Les protéines Hsp70 appartiennent à une famille de chaperons moléculaires très conservés qui jouent un rôle essentiel dans le contrôle qualité des protéines et qui protègent les cellules contre diverses agressions de l'environnement. Pour fonctionner comme un chaperon moléculaire, les protéines Hsp70 agissent de concert avec plusieurs co-chaperons et co-facteurs nécessaires au fonctionnement de son cycle ATPasique. Nos travaux montrent que les bactéries du genre Mycobacterium codent pour une nouvelle famille de protéines atypiques apparentées à Hsp70 dont l'architecture s'articule autour d'un domaine ATPase putatif à l'extrémité N-terminale, similaire au domaine de la superfamille Hsp70-actine, d’un segment transmembranaire (TMD) putatif et d'une longue région riche en proline/thréonine (P/T) en sa partie C-terminale. Le but de ce travail de thèse était d’étudier la fonction et la localisation cellulaire des protéines de type Hsp70 chez les mycobactéries. Nous avons d’abord constaté que la protéine Hsp70-Like de M. smegmatis (Msmg_Hsp70-Like) se localisait en foci distincts à la membrane des cellules et que son expression induisait un phénotype d’agrégation cellulaire. Afin d’éclaircir le rôle des domaines putatifs TMD et P/T, nous avons construit un ensemble de mutants dans lesquels ces éléments structurels ont été supprimés. Nous avons constaté que le domaine TMD putatif était important pour la localisation de Hsp70-Like, pour la formation des foci à la membrane et pour le phénotype d'agrégation des cellules. En revanche, le domaine riche en P/T n’a aucun effet sur ces phénotypes. In vitro, le domaine ATPase putatif de Msmg_Hsp70-Like a été purifié et des essais de cristallisation sont en cours. Des expériences supplémentaires restent cependant nécessaires pour évaluer la fonction de cette nouvelle famille de protéines. / Hsp70 belongs to a highly conserved family of molecular chaperone proteins that unambiguously plays essential roles in protein quality control, protecting cells against various environmental insults. To function as a bona fide molecular chaperone, Hsp70 acts in concert with several co-chaperones and nucleotide exchange factors to complete its ATP-dependent chaperone cycle. Our work shows that bacteria from the genus Mycobacterium encode new atypical Hsp70-Like proteins that share a common architecture: a putative ATPase domain at the N-terminus similar to members of the Hsp70-actin superfamily, a single putative transmembrane domain (TMD) in the middle of the protein and a long proline/threonine (P/T) - rich region at the C-terminal. The aim of this thesis work was to shed light on the function and the cellular localization of Hsp70-like proteins in mycobacteria. We first found that Msmg Hsp70-Like protein localizes to discrete foci within cells and that its expression induces a cell aggregation phenotype. To shed light on the role of the putative TMD and P/T- rich domains in Hsp70-Like, we engineered a set of mutants in which these structural elements were deleted. We found that the central putative TMD was important for the cell envelop localization of Hsp70-Like, for the formation of foci and for cell aggregation. In contrast, the P/T-rich had no effect on these phenomena. In vitro the putative ATPase domain of Msmg Hsp70-Like was purified and crystallization trials were performed. Further research is needed to assess the function of this novel family of proteins.

Įvairios širdies ligos, kurių metu vyksta kardiomiocitų žuvimas, yra viena iš pagrindinių mirtingumo priežasčių visame pasaulyje. Regeneracinė ląstelių terapija, naudojant pirmines raumeninės kilmės ląsteles širdies ligų gydyme, sulaukia vis didesnio dėmesio. Dėl įvairių patologinių procesų, vykstančių pažeistame audinyje, didelė dalis transplantuotų ląstelių žūva. Todėl viskas, kas gali padėti transplantuotiems mioblastams išgyventi ir geriau prigyti, verta nuodugnesnių tyrimų. Šiame darbe buvo tirtas streso baltymo Hsp70 vaidmuo suaugusio triušio raumens kamieninių ląstelių įvairių viduląstelinių sistemų, atsakingų už ląstelių žuvimą ar išgyvenimą, reguliacijoje. Suaugusio triušio raumens kamieninės ląstelės buvo transfekuotos plazmide, turinčia hsp70 geną. Transfekuotų ląstelių padidėjusio atsparumo toksiniams poveikiams veikimo mechanizmai tirti lyginant jas su paprastomis kamieninėmis miogeninėmis ląstelėmis. Gauti rezultatai parodė, kad padidėjusi Hsp70 baltymo raiška apsaugo triušio raumens kamienines ląsteles nuo apoptozinio žuvimo po poveikio cheminėmis medžiagomis (naftazarinu, vandenilio peroksidu ir natrio prusidu) generuojančiomis reaktyvius deguonies darinius (ROS) ir sukeliančiomis oksidacinį stresą. Padidintas Hsp70 baltymo kiekis po poveikio osidacinį stresą indukuojančiomis medžiagomis keičia mitogenais aktyvinamos kinazės ERK 1,2, streso kinazės JNK trumpalaikį/pro-apoptozinį veikimą paprastose pirminėse miogeninėse ląstelėse į ilgalaikį/ani-apoptozinį... [toliau žr. visą tekstą] / Various heart diseases concomited with the death of cardiomyocytes is one of the major causes of death-rate. Regenerative stem cell therapy of damaged heart applying muscle-derived stem cells attains more and more attention. Patological environment in the damaged heart is major cause of death of newly