INTRODUÇÃO: A deiscência das anastomoses colorretais continua uma grave complicação da cirurgia colorretal. Pouco se sabe sobre as alterações moleculares que podem influenciar esse processo, mas entende-se que a síntese do colágeno é fundamental para uma adequada cicatrização. As Heat Shock Proteins (HSP) estão expressas em situações de estresse, tais como a hipovolemia, além de participarem da síntese do colágeno. Além disso, há poucas informações sobre a expressão da HSP70 nos processos cicatriciais. OBJETIVOS: Determinar a expressão da HSP70 no intestino grosso e nas anastomoses intestinais de ratos normo e hipovolêmicos, bem como a quantidade do colágeno total e a qualidade das células inflamatórias envolvidas nesse processo, além de correlacioná-las. MÉTODOS: Utilizaram-se 40 ratos Wistar que foram divididos em seis grupos. Submeteram-se 24 animais a cateterização da artéria carótida, seguida de sangramento (20% da volemia); destes, 8 foram submetidos somente à hipovolemia e, os outros 16, à hipovolemia seguida de colectomia (direita e esquerda). Dividiram-se os outros 16 animais em dois grupos: em oito realizou-se colectomia direita e nos outros oito, esquerda. Os espécimes foram avaliados no 7º e no 14º dia de pósoperat ório (PO). Pela coloração de Hematoxilina-eosina, avaliaram-se as células inflamatórias e a presença de necrose nas anastomoses, pelo método de Picrossírius, a quantidade de colágeno e por imunohistoquímica, a expressão da HSP70. RESULTADOS: A expressão da HSP70 no intestino grosso diminuiu com a hipovolemia (p<0,05). Não houve diferença estatística entre as células inflamatórias encontradas nas anastomoses dos grupos estudados. A quantidade de colágeno foi menor no 7º que no 14º dia de pósoperat ório (p<0,05), diferentemente da expressão da HSP70, que foi maior no 14º que no 7º dia (p<0,05). No 7º dia, a quantidade de colágeno estava menor no grupo desafio que no grupo controle (p<0,05), fato que não se repetiu no 14º dia de pós-operatório. Em relação à expressão da HSP70 nas anastomoses intestinais, não houve diferença estatística entre o grupo desafio e o controle, mas no à direita, tanto no 7º quanto no 14º dia houve tendência à diferença significativa. CONCLUSÕES: A expressão da HSP70 no intestino grosso é afetada pela hipovolemia, aumenta na cicatrização das anastomoses e é mais evidente quando a quantidade de colágeno é menor. A expressão da HSP70 pode ser um potencial marcador biológico das complicações das anastomoses intestinais. / INTRODUCTION: The anastomotic leakage remains a serious complication in surgery of large bowel. The influence about the molecular mechanisms involved at this process is barely known, but its well known that collagen synthesis is essential for good healing. The Heat Shock Proteins (HSP) are expressed at stress situations, such as hypovolemia, also they are involved at the process of collagen synthesis. Besides, there are a few information about HSP70 expression at the healing process. OBJECTIVES: To determine the HSP70 expression at large bowel and intestinal anastomoses in normal and hypovolemic rats, as well as the amount of collagen and the quality of the inflammatory cells involved at this process, and correlate them. METHODS: It was used fourty Wistar rats divided into six groups. Twenty-four rats were submitted to catheterization of carotida artery followed by withdraw of 20% of their blood volume; eight of them were underwent just to hypovolemia and the others sixteen to hypovolemia followed by colectomy (right and left). The remaining sixteen rats were divided into two groups: eight of them were underwent to right colectomy and eight to the left. The specimens were analyzed at the seventh and fourteenth postoperative (PO) days. The inflammatory cells were assessed by