O objetivo deste trabalho foi determinar a eficiência do LH suíno, em dosagens reduzidas em relação à dose tradicional de 5,0mg, no processo de sincronização da ovulação em fêmeas cíclicas. Foram tratadas 115 fêmeas das raças Landrace e Large White, com ordem de parto variando de 1 a 6 e escore corporal acima de 2 dentro de uma escala de 1-5, com variação de meio ponto. A detecção do cio foi realizada duas vezes ao dia, no início da manhã e no final da tarde, através do reflexo positivo de tolerância ao macho. As fêmeas foram divididas aleatoriamente em três tratamentos, com 600UI de eCG ao desmame e 2,5 (T1), 1,25 (T2) e 0,625mg (T3) de LH, 56 horas após a injeção de eCG. O grupo controle não recebeu a administração de LH. A ocorrência da ovulação foi determinada pela ultra-sonografia trans-retal. Os dados foram reavaliados de acordo com o número de inseminações em 1 e 2 inseminações. As fêmeas foram abatidas 96 horas após a ovulação, com a finalidade de proceder com a contagem do número de corpos lúteos e a colheita de embriões. O intervalo entre a aplicação do LH e a ocorrência da ovulação (IA-OV), nos três tratamentos foi de 41,0±5,9, 56,0±17,0, 58,2±18,8 respectivamente e 62,9±14,8 para o grupo controle. A melhor sincronização da ovulação (p<0,05, teste de Bartlett), ocorreu no T1, o qual corresponde a dose de LH de 2,5mg. Os resultados quanto ao número de inseminações, taxa de fertilização e viabilidade embrionária, não diferiram estatisticamente entre os tratamentos, porém, quando o intervalo (IA-OV) foi maior que 24 horas, a taxa de fecundação e viabilidade embrionária sofreram uma diminuição em comparação com os intervalos menores do que 24 horas (p<0,05). Os protocolos hormonais não influenciaram quanto ao número de cistos ovarianos (p<0,05, teste de Tukey). Conclui-se que a utilização da dose de LH de 2,5mg sincroniza a ovulação e pode ser aplicada em programas de IATF e que a realização de 1 inseminação artificial até 24 horas antes da ovulação em tempo fixo não deprecia a taxa de fecundação e o número de embriões viáveis / This work had as purpose the determination of the efficiency of the LH swine, in reduced dosage against the traditional 5,0mg dose, in the process of synchronization of the ovulation in cyclical females. There were treated 115 females of Landrace and Large White races, with average parity number varying from 1 to 6 and corporal sustain above 2 among 1 to 5 scale, with variation of half point. The detection of the heat was accomplished twice a day, in the beginning of the morning and at the end of the afternoon, through the positive reflex of tolerance to the male. The females were randomly divided in three treatments, with 600UI of eCG by the weaning and 2,5 (T1), 1,25 (T2) and 0,625mg (T3) of LH, 56 hours after the eCG injection. The control group didn\'t receive the LH administration. The occurrence of the ovulation was determined by the trans-rectal ultrasonography. The data were revalued according to the number of inseminations in 1 and 2 inseminations. The females were slaughtered 96 hours after the ovulation, with the purpose of proceeding with the counting of the number of corpora lutea and the recovered embryos. The interval between the LH application and the occurrence of the ovulation (IA-OV), in the three treatments was of 41,0±5,9, 56,0±17,0, 58,2±18,8 respectively and 62,9±14,8 for the control group. The best ovulation synchronization (p <0,05, test of Bartlett) happened in T1, which corresponds to the LH 2,5mg dose. The results concerning the number of inseminations, fertilization rate and embryonic viability, didn´t differ statistically among the treatments, however, when the interval (IA-OV) was over 24 hours, the fecundation rate and embryonic viability decreased if compared with the intervals shorter than 24 hours (p<0,05). The hormonal protocols didn´t cause influence as to the ovarian cysts number (p<0,05, test of Tukey). It´s conclusive that the use of the LH 2,5mg dose synchronizes the ovulation and it can be applied in IATF programs, and that accomplishment of 1 artificial insemination up to 24 hours before the ovulation in fixed time doesn´t depreciate the fecundation rate and the number of viable embryos

O Hormônio Juvenil (HJ) é um sesquiterpenóide que participa de diversas funções do ciclo de vida de insetos. Em Apis mellifera o HJ está envolvido também com o processo de diferenciação de castas e polietismo etário. Neste trabalho, genes participantes da degradação e das vias de síntese do HJ nos corpora allata (CA) foram identificados a partir das seqüências disponibilizadas pelo sequenciamento do genoma de A. mellifera. A identificação destes genes baseou-se em análises funcionais, como interferência por RNA fita dupla, similaridade entre seqüências, expressão tecido-específica e busca por motivos conservados. Análises de quantificação dos transcritos destes genes revelaram padrões condizentes com os títulos de HJ e mostraram que o balanço entre as vias de síntese e degradação deste hormônio age em conjunto para regular os títulos de HJ. Uma importante associação entre a degradação do HJ pelas enzimas esterase do HJ e epóxido hidrolase do HJ com o processo de diferenciação dos ovários, que ocorre durante o estágio larval, foi estabelecida. Estas enzimas parecem atuar ativamente na manutenção dos níveis de HJ durante o processo de diferenciação de castas. A alimentação mostrou ser um processo de suma importância sobre o metabolismo do HJ durante a vida adulta de operárias, em adição ao controle exercido pela alimentação já descrito durante o período larval, que leva à diferenciação de castas distintas. A execução deste trabalho contribuiu de maneira significativa para o conhecimento deste sistema instigante que controla toda a homeostasia em uma colônia do inseto social, Apis mellifera. / The sequisterpenoid, Juvenile Hormone (JH), is a key regulator in many aspects of insect life. In the Honey bee, Apis mellifera¸ JH is additionally involved in caste differentiation and also in age task performance during adult worker life. Herein, we identified genes coding to JH synthesis enzymes pathway in corpora allata and degradation in hemolymph and tissues based on sequences from Genome Sequencing Consortium. The identification of those genes involved functional assays as RNA interference, expression levels in specific tissues, search for functional motifs and also similarity among sequences. The results showed that a balance between synthesis and degradation occurs to the maintenance of hemolymph JH titers. An association between JH degradation by the enzymes, JH esterase and JH epoxide hydrolase, and ovary differentiation during larval stage was established. JH degradation showed to act together with the JH synthesis process to maintain the cast-specific titers of JH, which is essential to females development into castes. The nutrition status in Honey bee adult workers is an important mechanism controlling JH metabolism, in the same way it was observed previously for larvae development. The progress of this work contributed significantly to the knowledge of this amazing social insect life, A. mellifera.