transplanted muscle-derived stem cells. Therefore, everything increasing survival of transplanted myogenic cells is of research interest. This work has been designed to investigate role of stress protein Hsp70 in the regulation of intracellular systems responsible for the death or survival of primary myogenic cells. Rabbit muscle-derived stem cells were transfected with the plasmid carrying hsp70 gene. Various intracellular mechanisms responsible for the resistance of transfected cells have been investigated and compared with the regular non transfected primary myogenic cells. Our results show that Hsp70 protein protects rabbit muscle-derived stem cells from the toxic effect of compounds (naftazarin, hydrogen peroxide and sodium pruside) generating reactive oxigen species (ROS) and causing oxidative stress. Increased amount of intracellular Hsp70 protein converts transient/proapototic mode of action of ERK1,2 and JNK in regular primary myogenic cells to sustained/antiapoptotic action in transfected cells and significantly decreased total amount of JNK after the treatment with naftazatin. Transfected cells also showed sustained/anti-apoptotic mode of activation of transcription... [to full text]

Os fogachos são a queixa mais comum das mulheres peri- e pós-menopausa e estão fortemente relacionados com a diminuição dos níveis de estrogênio. No entanto, a fisiopatologia deste sintoma vasomotor muito desagradável é ainda desconhecido. Por outro lado, o estradiol (E2) apresenta a capacidade de induzir a expressão de HSP72, um membro da família de 70 kDa das proteínas de choque térmico (HSP70), que são citoprotetoras e cardioprotetoras. Sabe-se que a expressão HSP70 é comprometida em doenças inflamatórias relacionadas com o envelhecimento. Por isso, questionamos se a capacidade do organismo de desencadear uma resposta ao choque térmico (Heat Shock Response) robusta, estaria ainda presente após a retirada, via castração, do E2. Para tanto, foram estudados os efeitos do choque térmico (Heat Shock - HS), através de uma sessão de banho de imersão, em ratas Wistar submetidas a ovariectomia bilateral (OVX), após um período de washout hormonal de 7 dias. Doze horas após o HS, os animais foram mortos e o arco aórtico foi excisado cirurgicamente para análises moleculares. Os resultados foram comparados com os marcadores de estresse oxidativo no plasma (superóxido dismutase, catalase e lipoperoxidação), pois é bem estabelecido que a expressão de HSP70 é sensível a regulação redox. A relação entre a iHSP70 (intracelular) e a eHSP70 (extracelular/plasma), proposto como um índice do estado inflamatório sistêmico, também foi investigada. Os resultados mostraram que a Heat Shock Response continua preservada em animais OVX, como inferido a partir da expressão de HSP70 (até 40% de aumento, p <0,01) nas aortas, o que não foi acompanhado por nenhuma outra alteração em marcadores de estresse oxidativo, parâmetros hematológicos e no controle glicêmico. Desta forma, sugerimos que a avaliação periódica do status de HSP70 (iHSP70 vs eHSP70) pode ser de extrema relevância clínica, pois a diminuição da capacidade de defesa do organismo via Heat Shock Response está no centro do aparecimento de disfunções relacionadas com a menopausa. / Hot flashes, the most common complaint of peri- and postmenopausal women, are tightly related to decrease in estrogen levels. However, the pathophysiology of this very unpleasant vasomotor symptom is greatly unknown. On the other hand, estradiol (E2) has been found to induce the expression of HSP72, a member of the 70 kDa family of heat shock proteins (HSP70), which are cytoprotective and cardioprotective. Since it has been noticed that HSP70 expression is compromised in age-related inflammatory diseases, we argued whether the capacity of triggering a robust heat shock (HS) response would be still present after E2 withdrawal. Hence, we studied the effects of HS treatment (hot tub) in female Wistar rats subjected to bilateral oophorectomy (OVX) after a 7 day washout period. Twelve hours after HS, the animals were killed and aortic arches were surgically excised for molecular analyses. The results were compared with oxidative stress markers in the plasma (superoxide dismutase, catalase and lipoperoxidation) because HSP70 expression is sensitive to redox regulation. Extracellular (plasma) to intracellular HSP70 ratio, an index of systemic inflammatory status, was also investigated. The results showed that HS response was preserved in OVX animals, as inferred from HSP70 expression (up to 40% rise, p<0.01) in the aortas, which was accompanied by no further alterations in oxidative stress, hematological parameters and glycemic control either. As a consequence, periodic evaluation of HSP70 status (iHSP70 vs eHSP70) may be of clinical relevance because decreased HS response capacity is at the center of the onset of menopause-related dysfunctions.