Hematoxilin-eosin, the amount of collagen was stained by red Picrossirius and the HSP70 expression was determined by immunohistochemical study. RESULTS: The HSP70 expression at the large bowel gets lower when there is hypovolemia (p<0.05). There was no statistic difference on the inflammatory cells found in the groups. The amount of collagen was lower at the seventh than the fourteenth day (p<0.05), unlikely the HSP70 expression, which was the opposite (p<0.05). At the seventh day, the amount of collagen was lower at the study group than at the control group (p<0.05), otherwise at the fourteenth postoperative day. There was no statistic difference in HSP70 expression at the anastomoses of the groups, but at the right colon, there was disposition to significative difference at both days. CONCLUSION: The HSP70 expression at the large bowel is modified by hypovolemia, increases at the anastomoses healing and is more evident when the amount of collagen is lower. The HSP70 expression can be a potential biological marker of the complication of these anastomoses

A lesão pulmonar é determinante da morbi-mortalidade na pancreatite aguda (PA). Neutrófilos (PMN) e mediadores inflamatórios são responsáveis pelo desenvolvimento da lesão. A solução hipertônica modula a reposta inflamatória tendo como resultante um efeito imunomodulatório capaz de prevenir a lesão tecidual. Neste trabalho, investigamos os efeitos da solução hipertônica sobre os níveis de HSPs, MMPs e citocinas no tecido pulmonar, bem como, o mecanismo envolvido em sua regulação. Ratos machos Wistar foram submetidos a pancreatite pela injeção retrógrada de 1 ml/Kg de taurocolato de sódio 2,5%. Os animais foram randomizados em 4 grupos: 1) controle: não foi submetido a qualquer procedimento; 2) pancreatite sem tratamento (ST); 3) pancreatite e tratamento com solução fisiológica (SF); 4) pancreatite e tratamento com solução hipertônica (SH). Os animais dos grupos 3 e 4 tiveram a veia jugular cateterizada e receberam infusão de solução hipertônica ou fisiológica 1 hora após a indução de pancreatite. Os animais com PA foram sacrificados após 4, 12 e 24 horas. Os pulmões foram processados e submetidos a histologia com HE e dosagem de mieloperoxidase (MPO) para quantificação do infiltrado de neutrófilos. A produção e atividade das MMPs 2 e 9 foi analisada por zimografia. Western Blotting foi utilizado na detecção das HSPs 60, 70 e 90. As alterações na expressão gênica foram analisadas por RTPCR. Os níveis de peroxidação lipidica dosados por TBARs. A concentração de citocinas foi medida por ELISA. A reposição volêmica com SHT diminui o infiltrado inflamatório (PMN) 12 horas após a indução da PA. Concomitante a redução dos PMNs vimos a queda na atividade e expressão da MMP-9 e aumento da expressão protéica de HSP70 no tecido pulmonar. Tardiamente, 24 horas, o grupo tratado com SHT mostrou aumento na produção de IL-10, uma citocina anti-inflamatória. A SHT modula a resposta inflamatória, promovendo proteção ao tecido pulmonar contra os efeitos deletérios decorrentes da PA. Seus efeitos benéficos envolvem alterações celulares e moleculares que levam à redução da lesão tecidual. / Acute Pancreatitis (AP) is an inflammatory process of the pancreas with variable involvement of other organs and systems. The lungs are the most common distant organs affected by severe acute pancreatitis. The immunomodulatory effects of hypertonic solution (HS) provide potential strategies to attenuate inappropriate inflammatory reactions. This study tested the hypothesis that administration of HS modulates the development of lung injury in pancreatitis model. HS resuscitation results in a significant attenuation of lung injury following AP by modulate MMP 2 and 9 activity and protected tissue by increased HSPs 70 and 90 expression.