As Doenças inflamatórias intestinais (DII) são multifatoriais e sua etiologia envolve susceptibilidade genética, fatores ambientais, disbiose e ativação exacerbada do sistema imunológico no intestino. Essas doenças também tem sido relacionadas a baixos níveis de dehidroepiandrosterona (DHEA), um hormônio precursor de diversos esteroides e relacionado à modulação das respostas imunes. Porém, os mecanismos precisos que relacionam as ações deste hormônio com a proteção ou susceptibilidade à doença de Crohn ou colite ulcerativa ainda não são totalmente conhecidos. Sendo assim, este projeto buscou entender o papel imunomodulador do DHEA exógeno in vitro e in vivo durante a inflamação intestinal experimental induzida por dextran sulfato de sódio (DSS) em camundongos C57BL/6. Inicialmente, in vitro, DHEA inibiu a proliferação de células do baço de forma dose dependente nas concentrações de 5?M, 50?M ou 100?M, com diminuição da produção de IFN-?. Este hormônio não foi tóxico para células de linhagem mieloide, embora tenha causado necrose em leucócitos nas doses mais elevada (50 ?M e 100?M), o que pode ter influenciado a diminuição das citocinas in vitro. Nos ensaios in vivo, os camundongos tratados com DHEA (40 mg/Kg) foram avaliados na fase de indução da doença (dia 6) e durante o reparo tecidual, quando os animais expostos ao DSS e ao DHEA por 9 dias foram mantidos na ausência destas drogas até o dia 15. Houve diminuição do escore pós-morte, melhora no peso e nos sinais clínicos da inflamação intestinal, com redução de monócitos no sangue periférico com 6 dias e aumento de neutrófilos circulantes na fase de reparo tecidual (15 dias). Ainda, a suplementação com DHEA levou à redução da celularidade da lâmina própria (LP) e ao restabelecimento do comprimento normal do intestino. O uso deste hormônio também diminuiu a expressão do RNAm de IL-6 e TGF-?, enquanto aumentou a expressão de IL-13 no colón dos animais durante a fase de indução da doença, o que provavelmente ajudou na atenuação da inflamação intestinal. Além disso, houve acúmulo de linfócitos CD4+ e CD8+ no baço e diminuição apenas de linfócitos CD4+ nos linfonodos mesentéricos (LNM), indicando retenção das células CD4+ no baço após uso do DHEA. O tratamento foi também capaz de aumentar a frequência de células CD4 produtoras de IL-4 e diminuir CD4+IFN-?+ no baço, além de reduzir a frequência de CD4+IL-17+ nos LNM, sugerindo efeito do DHEA no balanço das respostas Th1/Th2/Th17 relacionadas à colite. Em adição, as células de baço dos animais tratados com DHEA e expostos ao DSS se tornaram hiporresponsivas, como visto pela diminuição da proliferação após re-estímulos in vitro. Finalmente, DHEA foi capaz de atuar no metabolismo dos camundongos tratados, levando à diminuição de colesterol total e da fração LDL no soro durante a fase de indução da doença, sem gerar quaisquer disfunções hepáticas. Com isso, podemos concluir que o DHEA atua por meio do balanço das respostas imunes exacerbadas, minimizando os danos locais e sistêmicos causados pela inflamação intestinal induzida por DSS. / Inflammatory bowel diseases (IBD) are multifactorial diseases whose etiology involves genetic susceptibility, environmental factors, dysbiosis and exacerbated activation of the immune system in the gut. These diseases have also been associated to lower levels of dehydroepiandrosterone (DHEA), a precursor of various steroid hormones, related to modulation of immune responses. However, the precise mechanisms that link the actions of this hormone with protection or susceptibility to Crohn\'s disease or ulcerative colitis are still not fully understood. Thus, this project aimed to understand the immunomodulatory role of exogenous DHEA in vitro and in vivo in experimental intestinal inflammation induced by dextran sodium sulfate (DSS) in C57BL/6 mice. Initially, in vitro, DHEA inhibited the proliferation of spleen cells in a dose dependent way on the concentrations of 5?M, 50?M and 100?M, with decreased production of IFN-?. This hormone was not toxic to myeloid lineage cells, although it caused necrosis of leukocytes at the highest doses (50?M and 100?M), which may have influenced the decrease of the cytokines in vitro. Mice treated with DHEA (40 mg / kg) were evaluated at the induction phase of the disease (day 6) and during tissue repair, when animals exposed to DSS and DHEA for 9 days were maintained in the absence these drugs until the day 15. There was decrease of postmortem score, improved weight and clinical signs of intestinal inflammation, besides reduced peripheral blood monocytes on day 6, together with an increase in circulating neutrophils in tissue repair phase (15 days). Supplementation with DHEA also led to a reduction in cellularity of the lamina propria (LP) and to the restoration of normal length of the gut. The use of this hormone also decreased the expression of of IL-6 and TGF-? mRNA, while IL-13 was augmented in the colon of mice during the induction phase of the disease, a fact probably related to attenuation of intestinal inflammation. Furthermore, there was accumulation of CD4+ and CD8+ cells in the spleen along with decreased CD4+ leukocytes in mesenteric lymph nodes (MLN), indicating retention of CD4+ cells in the spleen after use of DHEA. The treatment was also able to increase the frequency of CD4+ cells producing IL-4 and decrease CD4+IFN-?+ in spleen, with reduced frequency of CD4+IL-17+ in the MLN, suggesting a role for DHEA on the balance of Th1/Th2/Th17 responses related colitis. In addition, splenocytes of mice treated with DHEA and exposed to DSS became hiporresponsives as seen by decreased proliferation after re-stimulation in vitro. Finally, DHEA was able to act on the metabolism of treated mice, leading to decreased total cholesterol and LDL cholesterol in serum during the induction phase of the disease, without generating any liver dysfunction. Thus, we concluded that DHEA acts by balancing the exacerbated immune responses, minimizing local and systemic damages caused by intestinal inflammation induced by DSS.