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Acute liver failure (ALF) induced by acetaminophen (APAP) is a complex process associated with glutathione (GSH) depletion, energetics metabolism changes and mitochondrial dysfunction, resulting in the impairment of maintenance of tissue normal function. On this matter, organoselenium compounds, such as diphenyl diselenide (PhSe)2, have been highlighted in the last years due to the antioxidant properties and the hepatoprotective effects, however, the (PhSe)2 hepatoprotection mechanism remains unclear. So, this work was aimed to deepen into understanding of the effects of (PhSe)2 on the mitochondrial dysfunction as well as the signaling pathway during the ALF induced by APAP. Firstly, it was performed a comparative study between the organoselenium compound and the classical antidote (N-acetylcysteine, NAC) in the liver homogenate. (PhSe)2 presented similar results to the NAC reducing the oxidative damage markers, maintaining the GSH levels and enhancing the survival after the APAP overdose. The treatment with (PhSe)2 reduced plasmatic levels of transaminases (aspartate and alanine aminotransferase) and the morphological/histological changes. In addition, (PhSe)2 was able to reduce significantly the oxidative damage such as lipid peroxidation, reactive oxygen and nitrogen species generation, mitochondrial protein carbonylation and mitochondrial viability after ALF induced by APAP. In this context, the levels of non enzymatic antioxidants, such as GSH, and enzymatic antioxidants, such as catalase, Mn superoxide dismutase, glutathione peroxidase and glutathione reductase remained to the control levels. In general, the results noticed in this work the probably (PhSe)2 mechanism is closely related with the maintenance of antioxidant defense system and inhibition of mitochondrial transition permeability (MPT) indicated by reduction of mitochondrial swelling, activity preservation of respiratory complexes I, II and ATPase, and maintenance of H+ gradient with the mitochondrial membrane potential (Δψm) generation. It was observed that (PhSe)2 was able to limit the impairment of mitochondrial bioenergetics function with the normalization of oxidative phosphorilation (OXPHOS) and activation of heat shock protein pathway through the enhance of HSP70 levels, which in turn, modulates the MPT protecting the mitochondrial viability. (PhSe)2 treatment was able to maintain the appropriated levels of cytokines associated with the liver recovery, such as tumoral necrosis factor alfa (TNF-α), interleukin 6 (IL-6) and nuclear factor kappa B (NF-κB). Moreover, the integrity of cellular bioenergetic function could be associated with the increase of peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator (PGC-1α), helping to restore the nuclear respiratory factor 1 (NRF1) levels associated with the mitochondrial biogenesis. Finally, (PhSe)2 could be a useful therapeutic alternative that would contribute to the liver recovery, controlling the quality of mitochondrial function and maintaining homeostasis and cellular health. / A insuficiência hepática aguda (IHA) induzida por paracetamol (APAP) é um processo complexo que envolve depleção de glutationa (GSH), mudanças no metabolismo energético e disfunção mitocondrial, o que resulta na incapacidade de manter o funcionamento adequado do órgão. Neste contexto, a utilização de compostos orgânicos de selênio como o difenil disseleneto (PhSe)2 tem se destacado nos últimos anos, devido as propriedades antioxidantes e efeitos hepatoprotetores, no entanto, o mecanismo pelo qual (PhSe)2 age não está totalmente esclarecido. Assim, este estudo busca aprofundar nossos conhecimentos sobre as ações do (PhSe)2 na disfunção mitocondrial assim como a sinalização intracelular durante a IHA induzida por APAP. Para tanto, estabelecemos primeiramente um parâmetro comparativo entre o composto orgânico de selênio e o antídoto clássico (N-acetil cisteina, NAC), em homogenato. O (PhSe)2 foi tão efetivo quanto NAC reduzindo os marcadores de dano oxidativo, auxiliado na manutenção dos níveis de GSH e aumentando o tempo de sobrevivência após a intoxicação por APAP. O tratamento com (PhSe)2 reduziu alterações morfológica, minimizou o dano quando analisamos histologicamente o tecido hepático e determinou uma redução nos níveis plasmáticos dos indicadores de dano hepatocelular (AST e ALT). Além disso, o (PhSe)2 foi eficaz na redução significativa do dano oxidativo ao limitar a peroxidação lipídica, formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, carbonilação de proteínas mitocondriais e viabilidade mitocondrial após a IHA induzida por APAP. Neste contexto, os níveis de antioxidantes não enzimáticos, tais como GSH, e enzimáticos, tais como as enzimas catalase, manganês superoxido dismutase, glutationa peroxidase e glutationa redutase, também foram mantidos semelhantes ao grupo controle. Em geral os resultados observados neste estudo indicam que um importante mecanismo pelo qual o (PhSe)2 exerce os seus efeitos terapêuticos está relacionado a manutenção da atividade do sistema de defesa antioxidante e inibição da transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) indicados pela redução do inchaço mitocondrial, preservação da atividade dos complexos respiratórios I, II e ATPase, e manutenção do gradiente de H+ com a formação do potencial de membrana mitocondrial (Δψm). Também observamos que o (PhSe)2 limita a perda do funcionamento bioenergético mitocondrial com a manutenção dos níveis adequados de fosforilação oxidativa (OXPHOS) e ativa a via das proteínas