirtuines humaines affectent in vitro la viabilité des schistosomules ainsi que la stabilité de l’accouplement et la production d’oeufs des vers adultes. De plus, ces inhibiteurs induisent des changements morphologiques de l’appareil génital du ver femelle.Dans une seconde partie, nous avons entrepris d’étudier plus spécifiquement le rôle de SmSirt2 en tant que cible thérapeutique. Ainsi, l’expression de la protéine recombinante en bactérie E. coli (collaboration: C. Romier, IGBMC, Illkirch) ainsi que l’optimisation d’un dosage fluorimétrique nous ont permis de montrer que SmSirt2 présente une activité lysine désacétylase in vitro (collaboration: M. Jung, Université Albert-Ludwigs, Freibourg). De plus, l’utilisation de ce dosage nous a permis de mettre en place le criblage à haut débit d’une chimiothèque de plus de 80 000 composés afin d’identifier de nouvelles molécules inhibitrices de l’enzyme SmSirt2 (collaboration: J. Schultz, Kancera AB, Stockholm). Les composés les plus prometteurs, ont été testés in vitro sur des parasites en culture. Les résultats obtenus démontrent que les inhibiteurs de SmSirt2 affectent également la viabilité des schistosomules ainsi que la stabilité de l’accouplement et la production d’oeufs des vers adultes.Dans une dernière partie, nous avons mis en place un criblage d’une banque d’ADNc de vers adultes par la technique du double hybride en levure dans le but d’identifier les partenaires protéiques de Sirt1 chez S. mansoni. L’analyse partielle des résultats nous a permis de mettre en évidence que SmSirt1 interagit avec plusieurs protéines impliquées dans la régulation des gènes chez le schistosome. Au cours de ce projet, nous avons également développé et optimisé un protocole permettant d’étudier l’activité enzymatique de SmSirt1 par injection d’ARNm dans des ovocytes de Xénope. Ainsi, nous avons pu montrer que le sirtinol et la salermide, deux inhibiteurs de Sirt1 humaine, présentent également une activité inhibitrice sur l’enzyme du parasite (collaboration: K. Cailliau, Université des Sciences et Technologies, Lille).L’ensemble des résultats obtenus au cours de ce projet de thèse suggère que les sirtuines sont des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de la schistosomiase. Parmi les 5 orthologues identifiés chez S. mansoni, SmSirt2 semble une cible prometteuse. De plus, le criblage à haut débit que nous avons réalisé sur l’enzyme recombinante a permis d’identifier des molécules qui, après bio-optimisation, pourront être des candidats médicaments. Pour finir, ces résultats participent à une meilleure compréhension du rôle biologique des sirtuines chez S. mansoni et plus particulièrement sur leur implication dans la survie et la reproduction du parasite. / Schistosomiasis is the second most important parasitic disease worldwide after malaria. It is responsible for about 280 000 deaths annually and 700 million people in 74 countries are exposed to infection. Treatment of schistosomiasis currently depends on the use of the only available drug, praziquantel, and for this reason the development of new drugs is a strategic priority of the W.H.O. In this study, our objective was to identify novel therapeutic targets in order to develop new lead molecules for drug development. During this project we have focused our research on enzymes involved in histone modification, and more particularly on sirtuines, which are NAD+-dependent lysine deacetylases.In the first part of the project, we have identified 5 homologues of mammalian sirtuins in Schistosoma mansoni (SmSirt1, 2, 5, 6 and 7). Moreover, we studied the potential of sirtuins as therapeutic targets for the treatment of schistosomiasis by evaluating the toxicity for parasites maintained in culture of generic inhibitors of human sirtuins. In this way we showed that these inhibitors affect the viability of schistosomula and the stability of pairing and egg production of adult worms. Moreover, these inhibitors caused major morphological changes, particularly to the female worm genital apparatus.A second part of our work was devoted to the more detailed study of SmSirt2 as a therapeutic target. Immunisation of mice with the recombinant protein allowed us to obtain specific antibodies and to show that SmSirt2 protein is expressed at all parasite developmental stages. Furthermore, the use of the recombinant SmSirt2 expressed in E. coli (collaboration: C. Romier, IGBMC, Illkirch) and the optimization of a fluorimetric assay allowed us to show that SmSirt2 possesses a lysine deacetylase activity (collaboration: M. Jung, University Albert-Ludwigs, Freibourg). Moreover, the use of this assay allowed the setting up of a high-throughput screen (collaboration: J. Schultz, Kancera AB, Stockholm) of