Submitted by Ana Flávia Teresa Paiva (aflavia.paiva@gmail.com) on 2018-07-05T15:29:33Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de mestrado.pdf: 699288 bytes, checksum: 3c4b62716218390065cac7fea5b0cb42 (MD5) / Rejected by Isabel Pereira de Matos (isabel@fmva.unesp.br), reason: Falta Ficha Catalográfica; Arrumar palavras chave on 2018-07-05T19:05:16Z (GMT) / Submitted by Ana Flávia Teresa Paiva (aflavia.paiva@gmail.com) on 2018-07-05T20:22:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de mestrado.pdf: 790947 bytes, checksum: 15861ab0546530441a0c751b2150ab34 (MD5) / Approved for entry into archive by Ederson Vasconcelos Pereira null (edersonpereira@fmva.unesp.br) on 2018-07-06T14:09:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 paiva_aftp_me_araca_int.pdf: 790947 bytes, checksum: 15861ab0546530441a0c751b2150ab34 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-06T14:09:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 paiva_aftp_me_araca_int.pdf: 790947 bytes, checksum: 15861ab0546530441a0c751b2150ab34 (MD5) Previous issue date: 2018-06-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Objetivou-se comparar a concentração de LH plasmático, em resposta à kisspeptina exógena, em novilhas Nelore, para avaliar a maturação sexual do Sistema Nervoso Central. As hipóteses testadas foram de que em resposta a kisspeptina, a secreção de LH aumenta com a idade e que em uma mesma idade, novilhas com maior peso à desmama secretam mais LH que as desmamadas mais leves. Utilizou-se 50 bezerras, segregadas em leves (174kg) e pesadas (232kg), desafiadas mensalmente dos 8 aos 16 meses, com 10 µg/kg (IM) de kisspeptina recombinante bovina, e após 20 min foi realizada a coleta de sangue. Aos 16 meses as novilhas foram expostas a touros por 60 dias e 30 dias depois a taxa de prenhez foi avaliada. A quantificação de LH, P4 e leptina foi feita por radioimunoensaio e IGF-I por ELISA. Houve aumento na concentração de LH em resposta a kisspeptina dos 8 aos 14 meses de idade. Comparando diferença na concentração de LH entre o 8º mês com meses os subsequentes, observou-se aumento no grupo prenhe no 11º mês, e no grupo não prenhe no 12º mês. A taxa de prenhez no grupo pesado foi de 92% enquanto que no grupo leve foi de 62,5% e o tempo gestacional estimado foi maior no grupo pesado. A concentração do IGF-I foi maior aos 12 meses no grupo leve e aos 15 meses no grupo não prenhe, enquanto que a concentração de leptina foi maior no grupo pesado aos 13, 15 e 16 meses, e prenhe aos 9 e 10 meses. A concentração de LH após a kisspeptina aumentou com a idade, mas não foi maior nos animais mais pesados à desmama, mas foi capaz de avaliar a maturação sexual do hipotálamo e futuramente pode ser usada para a triagem de novilhas Nelore com precocidade sexual. / The objective was to compare the plasma luteinizing hormone (LH) concentration in response to exogenous kisspeptin in Nellore heifers in order to evaluate the sexual maturation of the Central Nervous System. The tested hypotheses were: in response to kisspeptin the LH secretion increases with age and at the same age, heifers with higher weaning weight secrete more LH compared to lighter ones. Fifty heifers were used, secreted in light (174kg) and heavy (232kg), challenged monthly from 8-16 mo, with 10 μg / kg (IM) of recombinant bovine kisspeptin, and after 20 min blood sample was collected. At 16 months the heifers were exposed to bulls for 60 days, the pregnancy was evaluated 30 days later. The LH, P4 and leptin quantification were done by radioimmunoassay and IGF-I by ELISA. There was an increase in LH concentration in response to kisspeptin from 8th to 14th months of age. Comparing the difference on LH concentration between the 8th with the following months, the pregnant group presented an increase at 11th whereas the non-pregnant group it was observed at 12th month. The heavy heifers pregnancy rate was 92% while in the light group it was 62.5% and gestational time was also higher in the heavy group. IGF-1 levels was greater at 12th mo in the light group and at 15th mo in non-pregnant group. Leptin level was higher at 13th, 15th and 16th mo in the heavy group and at 9th and 10th mo in pregnant group. The LH concentration after kisspeptin injection increased according to age, was not higher in heavier animals at weaning, but was able to evaluate hypothalamus sexual maturation and in the future can be used as a screening tool for sexual precocity in Nellore heifers.