do choque térmico aumentando a expressão de HSP70, a qual apresenta um efeito modulador importante sobre a MPT preservando a viabilidade mitocondrial. O tratamento com (PhSe)2 foi efetivo em preservar níveis apropriados de citocinas envolvidas na recuperação do tecido hepático, tais como fator de necrose tumoral alfa (TNF- α), interleucina 6 (IL-6) e fator nuclear kappa B (NF-κB). Além disso, a manutenção bioenergética celular poderia estar associada com os elevados níveis transcricionais do receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PGC-1α) que auxilia a restaurar os níveis de fator nuclear respiratório 1 (NRF1) os quais estão envolvidos no processo de biogênese mitocondrial. Por fim, o (PhSe)2 poderia ser uma importante alternativa terapêutica a qual auxiliaria na recuperação do fígado, controle de qualidade mitocondrial e manutenção da homeostase e saúde celular.

Made available in DSpace on 2016-12-08T15:59:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese doutorado Anderson COMPLETA VERSAO 3.pdf: 4759464 bytes, checksum: a5e0058789d16b29bc737da2e0e29d6a (MD5) Previous issue date: 2013-03-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fundamentação: Evidências experimentais e clinicas apontam um estado gradativo de ativação imune-inflamatória em pacientes com insuficiência cardíaca (IC). Níveis elevados de diversas citocinas são encontrados na circulação e no músculo cardíaco de indivíduos com IC, correlacionando-se, invariavelmente, com o grau de gravidade da doença e agindo na disfunção endotelial, na indução de anemia, na apoptose miocitária e na perda gradativa de massa muscular esquelética. Existem controvérsias sobre a intensidade do exercício físico que mais favorece o tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca (IC). Tem sido sugerido que o exercício intervalado de alta intensidade poderia proporcionar melhores resultados em termos de qualidade de vida (QoL) e parâmetros fisiológicos. Neste contexto, pouco tem sido estudado sobre os inflamatórios. Objetivo: Verificar o efeito terapêutico do exercício físico agudo e crônico de diferentes intensidades no perfil inflamatório em pacientes com IC. Método: Ensaio clínico controlado randomizado, desenvolvido durante 12 semanas, com vinte dois pacientes homens diagnosticados com IC compensados, fração de ejeção menor que 45%, média de idade de 53,8±8 anos, classe II e III da NYHA, aleatoriamente distribuídos em dois grupos: grupo submetido a exercício de moderada intensidade (GMI), exercitando-se com frequência cardíaca (FC) correspondente ao limiar aeróbio e grupo de exercício intervalado de alta intensidade (GAI), exercitando-se com FC correspondente ao limiar anaeróbio. Ambos os grupos realizaram exercício aeróbio em esteira rolante, três vezes por semana, durante 60 minutos de sessão de exercício. Foram feitas avaliações em quatro momentos: antes e após a primeira sessão de exercício e antes e após a última sessão (36°). Os marcadores inflamatórios circulantes foram determinados pela concentração plasmática de interleucinas (IL-1, IL-6, IL-10), fator de necrose tumoral alfa (TNF-&#945;), proteína solúvel sCD40, fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e proteína quimiotática de monócitos -1 (MCP-1), dosados por ELISA. A proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70) de células mononucleares foi dosada por Western Bloting e Kit por Elisa. Estas proteínas foram dosadas em nível plasmático (repouso) e em situação de exercício físico e choque térmico, intra, extracelular e a razão de ambas as situações. Antes e após o programa de exercício foram realizadas avaliações da: da função cardíaca e endotelial pelo ecodoppel (ECO); desempenho cardiorrespiratório por meio da ergoespirometria (VO2pico) e teste de caminhada de seis minutos (6MWT); qualidade de vida (QoL) por Questionário de Minesotta e SF-36. Resultados: Nas vias de sinalização inflamatórias, comparando o basal com à ultima sessão, verificou-se diminuição da IL-6 (p<0,001) para ambos os grupos, com maior queda para o GAI, assim como para o TNF-&#945; comparando o mesmo momento. Na sessão de exercício, a mudança aguda aconteceu na última sessão para o TNF-&#945;, VEGF e IL-10 em ambos os grupos. A expressão HSP70 aumentou em ambos os grupos, antes e após a realização do exercício (p <0,01). O GMI apresentou maior conteúdo intracelular de HSP70 com o exercício quando comparado com GAI, sendo que no nível de exportação extracelular, ambos os grupos apresentaram a mesma resposta. O treinamento proporcionou aprimoramento das respostas anti-inflamatórias verificadas pelaa razão intra e extra celular de HSP70. Houve melhora significativa da função diastólica do ventrículo esquerdo, avaliada pelo E/E´, apenas para o GAI. O VO2pico aumentou significativamente em 8,3% e 11,2% para o GMI e GAI, respectivamente. Independente da intensidade de exercício, verificou-se melhora superior a 15% em todos os domínios da QoL. Conclusão: Em ambos os grupos foi verificado aprimoramento da resposta anti-inflamatória e citoprotetora ao exercício, aguda e cronicamente. Foram observados ganhos significativos na função diastólica de VE e endotelial, desempenho cardiorrespiratório e na QoL, sem diferenças estatística entre os grupos.