more than 80 000 compounds in order to identify novel inhibitors. The most promising candidates were tested on parasites in culture and the results obtained showed that SmSirt2 inhibitors also affect the viability of schistosomula, as well as the stability of pairing and egg production of adult worms.In parallel, we have carried out screening of a yeast two-hybrid cDNA library in order to identify protein partners of Sirt1 in S. mansoni. The partial analysis of the results obtained shows that SmSirt1 interacts with several proteins involved in gene regulation. In the course of this project, using the enzyme expressed in Xenopus oocytes we were able to show that both sirtinol and salermide, inhibitors of human Sirt1, also inhibit the schistosome enzyme (Collaboration: K. Cailliau, University of Sciences and Technologies, Lille).Taken together, the results of this thesis project suggest that sirtuins are potential therapeutic targets for the treatment of schistosomiasis. Of the five orthologues of human sirtuins identified in S. mansoni, SmSirt2 seems to be a promising target. Moreover, high-throughput screening using the recombinant enzyme identified inhibitors that, after bio-guided optimization, could be drug candidates. Finally, these results contribute to a better understanding of the biological role of S. mansoni sirtuins and in particular their importance in parasite survival and reproduction.

Chez le cilié Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par la délétion massive et reproductible d'éléments transposables et de 45 000 courtes séquences en copie unique dispersées sur l'ensemble du génome. Des petits ARN non codants produits par la lignée germinale, les scanARN, sont impliqués dans la régulation épigénétique des délétions d'ADN mais les mécanismes sous-jacents sont peu compris. Nous avons montré que la triméthylation de H3 (H3K27me3 et H3K9me3) présente une localisation dynamique pendant le développement du noyau somatique qui est altérée si l'endonucléase requise pour les événements d'élimination d'ADN est déplétée. Nous avons identifié une histone méthyltransférase, Ezl1p, nécessaire à la méthylation de H3 et requise pour les réarrangements du génome. Des analyses à l'échelle du génome entier ont montré que Ezl1p et les scanARN sont nécessaires à l'élimination des longues séquences germinales répétées tandis que les courtes séquences uniques présentent des sensibilités différentes à la déplétion de ces facteurs. Des déterminants cis tels que la longueur de l'ADN à éliminer peuvent contribuer à définir les séquences délétées. Dans une seconde étude, nous avons montré que chez Paramecium, la fonction centromérique est restreinte aux chromosomes germinaux. Un processus d'inactivation des centromères se produit pendant le développement du noyau somatique. L'endonucléase requise pour la délétion des séquences germinales est nécessaire pour l'inactivation des centromères suggérant fortement que l'inactivation des centromères germinaux repose sur l'élimination physique de l'ADN centromérique. / In the ciliate Paramecium tetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome is characterized by massive and reproducible deletion of transposable elements and of 45,000 short, dispersed, single-copy sequences. A specific class of small RNAs produced by the germline during meiosis, the scnRNAs, are involved in the epigenetic regulation of DNA deletion but the underlying mechanisms are poorly understood. We showed that trimethylation of histone H3 (H3K27me3 and H3K9me3) displays a dynamic nuclear localization that is altered when the endonuclease required for DNA elimination is depleted. We identified the histone methyltransferase Ezl1p responsible for H3 methylations establishment and showed that it is required for correct genome rearrangements. Genome-wide analyses showed that scnRNA-mediated H3 methylation is necessary for the elimination of long, repeated germline DNA, while single copy sequences display differential sensitivity to depletion of the scnRNA pathway or Ezl1p. Our study reveals cis acting determinants such as DNA length that may contribute to define the deleted germline sequences. In a second study, we showed that in Paramecium cells, the centromeric function is restricted to the germline chromosomes. A process of centromere inactivation occurs during the development of the somatic lineage, concomitantly with the events of DNA elimination. Our genetic analyses show that the endonuclease required for DNA elimination and Ezl1p but not the scnRNA are necessary for centromere inactivation. Our data strongly suggest that centromere inactivation relies on the physical elimination of the centromeric sequences from the somatic genome.