Orientador: Guilherme de Paula Nogueira / Banca: Claudia Maria Bertan Membrive / Banca: Rafael Silva Cipriano / Resumo: Objetivou-se comparar a concentração de LH plasmático, em resposta à kisspeptina exógena, em novilhas Nelore, para avaliar a maturação sexual do Sistema Nervoso Central. As hipóteses testadas foram de que em resposta a kisspeptina, a secreção de LH aumenta com a idade e que em uma mesma idade, novilhas com maior peso à desmama secretam mais LH que as desmamadas mais leves. Utilizou-se 50 bezerras, segregadas em leves (174kg) e pesadas (232kg), desafiadas mensalmente dos 8 aos 16 meses, com 10 µg/kg (IM) de kisspeptina recombinante bovina, e após 20 min foi realizada a coleta de sangue. Aos 16 meses as novilhas foram expostas a touros por 60 dias e 30 dias depois a taxa de prenhez foi avaliada. A quantificação de LH, P4 e leptina foi feita por radioimunoensaio e IGF-I por ELISA. Houve aumento na concentração de LH em resposta a kisspeptina dos 8 aos 14 meses de idade. Comparando diferença na concentração de LH entre o 8º mês com meses os subsequentes, observou-se aumento no grupo prenhe no 11º mês, e no grupo não prenhe no 12º mês. A taxa de prenhez no grupo pesado foi de 92% enquanto que no grupo leve foi de 62,5% e o tempo gestacional estimado foi maior no grupo pesado. A concentração do IGF-I foi maior aos 12 meses no grupo leve e aos 15 meses no grupo não prenhe, enquanto que a concentração de leptina foi maior no grupo pesado aos 13, 15 e 16 meses, e prenhe aos 9 e 10 meses. A concentração de LH após a kisspeptina aumentou com a idade, mas não foi maior nos animais mais p... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective was to compare the plasma luteinizing hormone (LH) concentration in response to exogenous kisspeptin in Nellore heifers in order to evaluate the sexual maturation of the Central Nervous System. The tested hypotheses were: in response to kisspeptin the LH secretion increases with age and at the same age, heifers with higher weaning weight secrete more LH compared to lighter ones. Fifty heifers were used, secreted in light (174kg) and heavy (232kg), challenged monthly from 8-16 mo, with 10 μg / kg (IM) of recombinant bovine kisspeptin, and after 20 min blood sample was collected. At 16 months the heifers were exposed to bulls for 60 days, the pregnancy was evaluated 30 days later. The LH, P4 and leptin quantification were done by radioimmunoassay and IGF-I by ELISA. There was an increase in LH concentration in response to kisspeptin from 8th to 14th months of age. Comparing the difference on LH concentration between the 8th with the following months, the pregnant group presented an increase at 11th whereas the non-pregnant group it was observed at 12th month. The heavy heifers pregnancy rate was 92% while in the light group it was 62.5% and gestational time was also higher in the heavy group. IGF-1 levels was greater at 12th mo in the light group and at 15th mo in non-pregnant group. Leptin level was higher at 13th, 15th and 16th mo in the heavy group and at 9th and 10th mo in pregnant group. The LH concentration after kisspeptin injection increased according to a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

É relatado que em um alto percentual de granjas comerciais há uma queda de produtividade no segundo parto com relação ao primeiro, conhecida como a síndrome do segundo parto. Com o objetivo de analisar alternativas para aumentar o desempenho reprodutivo de secundíparas, um total de 663 primíparas foram desmamadas em média com três semanas de lactação e divididas em três tratamentos: T1, primíparas cobertas no primeiro estro após o desmame; T2, primíparas cobertas no segundo estro após o desmame; e T3, primíparas submetidas à hormonioterapia com altrenogest por cinco dias após o desmame e cobertas no primeiro estro após a retirada do produto. As fêmeas foram alocadas nos tratamentos conforme linhagem genética, leitões nascidos totais, leitões desmamados, escore corporal visual e duração da lactação anterior. Primíparas do T1 e T3 perderam peso no intervalo desmame e cobertura (4,5 e 2,0%, respectivamente), havendo ganho de peso nas primíparas do T2 (1,3%), sendo as perdas de peso diferentes entre os tratamentos (P<0,05). As primíparas do T1 e T2 apresentaram maior porcentagem de fêmeas em estro até 10 dias após o desmame ou retirada do altrenogest (94,1 e 95,0%, respectivamente) do que o T3 (86,4%, P<0,05). O intervalo desmame-estro foi semelhante entre T1 e T2, sendo maior que o intervalo retirada do altrenogest-estro do T3 (P<0,05). A taxa de parto e a taxa de parto ajustada foram mais altas (P<0,05) no T2 (94,3 e 95,7%) seguida pelo T1 (87,0 e 88,0%) e T3 (69,1 e 69,1%). O número de leitões nascidos totais e vivos foram maiores (P<0,05) no T2 (13,5 ± 0,2 e 12,7 ± 0,2), seguido pelo T1 (11,0 ± 0,2 e 10,4 ± 0,2) e T3 (9,8 ± 0,3 e 9,3 ± 0,3). Houve recuperação corporal e bons resultados reprodutivos das fêmeas cobertas no segundo estro quando fornecida uma quantidade de ração padronizada no IDCOB (4.0 kg/dia), além de ser uma técnica viável na prática, como evidenciado pelo alto percentual de fêmeas retornando à ciclicidade. Parece que para que haja um bom desempenho em primíparas tratadas com altrenogest é necessário um tratamento mais prolongado (12 a 18 dias). A perda de peso devido ao catabolismo lactacional persiste após o desmame como demonstrado pela perda de peso do grupo controle e do tratado com altrenogest no período entre o desmame e a cobertura. / In a high percentage of commercial farms, it is reported that productivity decreases during the second farrowing compared to the first, known as the second litter syndrome. In order to compare commonly used management in farms (breeding at the first estrus post-weaning) with breeding at the second estrus (“skip a heat”) or after the utilization of a progestagen analogue (altrenogest) post-weaning, a total of 663 primiparous were weaned on average at three weeks of lactation and divided into three treatments: T1, breeding at the first estrus post-weaning; T2, breeding at the second estrus post-weaning; and T3, primiparous treated with altrenogest five days after weaning and breeding at the first estrus after altrenogest withdrawal. Sows were allocated according to the genetic line, total born, weaned piglets, visual body condition score and previous lactation length. The percentage of weight loss between weaning and insemination was different among treatment groups (P<0.05), considering that T1 and T3 primiparous lost weight. T1 and T2 had greater percentage of females showing estrus within 10 days after weaning/altrenogest withdrawal (94.1 and 95.0% respectively) than T3 (86.4%, P<0.05). The altrenogest withdrawal to insemination interval was smaller than T1 and T2 weaning to estrus interval (P<0.05). Farrowing rate and adjusted farrowing rate were higher (P<0,05) in T2 (94,3 and 95,7%) followed by T1 (87,0 and 88,0%) and T3 (69,1 and 69,1%). The number of total piglets born and alive were higher in T2 (13,5 ± 0,2 and 12,7 ± 0,2), followed by T1 (11,0 ± 0,2 and 10,4 ± 0,2) and T3 (9,8 ± 0.3 and 9,3 ± 0,3). There were body recovery and better reproductive performance in females breed at second estrus, besides being a viable technique in practice, as evidenced by high percentage of females showing second estrus. It appears that for a better performance in primiparous treated with altrenogest is necessary longer (12 to 18 days) period of treatment than five days. The weight loss due lactational catabolism persists after weaning as demonstrated by control and altrenogest treated group weight loss between weaning and insemination.