Os fogachos são a queixa mais comum das mulheres peri- e pós-menopausa e estão fortemente relacionados com a diminuição dos níveis de estrogênio. No entanto, a fisiopatologia deste sintoma vasomotor muito desagradável é ainda desconhecido. Por outro lado, o estradiol (E2) apresenta a capacidade de induzir a expressão de HSP72, um membro da família de 70 kDa das proteínas de choque térmico (HSP70), que são citoprotetoras e cardioprotetoras. Sabe-se que a expressão HSP70 é comprometida em doenças inflamatórias relacionadas com o envelhecimento. Por isso, questionamos se a capacidade do organismo de desencadear uma resposta ao choque térmico (Heat Shock Response) robusta, estaria ainda presente após a retirada, via castração, do E2. Para tanto, foram estudados os efeitos do choque térmico (Heat Shock - HS), através de uma sessão de banho de imersão, em ratas Wistar submetidas a ovariectomia bilateral (OVX), após um período de washout hormonal de 7 dias. Doze horas após o HS, os animais foram mortos e o arco aórtico foi excisado cirurgicamente para análises moleculares. Os resultados foram comparados com os marcadores de estresse oxidativo no plasma (superóxido dismutase, catalase e lipoperoxidação), pois é bem estabelecido que a expressão de HSP70 é sensível a regulação redox. A relação entre a iHSP70 (intracelular) e a eHSP70 (extracelular/plasma), proposto como um índice do estado inflamatório sistêmico, também foi investigada. Os resultados mostraram que a Heat Shock Response continua preservada em animais OVX, como inferido a partir da expressão de HSP70 (até 40% de aumento, p <0,01) nas aortas, o que não foi acompanhado por nenhuma outra alteração em marcadores de estresse oxidativo, parâmetros hematológicos e no controle glicêmico. Desta forma, sugerimos que a avaliação periódica do status de HSP70 (iHSP70 vs eHSP70) pode ser de extrema relevância clínica, pois a diminuição da capacidade de defesa do organismo via Heat Shock Response está no centro do aparecimento de disfunções relacionadas com a menopausa. / Hot flashes, the most common complaint of peri- and postmenopausal women, are tightly related to decrease in estrogen levels. However, the pathophysiology of this very unpleasant vasomotor symptom is greatly unknown. On the other hand, estradiol (E2) has been found to induce the expression of HSP72, a member of the 70 kDa family of heat shock proteins (HSP70), which are cytoprotective and cardioprotective. Since it has been noticed that HSP70 expression is compromised in age-related inflammatory diseases, we argued whether the capacity of triggering a robust heat shock (HS) response would be still present after E2 withdrawal. Hence, we studied the effects of HS treatment (hot tub) in female Wistar rats subjected to bilateral oophorectomy (OVX) after a 7 day washout period. Twelve hours after HS, the animals were killed and aortic arches were surgically excised for molecular analyses. The results were compared with oxidative stress markers in the plasma (superoxide dismutase, catalase and lipoperoxidation) because HSP70 expression is sensitive to redox regulation. Extracellular (plasma) to intracellular HSP70 ratio, an index of systemic inflammatory status, was also investigated. The results showed that HS response was preserved in OVX animals, as inferred from HSP70 expression (up to 40% rise, p<0.01) in the aortas, which was accompanied by no further alterations in oxidative stress, hematological parameters and glycemic control either. As a consequence, periodic evaluation of HSP70 status (iHSP70 vs eHSP70) may be of clinical relevance because decreased HS response capacity is at the center of the onset of menopause-related dysfunctions.