Orientador: Jaime Amaya-Farfán / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T15:34:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_CarolinaSoaresde_M.pdf: 1533232 bytes, checksum: 1141b4840c5a0f9342072967abfece65 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As heat shock proteins (HSPs), ou proteínas do estresse, correspondem a um importante sistema de defesa celular que é capaz de proteger e reparar danos causados ao organismo, conferindo à célula maior tolerância e resistência contra situações de alteração na homeostase, sendo também consideradas como um sistema antioxidante complementar. A glutamina é conhecida pelo seu potencial em promover o aumento na HSP70 contra diversas situações agressoras. As proteínas do soro do leite (PSL) contêm concentrações elevadas de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAAs), sendo estes substratos para a síntese de glutamina, por meio da enzima glutamina sintetase. Objetivo: o objetivo deste trabalho foi observar a influência do consumo das proteínas do soro do leite (PSL), na forma concentrada (PSLC) e hidrolisada (PSLH), na concentração da HSP70 em ratos exercitados em esteira rolante. Metodologia: foram utilizados 48 ratos Wistar machos (290g ± 8g) divididos primeiramente pelo regime de atividade física em sedentários (S) e exercitados (E), e cada um desses, subdividido em outros três grupos, segundo a dieta. As dietas foram baseadas na AIN93-G, com substituição da fonte protéica da seguinte forma: PSLC, PSLH e caseína (CAS), como controle. O período em dieta experimental foi de 3 semanas, e os animais exercitados foram submetidos a 5 sessões de exercício a 22m/min durante 30 minutos como fonte de estresse térmico, na última semana de vida. Resultados: os resultados revelaram que o consumo da PSLH no grupo exercitado promoveu o aumento da HSP70 em pulmão, e nos músculos sóleo e gastrocnêmio. O consumo da PSLH aumentou os níveis de glutamato, isoleucina e leucina livres no plasma dos animais sedentários. Quando exercitado, o grupo PLSH teve redução no glutamato, leucina e valina (substratos envolvidos na síntese de glutamina) plasmáticos e aumento da enzima glutamina sintetase (GS) no sóleo, sugerindo o provável uso desses aminoácidos para proporcionar o aumento na HSP70. Em adição à elevação da GS, houve também aumento concomitante da concentração de corticosterona no grupo PSLH exercitado, sugerindo a influência do hormônio na enzima. Em relação ao possível dano oxidativo, avaliado pela geração de proteínas carboniladas, os grupos que consumiram PSLC e PSLH reduziram seus valores no plasma e, somente a PSLH, no gastrocnêmio. Houve preservação das proteínas totais e albumina nos grupos PSLC, PSLH exercitados. O ácido úrico aumentou no grupo PSLH exercitado, enquanto que a creatinina aumentou na PSLC, independente do exercício. A glicose foi reduzida nos animais sedentários que consumiram PSLH, porém as variações dos parâmetros sempre permaneceram dentro da normalidade. Nenhum efeito adverso ao consumo das diferentes fontes protéicas foi observado no rim ou no fígado, oriundo da mensuração das enzimas AST, ALT e o metabólito ureia respectivamente. Conclusão: os resultados indicam que o consumo da PSLH pode potencializar a resposta da HSP70, sugerindo aumento na proteção endógena e antioxidante, e que a PSLH possa ser mais estresse-responsiva em ratos submetidos ao exercício / Abstract: The heat shock proteins (HSPs), or stress proteins, correspond to an important cell defense system, whose function is to protect and repair injuries caused to the body, conferring the cell greater tolerance and resistance against altered homeostasis states, and for this reason they have been considered as a complementary antioxidant system. Glutamine in turn has been found to promote the increase of HSPs associated to various situations of stress. The milk whey proteins contain elevated concentrations of branched-chain amino acids (BCAAs), which can participate in the synthesis of glutamine via glutamine synthetase. Objective: the objective of this work was to assess the influence of the intake of the whey proteins either in the form of a concentrate (WPC) or a hydrolyzate (WPH) in enhancing the concentration of HSP70 in rats exercised in the treadmill. Methods: Forty-eight male Wistar rats (290 ± 8g) were divided, first, into two categories according to the level of physical activity: sedentary (S) and exercised (E), and each one subdivided into three groups according to the source of protein in the diet. The diets were based on the standard AIN93-G, formulated containing either WPC, WPH or casein (CAS), as the sole source of protein. The animals consumed the experimental diets for three weeks and those belonging to the exercised group were submitted to training 5 sessions on the last week of life. Results: the results showed that consumption of the WPH promoted the increase of HSP70 in lung, soleus and gastrocnemius in the exercised animals. Increases in plasma free glutamate, isoleucine and leucine of the sedentary rats were also observed. When exercised, the WPH group exhibited a reduction in the plasma levels of glutamate, leucine and valine (all involved in the synthesis of glutamine), plus an increase in the enzyme glutamine synthetase (GS) in the soleus muscle, thus suggesting a probable utilization of this amino acids, as a substrate, in the increase of HSP70. Considering that there was also an elevation of the corticosterone levels in the exercised cohorts that consumed the WPH, the concomitant increase of GS, suggested that the hormone exerted an influence on the enzyme. With regard to a possible oxidative damage, as assessed by the presence of carbonyls proteins, the group that consumed both of the whey proteins (WPC, WPH) exhibited lower plasma levels, but only the WPH reduced the levels in the gastrocnemius. Both total plasma proteins and albumin were preserved in the exercised animals. Uric acid was found to increase in the WPH exercised group, while creatinine increased in the WPC group, regardless of the exercise. Plasma glucose levels were also lowered in the sedentary animals that consumed the WPH diet, but at no time, did the increased or decreased levels of these parameters extrapolated normality. Additionally, from the AST, ALT and urea data, no adverse effects on either liver or kidney could be detected with the intake of the different proteins sources. Conclusion: from these results, it can be concluded that consumption of the WPH, in contrast to WPC or CAS, can enhance the HSP70 response suggesting a magnified endogenous and antioxidant protection, and that the hydrolyzed whey protein can be more stress-responsive / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

The exposure of plants to high salt concentrations causes accumulation of sodium ions. This leads to the inability of the plants to uptake water, a disturbance of ion homeostasis, a decrease in photosynthesis and oxidative stress. As a result of the salt stress, the availability of NADPH decreases. The adaptation to the concentrations of salt depends on plant's ability to compensate for the decreased availability of NADPH, which can be further used in antioxidative cycles and the synthesis of antioxidative compounds and osmoprotectants. In this work, the reduction of relative water content, a decrease in the Rubisco enzyme activity, an increase of Hsp70 in the leaves and an increase in the accumulation of sodium ions was shown in cucumber plants (Cucumis sativa L. convar. Jogger F1) exposed to salt stress (100 mM NaCl). As a consequence of salt stress, an increase in the activity of NADPH providing enzymes was found. Particularly on the second and third day of salt stress, an increase in the activity (up to 270 %) of: NADP-isocitrate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, NADP-malic enzyme, non-phosphorylating glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in leaves was detected. The activity of less abundant NADP-dehydrogenases (glucose 1-dehydrogenase, gluconate 2-dehydrogenase, galactose...

The centromeres of eukaryotes have a region on which the kinetochore is assembled, flanked by heterochromatin which provides cohesion between the sister chromatids during cell division. When centromeric heterochromatin is lost chromosomes no longer segregate evenly into the daughter cells during cell division. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) RNA interference (RNAi) is responsible for maintaining this heterochromatin. The pathway is part of a feedback loop whereby siRNAs generated from non-coding centromere transcripts are loaded into an Argonaute complex. The siRNAs guide the complex to the homologous centromere repeats in order to recruit Clr4 which modifies histone H3 with the heterochromatin mark H3K9me. A previous screen to find factors affecting centromere silencing isolated 13 loci termed centromere: suppressor of position-effect (csp) 1-13. Several csp mutants have been identified to be RNAi components. In this investigation the csp6 locus has been identified to be the Hsp70 gene ssa2+. It has been demonstrated that Argonaute proteins from plants and flies require Hsp70/90 chaperone activity for loading of siRNA. It therefore seems likely that Hsp70 may play a similar role in fission yeast. Genetic and biochemical techniques have been used in this study to investigate if the csp6 alleles are affecting siRNA loading in S. pombe. RNA Polymerase II (RNAPII) transcribes the pre-siRNA transcripts from the centromere repeats. csp3 was identified to be an allele of the RNAPII subunit rpb7+. rpb7-G150D was found to cause a silencing defect in the centromeric heterochromatin through a defect in transcription. Another RNAPII mutation, rpb2-m203, was found to have strong silencing defects caused by an unidentified non-transcriptional role in RNAi-mediated heterochromatin formation at the centromere. In order to gain more insight into the role of RNAPII in heterochromatin assembly I performed a screen in which the subunits rpb3 and rpb11 were subjected to random mutagenesis. Several mutants were isolated and characterisation of phenotypes regarding heterochromatin at the centromere has been carried out for nine of the mutants. As a result a novel phenomenon of RNAi-independent silencing at the centromere has been discovered.