De nombreuses altérations épigénétiques ont été décrites dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Nous avons récemment mis en évidence un enrichissement anormal en la marque histone H3K27me3, située sur 70 kb du cluster HIST1 (6p22) dans 50% des échantillons de patients atteints d'une LAM avec un caryotype normal (CN). Nous étudions dans ce travail, les conséquences cliniques et moléculaires de cette marque. H3K27me3 HIST1high est associé à 1) une meilleure survie des patients en analyse multivariée 2) la sous-expression du mRNA de plusieurs gènes histones (HIST1H1D, HIST1H2BG et HIST1H2BH) 3) un enrichissement fonctionnel en gènes associés à la réponse immunitaire ou inflammatoire, en faveur d’un engagement dans la différenciation granulocytaire, surexprssion confirmée pour trois de ces gènes (CYBB, FCN1 et CLEC4A) par RT-qPCR dans les blastes de patients H3K27me3 HIST1high 4) une diminution de la quantité absolue de protéine histone linker H1d par spectormétrie de masse et par Western blot et 5) une meilleure sensibilité à la différenciation induite par l'acide rétinoïque dans la lignée OCI-AML3 avec un KD de H1d (augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation CD11B et CD11C, présence de granules intra-cytoplasmiques et expression des gènes CYBB et ITGAM). En conclusion, le biomarqueur H3K27me3 HIST1high est associé à une meilleure survie dans les LAM-CN NPM1mut, un phénotype plus différencié des blastes et une sous-expression génique et protéique de certains histones incluant le sous-type histone linker H1d. H1d semble être important dans la différenciation des blastes de LAM NPM1mut et pourrait constituer une cible thérapeutique. / The epigenetic machinery is frequently altered in acute myeloid leukemia (AML). We previously described an abnormal histone H3K27me3 repressive enrichment covering 70 kb on the HIST1 cluster (6.p22). In the present work, we further studied the medical significance and the molecular impact of this new epigenetic biomarker. We observed that H3K27me3 HIST1high is associated with 1) a better patients' outcome in multivariate analysis, 2) a lower histone mRNA expression of several histone genes (HIST1H1D, HIST1H2BG and HIST1H2BH), 3) a mature granulocytic gene expression profile including immune or inflammatory responsive genes, (we confirmed the higher expression of three of these genes, CYBB, FCN1 and CLEC4A, using qPCR in the H3K27me3 HIST1high patients' samples), 4) a decrease in histone linker H1d absolute protein abundance by Mass spectrometry and by Western blot analyses and 5) a better retinoic acid sensitization of the H1d KD OCI-AML3 cell line (i.e. increase of CD11B and CD11C expression on cell surface, higher percentage of cytoplasmic granules and mRNA up-expression of two mature granulocytic genes, CYBB and ITGAM). To conclude, this study showed that epigenetic silencing of the HIST1 locus by the H3K27me3 mark is associated with a better outcome, but also a mature gene expression profile in the NPM1mut subgroup of patients. We suggested that H1d has an important role of histone linker expression in AML blast cell differentiation. This protein could constitute a new epigenetic target.