Os fogachos são a queixa mais comum das mulheres peri- e pós-menopausa e estão fortemente relacionados com a diminuição dos níveis de estrogênio. No entanto, a fisiopatologia deste sintoma vasomotor muito desagradável é ainda desconhecido. Por outro lado, o estradiol (E2) apresenta a capacidade de induzir a expressão de HSP72, um membro da família de 70 kDa das proteínas de choque térmico (HSP70), que são citoprotetoras e cardioprotetoras. Sabe-se que a expressão HSP70 é comprometida em doenças inflamatórias relacionadas com o envelhecimento. Por isso, questionamos se a capacidade do organismo de desencadear uma resposta ao choque térmico (Heat Shock Response) robusta, estaria ainda presente após a retirada, via castração, do E2. Para tanto, foram estudados os efeitos do choque térmico (Heat Shock - HS), através de uma sessão de banho de imersão, em ratas Wistar submetidas a ovariectomia bilateral (OVX), após um período de washout hormonal de 7 dias. Doze horas após o HS, os animais foram mortos e o arco aórtico foi excisado cirurgicamente para análises moleculares. Os resultados foram comparados com os marcadores de estresse oxidativo no plasma (superóxido dismutase, catalase e lipoperoxidação), pois é bem estabelecido que a expressão de HSP70 é sensível a regulação redox. A relação entre a iHSP70 (intracelular) e a eHSP70 (extracelular/plasma), proposto como um índice do estado inflamatório sistêmico, também foi investigada. Os resultados mostraram que a Heat Shock Response continua preservada em animais OVX, como inferido a partir da expressão de HSP70 (até 40% de aumento, p <0,01) nas aortas, o que não foi acompanhado por nenhuma outra alteração em marcadores de estresse oxidativo, parâmetros hematológicos e no controle glicêmico. Desta forma, sugerimos que a avaliação periódica do status de HSP70 (iHSP70 vs eHSP70) pode ser de extrema relevância clínica, pois a diminuição da capacidade de defesa do organismo via Heat Shock Response está no centro do aparecimento de disfunções relacionadas com a menopausa. / Hot flashes, the most common complaint of peri- and postmenopausal women, are tightly related to decrease in estrogen levels. However, the pathophysiology of this very unpleasant vasomotor symptom is greatly unknown. On the other hand, estradiol (E2) has been found to induce the expression of HSP72, a member of the 70 kDa family of heat shock proteins (HSP70), which are cytoprotective and cardioprotective. Since it has been noticed that HSP70 expression is compromised in age-related inflammatory diseases, we argued whether the capacity of triggering a robust heat shock (HS) response would be still present after E2 withdrawal. Hence, we studied the effects of HS treatment (hot tub) in female Wistar rats subjected to bilateral oophorectomy (OVX) after a 7 day washout period. Twelve hours after HS, the animals were killed and aortic arches were surgically excised for molecular analyses. The results were compared with oxidative stress markers in the plasma (superoxide dismutase, catalase and lipoperoxidation) because HSP70 expression is sensitive to redox regulation. Extracellular (plasma) to intracellular HSP70 ratio, an index of systemic inflammatory status, was also investigated. The results showed that HS response was preserved in OVX animals, as inferred from HSP70 expression (up to 40% rise, p<0.01) in the aortas, which was accompanied by no further alterations in oxidative stress, hematological parameters and glycemic control either. As a consequence, periodic evaluation of HSP70 status (iHSP70 vs eHSP70) may be of clinical relevance because decreased HS response capacity is at the center of the onset of menopause-related dysfunctions.