O aumento do consumo de oxigênio durante o exercício pode causar uma maior produção de espécies reativas do oxigênio (ERO), por outro lado, as defesas antioxidantes (AO) podem adaptar-se e aumentar sua atividade através da exposição ao exercício regular. A desidratação e a depleção de carboidratos podem ser as causas da fadiga durante o exercício. É possível que a expressão de HSPs possa complementar a defesa enzimática antioxidante. Este estudo tem como objetivo comparar os efeitos de hidratação com água (WAT) ou bebida esportiva (CHO-E) sobre parâmetros de estresse oxidativo em atletas futebolistas submetidos a um protocolo de exercício intermitente. A amostra foi composta por 30 atletas futebolistas de 2 times de futebol em 2 protocolos de experimentais, 18 atletas foram analisados em um protocolo sem reposição de fluídos e 12 atletas foram analisados com reposição de WAT e CHO-E. As coletas de sangue foram realizadas antes, depois e 6 horas após a realização de um protocolo de exercício intermitente. A reposição de líquidos (200 ml) foi efetuada a cada 20 minutos. O exercício físico intermitente por si só foi capaz de gerar aumento nos parâmetros de estresse oxidativo. A utilização de água (WAT) não alterou atividade das enzimas antioxidantes SOD e CAT e os níveis de dano oxidativo a proteínas, porem aumentou os níveis de peroxidação lipídica e expressão de HSP70. A Reposição com CHO-E aumentou significativamente a atividade da enzima SOD, o dano oxidativo a proteínas e não alterou outros parâmetros. Os grupos WAT e CHO-E não apresentaram diferenças significativas na sua taxa de sudorese, percentual de desidratação, perda de suor e osmolalidade plasmática quando comparados. No entanto o grupo CHO-E apresentou uma maior glicemia após o exercício. Concluímos que a reposição de carboidratos deve ser realizada com cautela, e mais estudos, com quantidades diferentes de carboidratos devem ser efetuados para uma prescrição nutricional segura durante o exercício. / The increase of oxygen consumption during exercise can result a higher production of reactive oxygen species (ERO),on the other hand, the antioxidant defenses (AO) can be adapted and increase its activity through the exposition to regular exercise. The dehydration and the carbohydration depletion can be the factor of fatigue during the exercise. Its Possible that the expression of HSPs can complement the antioxidant enzymatic defense. This study objective compare the effect of exercise and fluid repleacemet with water (WAT) or sport drink (CHO-E) on parameters of oxidative stress in soccers players submitted a protocol of intermittent exercise. The sample was composed for 30 athletes of 2 teamses of soccer in 2 experimental protocols , 18 athletes had been analyzed in a protocol without fluid replacement and 12 athletes had been analyzed with replacement of WAT and CHO-E. The blood samples had been carried through before, later and 6 hours after intermittent exercise. The fluid replacement (200 ml) was realized to each 20 minutes. The intermittent exercise by itself was capable to generate increase in the ofoxidative stress parameters. The WAT did not modify SOD and CAT enzymes activities, carbonyl proteins, but increased the levels of lipid peroxidation and HSP70 expression. The Replacement with CHO-E significantly increased the SOD enzyme activity, the oxidative damage of proteins and it did not modify other parameters. Groups WAT and CHO-E had not presented significant differences in sweat rate, dehydration, sweat loss and osmolality when compared. However group CHO-E presented a increase in blood glucose ater after the exercise. We conclude that carbohydrate replacement must be carried through with caution, and more studies, with different amounts of carbohydrate must be made for a secure nutritional reposition during the exercise.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores, tais como processos inflamatórios, estresse oxidativo, endotoxinas bacterianas, infecções e febre. Este efeito citoprotetor é principalmente atribuído à habilidade de as proteínas de choque térmico estabilizarem estruturas protéicas através de interações reversíveis. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Previamente, nós descrevemos a relação entre os níveis de HSP70 sérica, o estatus oxidante e o desfecho clínico de pacientes sépticos; o grupo de pacientes com maiores níveis pró-oxidantes e maiores níveis de HSP70 sérica também foi aquele que houve maior mortalidade. Afim de investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada, e a produção de nitrito, proliferação celular, viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de TNF-α e atividade fagocítica foram avaliadas. Também foram avaliadas as modificações estruturais causadas pela oxidação na HSP70 purificada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os efeitos modulatórios da HSP70 oxidada sobre a linhagem de macrófagos RAW 264.7 foram diferentes dos efeitos modulatórios da HSP70 nativa. Os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli, such as inflammation, oxidative stress, hypoxia, endotoxins, infections and fever. This cytoprotective effect is mainly attributed to their ability to stabilize protein structures through chaperon-like reversible interactions. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. Previously, we have described the relationship between serum HSP70 levels, oxidant status and clinical outcome of septic patients; the group of patients with higher pro-oxidant status and higher serum HSP70 had also higher mortality. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70 and evaluated nitrite production, cell proliferation, cell viability, reactive oxygen species production, TNF-α release and phagocytic activity. We also evaluated structural modifications caused by oxidation in purified HSP70. Oxidation of HSP70 altered its protein structure; besides, the modulatory effect of oxidized HSP70 on RAW265.7 cells was different from native HSP70. Macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability.