Wong Yue Hang Albert. / Thesis submitted in: December 2005. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2006. / Includes bibliographical references (leaves 108-119). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.i / Acknowledgements --- p.v / List of Figures --- p.x / List of Tables --- p.xi / Chapter Chapter 1 --- Introduction --- p.1 / Chapter Chapter 2 --- Literature Review --- p.4 / Chapter 2.1 --- Nasopharyngeal Carcinoma (NPC) --- p.4 / Chapter 2.1.1 --- Anatomy of Nasopharynx --- p.4 / Chapter 2.1.2 --- Histopathology of Nasopharyngeal Carcinoma --- p.5 / Chapter 2.1.3 --- Epidemiology and Etiology of Nasopharyngeal Carcinoma --- p.5 / Chapter 2.1.3.1 --- Endemic Regions of Nasopharyngeal Carcinoma --- p.5 / Chapter 2.1.3.2 --- Gender and Age Bias --- p.6 / Chapter 2.1.3.3 --- Nasopharyngeal Carcinoma in Hong Kong --- p.6 / Chapter 2.1.3.4 --- Environmental Factors and Diet --- p.7 / Chapter 2.1.3.5 --- HLA Haplotypes and Nasopharyngeal Carcinoma --- p.9 / Chapter 2.1.4 --- Epstein-Barr Virus (EBV) and Nasopharyngeal Carcinoma --- p.10 / Chapter 2.1.4.1 --- EBV and Human Cacners --- p.10 / Chapter 2.1.4.2 --- EBV Infection --- p.10 / Chapter 2.1.4.3 --- "Latent, Clonal EBV Infection" --- p.11 / Chapter 2.1.4.4 --- EBV Latency Form --- p.11 / Chapter 2.1.4.5 --- Reactivation of EBV --- p.12 / Chapter 2.1.5 --- Molecular Pathogenesis of Nasopharyngeal Carcinoma --- p.13 / Chapter 2.1.5.1 --- Genetic Changes --- p.13 / Chapter 2.1.5.2 --- Epigenetic Changes --- p.13 / Chapter 2.1.6 --- Therapy of Nasopharyngeal Carcinoma and its Deficiency --- p.14 / Chapter 2.1.6.1 --- Radiotherapy --- p.14 / Chapter 2.1.6.2 --- Concurrent Chemoradiotherapy --- p.16 / Chapter 2.1.6.3 --- Adjuvant and Neo-adjuvant Chemotherapy --- p.17 / Chapter 2.1.6.4 --- Chemotherapy in Metastatic Nasopharyngeal Carcinoma --- p.18 / Chapter 2.1.6.5 --- Novel Therapeutic Agents and Approach --- p.19 / Chapter 2.2 --- Histone Modification and Cancer --- p.20 / Chapter 2.2.1 --- Histone Modification and Transcription Regulation --- p.20 / Chapter 2.2.2 --- Carcinogenic Effect of Aberrant HAT and HDAC Activities --- p.21 / Chapter 2.2.3 --- Structural Classes of HDAC Inhibitors --- p.24 / Chapter 2.2.4 --- Anti-Cancer Mechanisms of HDAC Inhibitors --- p.25 / Chapter 2.3 --- Suberoylanilide Hydroxamic Acid (SAHA) --- p.27 / Chapter 2.3.1 --- Anti-tumor Effect of SAHA in Various Cancer Cell Lines --- p.27 / Chapter 2.3.2 --- SAHA Mediated Non-apoptotic Programmed Cell Death --- p.29 / Chapter 2.3.3 --- Anti-tumor and Preventive Effect of SAHA in Animal Model --- p.29 / Chapter 2.3.4 --- Clinical Trials of SAHA --- p.30 / Chapter 2.4 --- FK228 (Depsipeptide or FR901228) --- p.31 / Chapter 2.4.1 --- Anti-malignancy mechanism of FK228 --- p.31 / Chapter 2.4.2 --- Anti-angiogenesis --- p.32 / Chapter 2.4.3 --- Drug Resistance and FK228 --- p.33 / Chapter 2.4.4 --- Studies of FK228 on Animal Models --- p.33 / Chapter 2.4.5 --- Clinical Trials --- p.34 / Chapter 2.5 --- Histone Modification and Nasopharyngeal Carcinoma --- p.34 / Chapter Chapter 3 --- Materials and Methods --- p.36 / Chapter 3.1 --- Cell Lines --- p.36 / Chapter 3.2 --- EBER ish Hybridization (EBER ISH) --- p.37 / Chapter 3.3 --- HDAC Inhibitors --- p.38 / Chapter 3.4 --- Cellular Sensitivity of NPC Cell Lines to HDAC Inhibitors --- p.38 / Chapter 3.4.1 --- Drug Treatment --- p.38 / Chapter 3.4.2 --- Determining Relative Amount of Survival Cells (WST-1 Assay) --- p.39 / Chapter 3.5 --- Flow