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INTRODUÇÃO: A deiscência das anastomoses colorretais continua uma grave complicação da cirurgia colorretal. Pouco se sabe sobre as alterações moleculares que podem influenciar esse processo, mas entende-se que a síntese do colágeno é fundamental para uma adequada cicatrização. As Heat Shock Proteins (HSP) estão expressas em situações de estresse, tais como a hipovolemia, além de participarem da síntese do colágeno. Além disso, há poucas informações sobre a expressão da HSP70 nos processos cicatriciais. OBJETIVOS: Determinar a expressão da HSP70 no intestino grosso e nas anastomoses intestinais de ratos normo e hipovolêmicos, bem como a quantidade do colágeno total e a qualidade das células inflamatórias envolvidas nesse processo, além de correlacioná-las. MÉTODOS: Utilizaram-se 40 ratos Wistar que foram divididos em seis grupos. Submeteram-se 24 animais a cateterização da artéria carótida, seguida de sangramento (20% da volemia); destes, 8 foram submetidos somente à hipovolemia e, os outros 16, à hipovolemia seguida de colectomia (direita e esquerda). Dividiram-se os outros 16 animais em dois grupos: em oito realizou-se colectomia direita e nos outros oito, esquerda. Os espécimes foram avaliados no 7º e no 14º dia de pósoperat ório (PO). Pela coloração de Hematoxilina-eosina, avaliaram-se as células inflamatórias e a presença de necrose nas anastomoses, pelo método de Picrossírius, a quantidade de colágeno e por imunohistoquímica, a expressão da HSP70. RESULTADOS: A expressão da HSP70 no intestino grosso diminuiu com a hipovolemia (p<0,05). Não houve diferença estatística entre as células inflamatórias encontradas nas anastomoses dos grupos estudados. A quantidade de colágeno foi menor no 7º que no 14º dia de pósoperat ório (p<0,05), diferentemente da expressão da HSP70, que foi maior no 14º que no 7º dia (p<0,05). No 7º dia, a quantidade de colágeno estava menor no grupo desafio que no grupo controle (p<0,05), fato que não se repetiu no 14º dia de pós-operatório. Em relação à expressão da HSP70 nas anastomoses intestinais, não houve diferença estatística entre o grupo desafio e o controle, mas no à direita, tanto no 7º quanto no 14º dia houve tendência à diferença significativa. CONCLUSÕES: A expressão da HSP70 no intestino grosso é afetada pela hipovolemia, aumenta na cicatrização das anastomoses e é mais evidente quando a quantidade de colágeno é menor. A expressão da HSP70 pode ser um potencial marcador biológico das complicações das anastomoses intestinais. / INTRODUCTION: The anastomotic leakage remains a serious complication in surgery of large bowel. The influence about the molecular mechanisms involved at this process is barely known, but its well known that collagen synthesis is essential for good healing. The Heat Shock Proteins (HSP) are expressed at stress situations, such as hypovolemia, also they are involved at the process of collagen synthesis. Besides, there are a few information about HSP70 expression at the healing process. OBJECTIVES: To determine the HSP70 expression at large bowel and intestinal anastomoses in normal and hypovolemic rats, as well as the amount of collagen and the quality of the inflammatory cells involved at this process, and correlate them. METHODS: It was used fourty Wistar rats divided into six groups. Twenty-four rats were submitted to catheterization of carotida artery followed by withdraw of 20% of their blood volume; eight of them were underwent just to hypovolemia and the others sixteen to hypovolemia followed by colectomy (right and left). The remaining sixteen rats were divided into two groups: eight of them were underwent to right colectomy and eight to the left. The specimens were analyzed at the seventh and fourteenth postoperative (PO) days. The inflammatory cells were assessed by Hematoxilin-eosin, the amount of collagen was stained by red Picrossirius and the HSP70 expression was determined by immunohistochemical study. RESULTS: The HSP70 expression at the large bowel gets lower when there is hypovolemia (p<0.05). There was no statistic difference on the inflammatory cells found in the groups. The amount of collagen was lower at the seventh than the fourteenth day (p<0.05), unlikely the HSP70 expression, which was the opposite (p<0.05). At the seventh day, the amount of collagen was lower at the study group than at the control group (p<0.05), otherwise at the fourteenth postoperative day. There was no statistic difference in HSP70 expression at the anastomoses of the groups, but at the right colon, there was disposition to significative difference at both days. CONCLUSION: The HSP70 expression at the large bowel is modified by hypovolemia, increases at the anastomoses healing and is more evident when the amount of collagen is lower. The HSP70 expression can be a potential biological marker of the complication of these anastomoses