O desenvolvimento embrionário tem inicio a partir da fecundação do oócito pelo espermatozóide no interior do oviduto. O oviduto é um órgão tortuoso que mede de 20 a 30cm e está dividido em três porções: istmo, ampola e infundíbulo. Os hormônios influenciam a atividade das células-alvo pela ligação de moléculas receptoras especificas. A imuno-histoquímica é o conjunto de procedimentos que utiliza anticorpos como reagentes específicos para detecção de antígenos presentes em células ou tecidos, portanto, através desta técnica é possível verificar a presença de receptores hormonais em determinados órgãos. Este estudo teve como objetivo localizar a presença de receptores para o hormônio luteinizante (LH) nas diferentes porções do oviduto utilizando a técnica de imuno-histoquímica. Foram utilizadas 18 éguas que se encontravam em estro, ou seja, apresentavam um folículo maior que 35mm e trato reprodutivo condizente com a fase estrogênica do ciclo estral. Das 18 éguas utilizadas neste trabalho, 16 éguas (88,8 %) apresentaram receptores para hormônio luteinizante (RLH) no oviduto. Destas 16 éguas, 8 (44,4 %) apresentaram RLH no epitélio e 7 (38,8 %) apresentaram RLH no tecido muscular do istmo, 14 (77,7 %) apresentaram RLH no epitélio e 13 (72,2 %) no tecido muscular da ampola, 10 (55.5 %) apresentaram RLH no epitélio e 1 (5,5 %) no tecido muscular do infundíbulo. Nas éguas que apresentaram receptores no epitélio a intensidade verificada foi de 1,5; 2,5 e 2,6 no istmo, ampola e infundíbulo, respectivamente enquanto que na porção muscular foi de 1,14; 2,3 e 3 respectivamente, para cada uma das três porções estudadas. Foi verificada uma maior intensidade de receptores na ampola do oviduto, o que pode relacionar o LH no processo de fecundação do oócito pelo o espermatozóide. / Embryonic development begins with the fertilization of the egg by the sperm in the oviduct. The oviduct is a tortuous organ which extended measures 20 to 30cm and is divided into three parts: the isthmus, ampulla and infundibulum. Hormones influence the activity of target cells by binding to specific receptor molecules. Immunohistochemistry is the set of procedures that use antibodies as reagents for detection of specific antigens present in cells or tissues, therefore, using this technique it is possible to verify the presence of hormone receptors in certain organs. This study aimed to verify the presence of hormone receptors for luteinizing hormone (LH) in different portions of the oviduct using the technique of immunohistochemistry. We used 18 mares were in estrus that had a follicle greater than 35mm and reproductive tract consistent with the estrogen phase of the estrous cycle. From the 18 mares that were part of that study, 16 mares (88.8 %) had receptors for luteinizing hormone (RLH) in the oviduct. From these 16 mares, 8 (44.4 %) had RLH in the epithelium and 7 (38.8 %) had RLH in the muscle of the isthmus, 14 (77.7 %) had RLH epithelium and 13 (72.2 %) in the muscle of the ampulla, 10 (55.5 %) had RLH in the epithelium m and 1 (5.5 %) in the muscle of the infundibulum. In mares that had receptors in the epithelium the intensity verified was 1,5 ; 2,5 and 2,6 on the isthmus, ampulla and infundibulum, respectively while in the muscular portion was 1,14 ; 2,3 and 3 respectively, for each of the three portions studied. It was verified a greater intensity of receptors in the ampulla of the oviduct, which may relate the LH in the process of fertilization of the oocyte by the sperm.

O hormônio folículo estimulante (FSH) desempenha um papel central no desenvolvimento da célula de Sertoli até a puberdade, e na sinalização desta célula em relação à série espermatogênica, após a puberdade. Na fase proliferativa, FSH atua estimulando a captação de Ca2+ e o transporte de aminoácidos neutros nas células de Sertoli, além de ativar a via adenilil ciclase-AMPc. Neste período, que em ratos compreende do 5º dia ao 25º após o nascimento, FSH atua aumentando o número e o tamanho das células de Sertoli, sendo esta ação fundamental para que se processe uma espermatogênese normal no indivíduo adulto. A sinalização estimulada por FSH nestas células varia com idade, reduzindo seu estímulo sobre o transporte de Aminoácidos neutros (via sistema A) no período pós- púbere. Adicionalmente, FSH estimula uma resposta eletrofisiológica bifásica, representada por uma hiperpolarização rápida, seguida de uma despolarização prolongada. O objetivo desta tese foi analisar o envolvimento de vias sinalizadas pela gonadotrofina na fase pré-puberal da célula de Sertoli de ratos. Para tanto, foram utilizadas as técnicas de captação de 45Ca2+, de transporte de [14C]MeAIB e de registro eletrofisiológico intracelular, para a verificação da ação do FSH através de proteína Gs e proteína Gi, bem como de suas vias subseqüentes. Foi observado que FSH estimula a captação de 45Ca2+ e o transporte de [14C]MeAIB via proteína Gi, ação esta independente do aumento de AMPc, pois foram bloqueadas por Toxina Pertussis (PTX) e não foram mimetizadas por forscolina. Da mesma forma, a despolarização estimulada por FSH foi inibida por PTX. Subseqüente a ativação de Gi, PI3K é estimulada por FSH, em células de Sertoli imaturas. Esta via foi bloqueada por wortmannin, o que inibiu a ação de FSH nos parâmetros analisados. Também foi estudada a ação de IGF-I sobre a captação de 45Ca2+, sobre o transporte de [14C]MeAIB e foi observada sua resposta eletrofisiológica. Verificou-se ação de IGF-I nos transportes de 45Ca2+ e [14C]MeAIB de maneira significativa, e observou-se uma despolarização como resposta eletrofisiológica à sua aplicação tópica, em células de Sertoli de ratos imaturos. Sabe-se que FSH e IGF-I agem de maneira sinérgica no desenvolvimento das células de Sertoli, e que FSH estimula a síntese e a secreção de IGF-I, nestas células durante o período pré-púbere. Então foi verificada se a ação de FSH ocorre via IGF-I ou através de mecanismos paralelos. Para esta verificação utilizou-se o bloqueador de receptor de IGF-I, JB1, o qual bloqueia o acesso do fator de crescimento ao seu receptor tirosina cinase. Como resultado foi observado que o bloqueador JB1, inibe as ações estimuladas por IGF-I, entretanto sem alterar a resposta de FSH sobre os parâmetros analisados. E com o intuito de verificar o envolvimento de Cav1 (canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L), foi utilizado verapamil, o qual bloqueou a ação de FSH sobre a captação de 45Ca2+. A partir destes resultados, é possível sugerir que FSH estimula a captação de 45Ca2+, o transporte de [14C]MeAIB, bem como apresenta uma resposta eletrofisiológica vinculada a via GPCR/Gi/Gßy/PI3K/Akt-PKB/Cav1, em células de Sertoli de ratos imaturos durante sua fase proliferativa. / FSH plays a central role on Sertoli cell proliferation in development during puberty, and after this period is related to spermatogenic progression. FSH increase Sertoli cells number and size from the 5º to 15º day after birth, in the same period the FSH strongly stimulates neutral amino acid transport, also, FSH plays a biphasic electrophysiology response characterized by a rapid hyperpolarization following to a prolonged depolarizing. The aim of this work was study the pathways stimulated by FSH in Sertoli cells of rats during the pre pubertal phase. As markers we use 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and the membrane potential (MP) to verify the action of FSH on Gi and Gs protein pathways. It was observed that FSH enhanced 45Ca2+ uptake through Gi protein pathway, independently of cAMP, this action was bloked by PTX (250ng/mL) independent of adenil ciclase action. Also 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and MP response were blocked by wortmannin (100nM). The action IGF-1 in these parameters was also analyzed, the growth factor stimulates 45Ca2+ uptake and [14C]MeAIB transport and induce a prolonged depolarization on the MP. The use of an inactive analog of the IGF-1(JB1 1μg/ml) blocked the IGF-1 action but not the effects of FSH. The utilization of Verapamil (100 μM) blocker of the Cav1 (L type VDCC) inhibited the stimulation of FSH on 45Ca2+ uptake and [14C]MeAIB transport. These results suggest that the FSH action during proliferative stage of Sertoli cells on 45Ca2+ uptake, [14C]MeAIB transport and MP modification related to the GPCR/Gi/Gßy/PI3K/Akt-PKB/Cav1 pathway.