Cytometry Analysis --- p.40 / Chapter 3.5.1 --- Collecting Cells and Fixation --- p.40 / Chapter 3.5.2 --- Staining --- p.41 / Chapter 3.5.3 --- Flow Cytometry Analysis --- p.41 / Chapter 3.6 --- Protein Extraction --- p.41 / Chapter 3.6.1 --- Harvesting Samples --- p.41 / Chapter 3.6.2 --- Protein Extraction --- p.42 / Chapter 3.6.3 --- Protein Quantification --- p.42 / Chapter 3.7 --- Western Blotting --- p.43 / Chapter 3.7.1 --- SDS-Polyarcylamide Gel Electrophoresis (PAGE) (SDS-PAGE) --- p.43 / Chapter 3.7.2 --- Wet Transfer of Proteins --- p.43 / Chapter 3.7.3 --- Immunoblotting --- p.44 / Chapter 3.7.4 --- Signal Detection --- p.44 / Chapter 3.8 --- CodeLin´kёØ Oligonucleotide Microarray --- p.45 / Chapter 3.8.1 --- HDAC Inhibitor Treatment --- p.45 / Chapter 3.8.2 --- RNA Extraction --- p.45 / Chapter 3.8.3 --- Quality and Quantity Assessment of Total RNA Extracted --- p.46 / Chapter 3.8.4 --- CodeLinkIM Expression Bioarray System --- p.46 / Chapter 3.8.5 --- Data Analysis --- p.48 / Chapter 3.9 --- Real-time Reverse Transcription PCR (Real-time RT-PCR) --- p.48 / Chapter Chapter 4 --- Results --- p.50 / Chapter 4.1 --- Presence of EBV --- p.50 / Chapter 4.2 --- Anti-prolirative Effect of HDAC Inhibitors --- p.52 / Chapter 4.3 --- Histone Acetylation --- p.56 / Chapter 4.4 --- Induction of p21 Expression in NPC Cell Lines --- p.58 / Chapter 4.5 --- HDAC Inhibitors Induced Cell Cycle Arrest and Polyploidy Formation --- p.60 / Chapter 4.5.1 --- Trichostatin A Induced G2/M Arrest --- p.60 / Chapter 4.5.2 --- Suberoylanilide Hydroxamic Acid Induced G1 Arrest --- p.62 / Chapter 4.5.3 --- FK228 Mediated G2/M Arrest --- p.64 / Chapter 4.6 --- HDAC Inhibitors Altered the Expression of Cell Cycle Regulatory Proteins --- p.66 / Chapter 4.6.1 --- TSA Down-regulated Cyclin A and B --- p.66 / Chapter 4.6.2 --- Suppressed Expression of Cyclin D1 and B by SAHA --- p.69 / Chapter 4.6.3 --- Effect of FK228 on Expression of Different Cyclins in NPC Cell Lines --- p.71 / Chapter 4.7 --- Effect of HDAC Inhibitors on EBV Proteins --- p.73 / Chapter 4.8 --- HDAC Inhibitors Modulated Gene Expression Profile --- p.76 / Chapter 4.8.1 --- SAHA and FK228-Induced Gene Expression Profile --- p.76 / Chapter 4.8.2 --- Validation of Expression Profile of Selected Genes by Real-time RT-PCR --- p.83 / Chapter Chapter 5 --- Discussion --- p.87 / Chapter 5.1 --- Anti-proliferative Effect of SAHA and FK228 on NPC Cell Lines --- p.88 / Chapter 5.2 --- Resistance of SAHA or FK228 in NPC --- p.93 / Chapter 5.3 --- Growth Inhibitory Mechanism of SAHA and FK228 in NPC Cells --- p.94 / Chapter 5.4 --- Induction of Polyploidy Cells in NPC Cell Lines --- p.98 / Chapter 5.5 --- Does EBV play a Role in HDAC Inhibiotrs Induced Growth Arrest in NPC Cell Lines? --- p.99 / Chapter 5.6 --- Transcriptional Signature of SAHA and FK228 in NPC Cell Lines --- p.100 / Chapter 5.7 --- Combining SAHA or FK228 with other Anti-tumor Agents --- p.104 / Chapter 5.8 --- Future Prospectus --- p.105 / Chapter Chapter 6 --- Summary --- p.106 / References --- p.108 / Appendix 1 --- p.120 / Appendix 2 --- p.121