Upon exposure to heat or cold, Arabidopsis thaliana seedlings undergo rapid transcriptional reprogramming of several hundreds of genes that promote stress tolerance. Despite extensive characterisation of the transcriptional responses to these stimuli, however, relatively little is known about the mechanisms by which temperature signals are perceived and transduced in plant cells. High or low seasonal temperatures have large impacts on crop productivity and are expected to intensify given current global climatic projections. It is therefore of agricultural importance to better understand temperature signalling pathways in plants in order to find solutions to this problem. In this thesis, a chemical genomics screen for molecules activating or repressing heat-inducible genes in A. thaliana was performed in collaboration with Syngenta and the biological targets of these chemicals were predicted based on structural similarities to compounds with known modes of action. Many molecules that affect the function of chloroplasts or mitochondria either activate or repress heat-responsive genes, thus implicating these organelles in the regulation of plant temperature responses. In addition, the translation inhibitor cycloheximide was identified as a repressor of heat-inducible genes and an activator of early cold-inducible genes. Diverse translation inhibitors trigger a cytosolic influx of calcium ions and several inhibitors of translation elongation were found to strongly activate cold-inducible gene expression in a calcium-dependent manner. Furthermore, it was demonstrated that cold shock causes rapid translation repression in A. thaliana seedlings and that the elongation factor LOS1 is involved in cold- or cycloheximide-induced gene expression, thus implicating translational machinery in the regulation of temperature signalling in plants. Finally, one of the chemicals identified in the screen, S01A463859Y, was found to improve heat resilience in A. thaliana and may therefore be of potential use in enhancing crop productivity during thermal stress.

L'érythropoïèse est le processus permettant la production de globules rouges matures à partir de cellules souches hématopoïétiques. Ce programme de différenciation est en grande partie sous le contrôle du facteur de transcription GATA-1 qui active la transcription des gènes érythroïdes et de la protéine anti-apoptotique Bcl-xL. Au cours de l'apoptose, la caspase-3 clive GATA-1 induisant la diminution d'expression de Bcl-xL. Il a été montré que l'activation transitoire de la caspase-3 est indispensable pour la différenciation érythroïde terminale, mais GATA-1 n'est pas clivé. Dans ce travail, nous montrons qu'à la différence du proccessus apoptotique induit par la privation en Epo, au cours de la différenciation érythroïde, GATA-1 est protégé du clivage de la caspase-3 par la protéine chaperonne Hsp70. Au moment de l'activation de la capase-3, Hsp70 s'accumule dans le noyau des érythroblastes et protège GATA-1, permettant ainsi l'expression de Bcl-xL. Par contre, lors de la privation en Epo, Hsp70 est exportée du noyau et GATA-1 est clivé par la caspase-3 ce qui induit l'apoptose. D'autre part, la surexpression de GATA-1 induit un blocage de la maturation donc, l'expression de GATA-1 doit être finement régulée pour permettre une différenciation érythroïde normale. Nous avons montré qu'Hsp27 s'accumule dans le noyau des érythroblastes en cours de différenciation sous l'action de la phosphorylation de la MAPK p38. Hsp27 nucléaire interagit avec la forme acétylée de GATA-1 et induit son ubiquitinylation et sa dégradation par le protéasome. Ces résultats montrent un nouveau rôle d'Hsp70 et Hsp27 au cours de la