Leitão, C. C. F. Efeito do FSH, Ativina-A e GDF-9 sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. 2011. 112 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia), Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2011. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-15T15:22:10Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_ccfleitao.pdf: 1217871 bytes, checksum: f33f9f636971df4fb09b48a95e60fefb (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-15T15:48:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_ccfleitao.pdf: 1217871 bytes, checksum: f33f9f636971df4fb09b48a95e60fefb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-15T15:48:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_ccfleitao.pdf: 1217871 bytes, checksum: f33f9f636971df4fb09b48a95e60fefb (MD5) Previous issue date: 2011 / The aim of this study was to investigate the levels of messenger RNA (mRNA) for activin-A on goat preantral and antral follicles and the effects of follicle stimulating hormone (FSH), activin-A and growth and differentiation factor - 9 (GDF-9) on growth and mRNA expression for activin-A, GDF-9, bone morphogenetic protein (BMP) -2, -4, -6, -7, -15 and FSH receptor (FSH-R) in goat preantral follicles cultured in vitro. Initially, primordial, primary and secondary follicles, as well as cumulus-oocyte complexes (COCs) and mural granulosa/theca cells of small and large antral follicles were isolated mechanically from goat ovaries and the expression of mRNA for activin-A was evaluated by real-time PCR. For in vitro studies, goat secondary follicles were isolated and cultured for 6 days in the presence of FSH alone (50 ng/mL) or in combination with activin-A (100 ng/mL) or GDF-9 (200 ng/mL). Alone or in combination with FSH, the influence of activin-A on expression of activin-A and FSH-R, and the effect of GDF-9 on the levels of mRNA for GDF-9, FSH-R and BMP -2, -4, -6, -7 and -15 in secondary follicles after 6 days of culture were tested. For this, after extraction of total RNA and cDNA synthesis, the levels of mRNA for activin-A, GDF-9, FSH-R and BMP -2, -4, -6, -7 and -15 were quantified by real time PCR. The results showed that secondary follicles had lower levels of mRNA for activin-A, than compared to primary follicles (p<0.05). There was no difference in levels of mRNA for activin-A between primordial and primary or secondary (p>0.05). Allied to this, there was no difference between COCs of small and large antral follicles (p>0.05). Moreover, granulosa and theca cells of large antral follicles showed higher levels of mRNA for activin-A than in small antral follicles (p<0.05). When comparing mRNA expression for activin-A between COCs from small and large antral follicles and their granulosa and theca cells, no difference in expression levels was observed (p>0.05). After in vitro culture of secondary follicles, the presence of FSH either alone or associated with activin-A or GDF-9 increased survival, follicular growth and antrum formation (p<0.05). The FSH increased mRNA for activin-A, while the follicles cultured with activin-A showed increased levels of mRNA for FSH-R (p<0.05). In addition, GDF-9 decreased mRNA expression for BMP -2 and -15 (p<0.05), but had no effect on expression of BMP -4, -6, and -7 (p>0.05). In conclusion, during the transition from primary to secondary follicles there is a reduction of mRNA for activin-A, whereas there is an increased expression of this factor during the growth of antral follicles. FSH, activin-A and GDF-9 stimulate growth of goat secondary follicles after 6-day culture. After follicle culture FSH controls the expression of activin-A, and the expression of FSH-R is regulated by activin-A. Furthermore, GDF-9 reduces the mRNA expression for BMP-2 and -15 / O objetivo deste estudo foi investigar os níveis de RNA mensageiro (RNAm) para ativina-A em folículos pré-antrais e antrais caprinos e os efeitos do hormônio folículo estimulante (FSH), ativina-A e fator de crescimento e diferenciação - 9 (GDF-9) sobre o crescimento e a expressão de RNAm para ativina-A, GDF-9, proteína morfogenética óssea (BMP) -2, -4, -6, -7, -15 e receptor de FSH (R-FSH) em folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro. Inicialmente, folículos primordiais, primários e secundários, bem como complexos cumulus-oócito (COCs) e células da granulosa mural/teca de pequenos e grandes folículos antrais foram isoladas mecanicamente a partir de ovários de cabra e a expressão de RNAm para ativina-A foi avaliada por PCR em tempo real. Para os estudos in vitro, folículos secundários caprinos foram isolados e cultivados por 6 dias na presença de FSH sozinho (50 ng/mL) ou em combinação com ativina-A (100 ng/mL) ou GDF-9 (200 ng/mL). Isoladamente ou em combinação com FSH, a influência de ativina-A na expressão de ativina-A e R-FSH, e o efeito do GDF-9 sobre os níveis de RNAm para GDF-9, R-FSH e BMP -2, -4 , -6, -7 e -15 em folículos secundários após 6 dias de cultivo foram testados. Para isso, após a extração do RNA total e síntese do cDNA, os níveis de RNAm para ativina-A, GDF-9, R-FSH e BMP -2, -4, -6, -7 e -15 foram quantificados por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que folículos secundários apresentavam níveis menores de RNAm para ativina-A comparado aos folículos primários (p<0,05). Não houve diferença nos níveis de RNAm para ativina-A entre folículos primordial e primário ou secundário (p>0,05). Aliado a isso, não houve diferença entre COCs de pequenos e grandes folículos antrais (p>0,05). Além disso, as células da granulosa e da teca de grandes folículos antrais apresentaram maiores níveis de RNAm para ativina-A do que de pequenos folículos antrais (p<0,05). Quando comparamos a expressão do RNAm para ativina-A entre COCs de pequenos e grandes folículos antrais e suas