Epigenetic modifications are alterations in the cell nucleus that affect gene expression and can occur in chromatin at the level of DNA methylation or histone modifications. Such ‘epigenetic marks’ can be heritable through cell division but leave the DNA sequence unchanged. Post-­translational modifications can be found on the histone proteins associated with DNA; the majority of histone modifications are found on the lysine-­rich N-‐terminal amino acid “tails”. Histone acetylation and methylation influence the chromatin structure by loosening or tightening the packaging of DNA, respectively, in association with other chromatin modifiers. Condensed chromatin is linked to transcriptional silencing and genetic imprinting and also occurs at chromosomal centromeres, where it is linked to kinetochore binding. Heart development is well studied, but the epigenetic processes involved are not yet completely understood. While active chromatin mechanisms such as histone acetylation and chromatin remodelling have been described in the heart, the role of gene repressive epigenetic mechanisms has been poorly investigated. Cardiomyocytes are post-­mitotic cells that do not divide to regenerate a damaged heart. The regeneration of cardiomyocytes after myocardial infarction is an important topic of interest in cardiovascular science. There are various approaches to heart repair after infarction, including activating cardiomyocytes so they become mitotic once again, or growing cardiomyocytes in vitro to attach to a lesion site. An important factor in these approaches is understanding the epigenetic mechanisms controlling cell division. In this thesis, we aim to advance the current knowledge of the epigenetic repressive mechanisms involved in cardiomyocyte formation and heart development to explain their lack of regenerative capacities. We studied the epigenetic changes that occur during cardiac development leading to a non-­‐regenerative state to pinpoint the moment at which these changes arise. We found that the epigenetic process is independent of whether cardiac lineage differentiation occurs during embryogenesis or during differentiation in vitro. We discovered that cardiac heterochromatin displays a singular epigenetic signature during development as compared to brain, another post-­mitotic tissue, or liver, an actively regenerative tissue. We observed an epigenetic change in the repressive histone modification histone H3 lysine 9 trimethylation that was specific to heart development. This change involved a nuclear reorganisation of heterochromatin and a reduction of the levels of this mark in E13.5 and E14.5 embryos, as compared to E10.5 embryos. This was consistent with our observations of the histone lysine methyltransferase SUV39H1, the levels of which were lower after stage E10.5 of development. However, contradictorily, in differentiated cardiomyocytes in vitro, SUV39H1 was increased but showed low levels of H3K9me3, compared to ES cells, which had low levels of SUV39H1 and high levels of H3K9me3. We detected extremely low levels of the H3K9me3 in adult heart tissue. We observed that in adult hearts, the myocardium had maintained these major changes in H3K9me3, while this effect was not observed in the epicardium. Genomic studies were carried out to determine changes at a genomic level between the two key epigenetic stages in heart development we identified at E10.5 and E13.5. Methylated DNA immunoprecipitation sequencing and chromatin immunoprecipitation sequencing for H3K9me3 analyses were carried out to find overall changes in methylation patterns. No global changes in DNA methylation were detected between these developmental stages. These results imply that the differences observed in H3K9me3 are due to remodelling of the heterochromatin during heart development and cardiomyocyte formation, rather than quantitative changes.