différenciation érythroïde terminale en intervenant dans des mécanismes de régulation fine de l'expression de GATA-1. Nous avons déterminé les mécanismes par lesquels Hsp70 est accumulé dans le noyau des érythroblastes au cours de la différenciation érythroïde terminale. L'érythropoïèse est régulée positivement par deux facteurs indispensables à la prolifération et la survie des progéniteurs éythroïdes, le SCF pour les phases précoces jusqu'au stade d'érythroblaste basophile et l'Epo à partir des CFU-E jusqu'au stade d'érythroblastes. Avant la diminution d'expression de c-Kit, le récepteur au SCF, au stade d'érythroblastes basophiles, Hsp70 est principalement cytoplasmique. En effet, le SCF induit l'export nucléaire d'Hsp70 par la phosphorylation induite par AKT sur la sérine 400 résultant en une faible quantité d'Hsp70 nucléaire. Au stade de la diminution d'expression de c-Kit, l'export nucléaire induit par le SCF est diminué. D'autre part, l'Epo, en activant Lyn, induit la rétention nucléaire d'Hsp70. Nous décrivons donc un nouveau mécanisme du retard de la différenciation érythroïde par c-Kit puisque sa diminution est nécessaire pour que GATA-1 soit protégé du clivage de la caspase-3 par Hsp70 nucléaire. De plus, nous suggérons un nouveau mécanisme de Lyn dans la survie et la différenciation des érythroblastes sous Epo. Nous avons testé notre modèle au cours de syndromes myélodysplasiques (SMD) de bas grade, caractérisés par une anémie associée à un excès d'activation des caspases et de l'apoptose ainsi qu'un retard de différenciation des progéniteurs érythroïdes. Nous avons démontré qu'un défaut de localisation nucléaire d'Hsp70 est en partie responsable du phénotype observé puisque l'expression d'Hsp70 nucléaire restaure en partie le phénotype des progéniteurs érythroïdes de patients atteints de SMD. Ces résultats concordent avec notre modèle physiologique. De plus, il est envisageable que c-Kit pourrait être une nouvelle cible thérapeutique pour les patients atteints de SMD.

Les Hsp70 constituent une famille de chaperons moléculaires ubiquitaires qui jouent des rôles essentiels dans le repliement, le transport ou la dégradation des protéines. Le cytoplasme des cellules eucaryotes contient plusieurs paralogues de Hsp70 fortement conservés qui diffèrent essentiellement par leur expression spatio-temporelle. Plusieurs travaux suggèrent que ces paralogues ont des spécificités fonctionnelles que nous avons cherché à mettre en lumière et caractériser par des approches génétiques. Dans une première étude, nous avons comparé les activités des Hsp70 des levures Saccharomyces cerevisiae (Ssa1-4) et Yarrowia lipolytica (Ssa5-8) lorsqu'elles sont exprimées comme unique Hsp70 chez S. cerevisiae. Nous avons montré que ces Hsp70: 1) assurent la viabilité des cellules mais avec des taux de croissance très différents; 2) ont des effets variables sur la propagation et la stabilité des prions [URE3] et [PSI+]; et 3) permettent la dégradation protéasomale de CFTR avec des cinétiques comparables. Dans une seconde étude, nous avons montré que la formation de biofilms chez la levure dépend de la machinerie Hsp70 qui contrôle, via des voies distinctes, l'expression, la maturation et le recyclage d'une adhésine de surface (Flo11) requise pour ce processus. Enfin, nous avons construit et caractérisé des mutants de Y. lipolytica dans lesquels un ou plusieurs gènes codant des chaperons moléculaires ou acteurs de la protéostase (e.g. Hsp70, Hsp104, CHIP) ont été invalidés. Malgré une forte homologie et une redondance fonctionnelle, les Hsp70 possèdent des propriétés distinctes permettant aux cellules de faire face à différents types de substrats et de conditions de stress.