O conhecimento a respeito de mecanismos de reprodução e geração de diversidade genética de organismos do gênero Leishmania vem sendo alterado com o advento de novas tecnologias. Estudos de laboratório demonstraram ocorrência de reprodução sexuada experimentalmente em organismos do gênero Leishmania. Relatos na literatura mostram a ocorrência de híbridos no ambiente natural, associada a casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA). A partir da caracterização fenotípica realizada utilizando anticorpos monoclonais e eletroforese de isoenzimas em linhagens isoladas de pacientes com LTA na região Amazônica do Brasil, sete isolados (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 e M19697) apresentaram um padrão intermediário entre as espécies L. (V.) shawi shawi e L. (V.) guyanensis. O presente estudo visou realizar a confirmação da identidade híbrida desses parasitas através da clonagem dos isolados, seguida da análise do polimorfismo pela clivagem do produto da reação em cadeia da polimerase (PCR RFLP) tendo como alvo a enzima de choque térmico de 70 quilodaltons (hsp70). O hsp70 PCR RFLP também foi utilizado para análise comparativa da intensidade dos produtos de digestão, para estimar a ploidia dos híbridos e a proporção da herança dos alelos de hsp70. Foi realizada ainda, avaliação do comportamento biológico in vitro e experimental in vivo desses parasitas. A curva de crescimento foi realizada na 4° e 12° passagem após isolamento do parasita. Infecções experimentais de BALB/c foram realizadas para avaliação da evolução da infecção causada pelo isolado híbrido selvagem M19672 e sua comparação com as cepas parentais L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi. Foi determinada a carga parasitaria em pele, linfonodo e baço dos animais infectados e análise histopatológica das lesões. Os resultados obtidos a partir da clonagem dos isolados demonstraram que se tratavam de populações homogêneas de parasitas. Três isolados apresentaram padrão heterozigoto de L. (V.) guyanensis/L. (V.) s. shawi e quatro isolados apresentaram padrão homozigoto, apresentando somente os alelos de L. (V.) s. shawi. O ensaio de clivagem de sequências polimórficas amplificadas (SNP-CAPS) mostrou que os homozigotos apresentaram o mesmo número de cópias de hsp70 de L. (V.) s. shawi, enquanto que nos heterozigotos os alelos de L. (V.) guyanensis são mais representativos. Os parasitas híbridos apresentaram uma maior plasticidade fenotípica no crescimento in vitro. A infeção de BALB/c pelos parasitas híbridos apresentou uma evolução rápida tendo seu maior pico entre 14 e 28 dias pós-infecção, com regressão posterior da lesão. Esse período foi acompanhado da maior carga parasitária na pele e linfonodo. A infecção causada pelas cepas parentais mostrou aumento progressivo da lesão a partir do 21° dia de infecção para L. (V.) guyanensis e 35° dia para L. (V.) s.shawi. As alterações histopatológicas da lesão causada pelo híbrido apresentaram um padrão intermediário entre as de L. (V.) s. shawi e L. (V.) guyanensis, guardando, no entanto, mais características desta última. Nossos achados confirmam que as cepas analisadas são híbridas entre L. (V.) guyanensis e L. (V.) s. shawi da região do Baixo Amazonas, estado do Pará, área com alta ocorrência de casos de LTA na Brasil e grande diversidade de espécies do parasita, vetores e reservatórios / Knowledge about the mechanisms of reproduction and generation of genetic diversity of the genus Leishmania organisms has been changed with the advent of new technologies for it studies. Laboratory researches have shown the occurrence of experimentally sexual reproduction in the genus Leishmania. Reports in the literature shows the occurrence of hybrids in the natural environment, associated with cases of american cutaneous leishmaniasis (ACL). From the phenotypic characterization performed using monoclonal antibodies and isozymes in strains isolated from patients with ACL in the Amazon region of Brazil, seven isolates (M15983, M15984, M15987, M15988, M19672, M19676 and M19697) showed an intermediate pattern between species L. (V.) shawi shawi and L. (V.) guyanensis. This study aimed to perform the confirmation of the hybrid identity of these parasites by performing cloning of the isolated, followed by analysis of polymorphism by cleavage of the polymerase chain reaction product (PCR RFLP) targeting heat shock enzyme 70 kilodaltons (hsp70). The hsp70 PCR RFLP was also used for comparative analysis of the intensity of the digestion products to estimate the ploidy of the hybrids and the proportion of the inheritance of hsp70 alleles. It was also observed in this study the biological in vitro behavior of these parasites. The growth curve in vitro was held at 4° and 12° passage after the isolation of mammalian host. Experimental infections of BALB /c mice were carried out to evaluate the evolution of the infection caused by the hybrid wild strain M19672 compared to the parental strains L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi. The parasitic load was determined on the skin, lymph nodes and spleen of infected animals and histopathology of the lesions. The results from the cloning of the isolates showed that these are homogeneous populations of parasites. Three isolates presented heterozygous L.(V.) guyanensis/ L.(V.) s. shawi pattern and four presented homozygous pattern with only the L.(V.) s. shawi alleles. The cleavage amplified polymorphic sequences assay (SNP-CAPS) showed that the homozygous had the same number of copies of hsp70 L. (V.) s. shawi, whereas in the heterozygous alleles L. (V.) guyanensis are more representative. Hybrid parasites demonstrated a higher phenotypic plasticity growth in vitro. BALB /c infection by M19762 hybrids showed a rapid evolution with a peak between 14 and 28 days post-infection, with subsequent lesion regression. The period of greatest development of the lesion was accompanied by higher parasite burden in the skin and lymph nodes. The infection caused by parental strains showed a progressive increase in the lesion from the 21th day of infection for L. (V.) guyanensis, and day 35 PI for L. (V.) s. shawi The alteration in the histopathological lesions caused by the hybrid strain showed an intermediate pattern between those of L. (V.) s. shawi and L. (V.) guyanensis, keeping, however, more characteristics of the latter. Our findings confirm that the strains analyzed are true hybrids between L. (V.) guyanensis and L. (V.) s. shawi from Amazon region, Pará state, an area with high occurrence of ACL in Brazil and diversity of parasite species, vectors and reservoirs