células da granulosa e da teca, nenhuma diferença nos níveis de expressão foi observada (p>0,05). Após o cultivo in vitro de folículos secundários, a presença de FSH sozinho ou associado com ativina-A ou GDF-9 aumentou a sobrevivência, crescimento folicular e formação de antro (p<0,05). O FSH também aumentou o RNAm para ativina-A, enquanto os folículos cultivados com ativina-A apresentaram níveis aumentados de RNAm para R-FSH (p<0,05). Além disso, o GDF-9 diminuiu a expressão de RNAm para BMP -2 e -15 (p<0,05), mas não teve efeito sobre a expressão de BMP -4, -6 e -7 (p>0,05). Em conclusão, durante a transição de folículo primário para secundário há uma diminuição do RNAm para ativina-A, enquanto ocorre um aumento da expressão deste fator durante o crescimento de folículos antrais. FSH, ativina-A e GDF-9 estimulam o crescimento de folículos secundários caprinos após 6 dias de cultivo. Após cultivo folicular, FSH controla a expressão de ativina-A e a expressão do R-FSH é regulada por ativina-A. Ainda, GDF-9 reduz a expressão do RNAm para BMP -2 e -15

O oócito e as células do cumulus apresentam uma comunicação bi-direcional através de projeções que atravessam a zona pelúcida, sendo fundamental no transporte de aminoácidos para o crescimento e maturação oocitária. O oócito regula diversas funções das células do cumulus que o rodeiam e é o responsável por mantê-las diferenciadas das demais. Desta forma, estas células têm se mostrado de grande utilidade para pesquisa, pois podem manter o estado menos indiferenciado in vitro, semelhantes às fases iniciais de desenvolvimento folicular e, portanto, ideais para estudos que visam entender melhor o processo de diferenciação celular durante a foliculogênese, bem como as interações hormonais que ocorrem neste período. Diversos trabalhos têm sugerido a ação sinérgica do FSH e do IGF-1 na esteroidogênese, através da estimulação das mesmas vias metabólicas, porém com grande variabilidade dos resultados entre as espécies. Neste trabalho, as células do cumulus foram coletadas durante o procedimento de FIV na Clínica Proser, e posteriormente cultivadas em meio DMEM modificado, na concentração final de 5x104 células/poço. Para ambos experimentos as células foram cultivadas em incubadora por 24h antes dos tratamentos específicos de cada grupo. Para o transporte de [14C]MeAIB foram feitos 3 grupos: 1) grupo controle; 2) grupo FSH; 3) grupo IGF-1+FSH. Todos os grupos foram cultivados por 24h em meio DMEM, sendo acrescido 25ng/mL de IGF-1 ao grupo IGF-1+FSH. Posteriormente, as células foram incubadas à 37ºC por 45 min em meio HBSS acrescido de 0,2 μCi/mL de [14C]MeAIB por amostra. Foi adicionado ao meio de incubação 75 mIU/ml de FSH nos grupos FSH e IGF-1+FSH. A reação foi encerrada com colocação das placas em gelo e o meio foi retirado da placa e congelado. As células foram lavadas com HBSS à 4ºC e 0,5 mL/poço de água foi adicionado antes de serem congeladas à -20°C. Para a contagem do radioativo, as células foram descongeladas, sonicadas e centrifugadas à 800g por 10min. Alíquotas de 100 μL foram retiradas de todas as amostras (meio interno e externo) e colocadas em 1,5mL de liquido de cintilação para a mensuração da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida LKB beta modelo 1215. A dosagem de proteína das amostras foi realizada segundo o método de Lowry. Os resultados foram expressos pela relação entre radioatividade das células e a radioatividade do meio de incubação. Para a dosagem de 17ß-estradiol as células foram cultivadas nas mesmas condições conforme o experimento anterior. Após 24 horas de cultivo, as células foram divididas em quatro grupos: 1)grupo controle: somente o meio de cultivo; 2) grupo FSH: foi adicionado 75mUI de FSH ao meio; 3) grupo IGF-1: foi adicionado na concentração de 25ng IGF-1/mL ao meio; 4) grupo FSH+IGF-1: foi adicionado FSH (75mUI/mL) e IGF-1 (25ng/mL) ao meio. Ao final de 24h de cultivo, o meio foi congelado à -20ºC. O meio foi diluído na proporção 1:10 no meio tampão do kit. Posteriormente, a mensuração do 17ß-estradiol foi feita por Elisa, utilizando-se o kit comercial 17ß-estradiol EIA kit. Foram utilizados os seguintes itens para correlação com os parâmetros experimentais: a idade e o número de oócitos MII que foram submetidos à ICSI. Para a análise estatística foram feitos os testes: ANOVA de uma via seguido de pósteste de Bonferroni, Shapiro-Wilk para avaliação da distribuição dos dados, Kruskal-Wallis e coefeciente de correlação de Pearson’s. As diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05. Foi encontrado uma forte correlação negativa entre o número de oócitos MII e o transporte de [14C]MeAIB (n=5; P=0,03). Não foi encontrado correlação entre o transporte de [14C]MeAIB com a idade das pacientes, sendo o valore de P> 0,05. A incubação com FSH (75 mUI/mL) e o cultivo com IGF-1 (25ng/mL) durante 24h não estimularam o transporte de [14C]MeAIB nas células do cumulus humanas (n=5; P=0,620). O cultivo com a adição de FSH, IGF-1 ou ambos por 24h não aumentou a secreção de 17ß-estradiol (pg/mL) no meio de cultura, comparado ao grupo controle (n= 7; P = 0,855). Em relação à concentração de 17ßestradiol nas células do cumulus não tratadas, não foi encontrado nenhuma correlação entre os parâmetros avaliados de idade e número de oócitos MII (n=7) P> 0,05. Podemos concluir que o sistema A de transporte de aminoácidos está presente em células do cumulus humanas, sendo que a taxa basal é inversamente proporcional ao número de oócitos MII coletados. Provavelmente, o IGF-1 não ocasiona um aumento direto na expressão do FSHR, uma vez que quando adicionado ao meio de cutivo não estimulou os parâmetros analizados comparados aos grupos com somente FSH. Além disso, quando adicionado IGF-1 sozinho ao meio de cultura das células do cumulus, nenhuma alteração na produção de 17ß-estradiol foi observada, sugerindo que o IGF-1 não tenha um efeito direto na esteroidogênese destas células. Portanto, embora existam diversos trabalhos que tem auxiliado na compreensão da interação entre o IGF-1 e o FSH na diferenciação celular durante a foliculogênese, ainda faltam pontos cruciais neste processo em células humanas. Da mesma forma, são necessários mais estudos que caracterizem as células do cumulus, bem como a sua interação com o oócito, para que possamos aplicar estes conhecimentos com a finalidade de melhorar as taxas de MIV oocitária. / Oocyte and the cumulus cells have a bi-directional communication through projections that cross the zona pellucida, being fundamental for the transport of amino acids necessary for gamete growth and maturation. Oocyte plays a dominant role in establishing the heterogeneity of the granulosa cells found in preovulatory follicles by preventing the differentiation of the cumulus granulosa cells. Thus, culturing cumulus cells from preovulatory follicles is a suitable approach to study granulosa cell differentiation as well as the hormonal interactions that occur in folliculogenesis. Several studies have suggested the synergic action of FSH and IGF-1 in steroidogenesis, through the stimulation of the same metabolic pathways, but with great variability of results among species. We evaluate the basal transport and the transport stimulated by FSH [14C]MeAIB in human cumulus cells, observing whether the addition of IGF-I to the culture medium alters this parameter. Cumulus cells were collected during the IVF procedures at Proser Assisted Reproduction Center, and cultured in modified DMEM, at a final concentration of 5x104 cells/well. For both experiments, cells were cultured in an incubator for 24h before the specific treatment of each experimental group. For the transport of [14C]MeAIB 3 groups were made: 1) control group; 2) FSH group; 3) IGF-1 + FSH group. All groups were further cultured for 24h. Twenty five mg/mL of IGF-1 were added to the to the culture medium of the IGF-1 + FSH group. Cells were incubated at 37°C for 45 min in HBSS medium plus 0,2 μCi/mL of [14C] MeAIB per sample, wherein FSH and FSH + IGF-1 groups had 75 mIU/mL of FSH added to the incubation medium. The reaction was terminated by placing the plates on ice and the medium was removed from the plate and freezed. Cells were washed with HBSS at 4°C and 0.5 mL/well of water were added before being frozen at -20°C. For radioactive counting, cells were thawed, sonicated and centrifuged at 800g for 10min. Aliquots of 100 uL were taken from all samples (internal and external medium) and placed in 1.5 mL of scintillation liquid for measurement of radioactivity in a liquid scintillation spectrometer LKB beta 1215 model. Protein dosage of the samples was performed according to the method of Lowry. Results were expressed by the ratio between the radioactivity of cells and the radioactivity of the incubation medium. For the 17ß-estradiol dosage, cells were cultured under the same conditions as the previous experiment. After 24 hours of culture, the cells were divided into four groups: control group = only the culture medium; FSH group = it was added 75mUI of FSH to the medium; IGF-1 group = it was added IGF-1 at a concentration of 25ng/mL to the medium; FSH + IGF-1 group = it was added FSH (75mUI/mL) and IGF-1 (25ng/mL) to the medium. After of 24 hours of cultivation, the medium was frozen at -20°C. The medium was diluted in a 1:10 ratio in the kit buffer medium. Afterwards, measurement of 17ß-estradiol was made by ELISA using a 17ß-estradiol EIA commercial kit. The following items were used for correlation with the experimental parameters: the age of the patients and the number of MII oocytes that underwent ICSI. For statistical analysis two tests were used: One-way ANOVA followed by Bonferroni post-test, Shapiro-Wilk for evaluation of data distribution, Kruskal-Wallis and Pearson's correlation coefficient. Differences were considered significant when P <0.05. A strong negative correlation was found between the number of MII oocytes and the transport of [14C]MeAIB (n = 5; p = 0.03). No correlation was observed between the transport of [14C]MeAIB and the age of patients (P>0.05). The incubation with FSH (75 mIU/mL) and the cultivation with IGF-1 (25ng/mL) for 24 hours did not stimulate the transport of [14C]MeAIB in human cumulus cells (n = 5; P = 0.620). The culture with the addition of FSH, IGF-1, or both for 24 hours did not increase the secretion of 17ß-estradiol (pg/mL) in the culture medium compared to the control group (n = 7; P = 0.855). Regarding the 17ß-estradiol concentration in the untreated cumulus cells, it was not found any correlation between the evaluated parameters of age and number of MII oocytes (n = 7) P>0.05. We conclude that the A system amino acid transport is present in human cumulus cells, and that the basal rate is inversely proportional to the number of MII collected oocytes. Probably, IGF-1 does not cause a direct increase in FSHR expression, once when added to the culture medium it did not stimulate the parameters analyzed compared to the groups with FSH alone. Moreover, when IGF-1 is added alone to the culture medium of cumulus cells, no change in 17ß-estradiol production was observed, suggesting that IGF-1 has not a direct effect on these cells steroidogenesis. Therefore, although there are several studies that have assisted in understanding the interaction between IGF-1 and FSH in cell differentiation during folliculogenesis, there are still crucial unknown points in this process in human cells. Likewise, more studies are needed to characterize the cumulus cells, as well as their interaction with the oocyte, so we can apply this knowledge to improve oocyte IVM rates.